CN111013504B - 一种磁性聚合物微球的表面修饰方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种磁性聚合物微球的表面修饰方法，包括：先利用表面具有环氧基的磁性聚合物微球的环氧基与具有巯基或氨基的伯胺或酯进行反应，得到表面带有氨基或羧基的磁珠微球；再对引入的氨基或羧基进行支化扩增，最后将表面氨基或羧基扩增后的磁性微球与带羟基侧链的氨基酸衍生物进行酰胺反应，以引入大量的亲水性羟基。该表面修饰方法可以得到表面具有大量活性基团(氨基或羧基)及亲水性羟基的磁性微球，既能与生物活性物质高效率地偶联，又能保证其亲水性较高，减少出现后续偶联后磁珠应用时的非特性吸附。本发明还提供了表面修饰后的磁性微球。

Description

一种磁性聚合物微球的表面修饰方法
技术领域
本发明涉及磁珠修饰技术领域，特别涉及一种磁性聚合物微球的表面修饰方法。
背景技术
磁性聚合物微球是由聚合物包被磁性物质(如Fe3O4)形成的一种复合型材料，具有超顺磁性，可随着外加磁场的施加和去除产生磁性响应；并可通过偶联生物活性物质，实现多种功能，在细胞分离，免疫纯化与检测等方面有着广泛应用。磁性聚合物微球的表面可以通过化学手段修饰所需要的活性官能团，如羧基、氨基、羟基、巯基等，为后续的多种多样的生物活性物质偶联提供了可能性。
在磁性聚合物微球表面引入活性官能团最为常用的方法是将带有活性官能团的功能单体和作为骨架结构的聚合物单体通过共聚合包被在磁性物质外面。然而，这种方法获得的磁性聚合物微球表面能用于生物偶联的官能团数量很少，导致进一步偶联的偶联效率低。另外，聚合物材料由于疏水性较强，后续造成对生物样品的蛋白等物质的非特异性吸附，影响生物应用时的效果。
发明内容
鉴于此，本发明提供了一种磁性聚合物微球的表面修饰方法，其通过在表面具有环氧基的磁性聚合物微球引入指数倍增的活性基团(氨基或羧基)，大大增加了磁性聚合物微球表面的活性基团数量，再与带羟基侧链的氨基酸衍生物进行反应，从而在微球表面引入较多的亲水性羟基，增加了其亲水性，可降低后续对生物样品的非特性吸附，又不影响其后续与生物活性物质偶联的活性基团数量。
具体地，本发明提供了一种磁性聚合物微球的表面修饰方法，包括以下步骤：
(1)将表面具有环氧基的磁性聚合物微球悬浮于第一溶剂中，冰水浴下缓慢加入式A的化合物或式B的化合物，室温下搅拌反应过夜，反应结束后，用磁铁吸引后得到表面带有氨基的磁珠微球，或者用磁铁吸引后再悬浮于含第一路易斯碱的第二溶剂中并再次用磁铁吸引，得到表面带有羧基的磁性微球；
式A：Nu-R1-NH2，式B：Nu-R2-COOR，其中，Nu为-NH2或-SH，R1和R2独立地选自C2-6的亚烷基，R为烷基；
(2)
2a)将所述表面带有氨基的磁性微球悬浮于第三溶剂中，加入丙烯酸酯，在氮气保护下于室温搅拌反应1-4天，反应结束后用磁铁吸引，并清洗、干燥；
2b)将2a)中干燥后的磁性微球再悬浮于所述第三溶剂中，加入式D的化合物，室温下搅拌反应1-4天，反应结束后用磁铁吸引，并清洗、干燥；
式D：NH2-R3-NH2，R3选自C2-6的亚烷基；
(3)重复上述步骤2a)与2b)，循环次数为(n-1)次，得到表面氨基指数倍增的磁性微球；
或者将上述步骤2a)与2b)循环进行(n-2)次后，再重复一次步骤2a)，并将得到的磁珠置于含第二路易斯碱的第四溶剂中室温搅拌，用磁铁吸引后得到表面羧基指数倍增的磁性微球；其中，n为3-6的整数；
