CZ2022167A3 - Polymerní konjugát pro blokování nespecifických interakcí v imunochemických stanoveních, způsob jeho výroby a jeho použití - Google Patents

Abstract

Předkládané řešení se týká makromolekulárních blokátorů nespecifických interakcí analytu a dalších složek analytického systému s pevnou fází a významně tak snižuje nespecifické interakce ve stanovení. Makromolekulární blokátor obsahuje syntetický kopolymer nebo homopolymer, vybraný ze skupiny zahrnující polyakrylamid, polymethakrylamid, polyakrylát, polymetakrylát, poly(N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid), 2-polyoxazolín, na nějž je kovalentní vazbou připojena alespoň jedna hydrofobně-aktivní kotva umožňující omezení nespecifických interakcí v imunotestech. Řešení se dále týká způsobu přípravy a použití makromolekulárních blokátorů pro cílené zachycení specifických protilátek nebo antigenů či jiných molekul na povrch pevné fáze.

Description

Polymerní konjugát pro blokování nespecifických interakcí v imunochemických stanoveních, způsob jeho výroby a jeho použití

Oblast techniky

Předkládaný vynález popisuje syntetické makromolekulámí blokátory nespecifických interakcí během imunochemických stanovení a adherentní kotvy umožňující provedení imunotestů bez přítomnosti běžně používaných blokačních proteinů.

Dosavadní stav techniky

Jedním z klíčových problémů každého imunochemického stanovení, tj. stanovení využívajícího interakci analytu se specifickou protilátkou, imunoglobulinem, je problém nespecifických vazeb jednotlivých reaktantů (analytu, dalších složek ze vzorku, protilátky a komplexu analyt-protilátka) na povrch pevné fáze používané jako součást systému, případně na povrch reakční nádobky. Problém nespecifických vazeb, v anglickém jazyce zkracovaný jako NSB (Non-Specific-Binding), vede ke zhoršení některých parametrů stanovení (citlivost, specificita a reprodukovatelnost). K minimalizaci NSB se nejčastěji používají inertní, tj. k vlastní imunochemické reakci indiferentní, reaktanty vázající se na pevnou fázi nespecificky a tím minimalizující analogickou nespecifickou vazbu molekul účastnících se imunochemické reakce, respektive detekce

Historicky nejpoužívanějšími blokátory NSB jsou proteiny živočišného původu, a sice hovězí sérový albumin (BSA), kasein, odtučněné mléko, rybí případně prasečí želatina, apod. Společnou nevýhodou těchto blokátorů živočišného původu je nezanedbatelná variabilita jednotlivých výrobních šarží vyžadující nákladné testování každé nové šarže u koncových uživatelů, kteří tyto blokátory používají pro svoji standardizovanou výrobu. Další nevýhodou související s používáním vstupního materiálu živočišného původu jsou požadavky na testy prokazující nezávadnost z hlediska obsahu příslušnou legislativou vyjmenovaných zvířecích patogenů či kontaminantů.

Jako nejpoužívanější blokátor nespecifických interakcí, a to i přes výše uvedené výhrady, lze označit BSA. Pro účely imunochemických testů se jedná o tzv. „Albumin Fraction V“, izolovanou způsobem, kdy dochází ke zničení enzymatických aktivit proteáz. BSA se nepoužívá pouze jako blokátor NSB, ale nemálo diagnostických systémů využívá BSA konjugované s biotinem k vazbě avidinu, resp. streptavidinu, a následně pak k vazbě další biotinylované složky jako protilátky či antigenu. Využití avidinu či streptavidinu jako „cross“ reaktantu díky jeho čtyř vazebným místům pro biotin se s výhodnou používá pro konstrukci relativně robustní pevné fáze. BSA však rozhodně není ideální molekulou optimalizovanou pro potlačení těchto nespecifických interakcí, a to ani svými sorpčními vlastnostmi, ani vlastnostmi, které vyplývají z toho, že BSA je živočišného původu.

Syntetické molekuly, např. detergenty jako Tween20 nebo polymery jako je polyvinylalkohol nebo Ficoll, byly použity jako alternativy pro proteinová blokující činidla (Rodda, D.J. and H. Yamazaki, Poly(vinyl alcohol) as a blocking agent in enzyme immunoassays. Immunological Investigations, 1994. 23(6-7): p. 421-428; Gardas, A. and A. Lewartowska, Coating of proteins to polystyrene ELISA plates in the presence of detergents. Journal of Immunological Methods, 1988. 106(2): p. 251-255; Steinitz, M., Quantitation of the blocking effect of Tween 20 and bovine serum albumin in ELISA microwells. Analytical Biochemistry, 2000. 282(2): p. 232-238; Lim, C.S., et al., On optimizing the blocking step of indirect enzyme-linked immunosorbent assay for EpsteinBarr virus serology. Clinica Chimica Acta, 2013. 415: p. 158-161), nicméně často nebrání nespecifické vazbě v dostatečné míře (Huber, D., et al., Effectiveness of natural and synthetic blocking reagents and their application for detecting food allergens in enzyme-linked immunosorbent assays. Analytical and Bioanalytical Chemistry, 2009. 394(2): p. 539-548). Proto existuje poptávka po lepších technikách blokování.

- 1 CZ 2022 - 167 A3

Byla popsána blokovací činidla, která jsou strukturně na bázi kationtových povrchově aktivních látek založených na strukturně různých poly(ethylenglykolech) konjugovaných s alkylaminy (Fujimoto, N., et al., Polyethylene glycol-conjugated alkylamines - A novel class of sutfactants for the saturation of immunoassay solid phase surfaces. Talanta, 2020. 211; Fujimoto, N., et al., Novel synthetic blocking reagents. 2010: EP 2261662 A1). Kromě modifikovaných PEG bylo popsáno, že použití polyvinylalkoholu snižuje množství nespecifické vazby protilátek a polyvinylpyrrolidon zvyšuje citlivost detekce protilátek (Studentsov, Y.Y., et al., Enhanced enzyme-linked immunosorbent assay for detection of antibodies to virus-like particles of human papillomavirus. Journal of Clinical Microbiology, 2002. 40(5): p. 1755-1760).

Podstata vynálezu

Předkládaný vynález se týká syntetických makromolekulárních blokátorů nespecifických interakcí v imunotestech a podobných typech diagnostických testů schopných potlačit nespecifickou sorpci použitých protilátek či jiných makromolekul na pevnou fázi. Vynález popisuje molekuly na bázi polyakrylamidů, polymethakrylamidů, polyakrylátů, polymetakrylátů polyHPMA nebo poly(2oxazolínů), které mohou být použitelné k náhradě BSA a k potlačení nespecifických interakcí v diagnostických stanoveních. Vynález dále popisuje využití syntetických makromolekul jako vysoce účinných adherentních kotev nahrazujících používané blokační proteiny v adhezní složce diagnostických testů. Polymerní konjugáty podle předkládaného vynálezu jsou vysoce biokompatibilní, neimunogenní, netoxické, velmi dobře rozpustné ve vodných roztocích a umožňují připojit jak molekuly pouze jediného typu, tak i kombinace různých typů s různými funkcemi. Využití kontrolované radikálové kopolymerizace rovněž umožňuje připravit telechelické polymery nesoucí dvě různé funkční skupiny na koncích svých řetězců.

Předkládaný vynález popisuje vodorozpustný syntetický polymerní konjugát (makromolekulární blokátor nespecifických interakcí), který obsahuje funkční součásti, a to především “hydrofobněaktivní” kotvu a ligand omezující nespecifické nekovalentní interakce v biologických médiích (“interakce-snižující ligand”), které slouží jako synergické součásti systému a zvyšují blokační aktivitu makromolekulárního blokátoru nespecifických interakcí. Základní funkcí popsaného blokátoru je jeho vysoká aktivita při účinném blokování povrchu pevné fáze a při blokování nespecifických interakcí v roztoku, čímž se významně omezuje komplexní nespecifická interakce analytu s povrchem pevné fáze. Tímto omezením nespecifické sorpce klesá signál šumu a současně se zvyšuje podíl signálu analytu k signálu šumu, což vede k významnému zpřesnění analytického stanovení. S výhodou je možné popsaný makromolekulární blokátor využít i pro ukotvení biospecifické molekuly, např. avidinu, streptavidinu, a následně pak k vazbě další složky reagující s bio-specifickou složkou, např. biotinylovanou, jako jsou protilátky či antigeny. V tomto případě makromolekulární blokátor obsahuje navíc bio-specifickou kotvu, s výhodou biotin. S výhodou je možné kombinovat dvě varianty makromolekulárního blokátoru, a to blokátor neobsahující biospecifickou kotvu a blokátor obsahující tuto kotvu. Druhý z blokátorů umožní navázání bioaktivní molekuly, např. avidinu, na pevnou fázi, a první blokátor, který neobsahuje bio-specifickou kotvu, je zodpovědný za dokonalé odstínění nespecifických interakcí analytu s povrchem pevné fáze.

Kostra makromolekulárního blokátoru je tvořena syntetickým kopolymerem, na který jsou kovalentní vazbou připojeny funkční součásti: i) alespoň jedna “hydrofobně-aktivní” kotva umožňující omezení nespecifických interakcí v imunotestech; ii) s výhodou “interakce-snižující ligand” zvyšující blokační aktivitu celého blokátoru; iii) v některých případech může kopolymer s výhodou obsahovat ještě bio-specifickou kotvu.

Předmětem předkládaného vynálezu je polymerní konjugát fungující jako makromolekulární blokátor nespecifických interakcí v biologických médiích, který obsahuje základní lineární polymer (homopolymer nebo kopolymer), přičemž základní lineární polymer je vybraný ze skupiny zahrnující polyakrylamid, polymethakrylamid, polyakrylát, polymetakrylát, poly(N-(2

- 2 CZ 2022-167 A3 hydroxypropyl)methakrylamid), poly(2-oxazolín) a jejich statistické kopolymery. Polymerní konjugát dále obsahuje alespoň jednu hydrofobně-aktivní kotvu obecného vzorce -X’-R², kde

X’ je kovalentní vazba nebo spojka vybraná ze skupiny sestávající z: -S-C(=S)-;

-(CH₂)_p-C(=O)-; -NH-(CH₂)_n-C(=O)-; -NH-(CH₂-CH2-O)o-CH2-CH₂-C(=O)-; -O(CH2-CH₂-O)_o-CH₂-CH₂-C(=O)-; nebo -NH-(CH₂)_q(C(=O)-NH-(CH₂)_r)_p-C(=O)-; přičemž n je celé číslo od 1 do 7; o je celé číslo od 1 do 15; p, q a r jsou vzájemně nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z 1, 2 a 3;

přičemž -CH₂- skupiny X’ mohou být dále nezávisle substituovány jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny;

R² je vybrané ze skupiny sestávající z: fenyl, -S-(CH₂)_a-CH-((CH₂)b-CH3)₂; -S-(CH₂)b(CH=CH-CH₂)_a-(CH₂)_b-CH₃; -NH-(CH₂)_b-CH₃; -NH-(CH₂)_b-(CH=CH-CH₂)_a-(CH₂)_bCH₃; -O-(CH₂)_b-CH₃; -O-(CH₂)_a-C-((CH₂)_b-CH₃)₂; -NH-(CH₂)_a-C-((CH₂)_b-CH₃)₂; -O(CH₂)b-(CH=CH-CH₂)_a-(CH₂)_b-CH₃; a -O-C(=O)-(CH₂)_a-CH-((CH₂)_b-CH₃)₂; přičemž a je celé číslo od 0 do 4, Z? je celé číslo od 4 do 17;

přičemž pokud X‘ není kovalentní vazba, je skupina R² navázaná přes svou koncovou

-S- nebo -NH- nebo -O- skupinu nebo přes uhlík (v případě fenylu) ke koncové karbonylové nebo thiokarbonylové skupině spojky X‘;

přičemž hydrofobně-aktivní kotva -X’-R² je přes skupinu X‘ navázána na alespoň jeden konec základního lineárního polymeru;

a/nebo hydrofobně-aktivní kotva -X’-R² je přes skupinu X‘ navázána jako postranní řetězec ke karbonylové skupině monomerní jednotky základního lineárního polymeru;

a přičemž pokud koncové skupiny základního lineárního polymeru nejsou hydrofobně-aktivní kotvou, jsou nezávisle vybrané ze skupiny sestávající z:

CH;

-C — I CN

C H;

--C —C H₂ -CH;

CN

CH;

—c—ch₂-ch

CN

CH;

—c —ch₂—ch₂-c —R

I II

CN O

CH, O CH, OCH,

I II I I

--C —CH₂—C—OCH; --C—CH₂—C—CH;

I I I

C H; CN CH;

C Η; C H;

--C —C H₂ —C—CH;

CH; C H;

—C H₂—CH i

--HC

—CH₂—CH i

kde R¹ je nezávisle vybráno z H, CH₃;

kde R² je definováno výše;

-3CZ 2022-167 A3 kde R³ je vybráno ze skupiny, sestávající z -NH-CH2-CH(OH)-CH3; -NH-CH2CH2-OH; -NHCH2CH2CH2-OH; -NH-C(CH2OH)3; -NH-CH(CH2OH)2; -NH-CH2CH2-N⁺(CH3)₃Clj -OCH₂CH₂-OH; -O-CH-(CH₂CH₂O)₂-H; -O-C-(CH₂CH₂O)₃-H; -O-CH₂CH₂-N⁺(CH₃)₃Cr;

X je kovalentní vazba nebo spojka vzorce -NH-(CH₂)_n-C(=O)-; -NH-(CH₂-CH₂-O)_o-CH₂CH₂-C(=O)-; -O-(CH₂-CH₂-O)_o-CH₂-CH₂-C(=O)-; nebo -NH-(CH₂)_q(C(=O)-NH-(CH₂)_r)_pC(=O)-; přičemž n j e celé číslo od 1 do 7; o j e celé číslo odl do 15;/?, a r j sou vzáj emně nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z 1, 2 a 3; přičemž pokud X není kovalentní vazba, je skupina R² nebo R navázaná přes svou koncovou -S- nebo -NH- nebo -O- skupinu nebo přes uhlík (pokud io R² je fenyl) ke koncové karbonylové skupině spcjky X;

přičemž -CH₂- skupiny X mohou být dále nezávisle substituovány jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny;

R je vybrané ze skupiny sestávající z -OH,

-4CZ 2022-167 A3

--NH

o

CHj O

C Hj

CHt

H

F

H

H

-5CZ 2022-167 A3

, kde n je celé číslo od 1 do 5;

a přičemž molekulová hmotnost polymerního konjugátu je v rozmezí od 5 000 do 500 000 g/mol, s výhodou v rozmezí od 10 000 do 150 000 g/mol, výhodněji v rozmezí od 15 000 do 60 000 g/mol (což odpovídá 80 až 400 monomerním jednotkám).

Přirozenými aminokyselinami se rozumí histidin, isoleucin, leucin, lysin, methionin, fenylalanin, threonin, tryptofan, valin, arginin, cystein, glutamin, glycin, prolin, tyrosin, alanin, kyselina asparagová, asparagin, kyselina glutamová, serin, selenocystein.

Postranními řetězci přirozené aminokyseliny jsou řetězce navázané k alfa-uhlíku dané aminokyseliny.

Ve výhodném provedení jsou tyto postranní řetězce přirozené aminokyseliny vybrané ze skupiny zahrnující methyl, isopropyl, isobutyl, -CH(CH3)(CH2CH3), -CH2OH, -CH(OH)(CH3), -CH₂-(C₆H₄)OH, -(CH₂)2-S-CH₃, -CH2SH, -(CH₂)4-NH₂, -CH2COOH, -CH₂C(O)NH₂, -(CH₂)₂COOH, -(CH₂)₂C(O)NH2, -(CH₂)3NH-C(=NH)(NH₂), benzyl.

Ve výhodném provedení je X’ spojka vybraná ze skupiny sestávající z: -S-C(=S)-;

-6CZ 2022-167 A3

-(CH2)_p-C(=O)-; -NH-(CH2)n-C(=O)-; přičemž pan jsou vzájemně nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z 1, 2 a 3; výhodněji p a «jsou 2;

a R² je vybrané ze skupiny sestávající z: -NH-(CH2)b-CH3; -NH-(CH2)b-(CH=CH-CH2)_a(CH2)b-CH3; -O-(CH2)b-CH3; přičemž a je celé číslo od 0 do 4, Z? je celé číslo od 4 do 17;

přičemž skupina R² je navázaná přes svou koncovou -NH- nebo -O- skupinu ke koncové karbonylové nebo thiokarbonylové skupině spojky X‘.

V nej výhodnějším provedení je X’ spojka vybraná ze skupiny sestávající z: -S-C(=S)-;

-(CH2)_P-C(=O)-; -NH-(CH2)n-C(=O)-; přičemž pan jsou vzájemně nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z 1, 2 a 3; výhodněji p a «jsou 2;

a R² je vybrané ze skupiny sestávající z: -NH-(CH2)n-CH3; -NH-(CH2)8-CH=CH-(CH2)7-CH3; -O-(CH2)ii-CH3; přičemž skupina R² je navázaná přes svou koncovou -NH- nebo -O- skupinu ke koncové karbonylové nebo thiokarbonylové skupině spojky X‘.

Ve výhodném provedení je R vybrané ze skupiny sestávající z:

V jednom provedení jsou monomerní jednotky základního lineárního polymeru vybrané z monomerních jednotek obecného vzorce (K) a (L):

(K)

-7 CZ 2022-167 A3

-^n- ch₂—ch₂^— ^v <t=0 (L);

kde R¹ a R³ jsou definovány výše;

R’ je -CH₃ nebo -CH₂CH₃.

Pokud je tedy hydrofobně-aktivní kotva -X’-R² navázána přes skupinu X‘ jako postranní řetězec ke karbonylové skupině monomerní jednotky základního lineárního polymeru, je tím míněno, že 10 skupina -X’-R² nahradí ve výše uvedených vzorcích (K) a (L) skupiny R³ a/nebo R’.

