CZ308807B6 - Makromolekulární konjugáty pro vizualizaci a separaci proteinů a buněk - Google Patents

Makromolekulární konjugáty pro vizualizaci a separaci proteinů a buněk Download PDF

Info

Publication number
CZ308807B6
CZ308807B6 CZ201520A CZ201520A CZ308807B6 CZ 308807 B6 CZ308807 B6 CZ 308807B6 CZ 201520 A CZ201520 A CZ 201520A CZ 201520 A CZ201520 A CZ 201520A CZ 308807 B6 CZ308807 B6 CZ 308807B6
Authority
CZ
Czechia
Prior art keywords
conjugate
tag
gcpii
group
antibody
Prior art date
Application number
CZ201520A
Other languages
English (en)
Other versions
CZ201520A3 (cs
Inventor
Pavel Šácha
Pavel RNDr. Mg. Šácha
Jan Konvalinka
Jan doc. RNDr. Konvalinka
Jiří Schimer
Jiří Mgr. Schimer
Tomáš Knedlík
Tomáš Mgr. Knedlík
Václav Navrátil
Václav Mgr. Navrátil
Jan TYKVART
Jan Mgr. Tykvart
František Sedlák
František MUDr. Sedlák
Pavel Majer
Majer Pavel, Ph.D.
Petr CĂ­gler
Petr Mgr. Cígler
VladimĂ­r Ĺ ubr
Vladimír Ing. Šubr
Karel Ulbrich
Karel prof. Ing. Ulbrich
Jiří Strohalm
Jiří Ing. Strohalm
Original Assignee
Ústav Organické Chemie A Biochemie Av Čr, V.V.I.
Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i.
Univerzita Karlova
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Ústav Organické Chemie A Biochemie Av Čr, V.V.I., Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i., Univerzita Karlova filed Critical Ústav Organické Chemie A Biochemie Av Čr, V.V.I.
Priority to CZ201520A priority Critical patent/CZ308807B6/cs
Priority to SG11201704995QA priority patent/SG11201704995QA/en
Priority to CA2970913A priority patent/CA2970913C/en
Priority to US15/541,824 priority patent/US20180052152A1/en
Priority to EP16706122.5A priority patent/EP3245514B1/en
Priority to AU2016207126A priority patent/AU2016207126B2/en
Priority to PCT/CZ2016/050003 priority patent/WO2016112883A2/en
Publication of CZ201520A3 publication Critical patent/CZ201520A3/cs
Priority to IL253425A priority patent/IL253425B/en
Priority to US16/128,982 priority patent/US10302632B2/en
Publication of CZ308807B6 publication Critical patent/CZ308807B6/cs

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/56—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule
    • A61K47/58—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an organic macromolecular compound, e.g. an oligomeric, polymeric or dendrimeric molecule obtained by reactions only involving carbon-to-carbon unsaturated bonds, e.g. poly[meth]acrylate, polyacrylamide, polystyrene, polyvinylpyrrolidone, polyvinylalcohol or polystyrene sulfonic acid resin
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K49/00—Preparations for testing in vivo
    • A61K49/001—Preparation for luminescence or biological staining
    • A61K49/0013—Luminescence
    • A61K49/0017—Fluorescence in vivo
    • A61K49/005—Fluorescence in vivo characterised by the carrier molecule carrying the fluorescent agent
    • A61K49/0054—Macromolecular compounds, i.e. oligomers, polymers, dendrimers
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/02—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier
    • C07K17/08—Peptides being immobilised on, or in, an organic carrier the carrier being a synthetic polymer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K5/00—Peptides containing up to four amino acids in a fully defined sequence; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/10—Esters
    • C08F220/12—Esters of monohydric alcohols or phenols
    • C08F220/16—Esters of monohydric alcohols or phenols of phenols or of alcohols containing two or more carbon atoms
    • C08F220/18—Esters of monohydric alcohols or phenols of phenols or of alcohols containing two or more carbon atoms with acrylic or methacrylic acids
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/58—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen, e.g. N-methylolacrylamide, N-(meth)acryloylmorpholine
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/533—Production of labelled immunochemicals with fluorescent label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/531—Production of immunochemical test materials
    • G01N33/532—Production of labelled immunochemicals
    • G01N33/534—Production of labelled immunochemicals with radioactive label
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/60—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances involving radioactive labelled substances
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F2500/00—Characteristics or properties of obtained polyolefins; Use thereof
    • C08F2500/01—High molecular weight, e.g. >800,000 Da.

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
  • Medicinal Preparation (AREA)

Abstract

Makromolekulární vodorozpustné konjugáty založené na syntetickém kopolymeru, na nějž jsou kovalentní vazbou připojeny alespoň jedna afinitní kotva, alespoň jedna reportérová skupina a alespoň jedna směrovací skupina. Tyto makromolekulární konjugáty lze použít pro identifikaci, vizualizaci, kvantifikaci nebo izolaci proteinů a/nebo buněk.