或者将所述表面氨基指数倍增的磁性微球与式E的化合物在含第三路易斯碱的第五溶剂中进行室温搅拌反应，用磁铁吸引后得到表面羧基指数倍增的磁性微球；
式E：X-R4-COOH，X为卤素原子，R4选自C1-6的亚烷基；
(4)将表面氨基或羧基指数倍增的磁性微球与带羟基侧链的氨基酸衍生物进行酰胺反应，以在所述磁性微球的表面引入多个羟基。
本发明中，所述表面具有环氧基的磁性聚合物微球的制备是本领域公知，例如将带环氧基的功能单体、聚合单体在引发剂、交联剂存在下，通过共聚合包被在磁性物质外面。其中，所述带环氧基的功能单体为甲基丙烯酸缩水甘油酯、丙烯酸缩水甘油酯或烯丙基缩水甘油酯。可选地，所述聚合单体选自甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸乙酯、丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸正丁酯、甲基丙烯酸羟乙酯中的一种或多种。
优选地，所述R1、R2、R3和R4独立地选自C2-4的亚烷基。
其中，所述丙烯酸酯包括丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸异丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸正戊酯、丙烯酸异戊酯、丙烯酸己酯中的一种或多种，但不限于此。
可选地，所述带羟基侧链的氨基酸衍生物包括丝氨酸、苏氨酸、天门冬氨酸的衍生物。具体地，可以为丝氨酸、苏氨酸、天门冬氨酸的盐或酯。
本发明中，所述第一溶剂、所述第二溶剂、所述第三溶剂、所述第四溶剂、所述第五溶剂分别包括但不限于醇类溶剂、醚类溶剂、酮类溶剂、砜类溶剂、腈类溶剂和吡啶中的一种或多种。
可选地，所述醇类溶剂包括碳原子数为1-10的烃基醇和碳原子数为3-10的环烃基醇中的至少一种。所述醚类溶剂包括乙醚、甲基叔丁基醚、异丙醚、四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃、1,4-环氧六环、环戊基甲醚、乙二醇二甲醚、乙二醇二乙醚、二甘醇二甲醚、四甘醇二甲醚和二丁醚中的一种或多种。所述腈类溶剂包括碳原子数为1-20的烃基腈和碳原子数为3-20的环烃基腈中的至少一种。所述酰胺类溶剂包括二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺和N-甲基吡咯烷酮中的一种或多种。所述砜类溶剂包括二甲基亚砜和环丁砜中的至少一种。
在本发明一实施方式中，当加入式A的化合物时，所述第一溶剂为碱性，可以含有吡啶类溶剂，或者添加有路易斯碱(LiOH、NaOH等)。例如可以为添加有路易斯的四氢呋喃与乙醇的混合，或者为四氢呋喃、乙醇和吡啶的混合。
在本发明一实施方式中，所述第三溶剂、所述第四溶剂、所述第五溶剂分别为甲醇、乙醇等醇类溶剂。所述第二溶剂为醇类溶剂和醚类溶剂的混合；优选为甲醇、乙醇等烃基醇与四氢呋喃、2-甲基四氢呋喃等醚类的混合。