V jednom provedení je hydrofobně-aktivní kotva v polymerním konjugátu navázána přes skupinu

X jako postranní řetězec monomerní jednotky základního lineárního polymeru. V tomto provedení má polymerní konjugát od 0,5 do 10 % mol. monomerních jednotek základního lineárního 15 polymeru statisticky nahrazeno monomerními jednotkami obecného vzorce (I) a/nebo (II)

L Ά

-VCH₂-cá(I)

N—CH₂—CH₂ ch₂ i=o kde

R¹ je H nebo CH₃;

R² je definováno výše;

X je kovalentní vazba nebo spojka vzorce -NH-(CH₂)_n-C(=O)-; -NH-(CH₂-CH₂-O)_o-CH₂30 CH₂-C(=O)-; -O-(CH₂-CH₂-O)_o-CH₂-CH₂-C(=O)-; nebo -NH-(CH₂)_q(C(=O)-NH-(CH₂)_r)_pC(=O)-; navázaná přes svou koncovou -NH- nebo -O- skupinu ke karbonylové skupině monomerní jednotky obecného vzorce (I), přičemž n je celé číslo od 1 do 7; o je celé číslo od 1 do 15; p, qa r jsou vzájemně nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z 1, 2 a 3;

přičemž -CH₂- skupiny X mohou být dále nezávisle substituovány jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny;

-8CZ 2022-167 A3 přičemž platí, že pokud X není kovalentní vazba, je skupina R² je navázaná přes svou koncovou NH- nebo -O- nebo -S- skupinu nebo přes uhlík (v případě, že R² je fenyl) ke koncové karbonylové skupině spojky X;

a přičemž koncové skupiny lineárního polymeru jsou nezávisle vybrané ze skupiny sestávající z:

□CHj

CH,

I CN

Hi-C—CHj

CH;

kde X, R, R¹, R² a R³ jsou definovány výše.

Ve výhodném provedení je koncová skupina vybraná ze skupiny sestávající z

CHj

--C — C Hj

CM

CH₃

--C—CHj-CHj

CN

CH₃

--C—ch₂-ch

CN ^H3

CHU O

I II

--C —CH₂—C—OCHj

CHj

CH₃ OCHj

--C—CH₂-C —CHj

CN CHj

CHj CHj

--C —C H₂ —C —CHj

CHj CHj výhodněji je koncovou skupinou

CHj OCHj

--C—CHí-C—CHj

I I

CN CHj nebo

Ve výhodném provedení X je -NH-(CH2)_n-C(=O)-; přičemž n je vybrané ze skupiny sestávající z 1, 2 a 3; výhodněji n je 2;

a R² je vybrané ze skupiny sestávající z: -NH-(CH2)b-CH3; -NH-(CH2)b-(CH=CH-CH2)_a(CH2)b-CH3; -O-(CH2)b-CH3; přičemž a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 4 do 17;

přičemž skupina R² je navázaná přes svou koncovou -NH- nebo -O- skupinu ke koncové karbonylové skupině spojky X.

V nej výhodnějším provedení X je -NH-(CH2)_n-C(=O)-; přičemž n je vybrané ze skupiny sestávající z 1, 2 a 3; výhodněji n je 2;

-9CZ 2022-167 A3 a R² je vybrané ze skupiny sestávající z: -NH-(CH₂)n-CH3; -NH-(CH2)8-CH=CH-(CH2)7-CH3; -O-(CH2)ii-CH3; přičemž skupina R² je navázaná přes svou koncovou -NH- nebo -O- skupinu ke koncové karbonylové nebo thiokarbonylové skupině spojky X.

S výhodou polymerní konjugát v tomto provedení obsahuje od 0,7 do 5 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (I) a/nebo (II), výhodněji od 0,7 do 3,5 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (I) a/nebo (II), ještě výhodněji od 0,9 do 2 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (I) a/nebo (II).

V jednom provedení jsou monomerní jednotky základního lineárního polymeru monomerními jednotkami obecného vzorce (K) definovaného výše, přičemž od 0,5 do 10 % mol. monomerních jednotek (K) základního lineárního polymeru je statisticky nahrazeno monomerními jednotkami obecného vzorce (I), definovaného výše. S výhodou je nahrazeno od 0,7 do 3,5 % mol. monomerních jednotek (K) monomerními jednotkami obecného vzorce (I), výhodněji je nahrazeno od 0,9 do 2 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (K) monomerními jednotkami obecného vzorce (I).

V jednom provedení jsou monomerní jednotky základního lineárního polymeru monomerními jednotkami obecného vzorce (L) definovaného výše, přičemž od 0,5 do 10 % mol. monomerních jednotek (L) základního lineárního polymeruje statisticky nahrazeno monomerními jednotkami obecného vzorce (II), definovaného výše. S výhodou je nahrazeno od 0,7 do 3,5 % mol. monomerních jednotek (L) monomerními jednotkami obecného vzorce (II), výhodněji je nahrazeno od 0,9 do 2 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (L) monomerními jednotkami obecného vzorce (II).

V závislosti na způsobu přípravy uvedeného polymerního konjugátu může tento po navázání hydrofobně-aktivní kotvy jako postranní řetězce obsahovat rezidua aktivních esterů (například thiazolidin-2-thionovou skupinu). Tyto aktivní skupiny se odstraní reakcí s aminoalkoholem, což dává vzniknout monomerním jednotkám obecného vzorce (III) nebo (IV). V tomto provedení tedy polymerní konjugát dále obsahuje kromě monomerních jednotek obecného vzorce (I) a/nebo (II) ještě monomerní jednotky obecného vzorce (III) a/nebo (IV)

(III) n—ch₂—ch₂ c=o ch₂ co i⁴ (IV), kde R¹ je definováno výše;

a R⁴ je vybrané ze skupiny sestávající z -NH-(CH2)_X-CH2(OH); -NH-(CH2)_y-CH(OH)-CH3; NH-(CH₂)y-CH(OH)-(CH₂)z-CH3; a-NH-C(=O)-CH₃;kdexje celé číslo od 0 do 4,yje celé číslo

- 10CZ 2022-167 A3 od 0 do 3 a z je celé číslo od 1 do 4; přičemž platí, že pokud X není kovalentní vazba, je skupina R⁴ navázaná přes svou koncovou -NH- skupinu ke koncové karbonylové skupině spojky X.

Množství monomerních jednotek základního lineárního polymeru, které jsou statisticky nahrazené polymerními jednotkami obecného vzorce (III) a/nebo (IV) je od alespoň jedné monomerní jednotky do 15 % mol. monomerních jednotek, s výhodou od 1 % mol. do 12 % mol. monomerních jednotek, výhodněji od 5 do 9,5 % mol. monomerních jednotek.

V jednom provedení je hydrofobně-aktivní kotva -X’-R² v polymerním konjugátu navázána jako alespoň jedna koncová skupina základního lineárního polymeru.

V jednom výhodném provedení, kdy je hydrofobně-aktivní kotva -X’-R² v polymerním konjugátu navázána jako koncová skupina základního lineárního polymeru, je skupinou -X’-R² skupina:

-S-(CH₂)_a-CH-((CH₂)_b-CH₃)₂; -S-(CH₂)_b-(CH=CH-CH₂)_a-(CH₂)_b-CH₃; kde a je celé číslo od 0 do 4, Z? je celé číslo od 4 do 17.

Nejvýhodněji je skupinou -X’-R² skupina -S-C(=S)-S-(CH₂)n-CH₃.

V jednom provedení je jako základní lineární polymer použit polyakrylamid, polymethakrylamid, polyakrylát, polymetakrylát, poly(N-(2-hydroxypropyl)methakrylamid) (monomerní jednotky obecného vzorce (K)). V tomto provedení obsahuje polymerní konjugát právě jednu hydrofobněaktivní kotvu, která je přes skupinu X‘ navázána najeden konec základního lineárního polymeru, přičemž uvedený polymerní konjugát má obecný vzorec (A)

(A) kde

X‘ je definována výše; s výhodou X‘ je -S-C(=S)-;

R'jeHnebo CH₃;

R² je definováno výše, s výhodou R² je -S-(CH₂)_a-C-((CH₂)_b-CH₃)₂ nebo -S-(CH₂)_b-(CH=CHCH₂)_a-(CH₂)_b-CH₃; kde a je celé číslo od 0 do 4, bje celé číslo od 4 do 17.

R³ je definováno výše.

Druhá koncová skupina polymerního konjugátu obecného vzorce (A) je definována výše, CHj CHj s výhodou je druhou koncovou skupinou ^CN nebo ^{CN 0} , kde R je definováno výše. Nejvýhodněji je druhou koncovou skupinou

nebo

CN O o

-<! -C H₃-CH í-é —Η N—CHj-CHj-NH -ΐ.

<Jh₃

H H

- 11 CZ 2022-167 A3

V provedení, ve kterém je jako základní lineární polymer použit 2-polyoxazolín (monomerní jednotky obecného vzorce (L)), má v jednom provedení polymerní konjugát obecný vzorec (A j

R²—X-

—CH₂-CH₂ c=o

R¹ (A’), kde R² a X’ jsou definovány stejně jako u vzorce (A); R’ je -CH3 nebo -CH2CH3. Koncová skupina polymerního konjugátu obecného vzorce (A j je definovaná stejně jako u vzorce (A).

V jednom provedení je hydrofobně-aktivní kotva -X’-R² v polymerním konjugátu navázána na obou koncích základního lineárního polymeru, sestávajícího z monomerních jednotek (K) a/nebo (L). Skupiny X’ a R² jsou definovány výše. V tomto provedení je s výhodou hydrofobně-aktivní kotva -X’-R² vybraná ze skupiny zahrnující: -S-(CH2)_a-CH-((CH2)b-CH3)2 a -S-(CH2)b-(CH=CH-CH2)_a-(CH2)b-CH3; kde a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 4 do 17.

Nejvýhodněji je skupinou -X’-R² skupina -S-C(=S)-S-(CH2)n-CH3.

Ve výhodném provedení může polymerní konjugát obsahovat kromě hydrofobně-aktivní kotvy dále “interakce-snižující ligand”, zvyšující blokační aktivito celého blokátoru, a/nebo biospecifickou kotvu. V obou případech jsou tyto řetězce připojeny k polymernímu konjugátu jako postranní řetězce monomerních jednotek. Jako bio-specifická kotva může sloužit například biotin,

His6 nebo tris-nitrilooctová kyselina. Interakce-snižujícím ligandem je například aminocyklooktyl, aminoquinuclidin nebo norbornenyl.

V tomto provedení tedy polymerní konjugát podle předkládaného vynálezu má dále od alespoň jedné monomerní jednotky do 10 % mol. monomerních jednotek základního lineárního polymeru statisticky nahrazeno monomerními jednotkami obecného vzorce (V) a/nebo (VI)

R (V)

CO ch₂ ch₂ co

I R (VI), kde

- 12 CZ 2022 - 167 A3

R¹ je H nebo CH3;

R je definováno výše;

X je kovalentní vazba nebo spojka vzorce -NH-(CH2)n-C(=O); -NH(CH2-CH2-O)o-CH2-CH2-C(=O)-; -O-(CH2-CH2-O)o-CH2-CH2—C(=O)-;

nebo -NH-(CH2)q(C(=O)-NH-(CH2)r)p—C(=O)-; přičemž n je celé číslo od 1 do 7; o je celé číslo od 1 do 15;p, q a r jsou vzájemně nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z 1, 2 a 3;

přičemž -CH2- skupiny X mohou být dále nezávisle substituovány jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny;

přičemž platí, že pokud X není kovalentní vazba, je navázané přes svou koncovou -NH- nebo

-O- skupinu ke koncové karbonylové skupině monomerní jednotky obecného vzorce (V).

V jednom provedení obsahuje polymerní konjugát od 80 do 99 % mol. monomerních jednotek (K) nebo (L) základního lineárního polymeru, s výhodou od 85 do 98 % mol. monomerních jednotek (K) nebo (L) základního lineárního polymeru.

V jednom provedení obsahuje polymerní konjugát od 0,5 do 5 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (I) a/nebo (II), s výhodou od 0,7 do 3,5 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (I) a/nebo (II), výhodněji od 0,9 do 2 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (I) a/nebo (II).

V jednom provedení obsahuje polymerní konjugát od 0 do 15 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (III) a/nebo (IV), s výhodou od alespoň jedné monomerní jednotky do 12 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (III) a/nebo (IV), výhodněji od 1 % mol. do 9,5 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (III) a/nebo (IV).

V jednom provedení obsahuje polymerní konjugát od 0 do 10 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (V) a/nebo (VI), s výhodou od 0 do 5 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (V) a/nebo (VI), výhodněji od 0,5 do 3,5 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (V) a/nebo (VI), výhodněji od 0,7 do 2,5 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (V) a/nebo (VI).

Ve výhodném provedení obsahuje polymerní konjugát od 65 do 99,5 % mol. monomerních jednotek základního lineárního polymeru (monomerní jednotky obecného vzorce (K) a/nebo (L)), od 0,5 do 10 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (I) a/nebo (II), od 0 do 10 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (V) a/nebo (VI), a od 0 do 15 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (III) a/nebo (IV).

S výhodou obsahuje polymerní konjugát od 78,0 do 99,3 % mol. monomerních jednotek základního lineárního polymeru, od 0,7 do 5 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (I) a/nebo (II), od 0 do 5 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (V) a/nebo (VI), a od 0 do 12 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (III) a/nebo (IV).

S výhodou obsahuje polymerní konjugát od 81 do 98,8 % mol. monomerních jednotek základního lineárního polymeru, od 0,7 do 3,5 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (I) a/nebo (II), od 0,5 do 3,5 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (V) a/nebo (VI), a od 0 do 12 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (III) a/nebo (IV).

V jednom provedení obsahuje polymerní konjugát od 98 do 99,1 % mol. monomerních jednotek základního lineárního polymeru, od 0,9 do 2 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (I) a/nebo (II).

- 13 CZ 2022-167 A3

V jednom provedení má polymerní konjugát obecný vzorec (B)

R1	R1	R1	R1 \ । 1
ch2—c—/—ch2	-c— 1 — ch2	I -C—/	—ch2—c— 1 '
c=o	c=o	c=o	c=o
R3	1 X	I X	1 X
	1 5 Rz	R4	1 R
	(B),

kde

R¹ je H nebo CH₃;

R³ je vybráno ze skupiny sestávající z -NH-CH2-CH(OH)-CH3, -NH-CH2CH2-OH, -NHCH2CH2CH2-OH, -NHC(CH2OH)3, -NHCH(CH2OH)2, -NH-CH2CH2-N⁺(CH3)₃Cr,

-O-CH₂CH₂-OH, -O-(CH₂CH₂O)₂-H; -O-(CH₂CH₂O)₃-H, -O-CH₂CH₂-N⁺(CH₃)₃Cr;

Xje kovalentní vazba nebo spojka vzorce -NH-(CH₂)_n-C(=O)-; -NH-(CH₂-CH₂-O)_o-CH₂-CH₂C(=O)-; -O-(CH₂-CH₂-O)_o-CH₂-CH₂-C(=O)-; nebo -NH-(CH₂)_q(C(=O)-NH-(CH₂)_r)_pC(=O)-; přičemž n j e celé číslo od 1 do 7; o j e celé číslo odl do I 5; /7, a r j sou vzáj emně nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z 1, 2 a 3; a přičemž -CH₂- skupiny X mohou být dále nezávisle substituovány jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny;

R² je definované výše

R⁴ je definované výše;

R je definované výše;

přičemž platí, že pokud X není kovalentní vazba, jsou skupiny R₂, R4 a R navázané přes svou koncovou -S- nebo -NH- nebo -O- skupinu nebo přes uhlíkový atom (v případě, že R₂ je fenyl) ke koncové karbonylové skupině spojky X;

a přičemž koncové skupiny statistického lineárního kopolymeru obecného vzorce (B) jsou definovány výše. Monomerní jednotky v obecném vzorci (B) odpovídají monomerním jednotkám obecného vzorce (K), (I), (III) a (V), jejichž zastoupení je s výhodou následující: od 81 do 98,8 % mol. monomerních jednotek (K), od 0,7 do 3,5 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (I), od 0,5 do 3,5 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (V) a od alespoň jedné monomerní jednotky do 12 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (III).

V jiném provedení je polymerním konjugátem statistický lineární kopolymer obecného vzorce (C)

- 14 CZ 2022-167 A3

CO I	CO I	CO I
1 CH, I	1 CH,	1 ch2
1 ch2 i	1 ch2	1 ch2
1 co	1 co I	1 co I
l2 Rz	R4	1 R

(C),

kde

R’ je -CH₃ nebo -CH₂CH₃;

R² je definované výše;

R⁴ je definované výše;

R je definované výše;

přičemž koncové skupiny statistického lineárního kopolymeru obecného vzorce (C) jsou definovány výše. Monomerní jednotky v obecném vzorci (C) odpovídají monomerním jednotkám obecného vzorce (L), (II), (IV) a (VI), jejichž zastoupení je s výhodou následující: od 81 do 98,8 % mol. monomerních jednotek (L), od 0,7 do 3,5 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (II), od 0,5 do 3,5 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (VI) a od alespoň jedné monomerní jednotky do 12 % mol. monomerních jednotek obecného vzorce (IV).

Předmětem předkládaného vynálezu je dále způsob přípravy polymerního konjugáta, který obsahuje následující kroky:

0) poskytnutí monomerů lineárního kopolymeru;

i) polymerace monomerů lineárního kopolymeru, a to buď roztokovou nebo srážecí radikálovou polymerací nebo RAFT polymerací nebo kationtovou polymerací za otevření kruhu;

ii) navázání hydrofobní kotvy, popřípadě hydrofobně-podpůrné kotvy na lineární kopolymer za vzniku konjugáta;

iii) popřípadě navázání bio-specifické kotvy.

Uvedené polymerní konjugáty na bázi vinylických nebo cyklických monomerů jsou připraveny buď klasickou radikálovou roztokovou nebo srážecí polymerizací nebo kontrolovanou RAFT polymerizací nebo kationtovou polymerizací za otevření kruhu.

