JP4018826B2 - ウイルス抗原スライドの製造方法 - Google Patents
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Description
【発明の属する技術分野】
本発明は、ウイルスの測定手段に関する技術分野の発明であり、より具体的には、検体中の特定のウイルス抗体を測定し得る、ウイルス抗原スライドに関する発明である。
【0002】
【従来の技術】
特定のウイルスの抗原をスライド上に固定した「ウイルス抗原スライド」は、このスライド上に固定したウイルス抗原と検体とを接触させて、その検体中の特定のウイルスに対する抗体を、このウイルス抗体と前記のスライド上に固定したウイルス抗原との抗原抗体反応により検出し、これにより検体中のウイルス抗体を測定し得る手段として用いられる、ウイルス抗体測定用品である。
【0003】
このウイルス抗原スライドは、すでに実用化されており、ウイルス抗体検出試験の際に個別的に製造される他、市販もなされている。
このスライド上に固定するウイルス抗原の代表的なものとして、そのウイルス抗原を生産し得る特定の細胞が用いられている。この態様のウイルス抗原スライドにおいては、特定の細胞に発現するウイルス抗原と検体中のウイルス抗体との間の抗原抗体反応を検出することにより、検体中のウイルス抗体が測定され得るのである。
【0004】
ウイルス抗原を発現し得る特定の細胞を固定したウイルス抗原スライドにより測定されるウイルスの代表的なものの一つとして、EB(Epstein-Barr)ウイルスを挙げることができる。このEBウイルスは、伝染性単核症の原因ウイルスであるが、このEBウイルスの核抗原であるEBNA(EB virus-associated Nuclear Antigen)抗体は、伝染性単核症の急性期においては陰性で、回復期に入ってからは陽転するという特徴が知られている。そして、これが伝染性単核症の診断上の重要な指標となっている。
【0005】
上記のEBNAを生産する細胞としては、例えば、Raji細胞が知られており、このRaji細胞を固定した、EBNA測定用のウイルス抗原スライドは、既に市販されている。
【0006】
【発明が解決しようとする課題】
しかしながら、現在提供されているRaji細胞等のENBA発現細胞を固定した、EBNA測定用のウイルス抗原スライドにおいても課題が存在しないわけではない。
【0007】
すなわち、従来から用いられている、このEBNA抗体測定用のウイルス抗原スライドは、製造方法における難点故に、ロット間差を解消することが困難であり、EBNA抗体を正確に測定することに対する障害になっている点は否めない。
【0008】
そこで、本発明が解決すべき課題は、このような課題を克服した、EBNA測定用のウイルス抗原スライドを提供する手段を確立することである。
【0009】
【課題を解決するための手段】
本発明者は、この課題の解決のために、上記のRaji細胞のスライドへの固定方法について鋭意検討した。その結果、従来行われていない特定の条件を、Raji細胞のスライドへの固定に際して施すことにより、この課題を解決し得ることを見出した。
【0010】
すなわち、本発明は、Raji細胞を板状体に塗抹して、この細胞を板状体上に固定するEBNA抗原スライドの製造方法において、スライドとして用いる板状体におけるRaji細胞の塗抹後、この板状体を室温に晒し、次いで、水性溶媒と接触させた後に、塗抹したRaji細胞の固定化処理を行う、ウイルス抗原スライドの製造方法(以下、本発明製造方法という)を提供する発明である。
【0011】
なお、本発明において、「スライドとして用いる板状体」とは、Raji細胞を固定化する前提として塗抹する対象となる板状体であり、通常は、透明度の高いガラス板やプラスチック板等が用いられる。この板状体の典型的な態様は、いわゆるスライドグラスである。
【0012】
【発明の実施の形態】
以下、本発明の実施の形態について説明する。