Description

Vynález popisuje synteticky připravené makromolekuly mající vlastnosti monoklonálních protilátek, které mohou nahradit v jejich použití ve vědeckém výzkumu, v diagnostice, při biochemických vyšetřeních a při přípravě cíleně působících léčiv. Tyto syntetické makromolekuly, cíleně připravené a vážící se specificky na dané proteiny, jsou vhodné pro vizualizaci, identifikaci či izolaci biomolekul a/nebo buněk v biochemii, molekulární biologii a medicíně a jako směrující Ugandy ve farmacii a diagnostice.
Dosavadní stav techniky
Objev a následné používání monoklonálních protilátek umožňujících rozpoznávání a specifickou vazbu biologicky důležitých molekul způsobilo revoluci v biochemii a molekulární biologii, stejně jako v diagnostice aterapii mnoha závažných onemocnění. Ve vědeckém prostředí vedl tento objev k rozvoji mnoha důležitých metod dnes považovaných za rutinní, jako jsou Western blot, imunohistochemie, imunoprecipitace, průtoková cytometric či (konfokální) mikroskopie. Schopnost protilátek specificky vázat určité (makro)molekuly vedla k jejich použití jako terapeutických látek, které mohou účinkovat buď samy o sobě, či po jejich konjugaci s určitou biologicky aktivní látkou. Terapie pomocí monoklonálních protilátek dosáhla významných úspěchů v léčbě mnoha různých chorob, zejména různých typů autoimunitních poruch a různých typů nádorů [1]. V současnosti existuje přes 40 monoklonálních protilátek, které jsou schváleny americkou FDA a používány v terapii [2].
I přes značné úspěchy má používání monoklonálních protilátek i několik nevýhod. Výroba protilátek je především finančně velice nákladná. Jelikož molekuly protilátek jsou velké glykosylované proteiny obsahující disulfidové vazby, je produkce protilátek vázáná na eukaryotický expresní systém, který umožňuje provádět zmíněné posttranslační modifikace. Jakožto proteiny jsou molekuly protilátek náchylné k degradaci: obecně musejí být uchovávány při snížené teplotě, příp. zamrazené v alikvotech. Jejich opakované rozmrazování často vede ke ztrátě jejich schopnosti vázat daný antigen. Další nevýhodou je jejich způsob vlastního vzniku a přípravy, jelikož imunizace zvířete nemusí vést k úspěšné produkci protilátek - ty se často nemusí vůbec produkovat či mohou být nespecifické vůči danému antigenu. Jinou nevýhodou pak je fakt, že pro blízkou skupinu enzymů (tzv. homology; ať už paralogy či orthology) se často nedá použít tatáž protilátka (rozpoznávající nativní proteiny) v důsledku odlišností aminokyselinových zbytků na jejich povrchu.
Polymer vzniklý homopolymerací Whydroxypropytymethakrylamidu (HPMA) je netoxický, biokompatibilní, neimunogenní a ve vodě rozpustný. Původně byl vytvořen pro použití jako syntetická náhrada krevní plazmy, v současnosti se díky svým vlastnostem využívají kopolymery HPMA jako nosiče při vývoji polymemích léčiv a zobrazovacích sloučenin, zejména různých typů protinádorových léčiv [3-4], Většina HPMA kopolymerů jsou multivalentní makromolekuly umožňující kovalentní připojení více typů nízkomolekulámích sloučenin jako jsou léčiva, radionuklidy či fluorescenční sondy. Stejně tak dovolují i vazbu různých makromolekul, např. (glyko)proteinů, oligonukleotidů a polynukleotidů. Multivalence těchto kopolymerů umožňuje připojení jak pouze jediného typu molekul, tak i kombinace různých molekul [5-7],
Předkládaný vynález kombinuje výhody specifického cílení proteinů pomocí jejich specifických ligandů s univerzálností a stabilitou polymemího řetězce.
- 1 CZ 308807 B6
Podstata vynálezu
Předkládaný vynález poskytuje makromolekulami konjugát syntetického kopolymerů se třemi typy nízkomolekulámích funkčních sloučenin (zde nazývány také jako funkční skupiny, tj. afmitní kotva, reportérová skupina a směrovací skupina; toto označení se vztahuje k jejich funkci ve výsledném konjugátu a nemá nic společného s tzv. chemickými funkčními skupinami). Syntetický kopolymer vytváří kostru makromolekulámího konjugátů, na kterou jsou kovalentní vazbou připojeny molekuly funkčních skupin: (a) afmitní kotvy, (b) reportérové skupiny, což může být například fluorescenční sloučenina, radionuklid nebo komplex kovu, (b) směrovací skupiny umožňující specifické cílení tohoto konjugátu na daný protein. Směrovací skupina je na polymemí řetězec připojena pomocí flexibilní spojky. Schéma tohoto konjugátu je uvedeno na obr. 1.
Syntetický kopolymer je s výhodou vodorozpustný.
Příprava syntetického kopolymerů byla popsána již dříve [7-8]; polymery obsahují monomery:
alespoň jeden typ monomeru vzorce 1:
(1), kde: R1 je vybráno z H, CH3;
R2 je vybráno z NH2, NH-CH2-CH(OH)-CH3, NH-CH3, NH-CH2CH3, NH-CH2CH2-OH, NH-CH2CH2CH2-OH, NHC(CH2OH)3, NH-CH2CH2-N(CH3)3C1- O-CH2CH2-OH, O(CH2CH2O)2-H O-(CH2CH2O)3-H, O-CH2CH2-N+(CH3)3C1- NH-(CH2)3N+(CH3)2-(CH2)2-COO-;
a alespoň jeden typ monomeru vzorce 2:
(2), kde: R1 je vybráno z H, CH3, a
X je vybráno z NH-(CH2)2-CO, NH-(CH2)3-CO, NH-(CH2)4-CO, NH-(CH2)5-CO, Gly, GlyGly, GlyPheLeuGly, a
R3 je vybráno z
-2 CZ 308807 B6
(R3 představuje reaktivní skupinu).
Obsah reaktivních skupin (tj. obsah monomeru vzorce 2) v kopolymerů je s výhodou v rozmezí 0,5 až 30 % mol., výhodněji 2 až 20 % mol.
V polymemím konjugátu je alespoň jedna reaktivní skupina R kopolymerů nahrazena směrovací skupinou, alespoň jedna reaktivní skupina R je nahrazena afmitní kotvou, a alespoň jedna reaktivní skupina Rje nahrazena reportérovou skupinou. S výhodou je uvedenými skupinami nahrazena více než jedna reaktivní skupina R3. Výhodněji je uvedenými skupinami nahrazeno více než 50 % reaktivních skupin R3, ještě výhodněji 100 % reaktivních skupin R3. Reaktivní skupiny zbývající v polymemím řetězci po konjugaci jsou vždy nahrazeny l-aminopropan-2-ol skupinou.
Jako základní kopolymer je možno s výhodou použít kopolymer HPMA, tj. poly(HPMA-co-Maβ-Ala-TT); kopolymer připravený klasickou radikálovou roztokovou kopolymerací nebo řízenou radikálovou kopolymerací (např. RAFT-kopolymerací, reversible addition-fragmentation chaintransfer) A-(2-hydroxypropyl)mcthak ryl amidu (HPMA) a 3-(3methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thionu (Ma-β-Ala-TT). Obsah HPMA je s výhodou v rozmezí 70 až 98 % mol., obsah reaktivních thiazolidin-2-thionových skupin je 2 až 30 % mol.
Funkční sloučeniny jsou připojeny k polymemímu řetězci přes amidovou vazbu, jež vznikne reakcí aminoskupiny přítomné na molekule funkční sloučeniny, tj. afmitní kotvy, reportérové skupiny a směrovací skupiny, a reaktivní skupiny (s výhodou thiazolidin-2-thionové) přítomné na polymemím řetězci.
Molekulová hmotnost konjugátu je s výhodou v rozmezí 1000 až 500 000 g/mol, s výhodou v rozmezí 20 000 až 15 000 g/mol.
Afmitní kotvou může být například biotin. S využitím velmi silné interakce biotinavidin/streptavidin/neutravidin je možné tento konjugát snadno a specificky imobilizovat na různé typy nosičů na bázi Streptavidin Sepharosy, čímž je možno tento konjugát separovat ze směsi buď pomocí centrifugace či magnetické interakce (závislé na typu nosiče). Jelikož je interakce biotinu s avidinem/streptavidinem/neutravidinem velmi silná (Kd ~ 1015), nehrozí prakticky žádná možnost disociace konjugátu z tohoto nosiče. Biotin je možné využít i pro vazbu jiných proteinů, které jsou konjugovány se streptavidinem (buď chemicky či genetickou fúzí) - např. neutravidin konjugovaný s křenovou peroxidasou, čehož se dá využít například v metodě ELISA.
Afmitní kotvou může být mimo biotinu například také His-tag (polyhistidinová sekvence, nej častěji šest histidinů za sebou, vázaná komplexem chelatačního činidla a niklu), FLAG tag (sekvence DYKDDDDK rozpoznávaná protilátkou), hemagglutininový tag (sekvence aminokyselin YPYDVPDYA odvozená od povrchového glykoproteinu chřipkového viru, hemagglutininu, rozpoznávaná protilátkou), Strep-tag oktapeptidová sekvence WSHPQFEK vázaná modifikovaným streptavidinem - Strep-Tactinem), Avi-Tag (peptidová sekvence rozpoznávaná biotinligasou, biotinylace umožňuje následnou izolaci pomocí streptavidinu), GST (glutathion-S-transferasa; enzym vázající glutathion), c-myc-tag (peptidová sekvence EQKLISEEDL rozpoznávaná protilátkou), V5-tag (peptidová sekvence GKPIPNPLLGLDST rozpoznávaná protilátkou), E-tag (peptidová sekvence GAPVPYPDPLEPR rozpoznávaná
-3 CZ 308807 B6 protilátkou), S-tag (peptidová sekvence KETAAAKFERQHMDS rozpoznávaná protilátkou), SBP-tag (delší peptidová sekvence vázaná streptavidinem), poly(Glu)-tag (polyglutamátová sekvence, např. hexaglutamát, vázající se na aniontové iontoměniče), kalmodulinový tag (delší peptidová sekvence vázaná kalmodulinem) či jiná sloučenina schopná imobilizace na pevnou fázi.
Reportérovou skupinou může být fluorofor, s výhodou fluorofor ATTO488, umožňující vizualizaci polymeru a částic či buněk, na které je konjugát navázán. Díky tomu je možné konjugát použít v metodách jako jsou např. průtoková cytometrie (a odvozená technika FACS; Fluorescence activated cell sorting; separující buňky na základě jejich fluorescence při dané vlnové délce) či imunocytochemie a imunohistochemie. Pro případné in vivo zobrazování (imaging) je možné s výhodou použít fluorofor s emisí záření ve vzdáleně červené oblasti spektra (far-red fluorescence), např. DY676, jelikož záření s delší vlnovou délkou prochází tkání lépe než záření o kratší vlnové délce.
V jiném provedení vynálezu (nukleární magnetická rezonance; MRI) může reportérovou skupinou být komplex kovu, např. lanthanoidu (zejména Gd, Mn, příp. Dy, Eu). V dalším provedení (pozitronová emisní tomografie; PET) může reportérovou skupinou být komplex radionuklidu, např. vybraného ze skupiny zahrnující 64Cu, 68Ga, 18F. V jiném provedení (jednofotónová emisní počítačová tomografie, SPÉCT) může být reportérovou skupinou také komplex radionuklidu vybraného ze skupiny 99mTc, 123I 125I, 131I, 57Co, 51Cr, 67Ga, 64Cu, inIn, 90Y. Ligandy vhodné pro komplexaci uvedených kovů jsou dobře známy v oboru, například makrocyklické ligandy, deriváty cyklopentadienylu, fosfmové a azinové ligandy. V dalším provedení (elektrochemiluminiscence) může reportérovou skupinou být komplex ruthenia [Ru(Bpy)3]2+.
Směrovací skupina, tedy nízkomolekulámí látka, zajišťuje specifické cílení celého konjugátu na určitý protein. Směrovací skupinou může být inhibitor nebo substrát enzymu, agonista nebo antagonista receptoru, ligand proteinového přenašeče či jiná látka příp. sloučenina schopná selektivní vazby na určitý protein či peptidovou sekvenci. Při použití nízkomolekulámí sloučeniny vázající určitý protein je specifita cílení výsledného konjugátu dána především vlastnostmi této nízkomolekulámí sloučeniny. Jelikož směrovací skupina se většinou váže do místa vykonávajícího určitou biologickou funkci, vyžaduje tato vazba biologicky aktivní protein, tedy v jeho nativní konformaci. Tímto způsobem je možné, na rozdíl od velkého množství protilátek vázajících sekvenční epitop, rozlišit mezi biologicky aktivní a neaktivní formou daného enzymu.
Směrovací skupina může být na syntetický kopolymer připojena prostřednictvím flexibilní spojky, například spojky na bázi (oligo)polyethylenglykolu, peptidu, nukleové kyseliny či oligosacharidu. Spojka umožňuje vazbu inhibitoru do aktivního místa enzymu tak, aby nedocházelo ke sterickému bránění této vazby polymerem a zároveň je díky této spojce možné cílit i enzymy s aktivním místem skrytým ve vazebné dutině enzymu. S výhodou je spojka vybrána ze skupiny zahrnující spojky na bázi polyethylenglykolu, peptidu, s výhodou peptidu o molekulové hmotnosti 100 až 5000 g/mol, nebo nukleové kyseliny, s výhodou nukleové kyseliny obsahující 1 až 40 nukleotidů, nebo oligosacharidu, s výhodou oligosacharidu obsahujícího 1 až 40 monosacharidů.
Oproti v současnosti používaným protilátkám, předkládané syntetické molekuly podle vynálezu přinášejí několik výhod. Příprava polymemích konjugátů je nepříliš nákladná a v porovnání s protilátkami, v případě že existuje inhibitor daného enzymu, jsou konjugáty i relativně snadno připravíteIné. Polymemí konjugáty jsou chemicky výrazně stabilnější a jejich roztoky mohou být opakovaně rozmrazovány a zamrazovány bez výraznějšího vlivu na jejich schopnosti vázat daný enzym. Jednou z největších výhod těchto konjugátů je fakt, že díky přítomnému inhibitoru se váží do aktivního místa enzymu, a tak váží pouze enzymaticky aktivní formu tohoto enzymu a tudíž vždy jen nativní protein. Protilátky tuto schopnost postrádají. Další výhodou je nebiologický původ polymemí kostry - v mnoha metodách se složitými matricemi (např. imunoprecipitace z krevní plazmy, apod.) dochází ke kompetaci endogenních protilátek či příp. jiných proteinů s danými protilátkami použitými v daném experimentu, což často vede ke snížení úspěšnosti experimentu až k jeho neproveditelnosti (např. častý vznik falešných pozitivit u metody ELISA).
-4 CZ 308807 B6
Polymemí konjugáty, jakožto syntetické molekuly založené na zcela jiné bázi, těmito problémy netrpí a mohou tak být použity bez problémů. Neméně důležitým faktem je i fakt, že aktivní místo enzymů bývá většinou nej konzervovanějším místem celého enzymu; díky tomu je možné použít jeden inhibitor (a tudíž jeden konjugát) pro celou skupinu enzymů. Tato skupina může být poměrně malá (např. homologní proteiny; dva paralogy u jednoho organismu, či orthology u dvou různých organismů), ale může to být i např. celý typ enzymů (aspartátové proteasy apod.). U protilátek se tohoto nemůže nikdy dosáhnout, jelikož váží pouze povrch enzymů, tedy část velmi variabilní.
Zásadní výhodou systému polymemího konjugátu je jeho modularita. Jelikož jednotlivé funkční sloučeniny jsou připojovány na polymemí kostru prostřednictvím amidové vazby vzniklé reakcí aminoskupiny přítomné na funkční sloučenině a reaktivní (např. thiazolidin-2-thionové) skupiny přítomné na polymeru, je možné substituovat polymemí řetězec dle potřeby. Např. fluorofory je možno zaměnit za jiné (obsahují-li aminoskupinu) podle požadované vlnové délky. Je také možné mít několik typů fluoroforů na jednom polymemím řetězci. Výhodou je pak spíše přítomnost několika různých inhibitorů na jednom polymeru než více fluoroforů. Tímto se zajistí specifita konjugátu proti dvěma (či více) enzymům při použití jednoho konjugátu.
V příkladech této patentové přihlášky j sou popsány metody, j ež j sou běžně používány v biochemii a molekulární biologii a jež využívají protilátky. Jedná se o metodu ELISA, imunoprecipitace (resp. pull-down v případě použití látky neprotilátkového charakteru), imunocytochemie, Western blot, průtoková cytometric a povrchová plazmonová rezonance. Metody byly vybrány pro ilustraci širokých možností použití těchto polymemích konjugátů a demonstraci modularity a univerzálnosti tohoto přístupu.
ELISA (z angl. Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay) je imunologická metoda, jež ve svém sendvičovém uspořádání se dvěma různými látkami umožňuje kvantifikaci množství daného proteinu. Nejprve je primární protilátka proti danému proteinu sorbována na povrch destičky a neobsazený povrch destičky je zablokován roztokem kaseinu. Poté je přidán vzorek se stanovovaným proteinem a po jeho navázaní na protilátku je přidán polymemí konjugát vázající tento protein. Množství navázaného konjugátu je stanoveno pomocí Neutravidinu (konjugovaného s křenovou peroxidasou) vázajícího biotin přítomný na konjugátů. Mimo tento způsob stanovení množství konjugátu (chemiluminiscenčně) je možné jeho koncentraci stanovit i fluorescenčně pomocí fluoroforů přítomném na konjugátů. Alternativně k výše uvedenému postupu metody ELISA lze taktéž imobilizovat i polymemí konjugát vazbou na neutravidin/streptavidin sorbovaný na povrch destičky (skrze vazbu biotin-streptavidin). Po vazbě stanovovaného proteinu je přidána primární protilátka proti danému proteinu, jejíž množství je poté stanoveno pomocí sekundární protilátky konjugované s křenovou peroxidasou. Biotin přítomný na konjugátu tak lze použít jak pro imobilizaci, tak i pro detekci, naopak fluorofor pouze pro detekci.
Z výše uvedeného je zřejmé (jelikož polymemí konjugáty se váží na daný protein specificky přes směrovací skupinu), že je možné tento princip využít pro testování různých látek. Při prvním způsobu, kdy je studovaný protein navázán na sorbovanou primární protilátku, je směs konjugátu a potenciálního inhibitoru (nemusí se jednat o inhibitor v pravém, enzymologickém, smyslu slova, ale obecně o látku vázající se místo konjugátu a kompotující s ním o vazbu na studovaný protein, angl. binder) ponechána vázat se společně na studovaný protein. Z poměru navázaného a nenavázaného konjugátu pak lze zjistit sílu vazby. Analogicky, je-li konjugát imobilizován na sorbovaný streptavidin a na něj se váže studovaný protein, je opět možné přidat ke studovanému proteinu vzorek potenciálního inhibitoru a testovat tak, zdali inhibitor překáží vazbě proteinu na konjugát.