Prekurzory polymerních konjugáta popsaných výše jsou s výhodou připravovány klasickou radikálovou polymerací, roztokovou i srážecí, nebo kontrolovanou RAFT polymerací, či kationtovou polymerizací za otevření kruhu monomerů obecného vzorce (W), (X), (Y), (Z) a (T)

R¹

CH₂—C c-o (W)

- 15 CZ 2022-167 A3

R¹

CH 2— C c=o

X

R⁷ (Y)

R¹

I ch₂=c c=o

X

R² (Z)

R¹

I ch₂=c c=o

I

X

R (T), kde R¹ je H nebo CH3;

R³ je vybráno ze skupiny sestávající z -NH-CH2-CH(OH)-CH3, -NH-CH2CH2-OH, -NHCH2CH2CH2-OH, -NH-C-(CH2OH)3, -NH-CH-(CH2OH)2, -NH-CH2CH2-N⁺(CH3)₃CF,

-O-CH₂CH₂-OH, -O-CH-(CH₂CH₂O)₂-H; -O-C-(CH₂CH₂O)₃-H, -O-CH₂CH₂-N⁺(CH₃)₃CF;

R’ je -CH₃ nebo -CH₂CH₃ nebo -(CH₂)₂(C=O)OCH₃;

R² je vybrané ze skupiny sestávající z: fenyl; -S-(CH₂)_a-CH-((CH₂)b-CH₃)₂; -S-(CH₂)b(CH=CH-CH₂)_a-(CH₂)_b-CH₃; -NH-(CH₂)_b-CH₃; -NH-(CH₂)_b-(CH=CH-CH₂)_a-(CH2)_b-CH₃; O-(CH₂)_b-CH₃; -O-(CH₂)_a-C-((CH₂)_b-CH₃)₂; -NH-(CH₂)_a-C-((CH₂)_b-CH₃)₂; -O-(CH₂)_b(CH=CH-CH₂)_a-(CH₂)_b-CH₃; a -O-C(=O)-(CH₂)_a-CH-((CH₂)_b-CH₃)₂; přičemž a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 4 do 17;

přičemž pokud X není kovalentní vazba, je skupina R² je navázaná přes svou koncovou -Snebo -NH- nebo -O- skupinu nebo přes uhlík (v případě fenylu) ke koncové karbonylové skupině spojky X;

X je kovalentní vazba nebo spojka vzorce -NH-(CH₂)_n-C(=O)-; -NH-(CH₂-CH₂-O)_o-CH₂CH₂-C(=O)-; -O-(CH₂-CH₂-O)_o-CH₂-CH₂-C(=O)-; nebo -NH-(CH₂)_q(C(=O)-NH-(CH₂)_r)_pC(=O)-; navázaná přes svou koncovou -NH- nebo -O- skupinu ke karbonylové skupině monomeru obecného vzorce (Y) nebo (Z) nebo (T), přičemž n je celé číslo od 1 do 7; oje celé číslo od 1 do 15;p, qa r jsou vzájemně nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z 1, 2 a 3;

přičemž -CH₂- skupiny X mohou být dále nezávisle substituovány jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny;

R⁷ je vybraný z

- 16CZ 2022-167 A3

R je definované výše;

přičemž krok i) se provede roztokovou nebo srážecí radikálovou kopolymerací nebo RAFT polymerací monomerů obecného vzorce (W) a (Y) a/nebo (Z) a/nebo (T);

nebo kationtovou kopolymerizací za otevření kruhu v případě monomeru obecného vzorce (X);

přičemž celkový obsah komonomerů obecného vzorce (X), kde R’ je -(CH2)2(C=O)OCH3, (Y), (Z) a (T) je v rozmezí od 0,5 do 20 % mol., vztaženo na celkový počet monomerů; a přičemž reakce se provede při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C, s výhodou 40 až 80 °C, a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, A,A-dimethylacetamid, N,Ndimethylformamid, sulfolan, methanol, ethanol, dioxan, tetrahydrofůran, propanol, isopropanol, terc-butanol, A-vinylpyrolidon, aceton, voda a vodné pufry nebo jejich směsi;

za vzniku lineárního kopolymeru.

Volitelně, pokud R’ je -(CH2)2(C=O)OCH3, následuje krok hydrolýzy methylesterové skupiny substituentu R’ a následná reakce s thiazolidin-2-thionem za vzniku reaktivního postranního řetězce obsahujícího thiazolidin-2-thionovou skupinu.

Popřípadě se následně konjugují skupiny R⁷ a/nebo thiazolidin-2-thionové skupiny lineárního kopolymeru s hydrofobním molekulou obecného vzorce R²-H, kde R² je definováno výše, za vzniku polymerního konjugátu, obsahujícího hydrofobně-aktivní kotvu navázanou amidovou nebo esterovou vazbou ke karbonylové skupině postranního řetězce monomerní jednotky.

Skupiny R⁷ a/nebo thiazolidin-2-thionové skupiny lineárního kopolymeru se popřípadě současně s předchozím krokem nebo následně konjugují s nejvýše 10 % mol. (0 až 10 % mol.), vztaženo na celkový počet monomerů, biospecifické skupiny vzorce R-H, kde R je definované výše, za vzniku polymerního konjugátu, obsahujícího biospecifickou skupinu R navázanou amidovou nebo esterovou vazbou ke karbonylové skupině postranního řetězce monomerní jednotky.

Případné nezreagované reaktivní skupiny R⁷ a/nebo thiazolidin-2-thionové skupiny se odstraní reakcí s aminoalkoholem, vybraným ze skupiny zahrnující NH2-(CH2)_X-CH2(OH); NH2-(CH2)_yCH(OH)-CH₃; NH₂-(CH2)y-CH(OH)-(CH₂)z-CH3; kde x je celé číslo od 0 do 4,yje celé číslo od 0 do 3 a z je od 1 do 4; s výhodou je aminoalkoholem l-aminopropan-2-ol.

V jednom provedení se polymerní konjugát podle předkládaného vynálezu připraví klasickou radikálovou polymerací, roztokovou i srážecí, nebo kontrolovanou RAFT polymerací monomerů obecného vzorce (W) a (Z), přičemž obsah monomerů obecného vzorce (Z) v reakční směsi je v rozmezí od 0,5 do 10 % mol., s výhodou od 0,5 do 5 % mol., z celkového množství monomerů v reakční směsi.

V jednom provedení se polymerní konjugát podle předkládaného vynálezu připraví klasickou radikálovou polymerací, roztokovou i srážecí, nebo kontrolovanou RAFT polymerací monomerů

- 17CZ 2022-167 A3 obecného vzorce (W), (Z) a (T), přičemž obsah monomerů obecného vzorce (Z) v reakční směsi je v rozmezí od 0,5 do 10 % mol. z celkového množství monomerů v reakční směsi a obsah monomerů obecného vzorce (T) v reakční směsi je v rozmezí od 0,5 do 10 % mol., s výhodou od 0,5 do 5 % mol., z celkového množství monomerů v reakční směsi.

V jednom provedení se polymerní konjugát podle předkládaného vynálezu připraví kationtovou polymeraci za otevření kruhu monomerů obecného vzorce (X), kdy R’ je u jednoho monomeru CH3 nebo -CH2CH3 a u druhého monomeru je R’-(CH2)2(C=O)OCH3, přičemž obsah monomerů obecného vzorce (X), kde R’je -(CH2)2(C=O)OCH3 je v reakční směsi v rozmezí od 0,5 do 10 % mol. z celkového množství monomerů v reakční směsi.

V jednom provedení se polymerní konjugát podle předkládaného vynálezu připraví klasickou radikálovou polymeraci, roztokovou i srážecí, nebo kontrolovanou RAFT polymeraci monomerů obecného vzorce (W) a (Y), přičemž obsah monomerů obecného vzorce (Y) v reakční směsi je v rozmezí od 0,5 do 20 % mol. z celkového množství monomerů v reakční směsi. Reaktivní skupiny R⁷ monomeru (Y) umožňují navázání funkčních molekul (hydrofobně-aktivních kotev, bio-specifických molekul, interakce-snižujících ligandů). Funkční molekuly jsou navázány kovalentní amidickou nebo esterovou vazbou, která vzniká reakcí reaktivních skupin R7 zavedených do polymerů s aminoskupinami nebo hydroxy skupinami funkčních molekul. Jako rozpouštědlo je s výhodou využit DMA, DMF, DMSO nebo metanol.

V jiném provedení se polymerní konjugát podle předkládaného vynálezu připraví způsobem, obsahujícím následující kroky:

i) polymerace monomerů obecného vzorce (W), definovaných výše, přičemž krok i) se provede RAFT polymeraci při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C, s výhodou 40 až 80 °C, a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, A,A-dimethylacetamid, N,Ndimethylformamid, sulfolan, methanol, ethanol, dioxan, tetrahydrofůran, propanol, isopropanol, terc-butanol, A-vinylpyrolidon, aceton, voda a vodné pufry nebo jejich směsi;

v přítomnosti přenosového činidla obecného vzorce R⁸-X“-E, kde R⁸ je fenyl, -S-(CH₂)_a-CH-((CH₂)b-CH3)2; -S-(CH₂)b-(CH=CH-CH₂)_a-(CH₂)b-CH3; -S(CH2)b-CH3; přičemž a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 4 do 17;

X” je -S-C(=S)-; přičemž skupina R⁸ je navázaná přes svou koncovou -S- skupinu nebo přes uhlík (v případě fenylu) k thiokarbonylové skupině spojky X”; a

E je koncová skupina vybraná z:

ch3	ch3 1	cn3 ch3	ch3 1	O //
—c ch3 i 3	—c ch2	—c ch2-ch	—c ch2-ch2	—c \
CN	, CN CH’	CN ^Η3 CH3	- CN	R
ch3	0 -c(	Ch3 O	ch3 ch3 1 1
—c—ch2	—c ch2 c ch3	—c ch2 c	ch3
ch3	o—ch3	CN CH3	1 a CH3 CH3

kde R je definované výše, s výhodou je R vybrané ze skupiny sestávající z OH,

- 18 CZ 2022-167 A3

Tímto způsobem se připraví polymerní konjugát obecného vzorce (A).

Přenosovým činidlem R⁸-X“-E je s výhodou 2-kyanoprop-2-yl-dodecyltrithiokarbonát nebo N[2-[5-[(3aR,4R,6aS)-2-oxo-l,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4yl]pentanoylamino]ethyl]-4-cyano-4-dodecylsulfanylcarbothioylsulfanyl-pentanamid.

A-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA) a další monomery akrylamidového, methakrylamidového, akrylátové a metakrylátové typu (monomery obecného vzorce (W)) jsou komerčně dostupné.

Látky vzorce (Y) a (Z) byly připraveny podle postupů uvedených literatuře (Subr, V. and K. Ulbrich, Synthesis and properties of new N-(2-hydroxypropyi)methacrylamide copolymers containing thiazolidine-2-thione reactive groups. React. Funct. Polym., 2006. 66: p. 1525-1538; Ulbrich, K., et al., Targeted Drug Delivery with Polymers and Magnetic Nanoparticles: Covalent and Noncovalent Approaches, Release Control, and Clinical Studies. Chemical Reviews, 2016. 116(9): p. 5338-5431). Látky vzorce (X) byly připraveny dle postupů uvedených v literatuře (Glassner, Μ., M. Vergaelen and R. Hoogenboom, Poly(2-oxazoline)s: A comprehensive overview cfpolymer structures and their physical properties. Polymer International, 2018, 67(1), 32-45).

- 19CZ 2022 - 167 A3

Látky vzorce (T) byly získány postupem, kdy se 3-methakrylamidopropanová kyselina (Ma- β Ala-OH) a amin obecného vzorce NH2-R (kde R je definováno výše) rozpustí v dichlormethanu a k roztoku se přidá katalytické množství 4-dimethylaminopyridinu (DMAP) a postupně N-(3dimethylaminopropyl)-N-ethylkarbodiimid hydrochlorid (EDGHCl). Reakční směs se míchá po dobu 4 hodin při laboratorní teplotě. Následně se reakční směs naředí dichlormethanem (DCM) a extrahuje destilovanou vodou. Organická fáze se usuší Na2SO4, vakuově zahustí a krystaluje v mrazničce. Vzniklé krystaly látky vzorce (T) se odfiltrují, promyjí chladným CHCE a suší ve vakuu.

Klasická roztoková nebo srážecí polymerace je iniciována iniciátorem 2,2 -azobis(2methylpropionitril) ABIN nebo 2,2'-azobis[ N-(2-karboxyethyl)-2-methylpropionamidine] (V-70). Lineární kopolymer z kroku i) je pak zakončen zbytkem z radikálu vzniklého rozpadem použitého iniciátoru.

RAFT polymerace je iniciována iniciátorem, s výhodou vybraným ze skupiny zahrnující V-70, AIBN, ABIK a ABIK-Biotin, kde ABIK-Biotin je N-[2-[5-[(3aS,4S,6aR)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6ahexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]ethyl]-4-[(E)-[4-[2-[5-[(3aS,4S,6aR)-2oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]ethylamino]-1 -cyano-1 methyl-4-oxo-butyl]azo]-4-cyano-pentanamid, za přítomnosti přenosového činidla, s výhodou CTA-dodecylamin-biotin nebo CTA-dodecyl-COA, kde CTA-dodecylamin-biotin je N-[2-[5[(3aS,4S,6aR)-2-oxo-1,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]ethyl]4-cyano-4-dodecylsulfanylcarbothioylsulfanyl-pentanamid a CTA-dodecylamin-COA je 4-cyanoN-cyclooctyl-4-dodecylsulfanylcarbothioylsulfanyl-pentanamid.

V jednom z případů je připraven RAFT polymerací telechelický polymer, který již obsahuje na alfa-konci hydrofobně-aktivní kotvu a na omega-konci buď interakce-snižující ligand nebo biospecifickou kotvu.

Navázání hydrofobní kotvy na lineární kopolymer z kroku i) za vzniku polymerního konjugátu se provede konjugací reaktivních skupin na polymeru, např. R⁷ nebo thiazolidin-2-thionových (TT) skupin monomerních jednotek po zabudování monomeru obecného vzorce (Y), popsaného výše, s hydrofobně aktivní kotvou (prekurzorem obecného vzorce R²-H, kde R² je definováno výše, například nízkomolekulárním hydrofobním alifatickým řetězcem), který obsahuje vhodné reaktivní skupiny (například aminovou nebo hydroxylovou skupinu nebo SH skupinu); přičemž nízkomolekulárním alifatickým hydrofobním řetězcem je řetězec, který má molekulovou hmotnost v rozmezí od 100 do 400 g/mol. Hydrofobní kotva je tedy k lineárnímu kopolymeru navázána amidovou nebo esterovou vazbou mezi karbonylovou skupinou monomerní jednotky (Y) a -NHnebo -O- skupinou X, vzniklou reakcí reaktivních skupin na polymeru, aktivovaných karboxylů s aminoskupinami nebo hydroxy skupinami řetězce hydrofobní kotvy.

Případné nezreagované reaktivní skupiny kopolymeru, např. TT skupiny, se mohou odstranit reakcí s aminoalkoholem, vybraným ze skupiny zahrnující NH2-(CH2)a-CH2(OH); NH2-(CH2)b-CH(OH)CH3; NH2-(CH2)b-CH(OH)-(CH2)c-CH3; kde a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 0 do 3 a c je od 1 do 4; s výhodou s 1-aminopropan-2-olem, a/nebo se nezreagované NH2 skupiny mohou odstranit reakcí s acetythiazolidin-2-thionem.

Může následovat volitelný krok přečištění kolonovou chromatografií a lyofilizace výsledného produktu z předchozího kroku.

Případný interakce-snižující ligand je navázán analogicky.

Volitelná modifikace makromolekulárního blokátoru bio-specifickou molekulou umožňuje selektivní interakci s některými složkami imunoanalytického systému a jejich uchycení na pevnou fázi. Navázání bio-specifické kotvy na lineární kopolymer se provede konjugací reaktivních skupin na polymeru, např. thiazolidin-2-thionových (TT) skupin monomerních jednotek po zabudování

- 20 CZ 2022-167 A3 monomeru obecného vzorce (Y), popsaného výše, s bio-specifickou kotvou (např. derivátem biotinu), který obsahuje vhodné reaktivní skupiny (například aminovou nebo hydroxylovou skupinu); přičemž kotvou je molekula s molekulovou hmotnost v rozmezí od 80 do 1000 g/mol. Případná molekula kotvy je k lineárnímu kopolymeru navázána amidovou nebo esterovou vazbou vzniklou mezi reaktivními skupinami lineárního kopolymeru a vázanou kotvou, například aktivované karboxyly, a aminoskupinami nebo hydroxylovými skupinami bio-specifických kotev.

V jedné z variant je syntetickým makromolekulárním blokátorem telechelický vinylický kopolymer, ve kterém jsou funkční součásti, hydrofobní kotva, interakce-snižující ligand a/nebo bio-specifická kotva, připojeny k tomuto vinylickému syntetickému homopolymeru na oba konce jeho hlavního polymerního řetězce. V jednom provedení je jako základní lineární polymer použita monomerní jednotka obecného vzorce (K) a tvoří tedy polymerní konjugát obecného vzorec (A”) (A”), kde R¹ a R³ jsou definovány výše;

f^H3 O —c ch₂—ch₂—c^z

I \

R

R² je nezávisle vybrané ze skupiny sestávající z: CN · -S-C(=S)-CeH5,- S-C(=S)-S-(CH₂)_a-CH-((CH₂)_b-CH₃)₂; -S-C(=S)-S-(CH₂)_b-(CH=CH-CH₂)_a-(CH₂)_b-CH₃; -SC(=S)-S-(CH₂)b-CH₃; přičemž a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 4 do 17;

a R je definováno výše, s výhodou je R

Telechelické polymery obecného vzorce (A”) jsou tedy složeny pouze z monomerních jednotek (K), definovaných výše, a konce hlavních řetězců jsou zakončeny skupinami R²’, přičemž alespoň jeden konec hlavního řetězce je zakončený skupinou -S-C(=S)-S-(CH₂)_a-C((CH₂)_b-CH₃)₂ nebo -S-C(=S)-S-(CH₂)_a-(CH=CH-CH₂)_a-(CH₂)_b-CH₃ nebo -S-(CH₂)_b-CH₃; kde a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 4 do 17.

Připojení fůnkčních molekul je ve všech případech realizováno pomocí kovalentních vazeb mezi reaktivními skupinami na fůnkčních molekulách s reaktivními skupinami na kopolymerech nebo homopolymerech. S výhodou je využito reakce aminoskupin nebo hydroxylových skupin lokalizovaných na fůnkčních molekulách s aktivovanými karboxylovými skupinami na kopolymerech.