可选地，所述第一路易斯碱、第二路易斯碱、第三路易斯碱独立地选自碱土金属单质及其化合物、碱金属单质及其化合物、过渡金属氧化物和有机碱中中的至少一种。可选地，所述碱土金属及其化合物包括碱土金属单质、碱土金属的氢氧化物、碳酸盐、磷酸盐、氧化物、氢化物中的至少一种。可选地，所述碱金属及其化合物包括碱金属单质、碱金属的氢氧化物、碳酸盐、磷酸盐、氧化物、氢化物中的至少一种。所述有机碱包括乙胺、二异丙基胺、三乙胺、三乙醇胺、吡啶、甲醇钠、甲醇钾、乙醇钠、乙醇钾、叔丁醇钠、叔丁醇钾、丁基锂、苯基锂、二异丙基胺基锂和六甲基二硅胺基锂中的至少一种。
优选地，所述第一路易斯碱、第二路易斯碱、第三路易斯碱独立地选自氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氧化镁、氧化钙中的一种或多种。进一步优选为氢氧化锂、氢氧化钠或氢氧化钾。
步骤(4)中，所述酰胺反应的方法为本领域的技术人员所熟知，通常需要加入缩合剂、催化剂(又可称为活化剂)。其中，所述缩合剂包括1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)、O-苯并三氮唑-N,N,N',N'-四甲基脲四氟硼酸酯(TBTU)、O-(N-丁二酰亚胺基)-二(二甲胺基)碳鎓四氟硼酸盐(TSTU)、2-(7-氧化苯并三氮唑)-N,N,N',N'-四甲基脲六氟磷酸酯(HATU)和O-苯并三氮唑-四甲基脲六氟磷酸酯(HBTU)中的一种或多种。所述催化剂包括4-二甲氨基吡啶(DMAP)、N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)、N-羟基硫代琥珀酰亚胺(Sufo-NHS)、1-羟基苯并三氮唑、N,N-二异丙基乙胺(DIEA)、N-甲基吗啡啉和三乙基胺(TEA)中的任意一种。
其中，所述酰胺反应的溶剂包括酰胺类溶剂、醇类溶剂、醚类溶剂、酮类溶剂、砜类溶剂和腈类溶剂中的一种或多种。可选地，所述酰胺类溶剂包括N，N-二甲基甲酰胺、二甲基乙酰胺和N-甲基吡咯烷酮中的一种或多种。
作为示例性的本发明一实施方式中，步骤(1)中进行反应的反应方程式为：
Figure BDA0002313883090000051
本发明中，步骤2a)进行的是-NH2与丙烯酸酯的迈克尔加成反应，步骤2b)进行的是迈克尔加成反应得到的酯与二伯胺化合物D的酰胺化反应，每交替进行一次2a)与2b)，使微球表面的氨基逐级递增。其中，当步骤2a)与2b)的循环次数为(n-1)次时，即，步骤2a)与2b)依次交替进行了n次，磁性微球表面的氨基数目变成了步骤(1)得到的磁性微球的2n倍。作为示例性的，本发明一实施方式提供了n＝2时的反应方程式，如下所示：
支化扩增氨基的方法：
Figure BDA0002313883090000061
而当步骤2a)与2b)的循环次数为(n-2)次后，再重复步骤2a)时，即，步骤2a)进行了n次，步骤2b)进行了(n-1)次，磁性微球表面的氨基数目变成了步骤(1)得到的磁性微球的2n倍。作为示例性的，本发明一实施方式提供了n＝2时扩增羧基的反应方程式，如下所示：
支化扩增羧基的方法1：
Figure BDA0002313883090000062
本发明步骤(3)中，扩增羧基的另一途径如下所示：
Figure BDA0002313883090000071
作为示例性的本发明一实施方式中，步骤(4)中进行反应的反应方程式为：
改进亲水性的方法：
Figure BDA0002313883090000072