本発明製造方法において、スライドとして用いられる板状体上(以下、特に断わらない限り、板状体と記載する)に塗抹する、EBNA発現細胞であるRaji細胞は、バーキットリンパ腫患者から培養樹立されたリンパ芽球様細胞株で、EBV遺伝子を保有し、その細胞核内にEBNAを発現している細胞株である。このRaji細胞は、また、EBウイルス感染診断検査において、EBNA抗体測定に繁用されている。かかるRaji細胞は、世界中の研究機関において継代維持されているが、市販もされており、容易に入手することができる細胞である。
【0013】
Raji細胞の板状体の塗抹は、通常公知の方法に従って行うことができる。
すなわち、継代培養を行って得た、継代Raji細胞を洗浄後、Raji細胞の細胞懸濁液を調製し、この細胞懸濁液を板状体上に塗抹することにより、目的の塗抹を行うことができる。
【0014】
次いで、板状体上に塗抹した細胞懸濁液を、室温に晒して、完全に乾燥させることが必要である。本発明製造方法において、この室温に晒す時間は、1時間以内であることが好ましい。
このようにして、室温に細胞懸濁液を塗抹した板状体を晒した後、この板状体に塗抹されたRaji細胞と水性溶媒とを接触させる。ここで用いられる水性溶媒は、水を基礎とした溶媒であれば特に限定されるものではなく、PBS(水で希釈率を調整することも可能)、BSS(Balanced salt-solution:水で希釈率を調整することも可能)等が挙げられる。本発明においては、一定のpH及びイオン強度を保つことが好ましいという理由から、特に水で希釈したPBSを用いることが好適である。かかる場合のPBSの希釈率は、概ね4倍〜5倍程度が好ましい。
【0015】
このRaji細胞と水性溶媒との接触時間は、30秒程度であることが必要である。かかる接触時間が30秒程度よりも長くても、短くても、後述する蛍光抗体補体法によるENBA抗体の測定において、蛍光染色性が低下し、例えば、蛍光顕微鏡像がリング状に光る等の不都合が生じる傾向が強くなり、好ましくない。
【0016】
上記の処理を行った、Raji細胞を塗抹した板状体に固定化処理を施して、所望するウイルス抗原スライドを製造することができる。
この固定化処理は、公知の固定化処理方法に従って行うことができる。すなわち、上記のRaji細胞を塗抹した板状体をアセトン等の固定化溶媒に接触させ、これを乾燥させることにより、所望するRaji細胞を固定化した、ウイルス抗原スライドを製造することができる。
【0017】
上記のような工程を経て製造した、ウイルス抗原スライドは、驚くべきことに、従来のものに比べて、製品のロット間の格差は格段に解消され、EBNA抗原と検体中の抗EBNA抗体との抗原抗体反応をさらに的確に検出して、検体中のEBウイルスの測定効率及び測定確度を向上させることが可能である。
【0018】
この本発明製造方法に係わるウイルス抗原スライド(以下、本発明ウイルス抗原スライドともいう)を用いた、検体中のEBウイルスの測定手法は、現在、既存のウイルス抗原スライドを用いたウイルスの測定手法と同様の方法で行うことが可能である。
【0019】
本発明おいて、ENBA抗体の測定は、間接蛍光抗体補体法により行われる。すなわち、板状体に固定化したRaji細胞のEBNA抗原を抗原とし、検体中の抗EBNA抗体を反応させ(一次反応)、これにより生じた抗原抗体複合物に補体成分を反応させる(二次反応)。次いで、この補体成分に対する蛍光標識抗補体抗体を反応後(三次反応)、蛍光顕微鏡下で陽性像の有無を観察する方法である。
【0020】
なお、伝染性単核症の診断のために、本発明ウイルス抗原スライドを抗EBNA抗体を検出するべき検体は、特に限定されないが、例えば、血清等の血液検体や髄液検体等を用いることができる。
本発明ウイルス抗原スライドは、かかる測定手法において、好適に用いられる。
【0021】