Imunoprecipitace (resp. pull-down, tj. analogická metoda využívající jiné látky než protilátky) spočívá v navázání polymemího konjugátu na pevnou fázi, např. streptavidin sepharosu. Po odmytí nenavázaného konjugátu je nosič s navázaným konjugátem inkubován se vzorkem obsahujícím protein rozpoznávaný konjugátem. Po inkubaci je nosič promyt a daný protein je z nosiče uvolněn (zahřátím v přítomnosti SDS, změnou pH, změnou iontové síly apod.). Alternativně lze polymemí
- 5 CZ 308807 B6 konjugát přidat přímo ke vzorku a vzniklé komplexy konjugát-protein separovat ze vzorku přidáním streptavidin sepharosy.
Imunocytochemie spočívá ve vizualizaci proteinů, buněčných struktur a buněk prostřednictvím (konfokální) fluorescenční mikroskopie. Buňky narostlé na vhodném mikroskopovacím podkladu jsou nejprve inkubovány v přítomnosti polymemího konjugátů, po jeho odmytí a případném zafixování buněk (formaldehydem) či obarvení jader buněk (pomocí barviva DAPI či Hoechst) je navázaný polymemí konjugát vizualizován pomocí fluorescenční mikroskopie, s výhodou pak konfokální mikroskopie.
Průtoková cytometric umožňuje detekci povrchových proteinů buněk; následně pak počítání, třídění a separaci buněk. Buňky jsou nejprve inkubovány v přítomnosti polymemího konjugátu a poté jsou buňky suspendovány v roztoku. Buněčná suspenze poté prochází kapilárou, kde dochází k detekci fluorescenčně značených konjugátů navázaných na daném povrchovém antigenu. Na základě přítomnosti či nepřítomnosti fluorescence na povrchu buňky (tj. přítomnosti či nepřítomnosti daného povrchového antigenu) je možné buňky od sebe separovat (tzv. FACS, z angl. fluorescence-activated cell sorting).
Měření povrchové plazmonové rezonance (SPR) je biofýzikální technika analyzující průběh vazby (a následně pak sílu této vazby) dvou interagujících látek. V jednom uspořádání umožňuje stanovení disociační konstanty pro vazbu protein-konjugát; v jiném pak lze použít polymemí konjugát pro imobilizaci daného proteinu na povrch biosenzom a následně analyzovat vazbu mezi daným proteinem a další látkou. V prvním případě je na protilátku imobilizovanou na zlatý čip biosenzom navázán daný protein a poté je analyzována vazba konjugátu na tento protein. V druhém případě je na neutravidin imobilizovaný na zlatém čipu biosenzom navázán nejprve polymemí konjugát, na ten poté určitý protein a poté je analyzována vazba testované látky na tento protein.
Podle vynálezu lze poskytnout například konjugáty, které umožňují cílení glutamátkarboxypeptidasy II (GCPII), glutamátkarboxypeptidasy III (GCPIII), HIV-1 proteasy, aspartátových proteas, karbonické anhydrasy II (CA-II), karbonické anhydrasy VII (CA-VII), karbonické anhydrasy IX (CA-IX).
Glutamátkarboxypeptidasa II je membránová metalopeptidasa, exprimovaná zejména v centrální nervové soustavě (účastnící se zde degradace neurotransmitem N-acetyl-L-aspartyl-glutamátu; odštěpený volný glutamát poté způsobuje glutamátovou excitotoxicitu) a prostatě. Díky zvýšené expresi v karcinomu prostaty a neovaskulaturách většiny pevných nádorů se o GCPII již několik let uvažuje jako o cíli terapeutického zásahu (jak pro vizualizaci nádorů, tak pro cílené doručování léčiv).
Oblast použití předloženého vynálezu je nejen ve vědeckém výzkumu, konkrétně oblast biochemie a molekulární biologie a jejich metody využívající protilátky, ale i při diagnostice, v biochemických laboratořích při biochemických vyšetřeních a při specifické separaci biologicky aktivních látek.
Objasnění výkresů
Obr. 1 zobrazuje schematickou stmktum polymemích konjugátů.
Obr. 2 zobrazuje stmktum inhibitoru určeného k cílení GCPII.
Obr. 3 zobrazuje stmktum inhibitom určeného k cílení CA-IX.
Obr. 4 zobrazuje stmktum konjugátu 1 určeného k cílení GCPII.
-6CZ 308807 B6
Obr. 5 zobrazuje strukturu srovnávacího konjugátu 2 bez inhibitoru sloužícího jako negativní kontrola.
Obr. 6 zobrazuje strukturu konjugátu 3 určeného k cílení CA-IX.
Obr. 7A zobrazuje gel barvený stříbrem demonstrující afinitní izolaci GCPII (pull-down) z lyzátu buněk LNCaP pomocí konjugátu 1. Dráha 1: All Blue Marker (0,5 μΐ); 2: standard rhGCPII (50 ng); 3: Lyzát buněk LNCaP; 4: FT: konjugát 2 (negativní kontrola); 5: FT: konjugát 1; 6: FT: protilátka 2G7; 7: FT: negativní kontrola pro protilátku 2G7; 8: Eluce: konjugát 2 (negativní kontrola); 9: Eluce: konjugát 1; 10: Eluce: protilátka 2G7; 11: Eluce: negativní kontrola pro protilátku 2G7. Do všech drah bylo naneseno 8 μΐ vzorku.
Obr. 7B zobrazuje Western blot demonstrující afinitní izolaci GCPII (pull-down) z lyzátu buněk LNCaP pomocí konjugátu 1. Pro vizualizaci GCPII byla použita protilátka GCP-04 [9], Dráha 1: All Blue Marker (0,5 μΐ); 2: standard rhGCPII (5 ng); 3: Lyzát buněk LNCaP; 4: FT: konjugát 2 (negativní kontrola); 5: FT: konjugát 1; 6: FT: protilátka 2G7; 7: FT: negativní kontrola pro protilátku 2G7; 8: Eluce: konjugát 2 (negativní kontrola); 9: Eluce: konjugát 1; 10: Eluce: protilátka 2G7; 11: negativní kontrola pro protilátku 2G7. Do všech drah bylo naneseno 6 μΐ vzorku.
Obr. 8 zobrazuje typický průběh vazby konjugátu 1 na Avi-GCPII analyzovaný pomocí SPR (povrchová plazmonová rezonance). Extracelulámí rekombinantní GCPII (Avi-GCPII) byla imobilizována na zlatý čip pokrytý protilátkou D2B proti nativní GCPII. Poté byly na připravenou vrstvu aplikovány čtyři různé koncentrace konjugátu 1 (a) 8 nM; b) 4 nM; c) 2 nM; d) 1 nM) a byla monitorována asociační a disociační fáze vazby. Získané křivky byly zpracovány a následně fitovány v programu TraceDrawer v. 1.5 (Ridgeview Instruments AB, Švédsko).
Obr. 9 zobrazuje průtokovou cytometrii s buňkami exprimujícími GCPII (LNCaP) a neexprimujícími GCPII (PC-3). Buňky byly inkubovány v přítomnosti lOnM konjugátu 1 nebo konjugátu 2 a poté analyzovány na cytometru BD LSR Fortessa™.
Obr. 10 zobrazuje imunocytochemii pomocí konjugátu 1 a konjugátu 2. Buňky LNCaP (exprimující GCPII) a PC-3 (neexprimující GCPII) byly inkubovány v přítomnosti 10 nM konjugátu 1 či konjugátu 2; pro ověření selektivity vazby byly buňky inkubovány i v přítomnosti 10 nM konjugátu 1 či konjugátu 2 a 500 nM inhibitoru 2-PMPA. Jádra buněk byla obarvena pomocí Hoechst 33258 a buňky byly pozorovány pomocí konfokálního mikroskopu Zeiss LSM 780.
Obr. 11 zobrazuje imunocytochemii pomocí konjugátu 3 a konjugátu 2. Buňky HT-29 exprimující CA-IX byly inkubovány v přítomnosti 1 μΜ konjugátu 3 či konjugátu 2. Jádra buněk byla obarvena pomocí Hoechst 33258 a buňky byly pozorovány pomocí konfokálního mikroskopu Zeiss LSM 780.
Obr. 12 zobrazuje typický průběh vazby CA-IX na konjugát 3 analyzovaný pomocí SPR (povrchová plazmonová rezonance). Konjugát 3 byl navázán na streptavidin imobilizovaný na povrchu zlatého čipu. Poté byly na připravenou vrstvu aplikovány čtyři různé koncentrace rekombinantní CA-IX v TBS (a) 510 nM; b) 255 nM; c)128nM; d) 64 nM) a byla monitorována asociační a poté disociační fáze vazby (aplikace pouze TBS). Získané křivky byly zpracovány a následně fitovány v programu TraceDrawer v. 1.5 (Ridgeview Instruments AB, Švédsko).
Obr. 13 zobrazuje Western blot demonstrující afinitní izolaci CA-IX (pull-down) z lyzátu buněk HT-29 pomocí konjugátu 3. Protein CA-IX byl na membráně vizualizován pomocí protilátky M75. Dráha 1: All Blue Marker (2 μΐ); 2: Lyzát buněk HT-29 (Load); 3: volná dráha; 4: Eluce: konjugát 3; 5: Eluce: konjugát 2; 6: Eluce: protilátka M75; 7: Eluce: negativní kontrola pro protilátku M75; 8: volná dráha; 9: FT: konjugát 3; 10: FT: konjugát 2; 11: FT: protilátka M75; 12: FT: negativní kontrola pro protilátku M75. Do všech drah bylo naneseno 10 μΐ vzorku.
-7 CZ 308807 B6
Příklady uskutečnění vynálezu
I. Syntéza specifických inhibitorů
Všechny použité chemikálie pocházely od firmy Sigma-Aldrich, není-li uvedeno jinak. Všechny inhibitory testované v biologických esejích byly vyčištěny pomocí preparativního HPLC systému Waters Delta 600 (průtok 7 ml/min; gradient zobrazený pro každou sloučeninu, včetně retenčních časů) s kolonou Waters SunFire Cl 8 OBD Prep Column, 5 pm, 19x150 mm. Čistota sloučenin byla ověřena na analytickém HPLC systému Jasco PU-1580 HPLC (průtok 1 ml/min, s konstantním gradientem 2 až 100 % acetonitrilu ve 30 min; retenční čas zobrazen pro každou sloučeninu) s kolonou Watrex C18 Analytical Column, 5 pm, 250x5 mm. Finální sloučeniny byly minimálně 99% čistoty a jejich struktura byla dále potvrzena pomocí HR-MS na LTQ Orbitrap XL (Thermo Fisher Scientific) a pomocí NMR (Bruker Avance I™ 500 MHz vybavený kryo-sondou). Všechny uvedené interakční konstanty jsou v Hz.
Příklad 1: Příprava inhibitoru GCPII s linkerem (sloučenina A)
a) NaBH3CN, MeOH + 1%AcOH; b) 1)TBTU, DIEA, DMF; 2)TFA
Di-terc-butyl 2-(3-(6-((4-brombenzyl)amino)-1 -(terc-butoxy)-1 -oxohexan-2yl)ureido)pentandioát; sloučenina A3: 300 mg (0,615 mmol, 1 ekv.) di-terc-butyl 2-(3-(6-amino4(terc-butoxy)-l-oxohexan-2-yl)ureido)pentandioátu (sloučenina Ai, připravené podle [10]) a 120 mg (0,646 mmol, 1,05 ekv.) 4-brombenzaldehydu bylo rozpuštěno v 5 ml methanolu v láhvi s kulatým dnem. Bylo přidáno 50 pl ledové kyseliny octové a po rychlém promíchání dále 120 mg (1,85 mmol, 3,0 ekv.) kyanoborohydridu sodného v jedné dávce. Po 12 hodinách byla reakce zastavena přidáním 10 ml vody. Reakční směs byla po 10 minutách dále zředěna 50 ml vody a byla třikrát vytřepána ethylacetátem (3x 25 ml). Organická fáze byla vysušena a odpařena a surový produkt byl čištěn pomocí chromatografie na silikagelu (mobilní fáze: EtOAc + 1 % nasycený amoniak ve vodě, TLC analýza, Rf = 0,55). Hmotnost získaného čistého produktu byla 395 mg (výtěžek = 48 %).
- 8 CZ 308807 B6
Analytické HPLC (gradient 2 až 100 %, 30 min) RT = 23,4 min. HR-MS (ESI+): spočítáno pro C3iH5iO7N3Br [M]+ 656,29049. Nalezeno 656,29062. ŘNMR (500 MHz; DMSO-d6): 7,47 (m; 2H; m-Ph); 7,27 (m; 2H; o-Ph); 6,29 (d; 1H; J = 8,5; HN-Glu-2); 6,24 (d; 1H; J = 8,4; HN-Lys-2); 4,02 (btd; 1H; J1 = 8,6; J2 = 5,1; Glu-2); 3,96 (td; 1H; J1 = 8,1; J2 = 5,4; Lys-2); 3,62 (s; 2H; CH2Ph); 2,41 (t; 2H; J = 7,1; Lys-6); 2,25 (ddd; 1H; J1 = 16,6; J2 = 8,8; J3 = 6,8; Glu-4b); 2,18 (ddd; 1H; J1 = 16,6; J2 = 8,8; J3 = 6,1; Glu-4a); 1,86 (m; 1H; Glu-3b); 1,66 (m; 1H; Glu-3a); 1,57 (m; 1H; Lys-3b); 1,49 (m; 1H; Lys-3a); 1,40 (m; 2H; Lys-5); 1,38 (bs; 27 H; tBu); 1,29 (m; 2H; Lys4). 13CNMR (125,7 MHz; DMSO-d6): 172,50 (Lys-1); 172,11 (Glu-1); 171,63 (Glu-5); 157,31 (NH-CO-NH); 140,83 (/-Ph); 131,07 (m-Ph); 130,26 (o-Ph); 119,52 (p-Ph); 80,76 (CH(CH3)3); 80,45 (CH(CH3)3); 79,95 (CH(CH3)3); 53,18 (Lys-2); 52,38 (CH2-Ph); 52,36 (Glu-2); 48,49 (Lys6); 32,17 (Lys-3); 31,07 (Glu-4); 29,24 (Lys-5); 27,93 (CH(CH3)3); 27,84 (CH(CH3)3); 27,82 (CH(CH3)3); 27,77 (Glu-3); 23,03 (Lys-4), (24S,28S)-19-(4-brombenzyl)-24,28,30-trikarboxy-18,26-dioxo-3,6,9,12,15-pentaoxa-19,25,27triazatroakontan-l-aminium, 2,2,2-trifluoracetát, sloučenina A: 137 mg (0,34 mmol, 1,1 ekv.) BocNH-PEGs-COOH (PurePEG, LLC) bylo rozpuštěno v 1 ml DMF spolu s 1222 mg (0,38 mmol, 1,25 ekv.) TBTU. Poté bylo ke směsi najednou přidáno 132 μΐ (0,76 mmol, 2,5 ekv.) DIEA a směs byla 10 min míchána. Poté bylo ke směsi přidáno 200 mg (0,30 mmol, 1 ekv. sloučeniny A2 rozpuštěné v 1 ml DMF a průběh reakce byl monitorován pomocí TLC dokud sloučenina A2 nevymizela (cca 4 h). DMF byl poté odstraněn pomocí rotační odparky, reakční směs byla rozpuštěna v 20 ml ethylacetátu a vytřepána dvakrát nasyceným roztokem NaHCO3, dvakrát 10 % KHSO4 a jedenkrát solankou. Organická fáze byla vysušena a odpařena pomocí rotační odparky do sucha. Následně byl k olejovitému surovému produktu přidán 1 ml TFA a sonikováno 15 min. TFA bylo odstraněno proudem dusíku a produkt byl nakonec vyčištěn pomocí preparativního HPLC. (gradient: 15 až 50 % ACN, Rt = 33 min). Hmotnost získaného produktu byla 83,4 mg (výtěžek izolace byl 30 %).
Analytické HPLC (grád. 2 až 100%, 30 min): Rt= 17,1 min. HR-MS (ESI-): spočítáno pro C32H50Oi3N4Br [Μ]' 777,25632. Nalezeno 777,25681.
Příklad 2: Syntéza inhibitoru karbonické anhydrasy IX (sloučenina B)
Sloučenina B byla připravena podle níže uvedeného schématu:
a) (terc-butyl (4-hydroxybutyl)karbamát, (Ph)3P, DIAD, THF;
b) 5M NaOH, MeOH/H20, reflux 6 hod;
c) 1) DPPA, DIEA, Tol, RT až 90 °C; 2) sulfanilamid, ACN, 60 °C;
-9CZ 308807 B6
d) TFA;
e) 1) BOC-PEG5-COOH, TBTU, DIEA, DMF; 2) TFA methyl 4-(4-((terc-butoxykarbonyl)amino)butoxy)benzoát, sloučenina Bi: V 10 ml THF bylo smícháno 161 mg (1 ekv., 1,06 mmol) methyl 4-hydroxybenzoátu, 300 mg (1,5 ekv., 1,59 mmol) terc-butyl (4-hydroxybutyl)karbamátu a 400 mg (1,5 ekv., 1,59 mmol) trifenylfosfínu. Do roztoku bylo poté najednou přidáno 312 μΐ (1,5 ekv., 1,59 mmol) DIAD a reakce byla míchána přes noc. Reakční směs byla poté odpařena a surový produkt byl vyčištěn pomocí kolonové chromatografíe (He:EtOAc 4:1, RF = 0,25). Hmotnost získaného bílého prášku byla 260 mg, což představuje výtěžek 75 %.
Pozn: methyl 4-hydroxybenzoát měl stejný RF jako produkt, proto byl používán 1,5 ekv. u dalších sloučenin.
MS (ESI+): spočítáno pro C17H25O5N [MNa]+ 346,17. Nalezeno 346,2. Ή NMR (400 MHz; CDCh) δ 7,95 (d; J= 8,9 Hz; 2H); 6,87 (d; J = 8,9 Hz; 2H); 4,71 (s; 1H); 3,99 (t; J = 6,2 Hz; 2H); 3,85 (s; 3H); 3,17 (dd; J = 12,8; 6,3 Hz; 2H); 1,86 - 1,75 (m; 2H); 1,69 - 1,61 (m; 2H); 1,42 (s; 9H), 13C NMR (101 MHz; CDCh) δ 166,92 (s); 162,78 (s); 156,10 (s); 131,64 (s); 122,57 (s); 114,12 (s); 79,20 (s); 67,73 (s); 51,89 (s); 40,29 (s); 28,49 (s); 26,86 (s); 26,49 (s).
Kyselina 4-(4-((terc-butoxykarbonyl)amino)butoxy)benzoová, sloučenina B2: 270 mg sloučeniny Bi bylo rozpuštěno v 5 ml methanolu a poté bylo k roztoku přidáno 5 ml 5M NaOH. Směs byla refluxována, dokud analýza pomocí TLC neprokázala celkové vymizení sloučeniny Bi (6h). Reakční směs byla zředěna 20 ml EtOAc, vodná fáze byla okyselena 10 % KHSO4 do kyselého pH a dvakrát vytřepána 20 ml EtOAc. Tímto postupem bylo získáno 240 mg olej ovitého produktu, který po odstranění zbytků rozpouštědla přešel do bílé krystalické látky. Celkový výtěžek byl 95 %.
HR-MS (ESI-): spočítáno pro C16H22O5N [M]’ 308,16. Nalezeno 308,2. Ή NMR (400 MHz; CDCh) δ 8,03 (d; J = 8,9 Hz; 2H); 6,91 (d; J = 9,0 Hz; 2H); 4,65 (s; 1H); 4,04 (t; J = 6,2 Hz; 2H); 3,27 - 3,20 (m; 2H); 1,91 - 1,78 (m; 2H); 1,69 (dd; J = 14,8; 7,2 Hz; 2H); 1,44 (s; 9H), 13C NMR (101 MHz; CDCh) δ 171,51 (s); 163,46 (s); 156,20 (s); 132,42 (s); 121,92 (s); 114,28 (s); 79,42 (s); 67,86 (s); 40,36 (s); 28,56 (s); 26,89 (s); 26,53 (s).
Terc-butyl (4-(4-(3-(4-sulfamoylfenyl)ureido)fenoxy)butyl)karbamát, sloučenina B3: 720 mg (1 ekv., 2,33 mmol) sloučeniny B2 bylo rozpuštěno v 15 ml bezvodého toluenu a následně bylo přidáno 810 μΐ DIEA (2 ekv., 4,65 mmol). Do reakční směsi bylo najednou přidáno 552 μΐ DPPA (1,1 ekv., 2,56 mmol) a teplota směsi byla zvýšena na 90 °C po 2 h. Reakční směs byla poté odpařena a rozpuštěna v bezvodém ACN. Do směsi bylo poté najednou přidáno 601 mg (1,5 ekv., 3,49 mmol) sulfanilamidu a teplota byla zvýšena na 60 °C po dobu 15 h. Všechny těkavé látky byly po 12 h odpařeny a surový produkt byl vyčištěn pomocí kolonové chromatografíe (He:EtOAc, 2:5, RF = 0,25). Hmotnost získaného produktu byla 340 mg, což představuje výtěžek 30 %.
MS (ESI+): spočítáno pro C22H30O6N4S [MNa]+ 501,17. Nalezeno 501,2. Ή NMR (400 MHz; DMSO) δ 8,98 (s; 1H); 8,59 (s; 1H); 7,71 (d; J = 8,8 Hz; 2H); 7,59 (d; J = 8,9 Hz; 2H); 7,34 (d; J = 9,0 Hz; 2H); 7,20 (s; 2H); 6,91 - 6,81 (m; 3H); 3,91 (t; J = 6,4 Hz; 2H); 2,96 (dd; J = 12,9; 6,7 Hz; 2H); 1,71 - 1,61 (m; 2H); 1,51 (dt; J = 13,1; 6,5 Hz; 2H); 1,37 (s; 9H), 13CNMR (101 MHz; DMSO) δ 155,37 (s); 154,02 (s); 152,16 (s); 142,99 (s); 136,40 (s); 132,04 (s); 126,61 (s); 120,14 (s); 117,12 (s); 114,50 (s); 77,06 (s); 67,05 (s); 40,35 (překryv s pikem rozpouštědla) 27,77 (s); 26,85 (s); 25,73 (s).
4-(4-(3-(4-sulfamoylfenyl)ureido)fenoxy)butan-l-aminium 2,2,2-trifluoracetát, sloučenina B4: 500 mg sloučeniny B3 bylo rozpuštěno v 1 ml TFA a následně střídavě sonikováno a mícháno 15 min. Poté byla TFA odstraněna plynným dusíkem a produkt byl bez další purifíkace a charakterizace použit v dalším kroku.
- 10CZ 308807 B6
18-oxo-23-(4-(3-(4-sulfamoylfenyl)ureido)fenoxy)-3,6,9,12,15-pentaoxa-19-azatrikosan-laminium 2,2,2-trifluoracetát, sloučenina B: 46 mg (1 ekv., 112 pmol) BocNH-PEGs-COOH (PurePEG, LLC) bylo rozpuštěno v 0,5 ml DMF spolu s 36 mg (1 ekv., 112 gmol) TBTU a 49 μΐ (2,5 ekv., 279 pmol) DIEA. K tomuto roztoku bylo přidáno 55 mg (1 ekv., 112 pmol) sloučeniny B4 a směs byla míchána přes noc. Rozpouštědlo bylo poté odpařeno a surový produkt byl rozpuštěn v 10 ml EtOAc. Organická fáze byla dvakrát vytřepána nasyceným roztokem NaHCOs, dvakrát 10 % KHSO4, vysušena a odpařena. Bylo izolováno 53 mg produktu, ke kterému byl přidán 1 ml TFA a směs byla střídavě sonikována a míchána 15 min. Poté byla TFA odstraněna plynným dusíkem a produkt byl vyčištěn pomocí preparativního HPLC (gradient: 10 až 50 % ACN ve 40 min; RT = 22 min). Hmotnost získaného produktu byla 17 mg, což představuje výtěžek 31%.
Analytické HPLC: RT= 16,5 min. HR-MS (ESI-): spočítáno pro C30H48O10N5S [MH]+ 670,31164. Nalezeno 670,31164.
II. Syntéza kopolymerů HPMA a jejich konjugátů