本发明的步骤(4)中，当将所述表面羧基指数倍增的磁性微球与带羟基侧链的氨基酸衍生物进行酰胺反应时，是将带羟基侧链的氨基酸衍生物的羧基进行保护，并在酰胺反应后进行羧基的脱保护。类似地，当将所述表面氨基指数倍增的磁性微球与带羟基侧链的氨基酸衍生物进行酰胺反应时，是将带羟基侧链的氨基酸衍生物的氨基进行保护，并在酰胺反应后进行氨基的脱保护。这样可以提高所述酰胺反应的效率，并减少副反应反应。假如步骤(1)中磁性微球有m个环氧基，经过步骤(4)反应以后，所述磁性微球的表面具有(2n+1)*m个羟基，以及m*2n个氨基或羧基。
本发明提供的磁性聚合物微球的表面修饰方法中，先将表面具有环氧基的磁性聚合物微球的环氧基与式A的化合物或式B的化合物进行亲核取代反应，直接在磁性微球表面等比例引入活性官能团(氨基或羧基)；再对引入的氨基或羧基进行指数倍扩增，大大提升了磁珠表面活性官能团的密度；最后将表面氨基或羧基扩增后的磁性微球与带羟基侧链的氨基酸衍生物进行酰胺反应，除了第一步的亲核取代反应产生的等量羟基外，又在磁性微球表面引入了与氨基或羧基等量的亲水性羟基，引入羟基并不影响磁性微球表面的活性官能团数量(如上步骤4的示例性方程式所示)，又大大增加了磁性微球的亲水性，降低后续对生物样品的非特性吸附。
本发明还提供了采用上述表面修饰方法制得的磁性微球。该磁性微球表面具有大量的亲水性羟基，和大量的活性基团(羧基或氨基)，既能与生物活性物质高效率地偶联，又能保证其亲水性较高，减少出现后续偶联后磁珠应用时的非特性吸附问题。
具体实施方式
以下所述是本发明的示例性实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也视为本发明的保护范围。
本发明实施例中，所述表面具有环氧基的磁性聚合物微球的制备是本领域公知，例如可通过单体共聚法制备。作为示例性的，本发明提供了一种聚甲基丙烯酸缩水甘油酯(PGMA)包被的磁性微球，包括以下步骤：
首先采用化学共沉淀法制备油酸包覆的Fe3O4磁流体：在氮气保护想天，于70-90℃下，向氨水或碳酸氢钠溶液加入摩尔比为1:1.5-2的氯化亚铁和三氯化铁的水溶液，并滴加油酸，30分钟后用磁铁分离，并用去离子水清洗，得到油酸包覆的Fe3O4磁流体；
再通过乳液-悬浮聚合制备含环氧基的磁性聚合物微球：将60mL的甲基丙烯酸甲酯与5mL的交联剂二乙烯基苯(DVB)和30mL的甲基丙烯酸缩水甘油酯(GMA)、30g的油酸包覆的Fe3O4磁流体，以及3.0g的引发剂BPO(过氧化苯甲酰)混合形成有机相；将25g的聚乙烯醇-1788(PVA-1788)和30g的NaCl溶解在1L水中形成水相；将水相和有机相混合后，在45℃下孵育30分钟，再在30分钟内升温至60℃，最后将温度提升至70℃并在1000rpm下反应2小时。反应结束后降至室温，经磁性分离，并用乙醇和去离子水洗涤后，得到含环氧基的磁性聚合物微球。
实施例1
PGMA包裹的磁珠与半胱胺反应，得到表面修饰有氨基的磁珠的方法：
1.将PGMA包裹的磁珠(尺寸1微米)1克，悬浮于5mL的四氢呋喃/乙醇(1/20)的混合溶剂中，得到溶液；其中，该混合溶剂中含有氢氧化锂(4.2mg,0.10mmol)；
2.在冰水浴中，向上述溶液中缓慢加入半胱胺(154mg，2mmol，SH-CH2-CH2-NH2)，在室温下搅拌反应过夜。
3.反应结束后，用磁铁吸引得到磁珠，并按乙醇、超纯水，1X的PBS溶液和超纯水的顺序依次清洗两遍，再将清洗后的磁珠在30℃下真空干燥，放入真空袋中保存，即得到表面带有-NH2的磁珠微球。