伝染性単核症は、主にEBウイルス感染によって惹き起こされる。抗体検査による感染診断においては、EBV−VCA/IgM抗体が陽性となった際に、最近にEBV感染が起こったことが証明され、患者の疾患が、EBVによる伝染性単核症と診断されるが、患者によっては、VCA−IgMの抗体上昇が不十分な場合があり得る。ENBA抗体は、本疾患の回復期においてはじめてできる抗体であるので、EBV既感染のマーカーであるVCA−IgG抗体が陽性で、かつ、EBNA抗体が陰性の結果が得られた場合に、EBVの感染は、過去数カ月以内に起こったと判断される。さらに、EA−IgGが陽性であれば、ほぼEBVによる感染であると判断される。また、逆に、ENBA抗体が陽性であれば、患者の症状がEBVによる伝染性単核症であることを否定し得る。
【0022】
なお、本発明ウイルス抗原スライドは、上記のような伝染性単核症の診断に用いる診断用キットとしての形態もとり得る。
この診断用キットには、本発明ウイルス抗原スライドの他に、検体中の抗EBNA抗体を検出するために必要な公知の要素を加えることができる。具体的には、例えば、蛍光抗体、蛍光抗体用希釈液、対照陽性検体、対照陰性検体、希釈用緩衝液、封入液等を、診断用キットの要素として含ませることができる。
【0023】
【実施例】
以下、本発明を実施例を用いて具体的に説明するが、これらの実施例により、本発明の技術的範囲が限定されるものではない。
【0024】
本発明ウイルス抗原スライドの製造
市販されているRaji細胞を、培地としてRPMI1640−10%FBS培地を用い、CO2 インキュベーター中(37℃,5%CO2 ,湿度95%以上)で継代培養を行い、この培養3日目で、細胞の生存率が95%以上であることを確認して回収した。
【0025】
回収したRaji細胞を、無血清のRPMI1640培地に懸濁して、1500rpm の遠心処理を5分間、3回行うことにより、洗浄した。次いで、この洗浄したRaji細胞の3倍容の無血清のRPMI1640培地に懸濁して、この細胞懸濁液を、50μL のマイクロピペットで、スライドグラスのウエルに塗抹した(塗抹時の湿度は20〜80%、気温は20〜28℃であった)。この細胞懸濁液の塗抹終了後、塗抹済みのスライドグラスを30分間〜1時間、同様の環境下で放置して、スライドグラスの全ウエルが乾燥したことを確認した。次いで、このスライドグラスを染色カゴに移し、蒸留水で5倍容に薄めた、室温PBS又は氷冷PBS中に染色カゴごと静かに浸漬し、30秒間、室温下又は氷冷下で、Raji細胞と上記の希釈したPBSを接触させた。
【0026】
この希釈したPBSとスライドグラスの接触後、スライドグラスをアセトンと30秒間、室温で接触させ、さらに、別のアセトン中に、10分間、室温で接触させた後、スライドグラスを30分程室温で乾燥させて、Raji細胞をスライドグラスに固定した。
このようにして製造した本発明ウイルス抗原スライドは、保存容器に乾燥剤と共に入れ、−35℃で凍結保存を行った。
【0027】
対照として、従来の方法でウイルス抗原スライドを製造した。
すなわち、上記と同じく、市販のRaji細胞から調製した洗浄済みの継代Raji細胞を、スライドグラスに塗抹した後、2時間室温で放置した。次いで、アセトン:メタノール=1:1(容量比)の混液(−20℃)に1〜2分間、この細胞塗抹スライドを接触させ、Raji細胞の固定を行った。これを1時間風乾し、比較用の対照となるウイルス抗原スライドを製造し、これを、上記と同一の条件で凍結保存を行った。
【0028】
試験例1
上記の保存容器から、本発明ウイルス抗原スライドと比較用のウイルス抗原スライドを、各3枚(本発明ウイルス抗原スライドを、各本発明品A,B,Cで表し、比較用のウイルス抗原スライドを、各比較品a,b,cで表す)を取り出して、扇風機で送風しつつ、室温に戻した。
【0029】
被験血清は、3名の健常人の血清を用い(各血清1,2,3で表す)、各々の被験血清をPBSで5倍希釈し、30分間、56℃下に晒すことにより、患者自身の血清補体を不活化した。
マイクロプレート上で、10〜320倍の被験血清の二段階希釈列をつくり、湿潤箱中に置いた、ウイルス抗原スライドの各ウエルに、各々の希釈度の被験血清を接触させて、バイブレータ(VF−5:サクラ精機製)で、30秒間、微振盪を行った後、37℃のインキュベーター内で、30分間反応を行った。