Příklad 3: Syntéza konjugátu kopolymerů HPMA s inhibitorem GCPII (sloučeninou A), fluoroforem ATT0488 a biotinem (konjugát 1)
Syntéza polymemího prekurzoru poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT)
Monomemí sloučeniny /V-(2-hydroxypropyl)methakrylamid (HPMA) a 3-(3-methakrylamidopropanoyl)thiazolidin-2-thion (Ma-P-Ala-TT) byly připraveny podle publikovaného postupu [3, 7], Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) byl připraven pomocí RAFTkopolymerace (reversible addition-fragmentation chain-transfer). V 3,8 ml terc-butanolu bylo rozpuštěno 500 mg HPMA (85 % mol.) a k roztoku bylo přidáno 159 mg Ma-P-Ala-TT (15 % mol.) rozpuštěného v 0,8 ml DMSO, 1,21 mg 2-kyano-2-propylbenzodithioátu a 0,45 mg 2,2'-azobis(2methylpropionitrilu) a roztok byl převeden do polymerizační ampule. Směs byla probublána 10 min argonem a poté byla ampule uzavřena. Polymerizační reakce byla provedena při 70 °C po dobu 16 h. Polymemí prekurzor byl izolován vysrážením do směsi acetondiethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Koncové dithiobenzoátové skupiny byly odstraněny podle dříve publikovaného postupu [11]. Tímto postupem byl obdržen polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) s molekulovou hmotností Mw = 85 900 g/mol, polydisperzitou D = 1,22 a obsahující 13,4 % mol. reaktivních thiazolidin-2-thionových skupin.
Syntéza konjugátu 1
Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,045 g, Mw = 85 900 g/mol, 13,4 % mol. TT), sloučenina A (6,2 mg) a /V-(2-aminoethyl)biotinamid hydrobromid (biotin-NH2) (5 mg) byly rozpuštěny v 0,2 ml DMSO. ATT0488-NH2 (2,5 mg) bylo rozpuštěno v 0,1 ml DMSO a přidáno k roztoku polymemího prekurzoru. Poté byl přidán Λ'.Λ'-diisopropylcthylamin (DIPEA) (2,5 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h při teplotě místnosti a následně byl k roztoku přidán 1amino-propan-2-ol (5 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát poly(HPMA-co-Ma-p-Ala-Sloučenina A-co-Ma-p-Ala-ATT0488-co-Ma-p-Ala-NH-biotin) izolován vysrážením do směsi aceton :diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Polymemí konjugát byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí na chromatografické koloně Sephadex LH-20 v methanolu, vysrážen do diethyletheru, odfiltrován a vysušen ve vakuu. Výtěžek konjugátu poly(HPMA-co-Ma-p-Ala-Sloučenina A-coMa-p-Ala-ATT0488-co-Ma-p-Ala-NH-biotin) byl 33 mg, obsah inhibitom (sloučenina A) byl 9,8 %, obsah ATT0488 3,9 % a obsah biotinu 9,8 %.
- 11 CZ 308807 B6
Příklad 4: Syntéza srovnávacího konjugátu kopolymerů HPMA s fluoroforem ATT0488 abiotinem (konjugát 2)
Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,045 g, Mw = 85 900 g/mol, 13,4 %mol. TT; viz příklad 3) a 5 mg biotinu-NH2 bylo rozpuštěno v 0,2 ml DMSO. ATT0488-NH2 (2,5 mg) bylo rozpuštěno v 0,1 ml DMSO a přidáno k roztoku polymemího prekurzoru. Poté byl přidán Λζ/V-diisopropylethylamin (DIPEA) (2,5 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h při teplotě místnosti následně byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (5 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-ATT0488-co-Ma-P-Ala-NHbiotin) izolován vysrážením do směsi aceton :diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Polymemí konjugát byl vyčištěn na chromatografické koloně Sephadex LH-20 v methanolu, vysrážen do diethyletheru, odfiltrován a vysušen ve vakuu. Výtěžek konjugátu poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-ATT0488-co-Ma-p-Ala-NH-biotin) byl 32 mg, obsah ATT0488 5,1 % a obsah biotinu 10,8 %.
Příklad 5: Syntéza konjugátu kopolymerů HPMA s inhibitorem CA-IX (sloučeninou B), fluoroforem ATT0488 a biotinem (konjugát 3)
Polymemí prekurzor poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-TT) (0,045 g, Mw = 85 900 g/mol, 13,4 %mol. TT; viz příklad 3), sloučenina B (6,2 mg) a/V-(2-aminoethyl)biotinamid hydrobromid (biotin-NH2) (5 mg) a ATT0488-NH2 (2,5 mg) byly rozpuštěny v 0,3 ml DMSO. Poté byl přidán N,Ndiisopropylethylamin (DIPEA) (8 μΐ) a reakční směs byla míchána po dobu 4 h při teplotě místnosti a následně byl k roztoku přidán l-amino-propan-2-ol (5 μΐ) a reakční směs byla míchána 10 min. Poté byl polymemí konjugát poly(HPMA-co-Ma-P-Ala-SloučeninaB-co-Ma-P-Ala-ATT0488-coMa-P-Ala-NH-biotin) izolován vysrážením do směsi aceton:diethylether (3:1), odfiltrován, promyt acetonem a diethyletherem a vysušen ve vakuu. Polymemí konjugát byl vyčištěn od nízkomolekulámích příměsí na chromatografické koloně Sephadex LH-20 v methanolu, vysrážen do diethylethem, odfiltrován a vysušen ve vakuu. Výtěžek konjugátu poly(HPMA-co-Ma-p-AlaSloučenina B-co-Ma-P-Ala-ATT0488-co-Ma-P-Ala-NH-biotin) byl 39 mg, obsah inhibitoru (sloučenina B) byl 10,5 %, obsah ATT0488 3,7 % a obsah biotinu 8,6 %.
III. Evaluace vlastností polymemích konjugátů pomocí biochemických metod
Příklad 6: Inhibice aktivity GCPII pomocí inhibitorů a konjugátů 1
Inhibiční schopnosti inhibitorů a polymemích konjugátů na hydrolytickou aktivitu GCPII byly testovány pomocí HPLC metody (popsána v [12]) s využitím rekombinantní extracelulámí GCPII (Aví-GCPII; připravena dle [13]). Na 96jamkové destičce bylo 210 pg GCPII smícháno s roztokem 25mM Bis-tris propanu; 150mM NaCl, pH 7,4, 0,001 % monododecyl(oktaethylenglykol)etheru (Affymetrix; Octaethylene glycol monododecyl ether) a roztokem inhibitoru do celkového objemu 180 μΐ. Bylo použito deset různých koncentrací inhibitoru pokrývajících celou inhibiční křivku. Reakce byly nejprve inkubovány 5 min při 37 °C, poté zahájeny přidáním 20 μΐ pteroyl-bis(Lglutamátu) do finální koncentrace 400 nM a inkubovány při 37 °C po dobu 20 min. Reakce byly zastaveny pomocí 20 μΐ 25μΜ kyseliny 2-(fosfonomethyl)pentandiové (2-PMPA). Následně bylo 100 μΐ reakční směsi analyzováno pomocí přístroje Agilent 1200 Infinity (Agilent Technologies, Inc.) na RP-HPLC koloně Waters Acquity UPLC HSS T3 1,8 pm, 2,1x100 mm (Waters). HPLC analýza byla provedena isokraticky v 2,7% acetonitrilu a 97,3% 20mM fosfátu, pH6,0. Absorbance substrátu i produktu byla měřena při 281 nm. Hodnoty IC50 byly získány pomocí programu GraFit v.5.0.11 (Erithacus Software Ltd.).
Kinetické parametry Avi-GCPII (Km a kcat) pro pteroyl-bis(L-glutamát) v reakčním pufiru použitém pro určení IC50 byly získány postupem výše uvedeným, avšak bez přídavku inhibitom a s koncentracemi substrátu mezi 15 nM a 400 nM (konverze substrátu byla ve všech reakcích 13 ±
- 12CZ 308807 B6
%). Za předpokladu kompetitivního typu inhibice a s pomocí hodnot KM a kcat byly hodnoty Ki pro každý inhibitor určeny pomocí Cheng-Prusoffovy rovnice [14],
Bylo připraveno a otestováno několik inhibitorů GCPII, které byly založeny na struktuře glutamátmočovina-lysin-spojka; tyto inhibitory se mezi sebou lišily různým typem spojky [12], Pro konjugaci s HPMA polymerem byla vybrána sloučenina A, avšak všechny testované inhibitory dosahovaly nanomolámích či subnanomolámích hodnot Ki a po jejich konjugaci s kopolymerem HPMA došlo ke snížení hodnoty Ki (výsledného polymemího konjugátů) přibližně o 2 až 3 řády (zde vybrán a ukázán pouze konjugát 1 obsahující sloučeninu A). Toto snížení bylo závislé na daném inhibitoru a na množství připojených molekul inhibitoru. Mimo tyto konjugáty byl připraven i srovnávací konjugát bez inhibitoru GCPII (konjugát 2) fungující jako negativní kontrola; tento konjugát neinhiboval aktivitu GCPII. Hodnoty Ki a základní charakteristiky připravených látek jsou uvedeny v tab. 1.
Tab. 1: Připravené inhibitory a polymemí konjugáty a jejich inhibiční konstanty (Ki) vůči GCPII
Název sloučeniny g/mol Směrován o proti Počet inhibitorů Ki [pM] Modifikace
2-PMPA 226 GCPII - 370 ±30 -
sloučenina A 780 GCPII - 2033 ±426 -
konjugát 1 107 000 GCPII 13,7 3,1 ±0,5 sloučenina A, ATTO488, biotin
konjugát 2 96 000 - 0 neměřeno ATTO488, biotin
Příklad 7: Afmitní izolace (pull-down) GCPII pomocí polymemích konjugátů a následná detekce GCPII pomocí Western blotu
Buňky LNCaP (kultivované na 100 mm Petriho misce), odvozené od buněk metastáz adenokarcinomu prostaty a endogenně exprimující GCPII, byly lyžovány sonikací ve vodní lázni (3 min/0 °C) ve 450 μΐ 50 mM Tris-HCl, 150 mM NaCl, pH 7,4, 1% Tween 20. Získaný buněčný lyzát byl dále zředěn v20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,4 (TBST) na finální koncentraci proteinů 200 ug/ml (koncentrace GCPII byla přibližně 100ng/ml). Mezitím byl konjugát 1 a srovnávací konjugát 2 (jako negativní kontrola zobrazující nespecifickou vazbu) předvázán na 20 μΐ Streptavidin Sepharosy (5μΜ roztok ve 200 μΐ TBST, 1 h, 6 °C) a po promytí 2x 200 μΐ TBST byl nosič smíchán s 200 μΐ lyzátu buněk LNCaP a inkubován při 6 °C po dobu 12 h. Nosič byl poté promyt 2x 200 μΐ TBST a následně byly proteiny eluovány přídavkem 50 μΐ vzorkového pufiru pro SDS-PAGE a zahřátím na 98 °C po dobu 10 min.
Pro porovnání účinnosti izolace GCPII pomocí konjugátu 1 byla GCPII izolována zároveň i pomocí protilátky 2G7 [15] (tzv. imunoprecipitace). Experiment byl proveden analogicky k experimentu s polymemími konjugáty: 5 pg protilátky bylo předvázáno na 20 μΐ Protein G Sepharosy a dále bylo postupováno dle výše uvedeného postupu. Nosič Protein G Sepharosa bez protilátky byl použit jako negativní kontrola.
Po izolaci byly vzorky rozděleny na SDS-PAGE elektroforéze a gel byl buď obarven stříbrem či přeblotován na nitrocelulosovou membránu (polosuchý blot: 15V/15min). Po přenesení proteinů na membránu byl povrch membrány blokován pomocí 0,55% (w/v) roztoku kaseinu v PBS (Casein Buffer 20X-4X Concentrate, SDT) při teplotě místnosti po dobu 1 h. Poté byly bloty inkubovány s primární protilátkou GCP-04 [9] po dobu 12 h při 6 °C (200 ng/ml; zředěno v 0,55% roztoku kaseinu); poté byly bloty omyty třikrát PBS obsahujícím 0,05% Tween 20 (PBST) a inkubovány se sekundární kozí protilátkou proti myším imunoglobulinům konjugovanou s křenovou peroxidasou (Thermo Scientific; zředěno v 0,55% roztoku kaseinu 1:25 000). Nakonec byly bloty omyty třikrát PBST a na membránu byl nanesen chemiluminiscenční substrát SuperSignal West Dura/Femto Chemiluminescent Substrate (Thermo Scientific). Chemiluminiscence byla zaznamenána pomocí ChemiDoc-It™ 600 Imaging System (UVP).
- 13 CZ 308807 B6
Konjugát 1 byl schopen afmitně izolovat GCPII z lyzátu buněk LNCaP endogenně exprimujících GCPII. Množství GCPII izolované pomocí konjugátu 1 a protilátky 2G7 vytvořené proti nativní GCPII bylo prakticky stejné (Obr. 7A, B). Výhodou polymemích konjugátů oproti protilátkám je jejich možnost použití v případech, kdy je použití protilátek nemožné či obtížné, např. při imunoprecipitaci proteinů z krevní plazmy, kdy velké množství endogenních protilátek v krvi kompetuje o vazebná místa na nosiči s proteinem G. Řešením může být biotinylace těchto protilátek, což ovšem může protilátku poškodit. Použití biotinylovaných polymemích konjugátů a nosiče se streptavidinem tento problém řeší, neboť endogenní protilátky nejsou biotinylovány.
Příklad 8: Kvantifikace interakce polymemích konjugátů s GCPII pomocí povrchové plazmonové rezonance (SPR)
Všechna měření interakce polymemích konjugátů s příslušnými proteiny pomocí povrchové plazmonové rezonance (SPR) byla provedena na čtyřkanálovém SPR senzom vyvinutém na Ústavu fotoniky a elektroniky AV ČR v Praze [16-17], V typickém experimentu byl SPR čip (dodáván ÚFE AV ČR) ponořen na 1 h při 37 °C do ethanolového roztoku (7:3) alkanthiolů HS-(CH2)nPEG4-OH a HS-(CH2)n-PEG6-O-CH2-COOH (Prochimia) o výsledné koncentraci 0,2 mM. Čip byl následně opláchnut ethanolem pro UV spektroskopii, deionizovanou vodou a vysušen dusíkem. Nakonec byl čip nasazen na hranol SPR čipu; všechna měření byla provedena při 25 °C.
Aktivace koncových karboxylových skupin na povrchu senzom bylo provedeno in sítu přidáním směsi (1:1) ll,51mg/ml A-hydroxysukcinimidu (NHS, Biacore) a 76,68 mg/ml l-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)-karbodiimid hydrochloridu (EDC, Biacore) v deionizované vodě po dobu 5 min při průtoku 20 μΐ/min. Další části experimentu byly poté prováděny při průtoku 30 μΐ/min. Následně byla po dobu 8 min nanášena směs protilátky D2B proti nativní GCPII (20 ng/μΐ) s BSA (20 ng/μΐ; molámí poměr D2B:BSA byl 1:2,3) v lOmM octanu sodném, pH 5,0. Pro odstranění nespecificky navázaných molekul byl použit pufr o vysoké iontové síle (PBS s 0,5M NaCl) a poté byl pro deaktivaci zbylých aktivovaných karboxylových skupin aplikován 1M ethanolamin (Biacore). Roztok rekombinantní extracelulámí GCPII (Avi-GCPII, připravena podle [13]) v 20mM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH7,4 (TBS) o koncentraci 8 ng/μΐ byl použit k imobilizaci AviGCPII na připravený zlatý čip s vrstvou protilátky D2B ve směsi s BSA. Nakonec byl injektován (při průtoku 60 μΐ/min) roztok testovaného polymemího konjugátu v proměnlivých koncentracích (fáze asociace) a následně pouze TBS (fáze disociace).
Křivky popisující vazbu byly exportovány a analyzovány v programu TraceDrawer v. 1.5 (Ridgeview Instruments AB) pro zisk parametrů kon a kOff (obr. 8).
Měření kinetických parametrů vazby GCPII a konjugátu 1 odhalilo vysokou hodnotu asociační rychlosti interakce (kon = 9,7-105 MV); hodnota disociační rychlosti byla pod detekčním limitem našeho SPR přístroje (kOff < 2-10’5 s1), proto nemohla být určena přesná hodnota disociační konstanty (Kd < 20 pM). Tato hodnota je porovnatelná s nejlepšími dostupnými protilátkami proti GCPII. Díky velmi malé hodnotě kOff prakticky nedochází k odmývání GCPII navázané na konjugátu 1, čehož se dá využít pro velmi pevnou imobilizaci GCPII.
Příklad 9: ELISA pro kvantifikaci GCPII s využitím polymemích konjugátů
Sendvičová ELISA, standardně prováděná se dvěma protilátkami byla modifikována pro použití polymemích konjugátů v roli jak imobilizační, tak i druhé specifické detekční protilátky. Všechny kroky experimentu byly provedeny při pokojové teplotě.
Při použití polymemích konjugátů namísto imobilizační protilátky byl do 96jamkové destičky Maxisorb (Nunc) sorbován streptavidin (500 ng/jamku) ve lOOmM borátovém pufru, pH 9,5 (1 h). Po promytí 3x 200 μΐ TBS byl neobsazený povrch jamky zablokován 0,55% (w/v) roztokem kaseinu v TBS (Casein Buffer 20X-4X Concentrate, SDT, 24 h). Po dalším promytí 3x 200 μΐ
- 14CZ 308807 B6
TBST byl na streptavidin navázán konjugát 1 (100 nM v TBST, 2 h). Nenavázaný polymer byl odmyt promytím 3x 200 μΐ TBST a následně byl do jamek přidán roztok rekombinantní extracelulámí GCPII (rhGCPII; připravena dle [18]) v TBST (v množstvích 1 ng až 1 pg/jamku, 20 min). Po promytí 3x 200 μΐ TBST byla přidána specifická myší protilátka J591 v TBST (25 ng/jamku, 1 h), po jejím odmytí 3x 200 μΐ TBST byla přidána sekundární kozí protilátka rozpoznávající myší IgG v TBST (100 ng/jamku, Thermo Scientific, 30 min). Po promytí 5x 200 μΐ TBST byl přidán chemiluminiscenční substrát a luminiscence byla změřena na spektrofotometrické čtečce Tecan Infinite M1000 PRO.
Ve druhém případě byla na destičku nejprve nasorbována protilátka 2G7 v borátovém pufru (500 ng/jamku). Po zablokování povrchu kaseinem a jeho odmytí (viz výše) následovala inkubace s rekombinantní extracelulámí GCPII (rhGCPII; připravena dle [18]) v TBST (v množstvích 1 ng až 1 pg/jamku, 20 min). Po promytí 3x 200 μΐ TBST byl přidán roztok konjugátu 1 (v koncentracích od 0,5 až 1000 nM v TBST, 1 h), po jehož odmytí 3x 200 μΐ TBST byl do jamky přidán NeutrAvidin konjugovaný s křenovou peroxidasou (100 ng/jamku, Thermo Scientific). Po promytí 5x 200 μΐ TBST byl přidán chemiluminiscenční substrát a luminiscence byla změřena na spektrofotometrické čtečce Tecan Infinite M1000 PRO.
Při klasické metodě ELISA se používají dvě protilátky proti nativní GCPII; limitací tohoto přístupu je podmínka rozdílnosti epitopů těchto dvou protilátek. Např. dvě z nejznámnějších protilátek proti GCPII - J591 a J415 - nelze spolu použít [19], V případě sendviče protilátek J591 a 2G7 je tato podmínka splněna a limit detekce se pohybuje mezi 1 až 2 pg GCPII. V prvním případě, kdy byl polymemí konjugát nejprve imobilizován na streptavidin a až poté inkubován s antigenem (rhGCPII), byl limit detekce přibližně 30 pg. Ve dmhém případě, kdy byla rhGCPII navázána nejprve na protilátku 2G7 a až poté byl přidán polymemí konjugát, došlo k poklesu limitu detekce na 0,5 pg GCPII, tedy hodnotu menší jako v případě použití nejlepšího sendviče pro kvantifikaci GCPII. Významnou výhodou polymerů je jejich necitlivost na přítomnost interferujících protilátek, tedy časté a závažné příčiny falešné pozitivity v případě použití dvou protilátek. Interferující protilátky rozpoznávají epitopy na protilátkách a mohou tak propojit protilátky použité v sendviči bez přítomnosti vlastního stanovovaného antigenu. Polymemí konjugáty, jakožto molekuly zcela jiného chemického charaktem, tímto problémem netrpí.
