WO2002010132A1 - Derive de succinimide utile en tant que monomere bifonctionnel polymerisable - Google Patents

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WO2002010132A1
WO2002010132A1 PCT/FR2001/002508 FR0102508W WO0210132A1 WO 2002010132 A1 WO2002010132 A1 WO 2002010132A1 FR 0102508 W FR0102508 W FR 0102508W WO 0210132 A1 WO0210132 A1 WO 0210132A1
Authority
WO
WIPO (PCT)
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polymer
monomer
biological ligand
conjugate
nas
Prior art date
Application number
PCT/FR2001/002508
Other languages
English (en)
Inventor
Marie-Thérèse CHARREYRE
Franck D'agosto
Original Assignee
Bio Merieux
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Bio Merieux filed Critical Bio Merieux
Priority to AU2001284092A priority Critical patent/AU2001284092A1/en
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D207/00—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D207/02—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom
    • C07D207/30—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members
    • C07D207/34—Heterocyclic compounds containing five-membered rings not condensed with other rings, with one nitrogen atom as the only ring hetero atom with only hydrogen or carbon atoms directly attached to the ring nitrogen atom having two double bonds between ring members or between ring members and non-ring members with hetero atoms or with carbon atoms having three bonds to hetero atoms with at the most one bond to halogen, e.g. ester or nitrile radicals, directly attached to ring carbon atoms
    • C07D207/36—Oxygen or sulfur atoms
    • C07D207/40—2,5-Pyrrolidine-diones
    • C07D207/404—2,5-Pyrrolidine-diones with only hydrogen atoms or radicals containing only hydrogen and carbon atoms directly attached to other ring carbon atoms, e.g. succinimide

Definitions

  • the present invention relates to a novel polymerizable bifunctional monomer as well as polymers incorporating this monomer and a polymer-chemical reagent conjugate.
  • Synthetic polymers have been used for a long time both in the therapeutic field to vectorize active molecules or genes and in the diagnostic field. In the latter case, biological ligands are fixed to the polymers either by complexation, by covalence or by specific recognition, and the conjugates 0 thus formed are used in tests for detection of target molecules, essentially to increase the sensitivity.
  • the monomer N-acryloxysuccinimide is a monomer which has been used very frequently for the synthesis of polymers by the radical route.
  • the interest of the NAS monomer is to carry a reactive chemical function which allows the coupling of 5 chemical reagents and in particular of biological ligands on the polymer.
  • patent FR 2 707 010 (Mecuringt C. et al) describes a copolymer based on N-vinyl pyrrolidone such as the N-vinyl pyrrolidone / N-acryloxysuccinimide copolymer (NVPNAS) for fixing biological ligands on a solid support.
  • NDPNAS N-acryloxysuccinimide copolymer
  • the present invention describes a new type of monomer which has good reactivity in copolymerization and two reactive functions for increasing the coupling rates of chemical reactants. 0
  • This monomer has the following structure
  • R is H or C1 to C6 alkyl.
  • R is H or a linear alkyl from Cl to C4.
  • R is H.
  • the bond represented by a non-rectilinear line means that the R group can be the Z or E isomer with respect to the ethylenic bond.
  • the invention also relates to a polymer comprising at least one monomer incorporated by polymerization (polymer incorporating the monomer of the invention) and in particular a copolymer.
  • copolymer should be understood as a polymer formed by at least two different monomers B and C (one of which is a monomer according to the invention) and in particular random copolymers (in which the monomer units B and C are distributed statistically along the macromolecular chain) and the alternating copolymers (in which the monomers B and C follow one another regularly according to a general structure (B n C m ) p in which n, m and p are whole or identical numbers).
  • copolymers can be obtained, for example, by radical or anionic polymerization, preferably by living radical polymerization such as reversible termination polymerization (use of nitroxide radicals), atom transfer polymerization (ATRP), transfer polymerization reversible chain by addition-fragmentation (RAFT, see patent WO 98/01478).
  • living radical polymerization such as reversible termination polymerization (use of nitroxide radicals), atom transfer polymerization (ATRP), transfer polymerization reversible chain by addition-fragmentation (RAFT, see patent WO 98/01478).