【0030】
次いで、PBSで被験血清を洗い流した後、10分間、ENBA抗原スライドをPBS中に浸漬した(PBSの交換を1回行った)。
浸漬後、スライドグラスのウエル間に付着しているPBSを拭き取り、スライドグラス上の各Raji細胞が濡れている状態のうちに、冷BSSで至適希釈を行った補体〔ヒト:20倍(自家製)、モルモット:120倍(デンカ生研製)〕を、直ちに各スライドグラス上のRaji細胞に接触させて、補体反応を開始した。
【0031】
かかる補体反応は、補体を接触させた上記スライドグラスを、上記のバイブレーターで、60秒間微振盪後、37℃のインキュベーター内で、45分間放置することにより行った。
補体反応終了後、スライドグラス上の補体をPBSで洗い流し、10分間、各マイクロプレートをPBS中に浸漬した(PBSの交換を1回行った)。
【0032】
浸漬後、スライドグラスのウエル間に付着しているPBSを拭き取り、スライドグラス上の各Raji細胞が濡れている状態のうちに、PBSで至適希釈した蛍光抗体(FITC標識した抗ヒト抗体と抗モルモットC3抗体:抗ヒト抗体は20倍希釈、抗モルモット抗体は80倍希釈)を接触させて、抗原抗体反応を行った。
【0033】
かかる抗原抗体反応は、蛍光抗体を接触させた上記スライドグラスを、上記のバイブレーターで、30秒間微振盪後、37℃のインキュベーター内で、30分間放置することにより行った。
抗原抗体反応終了後、スライドグラス上の蛍光抗体をPBSで洗い流し、10分間、各スライドグラスをPBS中に浸漬した(PBSの交換を1回行った)。
【0034】
浸漬後、スライドグラスのウエル間に付着しているPBSを拭き取り、封入剤(グリセリン:PBS=1:1)を、各ウエルに滴下した。
次いで、各スライドグラスのウエルをカバーグラスで封入し、各々の蛍光を励起させて(U励起又はB励起による)、蛍光顕微鏡による観察を行った。
結果を第1表に表す。
【0035】
【0036】
表中における被験血清の希釈率は、蛍光顕微鏡下で、固定化したRaji細胞の蛍光染色像が鮮明に認められた希釈率である。例えば、表中で、「80」とあるのは、80倍に被験血清を希釈しても、蛍光顕微鏡における固定化したRaji細胞の染色像が鮮明であるが、160倍では鮮明ではなかったことを示している。
【0037】
この第1表により、同一の被験血清において、本発明品においては、比較品の少なくとも2倍高い希釈率が認められることが明らかになった。すなわち、本発明ウイルス抗原スライドにおいては、EBNA抗体の蛍光染色法による検出感度が飛躍的に向上することが明らかになった。
また、本発明品は、比較品に比べて、同一の被験血清に対して、ロット間における結果のズレが小さいことが明らかになった。
【0038】
なお、比較品3ロット(比較品a,b,c)は、9ロットの比較品を製造してはじめて得ることができた。すなわち、比較品9ロット中、6ロットは20倍に被験血清を希釈しても、固定化したRaji細胞の染色像が十分に認められなかった。これに対して、本発明品においては、製造した3ロット全て(本発明品A,B,C)が、20倍に希釈した被験血清に対して、固定化したRaji細胞の鮮明な染色像を与えた。
【0039】
【発明の効果】
本発明により、製品ロット間差が少なく、蛍光抗体補体法における染色性に優れる、検体中のEBウイルスを測定し得る、ウイルス抗原スライドの製造方法が提供される。
Claims (1)
- Raji細胞を板状体に塗抹して、この細胞を板状体上に固定するEBNA抗原スライドの製造方法において、スライドとして用いる板状体におけるRaji細胞の塗抹後、この板状体を室温に晒し、次いで、水性溶媒と接触させた後に、塗抹したRaji細胞の固定化処理を行う、ウイルス抗原スライドの製造方法。
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