-21 CZ 2022 - 167 A3

V jednom provedení je polymerním konjugátem kopolymer na bázi 2-oxazolínů. Vodorozpustný kopolymer na bázi poly(2-methyl-2-oxazolin)u nebo poly(2-ethyl-2-oxazolin)u (monomerních jednotek (X)) je připraven pomocí kationtové polymerizace za otevření kruhu. Polymerizace je iniciována iniciátorem vybraným ze skupiny: methyl tosilate nebo 2-phenyl-2-oxazolinium tetrafluoroborate. Kopolymer obsahující karboxylové skupiny vhodné pro navázání lze připravit buď přímou kopolymerací s monomerní jednotkou obsahující karboxylovou skupinu nebo metylester karboxylové kyseliny (monomerní jednotka (X), kde R’ je -(CH2)2(C=O)OCH3) nebo kyselou hydrolýzou homopolymeru, kdy je převedena část monomerních oxazolinových jednotek na etyliminové, na které je poté pomocí polymeranalogické reakce zavedena karboxylová skupina. Karboxylové skupiny, které obsahuje polymerní prekurzor, jsou v následujícím kroku aktivovány na aminoreaktivní skupiny viz výše, např. TT zavedené pomocí polymeranalogické reakce s thiazolidin-2-thionem. Takto aktivovaný polymerní prekurzor je v dalším kroku využit pro aminolytickou reakci s funkčními součástmi obecného vzorce R²-H, a popřípadě R-H, kde R a R² jsou definovány výše. Tyto funkční molekuly jsou připojeny k tomuto syntetickému kopolymeru do jeho bočních řetězců, viz obecný vzorec (C) popsaný výše.

Hlavní aktivní skupinou je “hydrofobně-aktivní” kotva (skupina R²), která zajišťuje aktivitu celého polymerního konjugátu jako blokátoru nespecifických interakcí a vhodného materiálu pro saturaci povrchů pevné fáze imunotestů. Aktivita polymerního konjugátu je dále navýšena pomocí interakce-snižujícího ligandu (skupina R), který synergicky v souladu s hydrofobně-aktivní kotvou zvyšuje blokační a saturační schopnost celého syntetického blokátoru nespecifických interakcí.

Variantně je na kopolymer také kovalentně připojena “biospecificky se vážící” kotva (skupina R, obsahující biotin, tris-NTA), která umožňuje využití kopolymeru jako bispecifického činidla s funkcí adherentní kotvy pro imobilizaci na pevnou fázi imunotestů jako jsou např. zkumavky, jamky mikrotitrační destičky, paramagnetické částice apod., a zároveň imobilizující další molekuly skrze vazbu na “biospecificky se vážící” kotvu. Jako vhodné biospecifické vazebné skupiny mohou být vybrány sloučeniny vázající některou z komerčně dostupných proteinových (purifikačních) značek (tagů), jako je např. tris-nitriltrioctová kyselina (tris-NTA) vážící oligohistidinové tagy. Vazebnou skupinou může být např. biotin, který díky velmi silné interakci biotinavidin/streptavidin/neutravidin umožní celý kopolymer využít posléze pro imobilizaci biomolekul jako jsou specifické protilátky či antigeny nejrůznějších M.W.

Všechny funkční molekuly mohou být na kopolymer připojeny prostřednictvím spojek, které jsou na bázi alifatických aminokyselin s 2 až 7 jednotkami CH2, klasických aminokyselin, oligopeptidů, nebo oligoPEGu. Spojka umožňuje omezení stérického bránění funkčních molekul tak, aby mohly vhodně interagovat s ostatními molekulami nebo povrchem destičky imunotestu. S výhodou je spojka vybrána ze skupiny zahrnující spojky na bázi alifatických aminokyselin a klasických aminokyselin a oligopeptidů.

Polymerní konjugáty dle předkládaného vynálezu (syntetické makromolekulární blokátory nespecifických interakcí) mají oproti v současnosti používaným proteinovým blokátorům na živočišné bázi několik výhod. Příprava makromolekulárního blokátoru je poměrně snadná a založená na kontrolovaném polymerizačním principu a příprava jednotlivých polymerních prekurzorů a finálních blokátorů je vysoce reprodukovatelná. Jedná se o syntetický kopolymer, který není živočišného původu. Vzhledem k metodě přípravy se jedná o produkt s naprosto reprodukovatelnými vlastnostmi.

Blokátor může být využit především jako reduktant nespecifických interakcí analyzované složky a dalších komponent tvořících analytický systém na povrch pevné fáze. Blokátor je přítomen v roztoku v nadbytku a interaguje s povrchem pevné fáze i ostatními složkami v roztoku, a tím potlačuje nespecifické interakce analytu a dalších složek, což by vedlo k ovlivnění výsledku testu. Blokátor může být využit v imunochemických metodách jakéhokoliv principu využívajících pevnou fázi jakékoliv formátu (paramagnetické částice, jamky mikrotitrační destičky, zkumavky, kuličky, apod.). Vedle využití jako blokátor, může být komolymer také využit k cílenému navázání některé složky imunoanalytického systému na pevnou fázi.

- 22 CZ 2022 - 167 A3

Makromolekulární blokátory jsou s výhodou využitelné v imunochemických nebo obdobných metodách, s výhodou vybraných z metod stanovení s luminiscenční, chemiluminiscenční, fluorescenční, radioaktivní, či enzymatickou detekcí, popřípadě stanovení využívající značení koloidními kovy. S výhodou v metodách Luminiscenční imunoanalýza (LIA), Imunoluminometrická analýza (ILMA), Chemiluminiscenční imunoanalýza (CLIA), Imunochemiluminometrická analýza (ICMA), Elektrochemiluminiscenční analýza (ECL), Fluorescenční imunanalýza (FIA), Imunofluorometrická analýza (IFMA), Radioaktivní imunoanalýza (RIA), Imunoradiometrická analýza (IRMA), Enzymová imunoanalýza (EIA), Imunoenzymometrická analýza (IEMA), metodách průtokové cytometrie, Immunohistochemie (IHC), či Western blottingu (WB).

Předmětem předkládaného vynálezu je tedy rovněž použití polymerního konjugátu v imunochemických metodách jako blokátoru nespecifických interakcí analytu a dalších složek analytického systému s pevnou fází a popřípadě pro zachycení specifických protilátek nebo antigenů či jiných molekul na povrch pevné fáze, zejména ve výše uvedených imunochemických metodách.

Kopolymery jsou navrženy jako vysoce aktivní syntetické makromolekulární inhibitory nespecifických interakcí v analytických stanoveních využívajících jakýkoliv detekční signál (radioaktivita, kolorimetrie, fluorescence, luminiscence, turbidimetrie, apod.).

Shrnutí

Makromolekulární blokátor nespecifických interakcí podle vynálezu je funkční molekulou, která slouží v testech jako blokátor nespecifických interakcí analytu a dalších složek analytického systému s pevnou fází a významně tak snižuje nespecifické interakce ve stanovení. Blokátor může být také použit pro cílené zachycení specifických protilátek nebo antigenů či jiných molekul na povrch pevné fáze. Makromolekulární blokátor je syntetického původu a jeho příprava je vysoce definovaná. Aktivita blokátoru je založena na kombinaci dvou kotev, kdy základní hydrofobní kotva způsobuje vysokou afinitu k pevné fázi a omezuje hydrofobní nespecifické interakce v samotném roztoku a interakce-omezující ligand přidává celému makromolekulárnímu blokátoru přidanou funkcionalitu, která se projeví v navýšení jeho blokační aktivity.

Předkládaný vynález umožní nahrazení proteinů živočišného původu syntetickým makromolekulárních blokátorem, který je nejenom účinnější v samotné blokační aktivitě, ale je také definovaný ve své struktuře, má vysokou reprodukovatelnost mezi jednotlivými šaržemi a není ho nutné testovat na přítomnost virů a jiných patogenů.

Předkládaný vynález umožňuje zlepšit výsledky a průběh stanovení v rámci imunotestů a podobných diagnostických stanovení. Makromolekulární blokátor v rámci stanovení nahrazuje jak část odpovídající za omezení nespecifických interakcí, tak umožňuje zakotvení důležitých molekul, např. specifických protilátek na povrch pevné fáze.

Objasnění vyobrazení

Obrázek 1: Porovnání výsledků při využití systému s BSA a s konjugáty 2 a 3 (A, vlevo) a výřez pro malé hodnoty (B, vpravo).

Příklady provedení vynálezu

Všechny použité chemikálie pocházely od firmy Sigma-Aldrich, není-li uvedeno jinak.

- 23 CZ 2022-167 A3

Monomerní sloučeniny A-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA) a 3-(3-methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thion (Μη-β-Ala-TT) byly připraveny podle publikovaného postupu (Subr, V. and K. Ulbrich, Synthesis and properties of new N-(2-hydroxypropyf methacrylamide copolymers containing thiazolidine-2-thione reactive groups. React. Funct. Polym., 2006. 66: p. 1525-1538; Chytil, P., etal., N-(2-HydroxypropyQmethacrylamide-basedpolymer conjugates with pH-controlled activation cf doxorubicin for cell-specific or passive tumour-targeting. Synthesis by RAFTpolymerisation and physicochemical characterisation. Eur. J. Pharm. Sci., 2010. 41: p. 473482).

Příklad 1:

Příprava monomeru A-[3-(dodecylamino)-3-oxo-propyl]-2-methyl-prop-2-enamidu

CH₃ ch₂=c

C=O 0

HN-CH₂-CH₂—c—NH—CH₂-(CH₂)₁₀—CH₃

3-methakrylamidopropanová kyselina (Ma- β -Ala-OH, 2 g) a NH2-dodecylamin (2,54 g) byly rozpuštěny v 10 ml dichlormethanu (DCM) a k roztoku bylo přidáno katalytické množství 4dimethylaminopyridinu (DMAP) a postupně 3,1 g V-(3-dimethylaminopropyl)-V'ethylkarbodiimid hydrochloridu (EDCHC1). Reakční směs byla míchána 4 hod při laboratorní teplotě. Reakční směs byla naředěna 10 ml dichlormethanu (DCM) a extrahována 3x10 ml destilované vody. Organická fáze byla usušena Na2SO4 a vakuově zahuštěna na 5 ml a dána krystalovat do mrazničky. Vypadlé krystaly byly odfiltrovány, promyty chladným CHCE a sušeny ve vakuu. Bylo získáno 2,8 g monomeru Ma- β -Ala-dodecylaminu. Charakterizace pomocí HPLC na koloně Chromolith High Resolution RP18e ukázala jeden pík s retenčním časem 12,8 min při 220 nm.

Příklad 2:

Příprava monomeru A-[3-(octadecylamino)-3-oxo-propyl]-2-methyl-prop-2-enamidu

CH₃ ch₂=c c=o o

HN-CH₂-CH₂—c—NH—CH₂-(CH₂)_1S—CH₃

Ma- β -Ala-OH (2 g) a NH2-octadecylamin (3,69 g) byly rozpuštěny v 15 ml dichlormethanu (DCM) a k roztoku bylo přidáno katalytické množství 4-dimethylaminopyridinu (DMAP) a postupně 3,1 g EDCHC1. Reakční směs byla míchána 4 hod při laboratorní teplotě. Reakční směs byla naředěna 10 ml DCM a extrahována 3x10 ml destilované vody. Organická fáze byla usušena Na₂SO4 a vakuově zahuštěna na 5 ml a dána krystalovat do mrazničky. Vypadlé krystaly byly odfiltrovány, promyty chladným CHCE a sušeny ve vakuu. Bylo získáno 3,8 g monomeru Ma- β Ala-octadecylaminu. Charakterizace pomocí HPLC na koloně Chromolith High Resolution RP18e ukázala jeden pík s retenčním časem 13,9 min při 220 nm.

Příklad 3:

Příprava statistického kopolymeru poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) radikálovou polymerizací

-24 CZ 2022-167 A3

ch₃ ch₃

-CH₂—C—/ — ch₂—C— 1 c=o c=o

CH₃ c-ch₃ CN

I I

NH NH

Óh₂ Íh-oh

I ch₃

I CH, in₂ i=o

Kopolymer obsahující thiazolin-2-thionové (TT) reaktivní skupiny byl připraven roztokovou radikálovou kopolymerací HPMA s 3-(3-methakrylamidopropanoyl)thiazolidine2-thionem v DMSO při 60 °C po dobu 6 hodin. Celková koncentrace komonomerů v polymerační směsi byla 12,5 % hmota, a koncentrace AIBN (azobisizobutyronitril) byla 1,0 % hmota.

HPMA (1 g, 6,98 mmol), 3-(3-methakrylamidopropanoyl)thiazolidine2-thion (0,246 g, 0,95 mmol) a AIBN (100 mg,) bylo rozpuštěno v 7,8 mL DMSO. Roztok byl probublán argonem po dobu 10 min. Polymerace probíhala v uzavřené ampuli při teplotě 60 °C po dobu 6 hod. Kopolymer byl izolován vysrážením do směsi aceton-diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyl etherem a vysušen ve vakuu. Polymer byl rozpuštěn v methanolu (5,5 mL) a přesrážen do směsi aceton-diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyl etherem a vysušen ve vakuu. Bylo získáno 0,965 mg kopolymeru o Mw 37 700 a dispersitě 2,04. Obsah TT reaktivních skupin byl 12,8 % mol., vztaženo na celkový počet monomerních jednotek.

Příklad 4:

Příprava konjugátu poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecylamin) radikálovou srážecí kopolymerací - konjugát 1

ch3	ch3 \	ch3
—CH, — C—/ — CH2-	-C—J j-	-c-ch3
1 c=o I	c=°y	Ín
NH	NH
| CH2	| CH, 1
| CH-OH	ch2
| ch3	1 c=o I
	NH—CH	2—(CH2)1q-CH3

Konjugát poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecyl-amin) byl připraven srážecí radikálovou kopolymerací HPMA s A-[3-(dodecylamino)-3-oxo-propyl]-2-methyl-prop-2-enamidem, připraveným dle Příkladu 1, v acetonu při 60 °C po dobu 6 hodin. Celková koncentrace komonomerů v polymerační směsi byla 12,5 % hmota, a koncentrace AIBN byla 1,25 % hmota.

HPMA (1 g, 6,98 mmol), A-[3-(dodecylamino)-3-oxo-propyl]-2-methyl-prop-2-enamidem (0,046 g, 0,142 mmol) a AIBN (100 mg, 0,61 mmol) bylo rozpuštěno v 8,8 mL acetonu. Roztok byl probubláván argonem po dobu 10 min. Polymerace probíhala v uzavřené ampuli při teplotě 60 °C po dobu 6 hod. Vysrážený kopolymer byl odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Bylo získáno 0,879 g kopolymeru (83,7 %) s molekulovou hmotností Mw 46 300, obsahem hydrofobní komonomerní jednotky (odvozené od A-[3-(dodecylamino)-3-oxo-propyl]-2methyl-prop-2-enamidu) 1,5 % mol. a disperzitou 1,63.

-25 CZ 2022-167 A3

Příklad 5:

Příprava konjugátu poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecyl-amin) (konjugát 2) - roztoková polymerace

W	CHa	ch3 1 J		ch3
ch3—c—/ -	-CH2—C—/ —ch2	-C— / —ch2	-á4	-c—ch3
Ín ξ	c=o I	é=o I	é_°/	CN
	NH	NH I	NH
	ch2	ch2	| ch2
	CH-OH	ch2	ch2
	| ch3	C=O I	1 C=O I
		NH |	NH—CH	2—(CH2)1Q-CH3
		ch2 1
		CH—OH
		| ch3

Polymerní prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,2 g, Mw = 37 700 g/mol, 12,8 % mol TT) a dodecyl-amin (4,4 mg) byly rozpuštěny v 1,1 ml DMSO. Poté byl přidán N,Ndiisopropylethylamin (DIPEA) (10,4 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 hod při teplotě místnosti. Následně byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymerní konjugát poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecyl-amin) izolován vysrážením do směsi aceton: diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomerní jednotky (odvozené od A-[3-(dodecylamino)3-oxo-propyl]-2-methyl-prop-2-enamidu) 0,8 % mol. byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-naftalendialdehydem. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 34 300 a disperzita 1,67 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru. Obsah jednotek typu (III) byl 11,2 % mol.

Příklad 6:

Příprava konjugátu poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecyl-amin-co-Ma-P-Ala-ED-biotin) (konjugát 3) - roztoková polymerace

-26CZ 2022-167 A3

Polymerní prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,5 g, Mw = 41 600 g/mol, 11,8 % mol TT), byl rozpuštěn v 2,8 ml DMSO. K roztoku bylo přidáno 528 uL (14,5 mg) zásobního roztoku dodecyl-aminu (27,5 mg/lml CHCE) a 489 uL (21,5 mg) zásobního roztoku X-(2aminoethyl)biotinamidutrifluoracetatu (NH2-ED-biotinu.CF₃COOH) (22 mg/0,5 ml DMSO). Poté byl přidán Χ,Χ-diisopropylethylamin (DIPEA) (46,8 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 hod při teplotě místnosti. Následně byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (50 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymerní konjugát C3 poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecyl-aminco-Ma-P-Ala-ED-biotin) izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomerní jednotky (odvozené od X-[3-(dodecylamino)-3-oxo-propyl]-2-methyl-prop-2-enamidu) 1 % mol. byl stanoven v hydro lyzáta vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace onaftalendialdehydem, obsah jednotek obsahujících biotin byl 1,6 % mol. byl stanoven spektroskopicky pomocí HABA/avidin kilu, obsah jednotek typu (III) byl 9,2 % mol. Molekulová hmotnost konjugáta Mw 51 600 a disperzita 1,46 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru.