实施例2
PGMA包裹的磁珠的磁珠与乙二胺反应，得到表面修饰有氨基的磁珠的方法：
1.将PGMA包裹的磁珠(尺寸1微米)0.8克，悬浮于4mL的四氢呋喃/乙醇(1/20)的混合溶剂中，得到溶液；其中，该混合溶剂中含有氢氧化锂(4.2mg,0.10mmol)；
2.在冰水浴中，向上述溶液中缓慢加入乙二胺(96mg，1.6mmol，NH2-CH2-CH2-NH2)，在室温下搅拌反应过夜。
3.反应结束后，用磁铁吸引得到磁珠，并按乙醇、超纯水，1X的PBS溶液和超纯水的顺序依次清洗两遍，再将清洗后的磁珠在30℃下真空干燥，放入真空袋中保存，即得到表面带有-NH2的磁珠微球。
实施例3
PGMA包裹的磁珠的磁珠与3-巯基丙酸甲酯反应，得到表面修饰有羧基的磁珠的方法：
1.将PGMA包裹的磁珠(尺寸1微米)1.0克，悬浮于5mL的四氢呋喃/乙醇(1/20)的混合溶剂中，得到溶液；其中，该混合溶剂中还含有吡啶(8μL，0.10mmol)；
2.在冰水浴中，向上述溶液中缓慢加入3-巯基丙酸甲酯(240mg，2mmol，SH-CH2-CH2-COOCH3)，在室温下搅拌反应过夜；
3.反应结束后，用磁铁吸附得到磁珠，分别用四氢呋喃/乙醇(1/20)的混合溶剂和乙醇洗两遍；
4.将清洗后的磁珠再次悬浮在15mL的四氢呋喃/乙醇(1/20)的混合溶剂中，该混合溶剂中还含有氢氧化锂(84mg，2mmol)，于50℃下反应过夜；
5.反应结束后，用磁铁吸引得到磁珠，并按乙醇、超纯水、1X的PBS溶液和超纯水的顺序清洗两遍，再将清洗后的磁珠在30℃下真空干燥，放入真空袋中保存。
实施例4
PGMA包裹的磁珠的磁珠与β-丙氨酸甲酯反应，得到表面修饰有羧基的磁珠的方法：
1.将PGMA包裹的磁珠(尺寸1微米)1.0克，悬浮于10mL的四氢呋喃/乙醇(1/20)的混合溶剂中，得到溶液；其中，该混合溶剂中还含有吡啶(12μL，0.15mmol)；
2.在冰水浴中，向上述溶液中缓慢加入β-丙氨酸甲酯的盐酸盐(280mg，2mmol)，在室温下搅拌反应过夜；
3.反应结束后，用磁铁吸附得到磁珠，分别用四氢呋喃/乙醇(1/20)的混合溶剂和乙醇洗两遍；
4.将清洗后的磁珠再次悬浮在15mL的四氢呋喃/乙醇(1/20)的混合溶剂中，该混合溶剂中还含有氢氧化锂(84mg，2mmol)，于50℃下反应过夜，以使酯水解；
5.反应结束后，用磁铁吸引得到磁珠，并按乙醇、超纯水、1X的PBS溶液和超纯水的顺序清洗两遍，再将清洗后的磁珠在30℃下真空干燥，放入真空袋中保存。
实施例5
磁珠表面氨基的支化扩增方法：
1.取实施例1或实施例2中表面带有氨基的磁珠5克，悬浮于50mL的甲醇中；
2.向所得悬浮液中加入10mL的丙烯酸甲酯(CH2＝CH-COOCH3)，在氮气保护下，于室温下搅拌反应3天；
3.反应结束后，用磁铁吸附得到磁珠，并乙醚清洗3遍，然后在30℃下真空干燥；再将干燥后的磁珠再次悬浮在50mL的甲醇中，并加入15mL的乙二胺，在室温下反应3天；
5.重复2-3的过程2-4次(即步骤2、3的反应各交替进行了3-5次)，直至磁珠表面氨基数量达到目标；
6.反应结束后，用磁铁吸引得到磁珠，并用甲醇和乙醚各清洗3遍；然后，按乙醇、超纯水、1X的PBS溶液和超纯水的顺序清洗两遍，在30℃下真空干燥，放入真空袋中保存。
实施例6
磁珠表面羧基的支化扩增方法：