  • ATRP atom transfer polymerization
  • RAFT transfer polymerization reversible chain by addition-fragmentation
  • the copolymer can also comprise 3 or more monomers, at least one of which is the monomer of the invention, in particular di-NAS.
  • the other monomers which can be used in copolymerization with the monomer of the invention are hydrophobic or hydrophilic of the ethylene, propylene, vinyl aromatic, vinyl ether, N-vinyl pyrrolidone, acrylate, methacrylate, (meth) acrylamide, styrene or substituted styrene derivative type, vinyl halide (vinyl chloride), vinyl acetate, diene or monomers with nitrile functions (acrylonitrile).
  • the other monomer (s) are chosen, for example, from monomers derived from acrylamide, from methacrylamide, N-vinylpyrrolidone (NVP), preferably N-acryloyl morpholine (NAM).
  • NNP N-vinylpyrrolidone
  • NAM N-acryloyl morpholine
  • chemical reagent includes all the molecular compounds capable of reacting by formation of covalent bond with the ester function of N-hydroxysuccinimide carried by the monomer of the invention or the polymer containing said monomer of the invention, and in particular the biological ligands.
  • the only necessary condition for the chemical reagent is to carry a reactive function capable of reacting with the ester function of N-hydroxysuccinimide.
  • the reactive function is chosen, for example, from amine, hydrazine, hydrazide, azide, alkoxyamine, hydroxyl groups.
  • the present invention also relates to a polymer-chemical reagent conjugate comprising at least one chemical reagent, preferably a biological ligand attached to a polymer.
  • biological ligand is meant a compound which has at least one recognition site allowing it to react with a target molecule of biological interest.
  • biological ligands of polynucleotides, antigens, antibodies, polypeptides, proteins, haptens.
  • polynucleotide signifies a sequence of at least 2 deoxyribonucleotides or ribonucleotides optionally comprising at least one modified nucleotide, for example at least one nucleotide comprising a modified base such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5-deoxyuridine, deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base allowing hybridization.
  • a modified base such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino-5-deoxyuridine, deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base allowing hybridization.
  • This polynucleotide can also be modified at the level of the internucleotide bond such as for example phosphorothioates, H-phosphonates, alkyl-phosphonates, at the level of the backbone such as for example alpha-oligonucleotides (FR 2 607 507) or PNA (M Egholm et al., J. Am. Chem. Soc, 114, 1895-1897, (1992 or 2 'O-alkyl ribose. Each of these modifications can be taken in combination.
  • the polynucleotide can be an oligonucleotide, an acid natural nucleic acid or its fragment such as DNA, ribosomal RNA, messenger RNA, transfer RNA, nucleic acid obtained by an enzymatic amplification technique.
  • polypeptide is meant a chain of at least two amino acids.
  • amino acids is meant the primary amino acids which code for proteins, amino acids derived after enzymatic action such as trans-4-hydroxyproline and natural amino acids but not present in proteins such as norvaline,
  • hapten designates non-immunogenic compounds, that is to say incapable by themselves of promoting an immune reaction by production of antibodies, but capable of being recognized by antibodies obtained by immunization of animals in known conditions, in particular by immunization with a hapten-protein conjugate.
  • These compounds generally have a molecular mass of less than 3000 Da, and most often less than 2000 Da and can be, for example, glycosylated peptides, metabolites, vitamins, hormones, prostaglandins, toxins or various drugs, nucleosides and nucleotides.
  • antibody includes polyclonal or monoclonal antibodies, antibodies obtained by genetic recombination, and antibody fragments such as Fab or F (ab ') fragments 2-
  • antigen denotes a compound capable of generating antibody.
  • protein includes holoproteins and heteroproteins such as nucleoproteins, lipoproteins, phosphoproteins, metalloproteins and glycoproteins both fibrous and globular in their characteristic conformational form.
  • the chemical reagent is attached to the polymer directly or indirectly.
  • indirect fixation is meant fixation by a non-covalent interaction.
  • any known means can be used, based for example on affinity phenomena, in particular between biological molecules such as the biotin / streptavidin interaction.