Příklad 7:

Příprava statistického kopolymeru Raft-poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) RAFT polymerizací

CH₃ ch₃

-CH₂ —C—/ —CH₂—C— /

C=O

NH

Óh₂

Óh-CH

I ch₃ ch₃ i CH

V-VOJ

C=C / CN

NH ch₂

Óh₂

Polymerní prekurzor Raft-poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) byl připraven pomocí RAFTkopolymerace (reversible addition-fragmentation chain-transfer). V 10,9 ml terc-butanolu bylo rozpuštěno 1,25 g ΗΡΜΑ (88 % mol) a k roztoku bylo přidáno 308 mg Ma-β-ΑΗ-ΤΤ (12 % mol) rozpuštěného v 2,8 ml DMAc (dimethylacetamid), 3,13 mg 2-ethylsulfanylcarbothioylsulfanyl-2methyl-propanenitrile a 2,35 mg 2,2'-azobis(4-methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile) a roztok byl převeden do polymerizační ampule. Směs byla probublána 10 min argonem a poté byla ampule uzavřena. Polymerizační reakce byla provedena při 40 °C (24 h). Polymerní prekurzor Raftpoly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) byl izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Koncové trithiokarbonátové skupiny byly odstraněny podle dříve publikovaného postupu Perrier, S., P. Takolpuckdee, and C.A. Mars, Reversible addition-fragmentation chain transfer polymerization: End group modfication for functionalized polymers and chain transfer agent recovery. Macromolecules, 2005. 38(6): p. 2033-2036. Tímto postupem byl obdržen polymerní prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) s molekulovou hmotností Mw = 49 000 g/mol, polydisperzitou D = 1,23 a obsahující 11,6 % mol reaktivních thiazolidin-2-thionových (TT) skupin, vztaženo na celkový počet monomerních jednotek.

Příklad 8:

Příprava konjugátu Raft-poIy(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecyl-amin) (konjugát 4)

-27CZ 2022-167 A3

	ch3	ch3 i J		ch3
ch3—c—b-	-ch2—C—/ —ch2	-C— / —ch2	á-4	-c—ch3
Ón ξ	c=o I	é=o I	i=o/	CN
	NH	NH I	NH
	ch2	ch2	| ch2
	CH-OH	ch2	CH, | *
	| gh3	c=o I	c=o I
		Jih |	NH—CH	2—(CH2)10—ch3
		CHn
		| CH-OH
		| ch3

Polymerní prekurzor Raft-poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (82 mg, Mw = 49 000 g/mol, 11,6 % mol TT), připravený dle Příkladu 7, a dodecyl-amin (1,8 mg) byl rozpuštěn v 0,35 ml DMSO. Poté byl přidán A, A-diisopropylethylamin (DIPEA) (4,2 pl) a reakční směs byla míchána po dobu 4 hod při teplotě místnosti. Následně byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymerní konjugát Raft-poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecyl-amin) izolován vysrážením do směsi aceton: diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomerní jednotky (odvozené od A-[3(dodecylamino)-3-oxo-propyl]-2-methyl-prop-2-enamidu) 0,6 % mol. byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-naftalendialdehydem. Obsah jednotek typu (III) byl 11 % mol. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 66 000 a disperzita 1,09 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a RI detektorem.

Příklad 9:

Příprava konjugátu Raft-poIy(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecyl-amin-co-Ma-P-Ala-ED-biotin) (konjugát 5)

Η H

-28 CZ 2022-167 A3

Polymerní prekurzor Raft-poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (50 mg, Mw = 49 000 g/mol, 11,6 % mol TT), připravený dle Příkladu 7, dodecyl-amin (1,0 mg) a NH2-ED-biotin.CF₃COOH (2,4 mg) bylo rozpuštěno v 0,22 ml DMSO. Poté byl přidán Α,Α-diisopropylethylamin (DIPEA) (9,9 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 hod při teplotě místnosti. Následně byl k roztoku přidán 1amino-propan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymerní konjugát Raftpoly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecyl-amin-co-Ma-P-Ala-ED-biotin) izolován vysrážením do směsi aceton: diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomerní jednotky (odvozené od A-[3-(dodecylamino)-3-oxo-propyl]-2methyl-prop-2-enamidu) 0,9 % mol. byl stanoven v hydro lyzáta vzorku (6 N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-naftalendialdehydem. Obsah jednotek typu (III) byl 8,7 % mol. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 59 000 a disperzita 1,18 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory na Superose 6increase v PBS pufru. obsah jednotek obsahujících biotin byl 2,0 % mol. byl stanoven pomocí kita HABA-Avidin od Sigma-Aldrich.

Příklad 10:

Příprava konjugátu poIy(HPMA-co-Ma-P-Ala-oIeylamin) - konjugát 6

NH NH-CH₂—(CH^-CH^CH—(CH^-CH.

CH—OH

ÓH₃

Polymerní prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,2 g, Mw = 37 700 g/mol, 12,8 % mol TT), připravený dle Příkladu 3, a oleylamin (4,0 mg) byly rozpuštěny v 1,1 ml DMSO. Poté byl přidán N, A-diisopropylethylamin (DIPEA) (6,5 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 hod při teplotě místnosti. Následně byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymerní konjugát poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-oleylamin) izolován vysrážením do směsi aceton: diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomerní jednotky (obsahující oleylamin) 0,8 % mol. byl stanoven v hydrolyzáta vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace onaftalendialdehydem. Obsah jednotek typu (III) byl 12 % mol. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 45 200 a disperzita 1,70 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru.

Příklad 11:

Příprava konjugátu poIy(HPMA-co-Ma-P-Ala-stearylamin) - konjugát 7

-29CZ 2022-167 A3

ch₂ ch₂ch

CH-OH CH₂CH

I II ch₃ c=oc=o

NH NH—CH₂ — (CH₂)_1s-CH₃ ch₂

CH-OH

I ch₃

Polymerní prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,2 g, Mw = 37 700 g/mol, 12,8 % mol TT), připravený dle Příkladu 3, a stearylamin (3,6 mg) byly rozpuštěny v 1,1 ml DMSO. Poté byl přidán N,7V-diisopropylethylamin (DIPEA) (5,8 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 hod při teplotě místnosti. Následně byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymerní konjugát poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-stearylamin) izolován vysrážením do směsi aceton: diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomerní jednotky (obsahující stearylamin) 0,9 % mol. byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace onaftalendialdehydem. Obsah jednotek typu (III) byl 11,9 % mol. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 46 300 a disperzita 1,68 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru.

Příklad 12:

Příprava konjugátu poIy(HPMA-co-Ma-P-AIa-dodecanoI) - konjugát 8

CH₃ ch₃ ch₃ ch₂ C—/ —CH₂—C—f —CH₂—C—/

C=O

NH I ch₂

CH-OH

I ch₃ c=o

NH

I ch₂ ch₂ c=o

NH

I ch₂ ch₂ c=o

NH ch₃

C CH

L·--Vlij

CN

O (CHJ,—CH₃

CH₂

CH-OH

CH₃

Polymerní prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (200 mg, Mw = 40 200 g/mol, 10,8 % mol PFP) a 1-dodekanol (3,6 mg) byly rozpuštěny v 1,1 ml DMSO. Poté byl přidán N,Ndiisopropylethylamin (DIPEA) (5,8 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 hod při teplotě místnosti. Následně byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymerní konjugát poly(HPMA-co-Ma-B-Ala-dodecanol) izolován vysrážením

-30CZ 2022-167 A3 do směsi acetomdiethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomerní jednotky (obsahující dodekanol) 1,1 % mol. byl stanoven pomocí Ή NMR spektroskopie. Obsah jednotek typu (III) byl 9,7 % mol. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 43 400 a disperzita 1,81 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru.

Příklad 13:

Příprava přenosového činidla A-[2-[5-[(3aR,4R,6aS)-2-oxo-l,3,3a,4,6,6ahexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]ethyl]-4-cyano-4dodecylsulfanylcarbothioylsulfanyl-pentanamide (dodecyl-trithio-biotin)

S CN O

CH₃— (CH₂)_1o—CH₂— S—C—S— C— (CH₂)₂-é—HN— (CH₂)₂— nh

Íh₃ o

Η H

Dodecyl-trithio-biotin byl připraven dvoukrokovou syntézou. V prvním kroku byl připraven 2dodecylsulfanylcarbothioylsulfanyl-2-methyl-5-oxo-5-(2-thioxothiazolidin-3-yl)pentanenitrile (dodecyl-trithio-TT) reakcí 4-cyano-4-dodecylsulfanylcarbothioylsulfanyl-pentanoic acid (dodecyl-trithio-COOH) s thiazolidinem-2-thionem (TT) v dichormethanu v přítomnosti EDC.HC1. Ve druhém kroku reagoval připravený dodecyl-trithio-TT s V-biotinyl-ethylenediamin trifluoracetátem v DMF za vzniku požadovaného dodecyl-trithio-biotinu.

Dodecyl-trithio-COOH (100 mg, 0,247 mmol) a thiazolidin-2-thion (31,0 mg, 0,260 mmol bylo rozpuštěno v 4 mL dichlormethanu a k roztoku bylo přidáno katalytické množství dimethylaminopyridinu a EDC.HC1 (57 mg, 0,297 mmol). Reakční směs byla míchána 4 hod při laboratorní teplotě. Reakční směs byl promyta 2x10 mL destilované vody a DCM vrstva byla usušena bezvodým Na₂SO4 a DCM byl vakuově odpařen.

Dodecyl-trithio-TT (100 mg, 0,247 mmol) bylo rozpuštěno v 1 mL DMF. NH₂-EDbiotin.CFsCOOH (99,15 mg, 0,247 mmol) bylo rozpuštěno v 1 mL DMF a k roztoku bylo přidáno (43 uL, 0,247 mmol) DIPEA. Roztok NH₂-ED-biotinu byl poté přidán k roztoku dodecyl-trithioTT a mícháno po dobu 1 hod při laboratorní teplotě. Během reakce přešel původně nažloutlý roztok na bezbarvý. Reakční směs byla vlita do 100 mL destilované vody. Vysrážený produkt byl izolován centrifugách Produkt byl rozpuštěn v isopropanolu a isopropanol byl odpařen ve vakuu za vzniku pevného produktu.

Příklad 14:

Příprava prekurzoru poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecyl-amin-co-Ma-P-Ala-TT) a konjugátu poIy(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecyl-amin-co-Ma-P-Ala-propanoI) (konjugát 9) radikálovou terpolymerizací

-31 CZ 2022-167 A3

	ch3	ch3 1 J	ch3 \ ch3
CH3—C—/	-CH2—C—/ —ch2	-C— ! — I	ch2—c— / -Uc—ch3
cn y	C—O I	ó=o I	C=O / CN
	NH	NH
	ch2	| ch2	| ch2 1
	| CH-OH	ch2 1	ch2 I
	| ch3	c=o 1 NH 1 ch2 CH-OH 1 ch3	c=o 1 NH—CH2—(CHíh 0— CH3

Konjugát poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecyl-amin-co-Ma-P-Ala-TT) byl připraven roztokovou radikálovou terpolymerací HPMA s A-[3-(dodecylamino)-3-oxo-propyl]-2-methyl-prop-2enamidem a 3-(3-methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thionem v DMSO při 60 °C po dobu 6 hodin. Koncentrace komonomerů v polymerační směsi byla 12,5 % hmotn. a koncentrace AIBN byla 1,25 % hmotn.

HPMA (1 g, 6,98 mmol), A-[3-(dodecylamino)-3-oxo-propyl]-2-methyl-prop-2-enamid (0,051 g, 0,157 mmol) a 3-(3-methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thion (0,182 g, 0,706 mmol) a AIBN (118 mg) bylo rozpuštěno v 7,4 mL DMSO. Roztok byl probublán argonem po dobu 10 min. Polymerace probíhala v uzavřené ampuli při teplotě 60 °C po dobu 6 hod. Kopolymer byl izolován vysrážením do 200 mL směsi aceton-diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Bylo získáno 0,999 g kopolymeru (84,5 %) s obsahem 10,2 % mol. reaktivních TT skupin.

Takto získaný polymer (200 mg) byl rozpuštěn v DMSO (1,2 mL) a k roztoku bylo přidáno 20 uL 1 -amino-2-propanolu a mícháno 10 min do odbarvení reakční směsi. Konjugát 9 byl vysrážen do 30 mL směsi aceton-diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Bylo získáno 184 mg kopolymeru o Mw 38 700 a dispersitě 1,51. Obsah hydrofobní komonomerní jednotky (odvozené od A-[3-(dodecylamino)-3-oxo-propyl]-2-methyl-prop-2enamidu) 0,8 % mol. Obsah jednotek typu (III) byl 9,4 % mol.

Příklad 15:

Příprava polymerního konjugátu poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecyl-amin-co-Ma-P-Alaaminoquinuclidin) (konjugát 10) radikálovou terpolymerizací

-32CZ 2022-167 A3

ch₃ ch₃

CH₃

CH₃

-CH₂—C—{ —CH₂—C—!

CH₂—C— / —CH₂— C— !

c=o c=o

NH

NH

6h-oh

6h₃ ch₂ ch₂

6=o c=o

NH

6h₂

C=O

NH ch₂ ch₂

6=0

CH_a

C—CH_a

6n

1² c—o

NH—CH₂—_a—CH_a

Polymerní prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,2 g, Mw = 41 200 g/mol, D = 2,08, 11,8 % mol TT), připravený dle Příkladu 3, a dodecyl-amin (4,4 mg) byl rozpuštěn v 1,0 ml DMSO. Poté byl přidán Α,Α-diisopropylethylamin (DIPEA) (4,8 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 1 hod při teplotě místnosti. Následně byl k roztoku přidáno 55 uL zásobního roztoku 3aminoquinuclidinu (12,41 mg/200 uL DMSO) a Ν,Ν-diisopropylethylamin (DIPEA) (10,0 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 24 hod při teplotě místnosti. Poté byl k roztoku přidán 1-aminopropan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymerní konjugát 10, poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecyl-amin-co-Ma-P-Ala-aminoquinuclidin), izolován vysrážením do směsi acetomdiethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomerní jednotky (obsahující dodecylamin) 0,7 % mol. a obsah komonomerní jednotky obsahující aminoquinuclidin 0,9 % mol. byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-naftalendialdehydem. obsah jednotek typu (III) byl 10,2 % mol. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 40000 a disperzita 1,44 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru.

Příklad 16:

Příprava polymerního konjugátu poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecyl-amin-co-Ma- β -Alaaminocyklooktan) (konjugát 11)

	CHa	ch3 1 J	ch3 1 J	cn3 \	ch3
CHa—C—	-CH2—C—/ —ch2	—C—! —CH2-	1 c— /	—ch2—c— i 4-	c—ch3
6n \	6=0 I	6=0	6=0	6=o;	6n
	NH	| NH	I^H	NH
	6h2	6h2	6h2	6h2
	CH-OH	6h2	ch2	6h2
	CHa	é-o I	6=0	6=0 I
		NH |	1 NH	NH—CH2	—(CH2)1q-CH3
		ch2 1
		CH-OH /
		ch3 \

Polymerní prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,2 g, Mw = 37 700 g/mol, D = 2,04, 12,84 % mol TT), připravený dle Příkladu 3, byl rozpuštěn v 0,7 ml DMSO a k roztoku bylo přidáno 93

-33 CZ 2022-167 A3 uL (4,4 mg) zásobního roztoku dodecyl-aminu (23,66 mg/500 uL CHCL) a 125 ul (2,18 mg) zásobního roztoku aminocyklooktanu (8,7 mg/500 uL DMSO). Poté byl přidán Ν,Νdiisopropylethylamin (DIPEA) (14,9 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 hod při teplotě místnosti. Poté byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymerní konjugát 11, poly(HPMA-co-Ma^-Ala-dodecyl-amin-co-Ma- β -Alaaminocyklooktan), izolován vysrážením do směsi aceton: diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomerní jednotky (obsahující dodecylamin) 0,7 % mol. a obsah komonomerní jednotky obsahující aminocyklooctan 0,85 % mol. byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-naftalendialdehydem. Obsah jednotek typu (III) byl 11,29 % mol. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 43000 a disperzita 1,43 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru.

Příklad 17:

Příprava polymerního konjugátu poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecyl-amin-co-Ma- β -Alanorbornen-2-methylamin) (konjugát 12)

Polymerní prekurzor poly(HPMA-co-Ma^-Ala-TT) (0,2 g, Mw = 37 700 g/mol, D = 2,04, 12,84 % mol TT), připravený dle Příkladu 3, byl rozpuštěn v 1,0 ml DMSO a k roztoku bylo přidáno 93 uL (4,4 mg) zásobního roztoku dodecylaminu (23,66 mg/500 uL CHCE) a 84 ul (2,1 mg) zásobního roztoku 5-norbornen-2-methylaminu (4,99 mg/200 uL DMSO). Poté byl přidán N,Ndiisopropylethylamin (DIPEA) (14,8 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 hod při teplotě místnosti. Poté byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymerní konjugát 12, poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecyl-amin-co-Ma- β -Ala-5norbornen-2-methylamin), izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomerní jednotky (obsahující dodecylamin) 0,75 % mol. a obsah komonomerní jednotky obsahující 5-norbornen-2methylamin 2,5 % mol. byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-naftalendialdehydem. Obsah jednotek typu (III) byl 9,59 % mol. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 43 000 a disperzita 1,45 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru.

-34CZ 2022-167 A3

Příklad 18:

Příprava polymerního konjugátu poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecyl-amin-co-Ma- P -Ala(2,6-A-(2-aminoethyl)octahydroxyclopentapyrrole-2-karboxamide) (konjugát 13)

ch3/ ch3	ch3	ch3	ch3 \ CH3
ch3—c—1/ —CH2—C—/ —	CH2—C— ! —	-CH,—é— 1	—CH2—C— ! -Fc-ch3
CN \ é=o	é=o	é=o	é=o / CN
NH	NH	NH	NH
ch2	ch2 I	CH,	ch2 I
Íh-oh	CH2	ch2	CH2
Íh3	C—0 NH Íh2 Íh-oh Íh3	é=o NH Íh2 CH, 1 NH 1 c=o HN T h4Xh	C—0 NH—CH2—(CH^—CH3

Polymerní prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,2 g, Mw = 37 700 g/mol, D = 2,04, 12,84 % mol TT), připravený dle Příkladu 3, byl rozpuštěn v 1,0 ml DMSO a k roztoku bylo přidáno 93 uL (4,4 mg) zásobního roztoku dodecyl-aminu (23,66 mg/500 uL CHCE) a dále bylo přidáno 3,4 mg (2,6)-A-(2-aminoethyl)octahydrocyclopentapyrrole-2-karboxamidu. Poté byl přidán N,Ndiisopropylethylamin (DIPEA) (15,3 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 hod při teplotě místnosti. Poté byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymerní konjugát 13, poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-dodecyl-amin-co-Ma-b-Ala-(2,6A-(2-aminoethyl)octahydrocyclopentapyrrole-2-karboxamid), izolován vysrážením do směsi aceton: diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomerní jednotky (obsahující dodecylamin) 0,75 % mol. a obsah komonomerní jednotky obsahující A-(2-aminoethyl)octahydrocyclopentapyrrole-2-karboxamidu 1,8 % mol. byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-naftalendialdehydem. Obsah jednotek typu (III) byl 10,29 % mol. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 43 000 a disperzita 1,45 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru.