Metoda ELISA byla použita i pro stanovení hodnoty Kd pro testované polymery. Hodnota Kd by měla odpovídat hodnotě Ki zjištěné pomocí měření inhibice aktivity GCPII (viz tab. 1), či hodnotě Kd zjištěné pomocí měření této interakce pomocí SPR. Hodnota Kd zjištěná pomocí metody ELISA však byla přibližně 40krát vyšší (pro konjugát 1 byla hodnota Kd rovna 115 pM, hodnota Ki pak 3,1 pM a hodnota Kd(SPR) < 20 pM). Rozdíl mezi těmito hodnotami je pravděpodobně způsoben použitím odlišné metody.
Příklad 10: Modifikovaná metoda ELISA pro testování inhibitorů GCPII
Metoda ELISA byla také použita pro testování inhibitorů GCPII, postup byl proveden analogicky jako v příkladu 9. Metoda je založena na kompetici konjugátu 1 a daného testovaného potencionálního inhibitoru GCPII ve vazbě do aktivního místa GCPII. Množství navázaného konjugátu 1 je poté stanoveno chemiluminiscenčně a poté vztaženo na vzorek bez testovaného inhibitom (viz níže).
Na destičku Maxisorb (Nunc) nejprve nasorbována protilátka 2G7 v borátovém pufm (500 ng/jamku). Po zablokování povrchu kaseinem a jeho odmytí (viz výše) následovala inkubace s rekombinantní extracelulámí GCPII (rhGCPII; připravena dle [18]) v TBST (10 ng/jamku, 1 h). Po promytí 3x 200 μΐ TBST byl přidán roztok obsahující buď samotný konjugát 1 (5nM v TBST, 1 hod; referentní vzorek) anebo směs konjugátu 1 (5nM v TBST) a dané testované látky o zvolené koncentraci (typicky 0,1 až 100 μΜ v TBST). Po inkubaci 1 h při teplotě místnosti byly jamky promyty 5x 200 μΐ TBST. Poté byl do jamky přidán NeutrAvidin konjugovaný s křenovou
- 15 CZ 308807 B6 peroxidasou (100 ng/jamku, Thermo Scientific) a po promyti 5x 200 pl TBST byl přidán chemiluminiscenční substrát a luminiscence byla změřena na spektrofotometrické čtečce Tecan Infinite M1000 PRO.
Příklad 11: Průtoková cytometrie buněk LNCaP a PC-3 pomocí polymemích konjugátů
Buněčné linie odvozené od buněk nádoru prostaty (PC-3 a LNCaP) byly kultivovány na 100 mm Petriho misce do dosažení 80% konfluence. Buňky LNCaP byly kultivovány v kompletním médiu RPMI-1640 (Sigma-Aldrich), zatímco buňky PC-3 v kompletním médiu DMEM-High Glucose (GE Healthcare), obsahujícími L-glutamin (finální koncentrace 4 mM) a FBS (finální koncentrace 10 %).
Po dosažení 80% konfluence bylo médium odstraněno, buňky opláchnuty PBS a 3 min inkubovány v 1,5 ml roztoku 0,25% trypsinu a 0,01% EDTA. Buňky byly v tomto roztoku rozsuspendovány a přeneseny do 8 ml DMEM či RPMI kompletního média, centrifůgovány 250xg/2 min a promyty 5 ml PBS. Následně bylo přidáno 500 μΐ 10% fetálního hovězího séra v PBS pro zablokování buněčného povrchu (1 h/37 °C). Množství buněk bylo spočítáno pomocí Countess® Automated Cell Counter (Invitrogen). Poté bylo inkubováno 50 μΐ buněčné suspenze (obsahující 2xl05 buněk) s 10 nM konjugátem 1 či konjugátem 2 (1 h/37 °C). Nakonec byla buněčná suspenze zředěna 150 μΐ PBS a fluorescence buněk byla analyzována pomocí průtokového cytometru BD LSR Fortessa™. Analýza výsledků byla provedena pomocí BD FACSDiva™ Software.
Jak je patrno z obr. 9, fluorescence buněk LNCaP inkubovaných s konjugátem 1 je výrazně vyšší než u buněk PC-3 neexprimujících GCPII, což svědčí o specifické vazbě na buňky pomocí interakce GCPII na povrchu buněk a jejím inhibitorem na konjugátu 1.
Příklad 12: Vizualizace GCPII na povrchu buněk pomocí polymemích konjugátů (imunocytochemie)
Fluorescenční vizualizace GCPII na povrchu buněk (imunocytochemie) pomocí polymemích konjugátů byla provedena na dvou typech buněčných linií odvozených od karcinomu prostaty: buněk LNCaP (endogenně exprimující GCPII) a PC-3 (endogenně neexprimující GCPII). Buňky byly přes noc kultivovány v kompletním RPMI-1640 médiu (LNCaP) či DMEM-High glucose médiu (PC-3). Do média byl přidán roztok konjugátu 1 či konjugátu 2 do finální koncentrace 10 nM a buňky byly inkubovány v jejich přítomnosti 2 h při 37 °C. Následně bylo médium odebráno, buňky opláchnuty 0,5 ml PBS a inkubovány s 0,5 pg/ml roztokem Hoechst Stain Solution H33258 (Sigma) po dobu 15 min pro obarvení buněčného jádra. Nakonec byly buňky opláchnuty 0,5 ml PBS. Obrázky byly pořízeny pomocí konfokálního laserového mikroskopu Zeiss LSM 780 (Carl Zeiss, Inc., Oberkochen, Germany), s olejovým imerznim objektivem (Plan-Apochromat 63x/1.40 Oil DIC M27).
Nastavení mikroskopu pro jednotlivé kanály bylo následující: pro Hoechst 33258: excitace 3 % výkonu 405nm diodového lasem (max. výkon 30 mW), rozsah emisního spektrálního detektoru: 410 až 585 nm; pro ATT0488: excitace 3,5 % výkonu 488nm argonového lasem (max. výkon 25 mW), rozsah emisního spektrálního detektoru: 517 až 534 nm. Obrázky byly zpracovány pomocí programu ZEN 2011 (Carl Zeiss Microscopy).
Jak je patrno z obr. 10, pouze buňky exprimující GCPII, jež byly inkubovány s konjugátem 1 obsahujícím inhibitory GCPII, byly schopny vázat a následně intemalizovat fluorescenčně značené konjugáty. Buňky neexprimující GCPII anebo inkubované s konjugátem bez inhibitorů GCPII nebyly schopné interagovat s polymemími konjugáty. Dále bylo ukázáno, že přítomnost inhibitom 2-PMPA kompetujícího s polymemím konjugátem vede pravděpodobně k zablokování aktivního místa GCPII a tudíž neschopnosti vázat a intemalizovat polymemí konjugáty (obr. 10).
- 16CZ 308807 B6
V této přihlášce bylo ukázáno, že polymemí konjugáty proti GCPII tento enzym specificky inhibují (Ki = 3,1 pM), pomocí SPR byla určena disociační konstanta vazby GCPII-konjugát (Kd < 20 pM). Polymemí konjugáty byly dále použity k vizualizaci GCPII na povrchu a uvnitř buněk pomocí konfokální fluorescenční mikroskopie - po vazbě konjugátu na GCPII na povrchu buňky dochází k intemalizaci vzniklého komplexu do nitra buňky. Podobně fungovaly konjugáty i v průtokové cytometrii. Pomocí polymemích konjugátů bylo možné GCPII izolovat z různých biologických vzorků, jako byly např. lyzáty buněk a tkání, příp. krevní sémm a plazma. V kombinaci s protilátkou proti GCPII je možné metodou ELISA v sendvičovém uspořádání detekovat a kvantifikovat řádově pikogramy až zlomky pikogramů GCPII. Díky použití kombinace protilátkakonjugát sendvičová ELISA netrpí falešnými pozitivitami způsobenými vazbou endogenních interferujících protilátek. Tohoto se dá využít pro velmi citlivou a specifickou kvantifikaci GCPII v biologicky zajímavých vzorcích, např. krvi, krevní plazmě, krevním séru, mozkomíšním moku, moči, synoviální tekutině, plodové vodě, ascites, pleurální tekutině, perikardiální tekutině, slinách, potu či semenné plazmě.
Stejný konjugát se stejným inhibitorem se selektivně váže i do aktivního místa glutamátkarboxypeptidasy III (GCPIII), blízkého homologu GCPII. Při použití protilátky selektivně vázající pouze GCPIII byla ELISA selektivní pro GCPIII, přítomnost GCPII se stanovením neinterferovala. Pomocí imobilizace přes afmitní tag a použitím stejného konjugátu se podařilo s velkou citlivostí detekovat a kvantifikovat množství rekombinantně připravených proteinů GCPII a GCPIII.
Příklad 13: Vizualizace CA-IX na povrchu buněk pomocí polymemích konjugátů (imunocytochemie)
Vizualizace CA-IX na povrchu buněk (imunocytochemie) pomocí polymemích konjugátů byla provedena na buněčné linii HT-29 endogenně exprimující CA-IX. Buňky byly 48 h kultivovány v médiu, do kterého byl poté přidán roztok konjugátu 3 či konjugátu 2 do finální koncentrace 1000 nM a buňky byly inkubovány v jejich přítomnosti 2 h při 37 °C. Následně bylo médium odebráno, buňky opláchnuty 0,5 ml PBS a inkubovány s 0,5 pg/ml roztokem Hoechst Stain Solution H33258 (Sigma) po dobu 15 min pro obarvení buněčného jádra. Nakonec byly buňky opláchnuty 0,5 ml PBS. Obrázky byly pořízeny pomocí konfokálního laserového mikroskopu Zeiss LSM 780 (Carl Zeiss, Inc., Oberkochen, Germany), s olejovým imerzním objektivem (PlanApochromat 63x/1.40 Oil DIC M27). Nastavení mikroskopu pro jednotlivé kanály bylo následující: pro Hoechst 33258: excitace 3 % výkonu 405 nm diodového lasem (max. výkon 30 mW), rozsah emisního spektrálního detektoru: 410 až 585 nm; pro ATT0488: excitace 3,5 % výkonu 488 nm argonového lasem (max. výkon 25 mW), rozsah emisního spektrálního detektoru: 517 až 534 nm. Obrázky byly zpracovány pomocí programu ZEN 2011 (Carl Zeiss Microscopy).
Pomocí imunocytochemie bylo ukázáno, že pouze konjugát 3 obsahující inhibitor CA-IX se vázal na buňky HT-29 exprimující CA-IX (obr. 11). Při experimentu byla specificky vizualizována membrána buněk, což je v souladu s faktem, že CA-IX je membránový protein.
Příklad 14: ELISA pro kvantifikaci CA-IX s využitím polymemích konjugátů
Sendvičová ELISA pro kvantifikaci CA-IX byla provedena analogicky k metodě ELISA pro kvantifikaci GCPII (viz příklad 9); všechny kroky experimentu byly provedeny při pokojové teplotě.
Do destičky byla nejprve nasorbována protilátka proti CA-IX M75 v TBS (500 ng/jamku, 2 h). Po zablokování povrchu kaseinem (18 h) a jeho odmytí následovala inkubace s lyzátem buněk HT-29 naředěným v20nM Tris-HCl, 200mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH 7,4 (TBST') (v množstvích 32 pg až 32 ng celkového proteinu/jamku, 4 h). Jako standard byl použit konstrukt obsahující katalytickou doménu a PG doménu karbonické anhydrasy IX (aminokyseliny 55 až 390, dále nazýván CA-IX s PG), který byl připraven rekombinantní expresí v hmyzích S2 buňkách a vyčištěn
- 17CZ 308807 B6 dle popisu v [20], Po promytí 3x 200 μΐ TBST byl přidán roztok 5nM konjugátu 3 v TBST' (1 h), po jehož odmytí 3x 200 μΐ TBST byl do jamky přidán NeutrAvidin konjugovaný s křenovou peroxidasou naředěný v TBST' (100 ng/jamku, 30 min, Thermo Scientific). Po promytí 5x 200 μΐ TBST byl přidán chemiluminiscenční substrát a luminiscence byla změřena na spektrofotometrické čtečce Tecan Infinite Ml000 PRO.
Pro vývoj metody ELISA pro kvantifikaci CA-IX byl použit konjugát 3 s inhibitorem selektivně se vázajícím do aktivního místa lidských karbonických anhydras, zejména karbonické anhydrasy IX (CA-IX). V kombinaci se selektivní imobilizaci CA-IX přes monoklonální protilátku (v metodě ELISA v sendvičovém uspořádání) se dosáhlo velmi citlivého stanovení CA-IX v roztoku a v různých biologických matricích, zejména v tkáňových a buněčných lyzátech, stejně jako v krevní plazmě a séru. Podobně jako v případě GCPII, metoda ELISA pro kvantifikaci CA-IX pomocí konjugátu 3 umožnila detekci pikogramových množství CA-IX; pomocí kombinace protilátky M75 (vázající CA-IX) a konjugátu 3 bylo možné v lyzátu buněk HT-29 detekovat 1 pg CA-IX. Díky několika inhibitorům CA-IX přítomným na jednom konjugátu bylo možné pro vývoj velmi citlivé metody ELISA použít i relativně slabý (submikromolámí) inhibitor CA-IX. Inkubací polymemího konjugátu s CA-IX v přítomnosti testovaných sloučenin bylo možné s velkou přesností určit sílu vazby (tzn. inhibiční konstantu) všech těchto testovaných látek.
Příklad 15: Kvantifikace interakce polymemích konjugátů s CA-IX pomocí povrchové plazmonové rezonance (SPR)
Měření interakce proteinu CA-IX s konjugátem 3 pomocí povrchové plazmonové rezonance (SPR) bylo provedeno na čtyřkanálovém SPR senzoru vyvinutém na Ústavu fotoniky a elektroniky AV ČR v Praze [16-17], V typickém experimentu byl SPR čip (dodáván ÚFE AV ČR) ponořen na 1 h při 37 °C do ethanolového roztoku (7:3) alkanthiolů HS-(CH2)n-PEG4-OH a HS-(CH2)n-PEG6-OCH2-COOH (Prochimia) o výsledné koncentraci 0,2 mM. Čip byl následně opláchnut ethanolem pro UV spektroskopii, deionizovanou vodou a vysušen dusíkem. Nakonec byl čip nasazen na hranol SPR čipu; všechna měření byla provedena při 25 °C.
Aktivace koncových karboxylových skupin na povrchu senzoru bylo provedeno in sítu přidáním směsi (1:1) 11,51 mg/ml A-hydroxysukcinimidu (NHS, Biacore) a 76,68 mg/ml l-ethyl-3-(3dimethylaminopropyl)karbodiimidhydrochloridu (EDC, Biacore) v deionizované vodě po dobu 5 min při průtoku 20 μΐ/min. Další části experimentu byly poté prováděny při průtoku 30 μΐ/min. Následně byl po dobu 8 min nanášen roztok neutravidinu (20 ng/μΐ) v lOmM octanu sodném, pH 5,0. Pro odstranění nespecificky navázaných molekul neutravidinu byl použit pufr o vysoké iontové síle (PBS s 0,5M NaCl) a poté byl pro deaktivaci zbylých aktivovaných karboxylových skupin aplikován 1M ethanolamin (Biacore). Na mobilizovaný neutravidin byl poté navázán konjugát 3 (ΙμΜ v TBS, 13 min) obsahující inhibitor CA-IX. Nakonec byl na tuto připravenou vrstvu injektován roztok rekombinantní CA-IX v TBS v proměnlivých koncentracích (koncentrace CA-IX byly 64, 128,255 a 510 nM) a následně pouze TBS (fáze disociace).
Křivky popisující vazbu (obr. 12) byly exportovány a analyzovány v programu TraceDrawer v. 1.5 (Ridgeview Instruments AB) pro zisk parametrů kon a kOff.
Hodnota disociační konstanty mezi CA-IX a konjugátem 3 byla stanovena na Kd = 193 nM; s hodnotou asociační rychlosti kon= 2,64-104 MV a kOff = 5,07-3 s1.
Příklad 16: Afinitní izolace (pull-down) CA-IX pomocí polymemích konjugátů
Buňky HT-29 (kultivované na 100mm Petriho misce) endogenně exprimující CA-IX, byly lyžovány sonikací ve vodní lázni (3 min/0 °C) ve 450 μΐ 50nM Tris-HCl, 150mM NaCl, pH7,4, 1% Tween 20. Získaný buněčný lyzát byl dále zředěn v 20nM Tris-HCl, 150mM NaCl, 0,1% Tween 20, pH7,4 (TBST) na finální koncentraci proteinů 360 gg/ml. Mezitím byl konjugát 3 a konjugát 2 (jako negativní kontrola zobrazující nespecifickou vazbu) předvázán na 25 μΐ
- 18 CZ 308807 B6
Streptavidin Sepharosy (200nM roztok ve 200 μΐ TBST, 1 h, 6 °C) a po promyti 3x 200 μΐ TBST byl nosič smíchán s 200 μΐ lyzátu buněk HT-29 a inkubován při 25 °C po dobu 3 h. Nosič byl poté promyt 3x 200 μΐ TBST a následně byly proteiny eluovány přídavkem 25 μΐ vzorkového pufru pro SDS-PAGE a zahřátím na 98 °C po dobu 10 min.
Pro porovnání účinnosti izolace CA-IX pomocí konjugátu 3 byla CA-IX izolována zároveň pomocí protilátky M75. Experiment byl proveden analogicky k experimentu s polymemími konjugáty: 1 pg protilátky byl předvázán na 20 μΐ Protein G Sepharosy a dále bylo postupováno dle výše uvedeného postupu. Nosič Protein G Sepharosabez protilátky byl použit jako negativní kontrola.
Po izolaci byly vzorky rozděleny na SDS-PAGE elektroforéze a gel byl přeblotován na nitrocelulosovou membránu (mokrý blot: 100 V/1 h). Po přenesení proteinů na membránu byl povrch membrány blokován pomocí 0,55% (w/v) roztoku kaseinu v PBS (Casein Buffer 20X-4X Concentrate, SDT) při teplotě místnosti po dobu 1 h. Poté byly bloty inkubovány s primární protilátkou M75 po dobu 12 h při 6 °C (200 ng/ml; zředěno v 0,55% roztoku kaseinu); poté byly bloty omyty třikrát PBS obsahujícím 0,05% Tween 20 (PBST) a inkubovány se sekundární kozí protilátkou proti myším imunoglobulinům konjugovanou s křenovou peroxidasou (Thermo Scientific; zředěno v 0,55% roztoku kaseinu 1:25 000). Nakonec byly bloty omyty třikrát PBST a na membránu byl nanesen chemiluminiscenční substrát SuperSignal West Dura/Femto Chemiluminescent Substráte (Thermo Scientific). Chemiluminiscence byla zaznamenána pomocí ChemiDoc-It™ 600 Imaging System (UVP).
Pomocí konjugátu 3 bylo možné afinitně izolovat CA-IX z lyzátu buněk HT-29 endogenně exprimujících CA-IX. Množství CA-IX izolované pomocí konjugátu 3 a protilátky M75 vytvořené proti nativní CA-IX bylo prakticky stejné (obr. 13, dráhy 4 a 6). Srovnávací konjugát 2 sloužící jako negativní kontrola (bez inhibitoru CA-IX) nevykazoval žádnou vazbu CA-IX, což svědčí o selektivní vazbě CA-IX na polymemí konjugát pomocí inhibitoru přítomném na konjugátu 3.
Příklad 17: Modifikovaná metoda ELISA pro testování inhibitorů CA-IX
Metoda byla provedena analogicky podle příkladu 10.
Na destičku Maxisorb (Nunc) nejprve nasorbována protilátka M75 v borátovém pufru (500 ng/jamku). Po zablokování povrchu kaseinem a jeho odmytí (viz výše) následovala inkubace s rekombinantní CA-IX (připravena dle [20]) v TBST; 10 ng/jamku, 1 h). Po promytí 3x 200 μΐ TBST byl přidán roztok obsahující buď samotný konjugát 3 (5nM v TBST, 1 h; referentní vzorek) anebo směs konjugátu 3 (5nM v TBST) a dané testované látky o zvolené koncentraci (typicky 0,1 až 100 μΜ v TBST). Po inkubaci 1 h při teplotě místnosti byly jamky promyty 5x 200 μΐ TBST. Poté byl do jamky přidán NeutrAvidin konjugovaný s křenovou peroxidasou (100 ng/jamku, Thermo Scientific) a po promytí 5x 200 μΐ TBST byl přidán chemiluminiscenční substrát a luminiscence byla změřena na spektrofotometrické čtečce Tecan Infinite M1000 PRO.
Průmyslová využitelnost
Syntetické makromolekulami konjugáty, které jsou předmětem předkládaného vynálezu, lze použít ve všech laboratorních a diagnostických aplikacích, kde se dosud běžně používá polyklonálních nebo monoklonálních protilátek, jejich fragmentů a derivátů. Jedná se o použití jako levné a stabilní náhrady protilátek používaných v diagnostické metodě ELISA (Enzyme-Linked Immunosorbent Assay), dále při izolaci a kvantifikaci biomolekul v komplexních směsích (náhrada protilátek při imunoprecipitaci), vizualizaci nádorových marker a dalších povrchových molekul (náhrada protilátek při imunohistochemické analýze) a konečně při náhradě protilátek při fluorescenční cytometrii. V diagnostické metodě MRI lze použít například polymemí konjugát s atomem gadolinia určený pro in vivo detekci.