  • biotin is introduced onto the polymer by coupling equivalent to the reactive ester function of N-hydroxysuccinimide and the binding of the biological ligand to the polymer is ensured by the presence of the streptavidin introduced by coupling onto the biological ligand.
  • streptavidin is introduced onto the polymer by covalent coupling to the reactive ester function of N-hydroxysuccinimide and the binding of the biological ligand to the polymer is ensured by the presence of the biotin introduced by coupling onto the biological ligand.
  • direct attachment attachment by covalent coupling.
  • Many methods for introducing reactive functions on a biological ligand are available: for proteins, antigens, antibodies or polypeptides, see for example
  • a polynucleotide is synthesized for example by chemical method on solid support having a reactive function at any point of the chain such as, for example, the 5 ′ end or the 3 ′ end or on a base or on an internucleotide phosphate or on the 2 ′ position of the sugar (see “Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties” edited by S. Agrawal, Humana Press, Totowa, New Jersey).
  • the biological ligand-polymer conjugates of the present invention are for example used in tests for the detection of target molecules, for example in the diagnostic field or in therapeutic fields to vectorize active molecules or genes.
  • the biological ligand is capable of forming a complex with at least one target molecule.
  • the biological ligand is capable of forming a ligand / anti-ligand capture complex.
  • said anti-ligand constitutes the target molecule.
  • the biological ligand can be a nucleic acid sufficiently complementary to the target to hybridize specifically according to the reaction conditions and in particular the temperature or the salinity of the reaction medium.
  • N-Acryloylmorpholine (NAM, Polysciences Inc, reference 21192) is distilled before use in polymerization. Chloroform (Merck, reference 22711.290) is used as it is.
  • Triethylamine (Acros reference 15791-0010) is used as it is.
  • the azobis-isobutyronitrile ALBN polymerization initiator
  • Fluka, reference 11630 is recrystallized from ethanol.
  • the trioxane (internal reference for monitoring R.M.N. 'H, Acros, reference 14.029.5000) is used as it is.
  • the polymerizations are carried out in DMSO-d6 (99.5%, SDS, reference 520-4).
  • Tetramethylsilane is used as an internal reference.
  • Elementary analyzes are carried out at the "Central Analysis Service of
  • CNRS "(Solaize, France). Mass spectrometry analysis is carried out using a ZAB-SEQ spectrometer (VG, Manchester, UK). The average molar masses and the polymolecularity indices are determined by CES ( Steric Exclusion Chromatography) in DMF (column Polymer Laboratories Gel Mixed,) on the basis of a polystyrene calibration. Detection is ensured by a refractometer (DRI
  • N-hydroxysuccinimide (50.0 g, 0.430 mol, Aldrich, reference 13067-2) and triethylamine (65.9 g, 0.645 mol) are dissolved in 650 ml of chloroform.
  • Acryloyl chloride 43.0 g, 0.470 mol, Aldrich, reference A2410-9) is added dropwise over 2 hours 5 minutes to the mixture maintained at 0 ° C and with stirring.
  • reaction mixture is washed three times with 1300 L of a saturated NaCl solution.
  • the organic phase is dried over MgSO 4 , filtered and concentrated until a volume of approximately 150 ml is obtained.
  • the mixture thus obtained is placed at 0 ° C. overnight or at ambient temperature for 12 hours.
  • the presence of 1.5 equivalents of triethylamine promotes the formation of di-
  • the thin layer chromatographies are carried out on silica gel (Merck 60F 254 ) deposited on aluminum foil (UV development and EtOH / H 2 SO 4 mixture with heater).
  • the crude product is purified on silica gel (Merck 40-63 ⁇ m) by column chromatography.
  • the eluent used is a mixture of ethyl acetate / dichloromethane (3/2 v / v). Purification isolates the di-NAS product from the NAS.
  • the structure of the di-NAS is as follows:
  • Table 1 Characterization of di-NAS: elementary analysis and mass spectrometry.
  • the polymerizations are carried out directly inside an NMR tube.
  • a homogeneous solution of di-NAS (170 mg, 0.25 mol.L “1 ), of NAM (148 mg, 0.52 mol .L “1 ), AIBN (0.9 mg, 2.7.10 " 3 mol.L “1 ) and trioxane (3.5 mg,
  • copolymers are precipitated in ether, recovered by filtration, washed several times with ether and finally dried under vacuum to constant mass.