1.按照上述实施例5中氨基支化扩增方法进行官能团扩增，只是在最后一次丙烯酸酯反应后，不再进行与乙二胺的反应，而是将磁珠置于含1.5mM氢氧化锂的甲醇溶液中室温搅拌反应过夜；
2.反应结束后，用磁铁吸引得到磁珠，并甲醇和乙醚各清洗3遍，然后再按乙醇、超纯水、1X的PBS溶液和超纯水的顺序清洗两遍，在30℃下真空干燥，放入真空袋中保存，得到表面羧基得到支化扩增的磁珠。
实施例7
磁珠表面羧基的支化扩增方法：
1.将10g的一氯乙酸溶解在50毫升甲醇中，并加入4.2g的氢氧化钠，搅拌均匀；
2.向上述溶液中加入实施例5中氨基支化扩增后的磁珠，在室温下充分搅拌反应3天；
3.反应结束后，用磁铁吸引得到磁珠，并甲醇和乙醚各清洗3遍；然后再按乙醇、超纯水、1X的PBS溶液和超纯水的顺序清洗两遍，在30℃下真空干燥，放入真空袋中保存，得到表面羧基得到支化扩增的磁珠。
实施例8
在活性基团支化扩增后的磁珠表面引入较多羟基，以增加其亲水性的方法：
1.将930mg的1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(简称EDC)、732mg的4-二甲氨基吡啶(DMAP)、952g羧基得到保护的丝氨酸(将羧基转变为酯基，具体为L-丝氨酸甲酯盐酸盐)溶解在50mL的二甲基甲酰胺(DMF)：四氢呋喃(THF)：甲醇＝1:1:38(体积比)的混合溶剂中，得到一溶液；
2.向上述溶液中缓慢加入5g的经过表面羧基支化扩增后的磁珠(例如实施例6或实施例7所得的磁珠)，在氮气保护的室温下反应过夜；
3.反应结束后，向反应混合物中加入5mL的乙醇胺以终止酰胺反应，用磁铁吸引得到磁珠，并甲醇和乙醚各清洗3遍；
4.将清洗后的磁珠再次悬浮在含氢氧化锂(84mg，2mmol)的15mL四氢呋喃/乙醇(1/20)的混合溶剂中，在50℃下反应过夜，以将羧基进行脱保护；
5.反应结束后，用磁铁吸引得到磁珠，并按乙醇、超纯水、1X的PBS溶液和超纯水的顺序清洗两遍，在30℃下真空干燥，放入真空袋中保存。
实施例8所得的磁珠，其表面修饰有高密度的羧基和亲水性羟基，其中，高密度的羧基可便于后续与生物活性物质(如多肽、抗体、抗原、生物素、叶酸等)，保证了偶联效率较高；在磁珠与生物活性物质偶联后，亲水性羟基仍存在，保证了其较高的亲水性，可降低后续对生物样品的非特性吸附。
实施例9
在活性基团支化扩增后的磁珠表面引入较多羟基，以增加其亲水性的方法：
1.将930mg的EDC、732mg的4-二甲氨基吡啶(DMAP)、952g氨基得到保护的丝氨酸(具体是Fmoc-L-丝氨酸)溶解在50mL的二甲基甲酰胺(DMF)：四氢呋喃(THF)：甲醇＝1:1:38(体积比)的混合溶剂中，得到一溶液；
2.向上述溶液中缓慢加入5g的经过表面氨基支化扩增后的磁珠(例如实施例5所得的磁珠)，在氮气保护的室温下反应过夜；
3.反应结束后，向反应混合物中加入5mL的乙醇胺以终止酰胺反应，用磁铁吸引得到磁珠，并甲醇和乙醚各清洗3遍；
4.将清洗后的磁珠悬浮于含有5％哌嗪和1,8-二氮杂二环[5.4.0]十一碳-7-烯(DBU)的DMF溶液10mL中，孵育10分钟以进行氨基的脱保护，然后在室温下于900rpm下震荡30分钟；
5.反应结束后，用磁铁吸引得到磁珠，并用乙醇和水反复清洗3次，烘干得到产物。