Claims (6)

1. Použití in vitro syntetického makromolekulámího konjugátu pro selektivní interakci s proteiny, přičemž uvedený konjugát obsahuje kopolymer připravitelný kopolymerací alespoň jednoho monomeru obecného vzorce I:
R1' O
(I), kde: R1 je vybráno z H, CH3;
R2 je vybráno z NH2, NH-CH2-CH(OH)-CH3, NH-CH3, NH-CH2CH3, NH-CH2CH2-OH, NH-CH2CH2CH2-OH, NHC(CH2OH)3. NH-CH2CH2-N(CH3)3C1 , O-CH2CH2-OH, O(CH2CH2O)2-H O-(CH2CH2O)3-H, O-CH2CH2-N(CH3)3C1, NH-(CH2)3N+(CH3)2-(CH2)2-COO-;
a alespoň jednoho monomeru obecného vzorce II:
(Π) kde: R1 je vybráno z H, CH3; a
X je vybráno z NH-(CH2)2-CO, NH-(CH2)3-CO, NH-(CH2)4-CO, NH-(CH2)5-CO, Gly, GlyGly, GlyPheLeuGly, a
R3 je vybráno z:
přičemž alespoň jedna reaktivní skupina R3 je v kopolymerů nahrazena kovalentně vazbou připojenou směrovací skupinou, alespoň jedna reaktivní skupina R3 je nahrazena kovalentně připojenou afmitní kotvou a alespoň jedna reaktivní skupina R3 je nahrazena kovalentně připojenou reportérovou skupinou, přičemž molekulová hmotnost konjugátu je s výhodou v rozmezí 1000 až 500 000 g/mol, přičemž směrovací skupinou je sloučenina schopná vazby na cílový protein,
-21 CZ 308807 B6 přičemž směrovací skupina je vybrána ze skupiny zahrnující inhibitor nebo substrát cílového enzymu, agonistu nebo antagonistu cílového receptoru, ligand cílového přenašeče, přičemž afmitní kotva je vybrána ze skupiny zahrnující biotin, His-tag, FLAG tag, HA tag, Streptag, Avi-Tag, GST-tag, c-myc-tag, V5-tag, E-tag, S-tag, SBP-tag, poly(Glu)-tag, kalmodulinový tag, a přičemž reportérová skupina je vybrána ze skupiny zahrnující fluorofory s excitačním maximem v rozmezí 350 až 850 nm, s výhodou ATTO488, DY676; komplexy lanthanoidů, s výhodou Gd, Mn, Dy, Eu; a komplexy radionuklidu 64Cu, 68Ga, 18F, 99mTc, 123I, 125I, 131I, 57Co,51Cr, 67Ga,64Cu,inIn, 90Y.
2. Použití podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde molekulová hmotnost konjugátu je v rozmezí 20 000 až 150 000 g/mol.
3. Použití podle kteréhokoliv z předcházejících nároků, kde směrovací skupina je připojena prostřednictvím spojky na bázi polyethylenglykolu, peptidu, s výhodou peptidu o molekulové hmotnosti 100 až 5000 g/mol, nebo nukleové kyseliny, s výhodou nukleové kyseliny obsahující 1 až 40 nukleotidů, nebo oligosacharidu, s výhodou oligosacharidu obsahujícího 1 až 40 monosacharidů.
4. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 v imunochemické metodě vybrané ze skupiny zahrnující ELISA, průtokovou cytometrii, imunocytochemii, imunohistochemii, Western blot a jeho modifikace.
5. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 3 in vitro pro testování inhibitorů, ligandů a jiných sloučenin a látek schopných vazby na cílový protein.
6. Použití podle kteréhokoliv z nároků 1 až 5, kde stanovovaným proteinem je GCPII, CA-IX.
CZ201520A 2015-01-14 2015-01-14 Makromolekulární konjugáty pro vizualizaci a separaci proteinů a buněk CZ308807B6 (cs)