Příklad 19:

Příprava homopolymerů dodecyIamine-poIy(HPMA)-biotin RAFT polymerací - konjugát 14 a 15

-35 CZ 2022-167 A3

Polymerní konjugáty dodecylamine-poly(HPMA)-biotin byly připraveny pomocí RAFTpolymerace (reversible addition-fragmentation chain-transfer). Příprava konjugátu 14: v 3,4 ml fórc-butanolu bylo rozpuštěno 0,4 g HPMA a k roztoku bylo přidáno 18,8 mg A-[2-[5[(3aR,4R,6aS)-2-oxo-l,3,3a,4,6,6a-hexahydrothieno[3,4-d]imidazol-4-yl]pentanoylamino]ethyl]4-cyano-4-dodecylsulfanylcarbothioylsulfanyl-pentanamide, připraveného v Příkladu 13, rozpuštěného v 425 ul DMAc a 4,31 mg 2,2'-azobis(4-methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile) a roztok byl převeden do polymerizační ampule. Směs byla probublána 10 min argonem a poté byla ampule uzavřena. Polymerizační reakce byla provedena při 30 °C (72 h). Polymerní prekurzor byl izolován vysrážením do směsi aceton: diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Tímto postupem byl obdržen polymerní konjugát dodecylamine-poly(HPMA)biotin s molekulovou hmotností Mw = 22 400 g/mol, polydisperzitou D = 1,18 a obsahující na alfa konci polymerního řetězce jednu molekulu dodecylaminu a na omega konci polymerního řetězce jednu molekulu biotinu. Obdobně byl připraven konjugát 15, který měl Mw = 42 000 g/mol, polydisperzitou D = 1,17.

Příklad 20:

Příprava homopolymeru dodecylamine-poly(HPMA) RAFT polymerací - konjugát 16

CH3—(CH^ o—ch2 -s -c—s -

/ CH3 a CN Čch2-c—J-c-ch3 c=oz ch3 NH CH—OH 1 ch3

Polymerní konjugát dodecylamine-poly(HPMA) byl připraven pomocí RAFT- polymerace (reversible addition-fragmentation chain-transfer). V 3,4 ml fórc-butanolu bylo rozpuštěno 0,4 g HPMA a k roztoku bylo přidáno 3,9 mg 2-kyanoprop-2-yl)-dodecyltrithiokarbonátu rozpuštěného v 64 ul DMAc a 1,72 mg 2,2'-azobis(4-methoxy-2,4-dimethylvaleronitrile) a roztok byl převeden do polymerizační ampule. Směs byla probublána 10 min argonem a poté byla ampule uzavřena. Polymerizační reakce byla provedena při 40 °C (24 h). Polymerní prekurzor byl izolován vysrážením do směsi aceton: diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Tímto postupem byl obdržen polymerní konjugát dodecylamine-poly(HPMA) s molekulovou hmotností Mw = 42 400 g/mol, polydisperzitou D = 1,12 a obsahující na alfa konci polymerního řetězce jednu molekulu dodecylaminu.

Příklad 21:

Příprava kopolymeru na bázi 2-oxazolínu o struktuře poly(2-methyl-oxazolin-co-A-ethyl-4oxo-4-(2-tioxothiazolidin-3-yl)butanamide)

-36CZ 2022-167 A3

V baňce byly pod argonovou atmosférou byly rozpuštěny 2-methyl-2-oxazolin (8,6 g, 101 mmol), methyl 3-(4,5-dihydrooxazol-2-yl)propanoate (l,73g, 11 mmol) a 2-fenyl-2oxazoliniumtetrafluorborátový iniciátor (39,6 mg, 168 pmol, [M]/[I] = 600) ve 25,1 ml čerstvě destilovaného sulfolanu tak, že byla koncentrace monomeru 3 M. Reakční směs byla míchána při 60 °C v rukavicovém boxu po dobu 2 týdnů, poté byla přes noc ukončena pevným azidem sodným (33 mg, 504 pmol). Polymerační směs byla zředěna destilovanou vodou (10 ml) a dialyzována proti stejnému rozpouštědlu (MWCO 3 kDa). Následně byl polymer izolován lyofilizací. Hydrolýza methylesterové skupiny byla provedena ve směsi voda:metanol (1:1) při pH 12 za použití 0,1 M NaOH. Po hydrolýze byl methanol odstraněn odpařením a vodný roztok byl okyselen 0,1 M HC1 na pH 2. Polymer byl zředěn destilovanou vodou (10 ml) a dialyzován proti stejnému rozpouštědlu (MWCO 3 kDa) a následně lyofizován. V dalším kroku byl 1 g polymeru rozpuštěn společně s 0,15 g thiazolidin-2-thinu v 10 ml DMSO a k roztoku bylo přidáno 0,3 g EDC.HC1. Reakční směs byla míchána 24 hod. Poly(2-methyl-oxazolin-co-V-ethyl-4-oxo-4-(2-tioxothiazolidin-3yljbutanamide) byl vysrážen do směsi aceton:diethyleter 2:1, odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Výsledný polymer byl získán jako nažloutlý prášek (výtěžek 71 % hmota.).

Molekulová hmotnost konjugátu Mw 12 400 a disperzita 1,13 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru. Obsah reaktivních thiazolidin-2-thionových (TT) skupin byl 9,8 % mol.

Příklad 22:

Příprava konjugátu polv(2-inetlivl-o\azolin-co- V-dodecvl- V-etlivl-butanediainide-co- V-2hydroxypropyl-A-ethyl-butanediamide) - konjugát 17 ^A-CH₂-CH₂-f —N-CH₂-CH₂-1 —N-CH₂-CH₂ c=oé=o (ÍH₂)₂ (CH₂)₂ c=oc=o

NHlh

Íh₂ Íh₂

Íh-OH (CH₂)_do

Íh₃

Polymerní prekurzor poly(2-mcthyl-oxazolin-co-,V-cthyl-4-oxo-4-(2-tioxothiazolidin-3yljbutanamide) (0,2 g, Mw = 12 400 g/mol, D = 1,13, 9,8 % mol TT), připravený dle Příkladu 21, byl rozpuštěn v 1,0 ml DMSO a k roztoku bylo přidáno 166,3 uL (3,0 mg) zásobního roztoku

-37CZ 2022-167 A3 dodecylaminu v CHCL (9,02 mg/500 uL CHCI3). Poté byl přidán Α,Α-diisopropylethylamin (DIPEA) (7,05 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 hod při teplotě místnosti. Poté byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poly(2-methyloxazolin-co-V’-dodecyl-V-ethyl-butanediamide-co-V’-2-hydroxypropyl-V-ethyl-butanediamide) byl izolován vysrážením do směsi aceton: diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomerní jednotky (obsahující dodecylamin 0,75 % mol. byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace o-naftalendialdehydem. Obsah jednotek typu (IV) byl 9,05 % mol. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 14 200 a disperzita 1,15 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru.

Příklad 23:

Příprava polymerního konjugátu poly(2-methyl-oxazolin-co-V’-dodecykV^ biitanediamide-co-VGcvclooctvl-V-ethvl-biitanediainide-co-V-2-hvdro\vpropvl-V-ethvlbutanediamide) - konjugát 18

—N-CH₂-CH₂c=o (CH₂)₂ c=o NH I ch₂ (CH₂)i₀

CH₃

Polymerní prekurzor poly(2-methyl-oxazolin-co-V-ethyl-4-oxo-4-(2-tioxothiazolidin-3yljbutanamide) (0,2 g, Mw = 12 400 g/mol, D = 1,13, 9,8 % mol TT), připravený dle Příkladu 21, byl rozpuštěn v 1,0 ml DMSO a k roztoku bylo přidáno 166,3 uL (3,0 mg) zásobního roztoku dodecylaminu v CHCL (9,02 mg/500 uL CHCI3) a 84 ul (2,1 mg) zásobního roztoku cyklooktylaminu v DMSO (4,99 mg/200 uL DMSO). Poté byl přidán ΛζΑ-diisopropylethylamin (DIPEA) (15,4 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 hod při teplotě místnosti. Poté byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (10 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymerní konjugát poly(2-methyl-oxazolin-co-A^-dodecyl-V-ethyl-butanediamide-co-Vcyclooctyl-V-ethyl-butanediamide-co-V-2-hydroxypropyl-V-ethyl-butanediamide) izolován vysrážením do směsi aceton: diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Obsah hydrofobní komonomerní jednotky (obsahující dodecylamin) 0,75 % mol. a obsah komonomerní jednotky obsahující cyklooktylamin 2,2 % mol. byl stanoven v hydrolyzátu vzorku (6N HC1, 115 °C, 16 h) pomocí HPLC s fluorescenčním detektorem (Ex. 229 nm, Em. 490 nm) na koloně Chromolith C18 metodou předkolonové derivatizace onaftalendialdehydem. Obsah jednotek typu (IV) byl 6,85 % mol. Molekulová hmotnost konjugátu Mw 15 300 a disperzita 1,18 byla stanovena pomocí HPLC Shimadzu opatřeného s multiúhlovým rozptylovým, viskozimetrickým a diferenciálním refraktorem detektory v PBS pufru.

Příklad 24:

Příprava 2-methyl-A-tetradecyl-prop-2-enamidu (Ma-tetradecylamin).

-38 CZ 2022-167 A3

Tetradecylamin (4,0 g, 18,8 mmol) byl rozpuštěn v 40 mL ethylacetatu a k roztoku byl přidán inhibitor 2,5-di-terc-butylhydrochinonu. Methacryloyl anhydrid (2,9 g, 18,8 mmol) byl naředěn 3 mL ethylacetátu a pozvolna přikapán k roztoku tetradecylaminu při laboratorní teplotě tak aby nepřesáhla 25 C. Po přídavku veškerého anhydridu byla reakční směs míchána 1 hod při laboratorní teplotě. Reakční směs byla vytřepána 3x 50 mL 2% NaHCO; a 50 mL H₂O. Reakční směs byla usušena bezvodým Na₂SO4 a produkt byl vykrystalován v mrazničce. Vypadlé krystaly byly odfiltrovány, promyty vychlazeným ethylacetátem a sušeny za vakua. Bylo získáno 3,5 g (66,1%) monomeru 2-methylJV-tetradecyl-prop-2-enamidu. Charakterizace pomocí HPLC na koloně Chromolith High Resolution RP18e ukázala jeden pík s retenčním časem 13,8 min při 220 nm. CHN analýza C=76,81 (nalezeno 76,90); H= 12,53(nalezeno 12,54); N=4,98(nalezeno 5,04).

Příklad 25:

Příprava konjugátu poly(HPMA-co-Ma-tetradecylamin) radikálovou srážecí kopolymerací

OCH₃ ch₃/ CH₃ CH₃ \ CH₃och ch₃—c—ch₂—c— / -CH₂—C—/—CH₂—C—/ 4-c—ch₂-c—ch₃

CH₃ CN \ C=O C=O / CNCH

NHNH

CH₂ch

II

CH—OH (CH₂)₁₂ ch₃ch

Konjugát poly(HPMA-co-Ma-tetradecylamin) byl připraven srážecí radikálovou kopolymerací HPMA s 2-methyl-V-tetradecyl-prop-2-enamidem, dle Příkladu 24, v acetonu při 40 °C po dobu 24 hodin. Celková koncentrace komonomerů v polymerační směsi byla 12,5 % hmotn. a koncentrace iniciátoru 2,2'-azobis[V-(2-karboxyethyl)-2-methylpropionamidinu (V-70) byla 0,5 % hmotn. HPMA (0,3 g, 2,1 mmol), 2-methyl-V-tetradecyl-prop-2-enamidu (0,025 g, 0,087 mmol) a AIBN (13 mg, 0,04 mmol) bylo rozpuštěno v 2,9 mL acetonu. Roztok byl probubláván argonem po dobu 10 min. Polymerace probíhala v uzavřené ampuli při teplotě 40 °C po dobu 24 hod. Vysrážený kopolymer byl odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Bylo získáno 0,196 g kopolymeru (60,4 %) s molekulovou hmotností Mw 44 300 a disperzitou 2,21. Obsah hydrofobní komonomerní jednotky (odvozené od 2-methyl-V-tetradecyl-prop-2enamidu) byl 1,0 % mol.

Příklad 26: Potlačení nespecifické sorpce IgG-HRP konjugátu na povrch jamek ELISA desky

Koncentrát konjugátu polyklonální králičí protilátky s křenovou peroxidázou připravený glutaraldehydovou metodou byl ředěn 500 x do fosfátového pufru s různým obsahem BSA, biotinylovaného BSA, konjugátu 1 z Příkladu 4 a konjugátu 3 z Příkladu 6. Do 96 jamkové polystyrénové mikrotitrační destičky (Greiner) byl dávkován každý testovaný roztok, a to vždy do čtyř jamek v objemu 200 uL do jedné jamky. Deska pak byla ponechána 60 minut na pracovním stole, při teplotě laboratoře a bez třepání. Po odsátí a opakovaném promytí jamek (3 x 350 uL) pufrem obsahujícím Tween 20 a NaCl, byla vyvolána kolorimetrická reakce přidáním 200 uL TMB. Po čase 10 minut byla kolorimetrická reakce zastavena přídavkem 50 uL 2 M HC1. Následně se měřila absorbance (optická densita OD) při vlnové délce 450 nm. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 1.

Tabulka 1. Výsledky potlačení nespecifické sorpce komerčními BSA a konjugáty 1 a 3

-39CZ 2022-167 A3

	Koncentrace testovaných blokátorů ve fosfátovém pufru, g/L
BSA (g/L)	biot. BSA (g/L)	Konjugát 1 (g/L)	Konjugát 3 (g/L)
0.2	1	5	0,1	0,5	2	0,2	1	5	0,1	0,5	2
OD450
3,19 0	0,65 4	0,07 7	251 7	0,54 0	0,08 9	0,39 4	0,10 5	0,04 9	1,00 2	0,165	0,08 7
2,76 0	0,60 9	0,06 8	2,43 5	0,49 0	0,09 8	0,37 6	0,12 8	0,04 7	0,99 7	0,194	0,08 8
3,04 8	0,69 1	0,06 9	2,48 8	0,50 4	0,10 5	0,39 0	0,12 9	0,04 6	0,97 6	0,18 4	0,10 5
2,88 2	0,78 2	0,07 5	2,56 4	0,51 4	0,13 0	0,38 3	0,13 7	0,04 7	0,94 7	0,16 9	0,10 4
průmě r	2,97 0	0.68 4	0,07 2	2,50 1	0,51 2	0,10 5	0.38 5	0,12 5	0,04 7	0.98 1	0,17 S	0,09 6
C.V., %	6,34	10,7 5	6,13	2,15	4,05	16,8	2,11	109 0	2,37	2,56	7,62	10,1 8

Z hodnot OD při koncentracích BSA, 1,0 g/L, a konjugátu 1, 0,2 g/L, plyne, že konjugát 1 snižuje nespecifickou sorpci použitého IgG-HRP konjugátu nejméně 5 x více než BSA. V případě biotinylovaného BSA a konjugátu 3 obsahujícího také biotin je z porovnání OD při koncentracích 0.1 a 0.5 g/L obou blokátorů zřejmé, že hodnoty OD u konjugátu 3 jsou nejméně 2.5 x menší. Rovněž je zřejmé, že zavedení biotinu přibližně 2 x zlepší blokační účinek u BSA.

Příklad 27: Modelový systém ELISA na stanovení TSH v krevním séru:

Ze dvou komerčně dostupných myších monoklonálních protilátek byl sestaven sendvičový systém ELISA na stanovení lidského TSH (human Thyroid Stimulating Hormone). Jedna monoklonální protilátka byla konjugována s biotinem a druhá s křenovou peroxidázou.

Příprava koi jugátu s biotinem:

mg protilátky v 1 mL borátového pufru pH 8,5 se biotinyluje 4% (w/w) Biotin-NHS, který se přidává v koncentraci 10 mg/mL v DMF, biotinylace probíhá po dobu 20 minut a je ukončena přídavkem 100 uL 0,2 M roztoku NH4CI. Následnou dialýzou se oddělí volný biotin.

Příprava kor,jugátu s křenovou peroxidázou:

mg protilátky se konjuguje s 5 mg křenové peroxidázy (HRP) pomocí glutaraldehydu. Nejprve se HRP aktivuje roztokem glutaraldehydu o koncentraci 1,25% ve fosfátovém pufru pH 6,8 po dobu 14 hodin. Po gelové chromatografii (Sephadex 25), kdy se odstraní volný glutaraldehyd, se aktivovaná HRP smíchá s roztokem IgG v 0.15 m NaCl za přídavku 5% (v/v) karbonát

-40CZ 2022 - 167 A3 bikarbonátové pufru pH 9,5. Reakce se zastaví po 14 hodinách přídavkem 5% (v/v) roztoku 0,2 M lysinu. Konjugát IgG-HRP se oddělí gelovou chromatografií na koloně s náplní Superdex HR 200.

Konjugáty pak byly použity pro konstrukci dvou sendvičových ELISA systémů.