  • NAS , H NAM are the values of the integrals corresponding to a vinyl proton of di- NAS and the NAM respectively, H ⁇ ,,, is the value of the integral of a proton of trioxane, C di .
  • NASt , C NAMt are the conversions of di-NAS and NAM after t minutes of polymerization.
  • Figure 6 shows the R.M.N. 'H (200 MHz) (vinyl area) of the reaction mixture during the copolymerization of di-NAS with NAM (solvent DMSO-d6).
  • FIG. 4 shows the variation of the conversion of the monomers as a function of time during the radical copolymerization in solution in DMSO-d6 of di-NAS (represented by the sign • in FIG. 4) with the NAM (represented by the sign o in Figure 4)
  • the copolymerization of di-NAS with NAM is easy since an overall conversion of 92%> is achieved in about two hours.
  • the conversion rates of the NAM and of the di-NAS are close to each other indicating a statistical incorporation of the comonomers in the chain and therefore a homogeneous composition of the macromolecules formed as a function of the conversion.
  • FIG. 5 shows the spectrum R.M.N 'H (200 Mz, solvent DMSO d6) of the copolymer based on NAM and on di-NAS, precipitated at 92% of overall conversion.
  • the molar composition of this copolymer corresponds to a NAM / di-NAS molar ratio of 66/34, close to the initial molar composition of the mixture of monomers (67/33).
  • Its number-average molar mass M n is of the order of 110,000 g.mol "1 with a polymolecularity index I p of 2.4 (Table 2).
  • This copolymer is soluble in low organic solvents (CHC1 3 ) or very polar (DMF, DMSO).
  • Table 2 Characterization of the copolymer based on NAM and di-NAS
  • Coupling with nucleic acids carrying an amino function at the 5 ′ end is carried out in a water / polar solvent mixture such as DMF or DMSO as described in patents FR 2 707 010 and FR 2 710 075 filed by the applicant.

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Abstract

L'invention concerne un monomère pour la polymérisation de formule générale (I) dans laquelle R est H ou un alkyl de C1 à C6, de préférence R et H ou un alkyl linéaire de C1 à C4. L'invention décrit aussi le polymère incorporant ledit monomère, un conjugué où un réactif chimique, préférentiellement un ligand biologique, est fixé sur le polymère et l'utilisation de ce conjugué pour former un complexe avec une molécule cible.

Description

DERIVE DE SUCCINIMIDE UTILE EN TANT QUE MONOMERE BIFONCTIONNEL POLYMERISABLE
La présente invention concerne un nouveau monomère bifonctionnel polymérisable ainsi que les polymères incorporant ce monomère et un conjugué polymère-réactif 5 chimique.
Les polymères de synthèse ont été utilisés depuis longtemps aussi bien dans le domaine thérapeutique pour vectoriser des molécules actives ou des gènes que dans le domaine du diagnostic. Dans ce dernier cas, des ligands biologiques sont fixés sur les polymères soit par complexation, par covalence ou par reconnaissance spécifique, et les conjugués 0 ainsi formés sont utilisés dans des tests de détection de molécules cibles, essentiellement pour augmenter la sensibilité.
Le monomère N-acryloxysuccinimide (NAS) est un monomère qui a été utilisé très fréquemment pour la synthèse de polymères par voie radicalaire. L'intérêt du monomère NAS est de porter une fonction chimique réactive qui permet le couplage de 5 réactifs chimiques et notamment de ligands biologiques sur le polymère. Ainsi, le brevet FR 2 707 010 (Mabilat C. et al) décrit un copolymère à base de N-vinyl pyrrolidone comme le copolymère N-vinyl pyrrolidone/N-acryloxysuccinimide (NVPNAS) pour la fixation de ligands biologiques sur un support solide. Ces mêmes copolymères ont été utilisés pour des réactions d'amplification de signal (voir brevet 0 FR 2 710 075, Mandrand B. et al.) ou pour la synthèse in situ de conjugués (voir WO
99/07749, Minard C. et al).