Priority Applications (9)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ201520A CZ308807B6 (cs) 2015-01-14 2015-01-14 Makromolekulární konjugáty pro vizualizaci a separaci proteinů a buněk
SG11201704995QA SG11201704995QA (en) 2015-01-14 2016-01-13 Macromolecular conjugates for visualization and separation of proteins and cells
CA2970913A CA2970913C (en) 2015-01-14 2016-01-13 Macromolecular conjugates for visualization and separation of proteins and cells
US15/541,824 US20180052152A1 (en) 2015-01-14 2016-01-13 Macromolecular conjugates for visualization and separation of proteins and cells
EP16706122.5A EP3245514B1 (en) 2015-01-14 2016-01-13 Macromolecular conjugates for visualization and separation of proteins and cells
AU2016207126A AU2016207126B2 (en) 2015-01-14 2016-01-13 Macromolecular conjugates for visualization and separation of proteins and cells
PCT/CZ2016/050003 WO2016112883A2 (en) 2015-01-14 2016-01-13 Macromolecular conjugates for visualization and separation of proteins and cells
IL253425A IL253425B (en) 2015-01-14 2017-07-11 Macromolecular conjugates for the imaging and separation of proteins and cells
US16/128,982 US10302632B2 (en) 2015-01-14 2018-09-12 Macromolecular conjugates for visualization and separation of proteins and cells