Systém s BSA

Biotinem značená monoklonální protilátka je vázána na stěny mikrotitrační destičky využitím biotinylovaného BSA:

Nejprve se do jamek mikrototrační destičky (Greiner) napipetuje 300 uL roztoku biot. BSA o koncentraci 10 ug/mL ve fosfátovém pufru, roztok se v jamkách nechá při laboratorní teplotě do druhého dne. Obsah jamek se důkladně odsaje a napipetuje se 300 uL roztoku streptavidinu o koncentraci 1 ug/mL ve fosfátovém pufru. Opět probíhá inkubace za laboratorní teploty do druhého dne, pak se roztok důkladně odsaje a napipetuje se 250 uL roztoku biotinylované monoklonální protilátky o koncentraci 1 ug/mL ve fosfátovém pufru obsahujícím i BSA v koncentraci 1 mg/mL. Tento roztok se v jamkách ponechá 48 hodin, pak následuje důkladné odsátí a sušení po dobu 4 hodin. Desky jsou takto připraveny k použití a lze je skladovat v lednici po dobu 6 měsíců.

Konjugát IgG-HRP se ředí 20 000 x do citrátového pufru obsahující BSA v koncentraci 1 mg/mL.

Systém s konjugáty 2 a 3

V tomto případě je biotinem značená monoklonální protilátka vázána na jamky využitím konjugátů 2 a 3. Postup potahování jamek je identický jako v systému s BSA, avšak s dvěma změnami: (i) místo biotinylovaného BSA o koncentraci 10 ug/mL se používá konjugát 3 o koncentraci 0,1 ug/mL; (ii) potahovací roztok biotinylované protilátky místo BSA obsahuje konjugát 2, také o koncentraci 1 mg/mL.

Konjugát IgG-HRP se rovněž ředí 20 000 x do citrátového pufru, který však obsahuje konjugát 2 v koncentraci 1 mg/mL.

V obou systémech byly použité stejné kalibrátory, tj. roztoky lidského TSH (Sigma-Aldrich k.č. T9265) v hovězím séru, jejich koncentrace byly stanoveny pomocí WHO referenčního preparátoru (NIBSC 80/558). Pracovní protokol byl rovněž stejný v obou systémech:

- 50 uL kalibrátoru či vzorku + 150 uL roztoku konjugátu IgG-HRP je pipetováno do jamky

- 120 min inkubace při laboratorní teplotě, bez třepání

- Odsátí, promytí 3 x promývacím roztokem

- 200 uL TMB, 10 min při laboratorní teplotě bez přístupu světla

- 50 uL 2 M HCl

- Měření optické density při 450 nm (OD450)

V následující Tabulce 2 jsou uvedeny hodnoty OD450 kalibrátorů pro oba systémy, každý kalibrátor byl v každém systému změřen ve dvou jamkách.

Tabulka 2. Kalibrační závislost kalibrátoru TSK při využití blokátorů na bázi komerčního BSA a kombinace konjugátu 2 a 3

- 41 CZ 2022-167 A3

Kalibrátor TSH, mlU/L	Systém s BSA	Systém s konjugáty 2 a 3
Průměr OD450	C.V., %	Průměr OD450	C.V., %
0	0,043	2,64	0,041	0,17
0,1	0,048	1,18	0,051	1,96
0,5	0,082	0,52	0,093	1,06
2,5	0,269	2,50	0,330	3,92
10	0,899	3,30	1,123	1,53
50	3,416	1,51	3,827	1,83

Hodnoty OD obou kalibračních závislostí jsou srovnatelné, pro systém s konjugáty 2 a 3 jsou pro kalibrátory 2,5, 10 a 50 mlU/L jsou odezvy kalibrace dokonce prokazatelně vyšší, stejně tak i hodnoty C.V. duplikátů jednotlivých kalibrátorů jsou srovnatelné. Je důležité si uvědomit, že pro dosažení shodné kalibrační křivky je nutné využít lOOnásobně nižší koncentraci konjugátu 3 než bitinylovaného BSA.

V obou systémech bylo analyzováno 500 reálných vzorků získaných z endokrinologické ambulance, získané výsledky jsou porovnány grafickou formou na Obrázcích 1A a 1B. Je zřejmé, že využití systému s konjugáty 2 a 3 umožňuje dosáhnout stejných výsledků na reálných vzorcích jako systém BSA. I zde je nutné si uvědomit, že konjugát 3 je využíván při lOOkrát nižší koncentraci než BSA.

Příklad 28: Potlačení nespecifické sorpce HRP na povrch jamek ELISA desky

Do 96 jamkové polystyrénové mikrotitrační destičky (Greiner) byl dávkován roztok křenové peroxidázy o koncentraci 5 mg/L ve fosfátovém pufru s obsahem BSA, konjugátu 2 (Příklad 5) a konjugátu 11 (Příklad 16) o koncentraci 0,1 g/L. Každý roztok byl dávkován vždy do osmi jamek v objemu 200 uL do jedné jamky. Deska pak byla ponechána 16 hodin na pracovním stole, při teplotě laboratoře a bez třepání. Po odsátí a opakovaném promytí jamek (3 x 350 uL) pufrem obsahujícím Tween 20 a NaCl, byla vyvolána kolorimetrická reakce přidáním 200 uL TMB. Po čase 10 minut byla kolorimetrická reakce zastavena přídavkem 50 uL 2 M HC1. Následně se měřila absorbance při vlnové délce 450 nm, výsledky jsou uvedeny v Tabulce 3.

Tabulka 3. Hodnoty absorbance při experimentu potlačení nespecifické sorpce HHP pomocí BSA, konjugátu 2 a konjugátu 11.

-42 CZ 2022-167 A3

	BSA	Konjugát 2	Kcmjngát11
OD*ai
Over, OD >3,6	0,405	0,220
	0,356	0,210
O,35S	0,232
0,300	0,195
0,365	0,206
0,393	0,200
0,363	0,311
0,434	0,253
průměr		0J72	0,228
C K, %	10,74	16,77

Z hodnot OD je zřejmé, že blokační účinek pro sorpci křenové peroxidázy roste v pořadí BSA konjugát 2 - konjugát 11. Zatímco BSA nebylo při koncentraci 0,1 mg/mL schopno zabránit HRP se nespecificky vázat na povrch destičky, tak konjugát 2 a 11 při této malé koncentraci již účinně omezovaly nespecifickou sorpci. Konjugát 11 obsahující kromě hydrofobně-aktivní kotvy i interakce-omezující ligand prokázal navýšenou schopnost blokace nespecifické interakce HRP na povrch destiček.

Příklad 29:

Kompetitivní sorpce konjugátů Konjugátu 14 a 15 versus BSA a biot. BSA versus konjugát 16 na povrch jamek ELISA desky

Do 96 jamkové polystyrénové mikrotitrační destičky (Greiner) byl dávkován fosfátový pufr s konjugátem obsahující biotin (konjugáty 14 a 15 z Příkladu 19), koncentrace konjugátu byla 1 mg/L, jako blokátor byl použit BSA o různé koncentraci. Alternativně fosfátový pufr obsahoval biotinylovaný BSA o koncentraci 1 mg/mL a jako blokátor byl použit konjugát neobsahující biotin (konjugát 16 z Příkladu 20). Každý roztok byl dávkován vždy do osmi jamek v objemu 200 uL do jedné jamky. Deska pak byla ponechána 16 hodin na pracovním stole, při teplotě laboratoře a bez třepání. Následně byl roztok důkladně odsát, do všech jamek bylo nadávkováno 200 uL fosfátového pufru obsahující 0,1% rybí želatiny a opět proběhla inkubace přes noc. Po odsátí a opakovaném promytí jamek (3 x 350 uL) pufrem obsahujícím Tween 20 a NaCl, byl do jamek nadávkován v objemu 200 uL roztok komerčního konjugátu streptavidinu s křenovou peroxidázou (STR-HRP) ředěného ve fosfátovém pufru s 0,1% rybí želatinou. Po jednohodinové inkubaci za laboratorní teploty a bez třepání, bylo provedeno odsátí a opakované promytí (3 x 350 uL) a

-43 CZ 2022-167 A3 vyvolána kolorimetrická reakce přidáním 200 uL TMB. Po čase 10 minut byla kolorimetrická reakce zastavena přídavkem 50 uL 2 M HC1. Následně se měřila absorbance při vlnové délce 450 nm, výsledky jsou uvedeny v Tabulce 4.

Tabulka 4. Výsledky sorpčních vlastností konjugátů 14 až 16.

	Sorpce konjugátu 14 při koncentiaci 1 mg/L z roztoku PBS za různé koncentrace blokátom BSA	Sorpce konjugátu 15 při koncentraci 1 mg/L z roztoku PBS za různě koncentrace blokátoru BSA	Sorpce biot. BSA při koncentraci 1 mg/L z roztoku PES za různé koncentrace blokátoru konjugátu 16
Koncentrace blokátoru, mg/L
0	7	50	0	7	50	0	0.5	1
ODtíi
3,751	3,733	1,579	3,477	3,390	1,735	2,921	1,985	1,341
3,956	3,559	1,545	3,693	3,530	1,807	2,880	1,799	1,235
3,952	3,118	1,686	3,776	3,475	1,874	2,977	1,721	1,142
3,691	3,390	1,559	3,691	2,969	1,735	2,800	1,599	1,061
3,931	3,625	1,711	3,660	3,234	1,815	2,801	1,577	1,135
3,839	3,538	1,616	3,596	3,380	1,772	2,810	1,694	1,240
3,839	3,742	1,742	3,566	3,400	1,809	2,766	1,642	1,235
3,962	3,786	1,654	3,740	3,536	1,745	2,779	1,772	1,235
Prime r	3^65	3,561	1,637	3,650	3-364	1,737	2.841	1,724	1203
CV,%	2,67	6,22	4,48	2,69	5,56	2,73	2,66	7,62	7,i5
Poměr	1,00	0J2	0.42	1,00	0J2	0,49	1,00	0,61	0,42

V uvedeném testuje měřený signál výsledkem vazby STR-HRP konjugátu na biotin navázaný na 10 pevnou fázi v průběhu inkubace prvního sorpčního pufru, tj. roztoků konjugátů 14 a 15 resp. biot

BSA. Z výsledků je zřejmé, že zatímco k poklesu sorpce konjugátů 14 a 15 více jak na 50 % je potřeba, aby koncentrace kompetitivního blokátoru, tj. BSA byla 50 mg/L, v případě konjugátu 16 jako blokátoru sorpce biotinylovaného BSA je postačující koncentrace 1 mg/mL. Tyto výsledky shodně prokazují výrazně lepší sorpční vlastnosti testovaných konjugátů ve srovnání s BSA.

-44 CZ 2022-167 A3

Příklad 30. Potlačení nespecifické sorpce IgG-HRP konjugátu na povrch paramagnetických mikročástic

Koncentrát konjugátu polyklonální králičí protilátky s křenovou peroxidázou připravený 5 glutaraldehydovou metodou byl ředěn 500 x do fosfátového pufru s BSA, konjugátem 2 (Příklad 5), konjugátem 11 (Příklad 16) a konjugátem 12 (Příklad 17), koncentrace blokátoru byla vždy 0,1 g/L. Suspenze paramagnetických částic (PMP) Invitrogen k. č. 1120ID o objemu 5 uL byla smíchána s 600 uL promývacího fosfátového roztoku v malé nádobce s konickým dnem, pro separaci PMP byl ke stěně nádobky přiložen silný magnet, po oddělení PMP byl objem kapaliny 10 odsát, tento promývací krok byl opakován. Následně bylo přidáno 300 uL roztoku konjugátu s testovaným blokátorem, suspenze byla ponechána 15 minut při teplotě laboratoře. Po magnetické separaci PMP a odsátí roztoku byly PMP dvakrát promyty již popsaným způsobem. V posledním kroku se k PMP přidal kolorimetrický substrát TMB v objemu 200 uL. Po 10 minutách bylo 150 uL roztoku převedeno do čisté jamky 96 jamkové mikrotitrační destičky a okamžitě přidán STOP 15 roztok v objemu 50 uL. Byla změřena absorbance (optická densita OD) při vlnové délce 450 nm.

Pro každý testovaný blokátor se celý proces opakoval třikrát. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 5.

Tabulka 5. Výsledky blokace nespecifické sorpce IgG-HRP na povrch PMP

	Blokátor v koncentraci 0,1 g/L
BSA	Konjugát 2	Konjugát 11	Konjugát 12
OD450
2,893	0,469	0,878	1,051
3,030	0,537	1,090	1,007
3,944	0,599	1,087	0,931
Průměr	3,289	0,535	1,018	0,996
C.K, %	14,19	9,92	9,75	4,94

Blokační účinek nespecifické sorpce konjugátu IgG-HRP byl stanoven pro kontrolní vzorek BSA a tři vybrané blokátory. Z výsledků uvedených v Tabulce 5. je zřejmé, že všechny testované syntetické blokátory vykazují několikrát lepší blokační aktivitu než samotný BSA. Bylo tedy 25 prokázáno, že syntetické blokátory mají významně lepší blokační účinek než běžně používaný BSA.

Příklad 31.

Potlačení nespecifické sorpce IgG-HRP konjugátu na povrch jamek ELISA desky porovnání více konjugátů

Koncentrát konjugátu polyklonální králičí protilátky s křenovou peroxidázou připravený glutaraldehydovou metodou byl ředěn 500 x do fosfátového pufru s obsahem BSA 1 g/L, a

-45 CZ 2022-167 A3 jedenácti vybraných konjugátů o obsahu lOkrát menším, Ij. 0.1 g/L. Do 96 jamkové polystyrénové mikrotitrační destičky (Greiner) byl dávkován každý testovaný roztok, a to vždy do osmi jamek v objemu 200 uL do jedné jamky. Deska pak byla ponechána 60 minut na pracovním stole, při teplotě laboratoře a bez třepání. Po odsátí a opakovaném promytí jamek (3 x 350 uL) pufrem obsahujícím Tween 20 a NaCl, byla vyvolána kolorimetrická reakce přidáním 200 uL TMB. Po čase 10 minut byla kolorimetrická reakce zastavena přídavkem 50 uL 2 M HC1. Následně se měřila absorbance (optická densita OD) při vlnové délce 450 nm. Výsledky jsou uvedeny v Tabulce 6.

Tabulka 6 Výsledky blokace nespecifické sorpce IgG-HRP na povrch jamek ELISA desky porovnání konjugátů (v popisu tabulky jsou uvedena jen čísla konjugátů)

	BSA	5	18	4	2 1 9	17	4	11	12	13	14
1 g/L	0.1 g/L
0,699	0,992	0987	0,850	0,687	0,593	0,288	0,538	0,592	0,805	0,895	0,521
0,555	0,967	1,118	0,881	0,664	0,586	0,254	0,515	0,652	0,800	0,851	0,540
0,879	1,051	1,138	1,026	0,698	0,578	0,251	0,510	0,565	0,789	0,811	0,527
1,012	1,034	1,025	0,938	0,699	0,662	0,264	0,522	0,592	0,665	0,738	0,536
0,995	1,003	1,016	0,920	0,682	0,682	0,242	0,516	0,688	0,640	0,712	0,512
1,004	1,003	1,140	0,970	0,720	0,710	0,242	0,527	0,550	0,717	0,770	0,527
0,737	0,990	1,143	0,963	0,651	0,672	0,244	0,519	0,611	0,665	0,698	0,517
0,862	0,984	1,093	0,967	0,680	0,604	0,248	0,503	0,543	0,626	0,732	0,519
Průměr	0,843	1,003	1,083	0,939	0,685	0,636	0,254	0,519	0,599	0,714	0,776	0,525
C.V.,%	19.77	2,73	5,87	5,90	3,12	8,01	6,18	2,08	8,40	10,51	9,05	1,79

Pro všechny testované konjugáty bylo dosaženo srovnatelného případně i signifikantně lepšího blokačního účinku při koncentraci lOkrát menší než u BSA. Za zmínku stojí i prokazatelně lepší reprodukovatelnost měřeného signálu sorbovaného konjugáta IgG-HRP pro testované syntetické blokátory oproti BSA.

Příklad 32. Příprava monomeru N-[3-(cycloocíylamino)-3-oxo-propyi]-2-methyl-prop-2enamide

3-methakrylamidopropanová kyselina (Ma- β -Ala-OH, 2 g) a NH2-cyklooktylamin (1,62 g) byly rozpuštěny v 10 ml dichlormethanu (DCM) a k roztoku bylo přidáno katalytické množství 4dimethylaminopyridinu (DMAP) a postupně 3,1 g N-(3-dimethylaminopropyl)-N'ethylkarbodiimid hydrochloridu (EDCHC1). Reakční směs byla míchána 4 hod při laboratorní teplotě. Reakční směs byla naředěna 10 ml dichlormethanu (DCM) a extrahována 3x10 ml destilované vody. Organická fáze byla usušena Na2SO4 a vakuově zahuštěna na 5 ml a dána krystalovat do mrazničky. Vypadlé krystaly byly odfiltrovány, promyty chladným CHC13 a sušeny ve vakuu. Bylo získáno 2,6 g monomeru Ma- β -Ala-cyklooktylaminu. Charakterizace pomocí HPLC na koloně Chromolith High Resolution RP18e ukázala jeden pík s retenčním časem 11,3 min při 220 nm. Další monomery typu (T) byly připraveny analogickou reakcí popsanou v tomto příkladu.