Bien que ces polymères présentent une bonne réactivité vis à vis du couplage de molécules chimiques, il est important d'améliorer le taux de couplage des réactifs 5 chimiques sur les polymères et donc il existe un besoin pour de nouveaux monomères qui présentent des performances accrues.
La présente invention décrit un nouveau type de monomère qui présente une bonne réactivité en copolymérisation et deux fonctions réactives pour augmenter les taux de couplage des réactifs chimiques. 0 Ce monomère a la structure suivante
Figure imgf000003_0001
dans laquelle R est H ou un alkyl de Cl à C6. Avantageusement R est H ou un alkyl linéaire de Cl à C4. De préférence R est H.
Quand R est H, le monomère dans la présente invention est appelé le di-NAS.
La liaison représentée par un trait non rectiligne signifie que le groupement R peut être l'isomère Z ou E par rapport à la liaison éthylénique.
L'invention concerne également un polymère comprenant au moins un monomère incorporé par polymérisation (polymère incorporant le monomère de l'invention) et notamment un copolymère.
Le terme copolymère doit être compris comme un polymère formé par au moins deux monomères B et C différents (dont l'un est un monomère selon l'invention ) et notamment les copolymères statistiques (dans lesquels les motifs monomères B et C sont répartis statistiquement le long de la chaîne macromoléculaire) et les copolymères alternés (dans lesquels les monomères B et C se succèdent régulièrement selon une structure générale (BnCm)p dans laquelle n, m et p sont des nombres entiers identiques ou différents). Ces différents copolymères peuvent être obtenus par exemple, par polymérisation par voie radicalaire, anionique, préférentiellement par polymérisation radicalaire vivante comme la polymérisation par terminaison réversible (utilisation de radicaux nitroxydes), la polymérisation par transfert d'atome (ATRP), la polymérisation par transfert réversible de chaîne par addition-fragmentation (RAFT, voir brevet WO 98/01478). Ces différentes techniques de polymérisation sont décrites par exemple dans K. Matyjazewski, Controlled Radical Polymerization, American Chemical Society Séries, Washington DC, USA, 1997 ; G. Odian, Principles of Polymerization, Third édition, Wiley-Interscience Publication, 1991. Le copolymère peut comprendre aussi 3 monomères ou plus, dont l'un au moins est le monomère de l'invention, en particulier le di-NAS.
Les autres monomères utilisables en copolymérisation avec le monomère de l'invention sont hydrophobes ou hydrophiles de type éthylène, propylène, vinyl aromatique, vinyl éther, N-vinyl pyrrolidone, acrylate, méthacrylate, (méth)acrylamide, styrène ou dérivé substitué du styrène, halogénure de vinyle (chlorure de vinyle), acétate de vinyle, diène ou des monomères présentant des fonctions nitriles (acrylonitrile).
Le ou les autres monomère sont choisis par exemple parmi les monomères dérivés d'acrylamide, de méthacrylamide, la N-vinylpyrrolidone (NVP), de préférence la N-acryloyl morpholine (NAM).
Le terme réactif chimique comprend tous les composés moléculaires susceptibles de réagir par formation de liaison covalente avec la fonction ester de N- hydroxysuccinimide porté par le monomère de l'invention ou le polymère contenant ledit monomère de l'invention, et notamment les ligands biologiques. La seule condition nécessaire pour le réactif chimique est de porter une fonction réactive susceptible de réagir avec la fonction ester de N-hydroxysuccinimide. La fonction réactive est choisie à titre d'exemple parmi les groupements aminé, hydrazine, hydrazide, azide, alcoxyamine, hydroxyle.
La présente invention concerne également un conjugué polymère-réactif chimique comprenant au moins un réactif chimique, préférentiellement un ligand biologique fixé sur un polymère.