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CZ201520A CZ308807B6 (cs) 2015-01-14 2015-01-14 Makromolekulární konjugáty pro vizualizaci a separaci proteinů a buněk

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CZ201520A3 CZ201520A3 (cs) 2016-07-27
CZ308807B6 true CZ308807B6 (cs) 2021-06-02

Family

ID=55411124

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CZ201520A CZ308807B6 (cs) 2015-01-14 2015-01-14 Makromolekulární konjugáty pro vizualizaci a separaci proteinů a buněk

Country Status (8)

Country Link
US (2) US20180052152A1 (cs)
EP (1) EP3245514B1 (cs)
AU (1) AU2016207126B2 (cs)
CA (1) CA2970913C (cs)
CZ (1) CZ308807B6 (cs)
IL (1) IL253425B (cs)
SG (1) SG11201704995QA (cs)
WO (1) WO2016112883A2 (cs)

Families Citing this family (9)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2016202582A1 (de) 2015-06-17 2016-12-22 Clariant International Ltd Wasserlösliche oder wasserquellbare polymere als wasserverlustreduzierer in zementschlämmen
WO2018108609A1 (en) 2016-12-12 2018-06-21 Clariant International Ltd Polymer comprising certain level of bio-based carbon
ES2867526T3 (es) 2016-12-12 2021-10-20 Clariant Int Ltd Uso de un polímero bioderivado en una composición cosmética, dermatológica o farmacéutica
WO2018108663A1 (en) 2016-12-15 2018-06-21 Clariant International Ltd Water-soluble and/or water-swellable hybrid polymer
WO2018108667A1 (en) 2016-12-15 2018-06-21 Clariant International Ltd Water-soluble and/or water-swellable hybrid polymer
EP3554644B1 (en) 2016-12-15 2025-03-19 Clariant International Ltd Water-soluble and/or water-swellable hybrid polymer
ES3033231T3 (en) 2016-12-15 2025-07-31 Clariant Int Ltd Water-soluble and/or water-swellable hybrid polymer
CZ310444B6 (cs) * 2021-09-13 2025-06-25 Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i. Fluorescenčně značený polymer pro vizualizaci nádorů a jeho použití
CZ310462B6 (cs) * 2022-04-22 2025-07-09 Ústav makromolekulární chemie AV ČR, v. v. i. Polymerní konjugát pro blokování nespecifických interakcí v imunochemických stanoveních, způsob jeho výroby a jeho použití

Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001094032A1 (de) * 2000-06-02 2001-12-13 Eppendorf Ag Verfahren zur herstellung von als ausgangsprodukte für mikroarrays dienenden oberflächenfunktionalisierten trägern zur immobilisierung von biomolekülen
EP2362220A1 (en) * 2010-02-25 2011-08-31 Corning Incorporated Affinity hydrogel and label independent detection methods thereof

Family Cites Families (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4778751A (en) * 1986-05-12 1988-10-18 Diagnostic Products Corporation Method for measuring antigens or antibodies in biological fluids using ligand labeled antigens or ligand labeled antibodies
US7662360B2 (en) * 2002-07-22 2010-02-16 Psimei Pharmaceuticals Plc Conjugates of N-hydroxypropymethacrylamide-methacrylate copolymer with nuclide activation agent and/or anti-cancer compounds
CZ294996B6 (cs) * 2003-07-16 2005-04-13 Ústav Makromolekulární Chemie Av Čr Reaktivní polymery a kopolymery na bázi N-(2-hydroxypropyl)methakrylamidu, způsob jejich přípravy a jejich použití pro syntézu polymerních léčiv, pro modifikaci biologicky aktivních proteinů a přípravu systémů pro dopravu genů

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2001094032A1 (de) * 2000-06-02 2001-12-13 Eppendorf Ag Verfahren zur herstellung von als ausgangsprodukte für mikroarrays dienenden oberflächenfunktionalisierten trägern zur immobilisierung von biomolekülen
EP2362220A1 (en) * 2010-02-25 2011-08-31 Corning Incorporated Affinity hydrogel and label independent detection methods thereof

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
B. Jeong, A. Gutowska: "Lessons from nature: stimuli-responsive polymers and their biomedical applications" TRENDS in Biotechnology 20 (7) 305-311 (2002) *
H. Ding et al.: "Two-step Fluorescence Screening of CD21-Binding Peptides with One-bead One-compound Library and Investigation of Binding Properties of HPMA Copolymer-Peptide Conjugates" Biomacromolecules 7 (11) 3037-3046 (2006) *
J. E. Gautrot et al.:"Protein-Resistant NTA-Functionalized Polymer Brushes for Selective and Stable Immobilization of Histidine-Tagged Proteins" ACS Appl. Mater. Interfaces, 2 (1), 193-202 (2010) *
K. Ulbrich, V. Šubr.: "Structural and chemical aspects of HPMA copolymers as drug carriers" Advanced Drug Delivery Reviews 62, 150-166 (2010) *
S.P. Cullen: "Synthesis and Evaluation of Polymer Brushes and Crosslinked Thin as Scaffolds for Biomolecule Immobilization" dissertation thesis, University of Wisconsin-Madison 2008, UMI no. 3348929 *
V. Subr, K. Ulbrich: "Synthesis and properties of nes (N-(2-hydroxypropyl)-methacrylamide copolymers containing thiazolidine-2-thione reactive groups" Reactive & Functional Polymers 66 s. 1525-1538 (2006) *

Also Published As

Publication number Publication date
WO2016112883A3 (en) 2016-08-25
CA2970913A1 (en) 2016-07-21
US10302632B2 (en) 2019-05-28
EP3245514A2 (en) 2017-11-22
US20180052152A1 (en) 2018-02-22
IL253425B (en) 2019-09-26
EP3245514B1 (en) 2019-07-10
CA2970913C (en) 2019-08-06
SG11201704995QA (en) 2017-07-28
WO2016112883A2 (en) 2016-07-21
IL253425A0 (en) 2017-09-28
CZ201520A3 (cs) 2016-07-27
AU2016207126B2 (en) 2018-11-29
AU2016207126A1 (en) 2017-07-13
US20190033300A1 (en) 2019-01-31

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CZ308807B6 (cs) Makromolekulární konjugáty pro vizualizaci a separaci proteinů a buněk
ES2988965T3 (es) Colorantes poliméricos solubles en agua que tienen cromóforos colgantes
US9696310B2 (en) Molecular sensor and methods of use thereof
Nath et al. Homogeneous plate based antibody internalization assay using pH sensor fluorescent dye
ES2773056T3 (es) Método de detección de formas activas de analito
US10138267B2 (en) Bioconjugates of heterocyclic compounds
Leistra et al. Force spectroscopy of multivalent binding of riboflavin-conjugated dendrimers to riboflavin binding protein
US10557853B2 (en) Molecular sensor and methods of use thereof
AU2016207125B2 (en) Macromolecular conjugates for isolation, immobilization and visualization of proteins
Bloch et al. The effect of linker type and recognition peptide conjugation chemistry on tissue affinity and cytotoxicity of charged polyacrylamide
EP3881072A1 (en) Molecules and methods for improved immunodetection of small molecules, such as histamine
Wang et al. Fluorescent labeling of live-cell surfaceome and its application in antibody-target interaction analysis
Unger-Angel Developing fluorescent molecular sensors for detecting protein isoforms and glycoforms in their native environments
CN111471686A (zh) 一种靶向p53蛋白的寡核苷酸序列及其衍生探针和应用