实施例9所得的磁珠，其表面修饰有高密度的氨基和亲水性羟基，其中，高密度的羧基可便于后续与生物活性物质(如多肽、抗体、抗原、生物素、叶酸等)，保证了偶联效率较高；在磁珠与生物活性物质偶联后，亲水性羟基仍存在，保证了其较高的亲水性，可降低后续对生物样品的非特性吸附。
以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (8)

1.一种磁性聚合物微球的表面修饰方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将表面具有环氧基的磁性聚合物微球悬浮于第一溶剂中，冰水浴下缓慢加入式A的化合物或式B的化合物，室温下搅拌反应过夜，反应结束后，用磁铁吸引后得到表面带有氨基的磁珠微球，或者用磁铁吸引后再悬浮于含第一路易斯碱的第二溶剂中并再次用磁铁吸引，得到表面带有羧基的磁性微球；
式A：Nu-R1-NH2，式B：Nu-R2-COOR，其中，Nu为-NH2或-SH，R1和R2独立地选自C2-6的亚烷基，R为烷基；
(2)2a)将所述表面带有氨基的磁性微球悬浮于第三溶剂中，加入丙烯酸酯，在氮气保护下于室温搅拌反应1-4天，反应结束后用磁铁吸引，并清洗、干燥；
2b)将2a)中干燥后的磁性微球再悬浮于所述第三溶剂中，加入式D的化合物，室温下搅拌反应1-4天，反应结束后用磁铁吸引，并清洗、干燥；
式D：NH2-R3-NH2，R3选自C2-6的亚烷基；
(3)重复上述步骤2a)与2b)，循环次数为(n-1)次，用磁铁吸引后得到表面氨基指数倍增的磁性微球；
或者将上述步骤2a)与2b)循环进行(n-2)次后，再重复一次步骤2a)，并将得到的磁珠置于含第二路易斯碱的第四溶剂中室温搅拌，用磁铁吸引后得到表面羧基指数倍增的磁性微球；其中，n为3-6的整数；
或者将所述表面氨基指数倍增的磁性微球与式E的化合物在含第三路易斯碱的第五溶剂中进行室温搅拌反应，用磁铁吸引后得到表面羧基指数倍增的磁性微球；
式E：X-R4-COOH，X为卤素原子，R4选自C1-6的亚烷基；
(4)将表面氨基或羧基指数倍增的磁性微球与带羟基侧链的氨基酸衍生物进行酰胺反应，以在所述磁性微球的表面引入多个羟基。
2.如权利要求1所述的表面修饰方法，其特征在于，所述R1、R2、R3和R4独立地选自C2-4的亚烷基。
3.如权利要求1所述的表面修饰方法，其特征在于，所述带羟基侧链的氨基酸衍生物包括丝氨酸、苏氨酸、天门冬氨酸的衍生物。
4.如权利要求1所述的表面修饰方法，其特征在于，所述第一路易斯碱、第二路易斯碱、第三路易斯碱独立地选自碱土金属单质及其化合物、碱金属单质及其化合物和过渡金属氧化物中的至少一种。
5.如权利要求4所述的表面修饰方法，其特征在于，所述第一路易斯碱、第二路易斯碱、第三路易斯碱独立地选自氢氧化锂、氢氧化钠、氢氧化钾、氢氧化钙、氧化镁、氧化钙中的一种或多种。
6.如权利要求1所述的表面修饰方法，其特征在于，所述第一溶剂至所述第五溶剂独立地选自醇类溶剂醚类溶剂、酮类溶剂、砜类溶剂、腈类溶剂和吡啶类溶剂中的一种或多种。
7.如权利要求1所述的表面修饰方法，其特征在于，所述丙烯酸酯包括丙烯酸甲酯、丙烯酸乙酯、丙烯酸丙酯、丙烯酸异丙酯、丙烯酸正丁酯、丙烯酸叔丁酯、丙烯酸异丁酯、丙烯酸正戊酯、丙烯酸异戊酯、丙烯酸己酯中的一种或多种。
8.一种如权利要求1-7任一项所述的表面修饰方法制得的磁性微球。
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