Claims (15)

1. Polymerní konjugát pro blokování nespecifických interakcí v biologických médiích, který obsahuje základní lineární polymer, vybraný ze skupiny zahrnující polyakrylamid, polymethakrylamid, polyakrylát, polymetakrylát, poly(V-(2-hydroxypropyl)methakrylamid), 2polyoxazolín a jejich statistické kopolymery; a alespoň jednu hydrofobně-aktivní kotvu obecného vzorce -X’-R², kde

X’ je kovalentní vazba nebo spojka vybraná ze skupiny sestávající z: -S-C(=S)-;

-(CH₂)_p-C(=O)-; -NH-(CH₂)_n-C(=O)-; -NH-(CH₂-CH2-O)o-CH2-CH₂-C(=O)-; -O-(CH₂CH₂-O)_o-CH₂-CH₂-C(=O)-; nebo -NH-(CH₂)_q(C(=O)-NH-(CH₂)_r)_p-C(=O)-; přičemž n je celé číslo od 1 do 7; o je celé číslo od 1 do 15; /o, q a r jsou vzájemně nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z 1, 2 a 3;

přičemž -CH₂- skupiny X’ mohou být dále nezávisle substituovány jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny;

R² je vybrané ze skupiny sestávající z: fenyl, -S-(CH₂)_a-CH-((CH₂)b-CH3)₂; -S-(CH₂)b(CH=CH-CH₂)_a-(CH₂)_b-CH₃; -NH-(CH₂)_b-CH₃; -NH-(CH₂)_b-(CH=CH-CH₂)_a-(CH2)_b-CH₃; O-(CH₂)_b-CH₃; -O-(CH₂)_a-C-((CH₂)_b-CH₃)₂; -NH-(CH₂)_a-C-((CH₂)_b-CH₃)₂; -O-(CH₂)_b(CH=CH-CH₂)_a-(CH₂)_b-CH₃; a -O-C(=O)-(CH₂)_a-CH-((CH₂)_b-CH₃)₂; přičemž a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 4 do 17;

přičemž pokud X‘ není kovalentní vazba, je skupina R² navázaná přes svou koncovou

-S- nebo -NH- nebo -O- skupinu nebo přes uhlíkový atom fenylové skupiny ke koncové karbonylové nebo thiokarbonylové skupině spojky X‘;

přičemž hydrofobně-aktivní kotva obecného vzorce -X’-R² je přes skupinu X‘ navázána na alespoň jeden konec základního lineárního polymeru;

a/nebo hydrofobně-aktivní kotva obecného vzorce -X’-R² je přes skupinu X‘ navázána jako postranní řetězec ke karbonylové skupině monomerní jednotky základního lineárního polymeru;

a přičemž pokud koncové skupiny základního lineárního polymeru nejsou hydrofobně-aktivní kotvou obecného vzorce -X’-R², jsou nezávisle vybrané ze skupiny sestávající z:

CH;

--C—CHj-CH;

CN

CH;

CH;

C H; C H;

C H; C H;

--OC H;

CH;

OCH;

R¹

kde R¹ je nezávisle vybráno z H a CH3;

R² je definováno výše;

R³ je vybráno ze skupiny, sestávající z -NH-CH2-CH(OH)-CH3; -NH-CH2CH2-OH; -NHCH2CH2CH2-OH; -NH-C(CH2OH)3; -NH-CH(CH2OH)2; -NH-CH2CH2-N⁺(CH3)₃Cr; -OCH₂CH₂-OH; -O-CH-(CH₂CH₂O)₂-H; -O-C-(CH₂CH₂O)₃-H; -O-CH₂CH₂-N⁺(CH₃)₃Cr;

X je kovalentní vazba nebo spojka vzorce -NH-(CH₂)_n-C(=O)-; -NH-(CH₂-CH₂-O)_o-CH₂CH₂-C(=O)-; -O-(CH₂-CH₂-O)_o-CH₂-CH₂-C(=O)-; nebo -NH-(CH₂)_q(C(=O)-NH-(CH₂)_r)_pC(=O)-; přičemž n je celé číslo od 1 do 7; oje celé číslo od 1 do 15; p, qa r jsou vzájemně nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z 1, 2 a 3; přičemž pokud X není kovalentní vazba, je skupina R² nebo R navázaná přes svou koncovou -S- nebo -NH- nebo -O- skupinu nebo přes uhlíkový atom fenylové skupiny ke koncové karbonylové skupině spojky X;

-47CZ 2022 - 167 A3 přičemž -CH2- skupiny X mohou být dále nezávisle substituovány jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny;

R je vybrané ze skupiny sestávající z -OH,

-48CZ 2022 - 167 A3

-49CZ 2022 - 167 A3

OH

kde n je celé číslo od 1 do 5;

a přičemž molekulová hmotnost polymerního konjugátu je v rozmezí od 5 000 do 500 000 g/mol.

2. Polymerní konjugát podle nároku 1, přičemž X’ je spojka vybraná ze skupiny sestávající z: S-C(=S)-; -(CH2)_p-C(=O)-; a -NH-(CH2)_n-C(=O)-; kde p a «jsou vzájemně nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z 1, 2 a 3;

a R² je vybrané ze skupiny sestávající z: -NH-(CH2)b-CH3; -NH-(CH2)b-(CH=CH-CH2)_a(CH2)b-CH3; -O-(CH2)b-CH3; přičemž a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 4 do 17; přičemž skupina R² je navázaná přes svou koncovou -NH- nebo -O- skupinu ke koncové karbonylové nebo thiokarbonylové skupině spojky X‘.

3. Polymerní konjugát podle nároku 1 nebo 2, kde hydrofobně-aktivní kotva je navázána jako postranní řetězec ke karbonylové skupině monomerní jednotky základního lineárního polymeru; přičemž od 0,5 do 10 % mol. monomerních jednotek základního lineárního polymeruje statisticky nahrazeno monomerními jednotkami obecného vzorce (I) a/nebo (II)

-50CZ 2022 - 167 A3

--N—CH_?-CH_Z —

L =_O -I

CH₇

CH_? =O (II), kde

R¹ a R²jsou definovány v nároku 1;

Xje kovalentní vazba nebo spojka vzorce -NH-(CH2)_n-C(=O)-; -NH-(CH2-CH2-O)_o-CH2-CH2C(=O)-; -O-(CH₂-CH2-O)o-CH2-CH₂-C(=O)-; nebo -NH-(CH₂)_q(C(=O)-NH-(CH₂)_r)_P-C(=O); navázaná přes svou koncovou -NH- nebo -O- skupinu ke karbonylové skupině monomerní jednotky obecného vzorce (I), přičemž n je celé číslo od 1 do 7; o je celé číslo od 1 do 15; /2, q a r jsou vzájemně nezávisle vybrány ze skupiny sestávající z 1, 2 a 3;

přičemž -CH2- skupiny X mohou být dále nezávisle substituovány jedním nebo více stejnými nebo různými postranními řetězci přirozené aminokyseliny;

přičemž platí, že pokud X není kovalentní vazba, je skupina R² je navázaná přes svou koncovou NH- nebo -O- nebo -S- skupinu nebo přes uhlíkový atom fenylové skupiny ke koncové karbonylové skupině spojky X;

a přičemž koncové skupiny lineárního polymeru jsou nezávisle vybrané ze skupiny sestávající z:

kde X, R, R¹, R² a R³ jsou definovány výše.

CH, CH,

--C—CHj-C—CHi

4. Polymerní konjugát podle nároku 3, kde Xje -NH-(CH2)_n-C(=O)-; přičemž n je vybrané ze skupiny sestávající zl,2a3;aR²je vybrané ze skupiny sestávající z: -NH-(CH2)b-CH3; -NH(CH₂)b-(CH=CH-CH₂)_a-(CH2)b-CH3; -O-(CH₂)b-CH₃; přičemž a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 4 do 17; přičemž skupina R² je navázaná přes svou koncovou -NH- nebo -O- skupinu ke koncové karbonylové skupině spojky X.

5. Polymerní konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 4, ve kterém je dále od alespoň jedné monomerní jednotky do 15 % mol. monomerních jednotek základního lineárního polymeru statisticky nahrazeno monomerními jednotkami obecného vzorce (III) a/nebo (IV)

-51 CZ 2022 - 167 A3 (ΠΙ)

---N —CH₂-CH₂ - -

- =o

CHj ch₂ =o

R⁺ (IV), kde

R¹ je definováno v nároku 1;

X je definováno v nároku 3, přičemž platí, že pokud X není kovalentní vazba, je navázané přes svou koncovou -NH- nebo -O- skupinu ke karbonylové skupině monomerní jednotky obecného vzorce (ni);

R⁴ je vybrané ze skupiny sestávající z -NH-(CH2)_X-CH2(OH); -NH-(CH2)_y-CH(OH)-CH3; -NH-(CH₂)y-CH(OH)-(CH₂)z-CH₃; a -NH-C(=O)-CH₃;kdexje celé číslo od 0 do 4,yje celé číslo od 0 do 3 a z je celé číslo od 1 do 4; přičemž platí, že pokud X není kovalentní vazba, je skupina R⁴ navázaná přes svou koncovou -NH- skupinu ke koncové karbonylové skupině spojky X.

6. Polymerní konjugát podle nároku 1 nebo 2, který obsahuje právě jednu hydrofobně-aktivní kotvu, která je přes skupinu X‘ navázána najeden konec základního lineárního polymeru, přičemž uvedený polymerní konjugát má obecný vzorec (A) , ( n

R —ý C=O i³ (A) kde

X‘, R¹, R², R³ jsou definovány v nároku 1;

s výhodou je R² vybrané ze skupiny sestávající z: -S-(CH2)_a-CH-((CH2)b-CH₃)2; -S-(CH₂)b(CH=CH-CH2)_a-(CH2)b-CH₃; přičemž α je celé číslo od 0 do 4, Z? je celé číslo od 4 do 17, a přičemž druhá koncová skupina polymerního konjugátu obecného vzorce (A) je definována v nároku 1.

7. Polymerní konjugát podle nároku 1 nebo 2, který obsahuje právě jednu hydrofobně-aktivní kotvu, která je přes skupinu X‘ navázána najeden konec základního lineárního polymeru, přičemž uvedený polymerní konjugát má obecný vzorec (A’)

R—N—CH₂- CH₂ -p =0

R· (A’) kde R² a X’ jsou definovány v nároku 1; s výhodou je R² vybrané ze skupiny sestávající z: -S(CH₂)_a-CH-((CH₂)b-CH₃)₂; -S-(CH₂)b-(CH=CH-CH₂)_a-(CH₂)b-CH₃; přičemž α je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 4 do 17;

R’ je -CH₃ nebo -CH₂CH₃,

-52CZ 2022 - 167 A3 a přičemž druhá koncová skupina polymerního konjugátu obecného vzorce (A’) je definována v nároku 1.

8. Polymerní konjugát podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 5, ve kterém je dále od alespoň jedné monomerní jednotky do 10 % mol. monomerních jednotek základního lineárního polymeru statisticky nahrazeno monomerními jednotkami obecného vzorce (V) a/nebo (VI)

R (V)

(VI), kde

R, R¹ je definováno v nároku 1;

X je definováno v nároku 3, přičemž pokud X není kovalentní vazba, je X navázané přes svou koncovou -NH- nebo -O- skupinu ke karbonylové skupině monomerní jednotky obecného vzorce (V).

9. Polymerní konjugát podle nároku 8, který je statistickým lineárním kopolymerem obecného vzorce (B)

R¹

CHj—c = f c o

R¹

I -CHj—C-= /

C O

I

X

R²

R¹ I —CHs —C— t c o

I —CH_Z

I R (B), kde

R, R¹, R², R³ jsou definovány v nároku 1;

R⁴ je definováno v nároku 5;

X je definováno v nároku 3; přičemž platí, že pokud X není kovalentní vazba, jsou skupiny R², R⁴ a R navázané přes svou koncovou -NH- nebo -O- skupinu ke koncové karbonylové skupině spojky X;

a přičemž koncové skupiny statistického lineárního kopolymeru obecného vzorce B jsou definovány v nároku 1.

10. Polymerní konjugát podle nároku 1, který je statistickým lineárním kopolymerem obecného vzorce(C)

-53CZ 2022 - 167 A3

kde

R’ je definováno v nároku 7;

R a R² jsou definovány v nároku 1;

R⁴ je definováno v nároku 5;

přičemž koncové skupiny statistického lineárního kopolymeru obecného vzorce (C) jsou definovány v nároku 1.

11. Způsob přípravy polymerního konjugátu podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 5 a 8 až 10, vyznačený tím, že zahrnuje následující kroky:

i) polymerace monomerů lineárního kopolymeru, vybraných ze skupiny zahrnující monomery obecného vzorce (W), (X), (Y), (Z) a (T)

R¹

CH₂=C

I c=o

X í⁷ (Y)

-54CZ 2022 - 167 A3 (Z)

R¹

I ch₂=c c=o

I

X

I R (T), kde R, R^1, R², R³ jsou definovány v nároku 1;

X je definováno v nároku 3;

R’ je -CH₃ nebo -CH₂CH₃ nebo -(CH₂)₂(C=O)OCH₃;

R⁷ je vybraný z

přičemž krok i) se provede roztokovou nebo srážecí radikálovou polymerací nebo RAFT polymerací nebo kationtovou polymerací za otevření kruhu; přičemž jedním z monomerů je monomer obecného vzorce (Y) a/nebo (Z) a/nebo (T) a/nebo (X), kde R’ je -(CH₂)₂(C=O)OCH₃, a celkový obsah monomerů obecného vzorce (X), kde R’ je -(CH₂)₂(C=O)OCH₃, (Y) a (Z) je v rozmezí od 0,5 do 20 mol %, vztaženo na celkový počet monomerů; a přičemž reakce se provede při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C, a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, A,A-dimethylacetamid, Α,Χ-dimethylformamid, sulfolan, methanol, ethanol, dioxan, tetrahydrofuran, propanol, isopropanol, terc-butanol, A-vinylpyrolidon, aceton, voda a vodné pufry nebo jejich směsi;

za vzniku lineárního kopolymeru;

ia) volitelně, pokud R’ je -(CH₂)₂(C=O)OCH₃, následuje krok hydrolýzy methylesterové skupiny substituentu R’ a následná reakce s thiazolidin-2-thionem za vzniku reaktivního postranního řetězce obsahujícího thiazolidin-2-thionovou skupinu;

ii) popřípadě konjugace skupin R⁷ a/nebo thiazolidin-2-thionových skupin lineárního kopolymeru z kroku i) nebo ia) s hydrofobním prekurzorem obecného vzorce R²-H, kde R² je definováno v nároku 1, za vzniku polymerního konjugátu, obsahujícího hydrofobně-aktivní kotvu navázanou amidovou nebo esterovou vazbou přes postranní řetězec monomerní jednotky;

- 55 CZ 2022 - 167 A3 iii) popřípadě konjugace skupin R⁷ a/nebo thiazolidin-2-thionových skupin lineárního kopolymeru z kroku i) nebo ia) se sloučeninou vzorce R-H, kde R je definované v nároku 1, za vzniku polymerního konjugátu, obsahujícího skupinu R navázanou amidovou nebo esterovou vazbou přes postranní řetězec monomerní jednotky;

iv) popřípadě odstranění nezreagovaných reaktivních skupin R⁷ a/nebo thiazolidin-2-thionových skupin reakcí s aminoalkoholem, vybraným ze skupiny zahrnující NH2-(CH2)_X-CH2(OH); NH2(CH₂)_y-CH(OH)-CH₃; NH₂-(CH2)y-CH(OH)-(CH₂)z-CH₃; kde x je celé číslo od 0 do 4,yje celé číslo od 0 do 3 a z je od 1 do 4; s výhodou je aminoalkoholem 1 -aminopropan-2-ol.

12. Způsob přípravy polymerního konjugátu obecného vzorce (A) podle nároku 6, vyznačený tím, že zahrnuje následující kroky:

i) polymerace monomerů obecného vzorce (W)

R¹ ch₂=c c=o I, R³ (W), kde R¹ a R³ jsou definovány v nároku 1;

přičemž krok i) se provede RAFT polymerací při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C, a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, X,X-dimethylacetamid, Α,Χ-dimethylformamid, sulfolan, methanol, ethanol, dioxan, tetrahydrofuran, propanol, isopropanol, terc-butanol, A-vinylpyrolidon, aceton, voda a vodné pufry nebo jejich směsi;

v přítomnosti přenosového činidla obecného vzorce R⁸-X“-E, kde R⁸ je fenyl, -S-(CH₂)_a-CH-((CH₂)b-CH₃)₂; -S-(CH₂)b-(CH=CH-CH₂)_a-(CH₂)b-CH₃; -S(CH2)b-CH₃; přičemž a je celé číslo od 0 do 4, b je celé číslo od 4 do 17;

X” je -S-C(=S)-;

přičemž skupina R⁸ je navázaná přes svou koncovou -S- skupinu nebo přes uhlík fenylu k thiokarbonylové skupině spojky X”; a

E je koncová skupina vybraná z:

CHj

--CHj

CN

CH₃

--ch₂

CN ^CK>

ch₃

CN

CN

O--CHj ch₃ O

--CH_?--CHj ^CN CHj

CH_a CH_a

----CH₂--GH_a a CHj

R je definované v nároku 1, s výhodou je R vybrané ze skupiny sestávající z OH,

-56CZ 2022 - 167 A3

za vzniku polymerního konjugátu obecného vzorce (A).

13. Způsob přípravy polymerního konjugátu obecného vzorce (A’) podle nároku 7, vyznačený tím, že zahrnuje krok polymerace monomerů obecného vzorce (X), kde R’ je -CH3 nebo -CH2CH3; přičemž reakce se provede kationtovou polymerizací za otevření kruhu při teplotě v rozmezí od 30 do 100 °C, a rozpouštědle s výhodou vybraném ze skupiny zahrnující dimethylsulfoxid, N,Ndimethylacetamid, Α,Χ-dimethylformamid, sulfolan, methanol, ethanol, dioxan, tetrahydrofůran, propanol, isopropanol, terc-butanol, A-vinylpyrolidon, aceton, voda a vodné pufry nebo jejich směsi;

za iniciace iniciátorem vybraným z methyl tosilátu nebo 2-fenyl-2-oxazolinium tetrafluoroborátu; za vzniku polymerního konjugátu obecného vzorce (A’)·

14. Použití polymerního konjugátu podle kteréhokoliv z předchozích nároků 1 až 10 v imunochemických metodách jako blokátoru nespecifických interakcí analytu a dalších složek analytického systému s pevnou fází a popřípadě pro zachycení specifických protilátek nebo antigenů či jiných molekul na povrch pevné fáze.

15. Použití podle nároku 14, kde imunochemické metody jsou vybrané ze skupiny zahrnující metody stanovení s luminiscenční, chemiluminisceční, fluorescenční, radioaktivní, či enzymatickou detekcí, popřípadě stanovení využívající značení koloidními kovy, s výhodou jsou imunochemické metody vybrané ze skupiny zahrnující Luminiscenční imunoanalýzu, Imunoluminometrickou analýzu, Chemiluminiscenční imunoanalýzu, Imunochemiluminometrickou analýzu, Elektrochemiluminiscenční analýzu, Fluorescenční imunanalýzu, Imunofluorometrická analýzu,