Par ligand biologique on entend un composé qui possède au moins un site de reconnaissance lui permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt biologique. A titre d'exemple on peut citer comme ligands biologiques les polynucléotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, les haptènes. Le terme « polynucléotide » signifie un enchaînement d'au moins 2 désoxyribonucléotides ou ribonucléotides comprenant éventuellement au moins un nucléotide modifié, par exemple au moins un nucléotide comportant une base modifiée tel que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Ce polynucléotide peut aussi être modifié au niveau de la liaison internucléotidique comme par exemple les phosphorothioates, les H- phosphonates, les alkyl-phosphonates, au niveau du squelette comme par exemple les alpha-oligonucléotides ( FR 2 607 507) ou les PNA (M. Egholm et al., J. Am. Chem. Soc, 114, 1895-1897, (1992 ou les 2' O-alkyl ribose. Chacune de ces modifications peut être prise en combinaison. Le polynucléotide peut être un oligonucléotide, un acide nucléique naturel ou son fragment comme un ADN, un ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique.
Par « polypeptide » on entend un enchaînement d'au moins deux acides aminés. Par acides aminés, on entend les acides aminés primaires qui codent pour les protéines, les acides aminés dérivés après action enzymatique comme la trans-4-hydroxyproline et les acides aminés naturels mais non présents dans les protéines comme la norvaline, la
N-methyl-L leucine, la Staline (voir Hunt S. dans Chemistry and Biochemistry of the amino acids, Barett G.C., éd., Chapman and Hall, London, 1985), les acides aminés protégés par des fonctions chimiques utilisables en synthèse sur support solide ou en phase liquide et les acides aminés non naturels. Le terme « haptène » désigne des composés non immunogènes, c'est-à-dire incapables par eux mêmes de promouvoir une réaction immunitaire par production d'anticorps, mais capables d'être reconnues par des anticorps obtenus par immunisation d'animaux dans des conditions connues, en particulier par immunisation avec un conjugué haptène-protéine. Ces composés ont généralement une masse moléculaire inférieure à 3000 Da, et le plus souvent inférieure à 2000 Da et peuvent être par exemple des peptides glycosylés, des métabolites, des vitamines, des hormones, des prostaglandines, des toxines ou divers médicaments, les nucléosides et nucléotides.
Le terme « anticorps » inclut les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, les anticorps obtenus par recombinaison génétique, et des fragments d'anticorps tels que des fragments Fab ou F(ab')2- Le terme " antigène " désigne un composé susceptible de générer des anticorps. Le terme "protéine" inclut les holoprotéines et les hétéroprotéines comme les nucléoprotéines, les lipoprotéines, les phosphoprotéines, les métalloprotéines et les glycoprotéines aussi bien fibreuses que globulaires sous leur forme conformationnelle caractéristique.
Le réactif chimique est fixé sur le polymère de manière directe ou indirecte.
Par fixation indirecte on entend une fixation par une interaction non covalente. Pour une interaction non covalente, on peut utiliser tous moyens connus fondés par exemple sur les phénomènes d'affinité, notamment entre molécules biologiques comme l'interaction biotine/streptavidine. Par exemple, la biotine est introduite sur le polymère par couplage co valent sur la fonction réactive ester de N-hydroxysuccinimide et la fixation du ligand biologique sur le polymère est assurée par la présence de la streptavidine introduite par couplage sur le ligand biologique. Dans un autre exemple, la streptavidine est introduite sur le polymère par couplage covalent sur la fonction réactive ester de N-hydroxysuccinimide et la fixation du ligand biologique sur le polymère est assurée par la présence de la biotine introduite par couplage sur le ligand biologique.
Par fixation directe on entend une fixation par couplage covalent. De nombreuses méthodes pour introduire des fonctions réactives sur un ligand biologique sont disponibles : pour les protéines, antigènes, anticorps ou polypeptides, voir par exemple
"Chemistry of protein conjugation and cross-linking", Wong S. S., CRC press, Boca Raton, 1991 ou "Bioconjugate techniques", Hermanson G.T., Académie Press, San Diego, 1996. Pour les acides nucléiques, on synthétise par exemple un polynucléotide par méthode chimique sur support solide ayant une fonction réactive à un endroit quelconque de la chaîne comme par exemple, l'extrémité 5' ou l'extrémité 3' ou sur une base ou sur un phosphate internucléotidique ou sur la position 2' du sucre (voir « Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties » édité par S. Agrawal, Humana Press, Totowa, New Jersey). Des méthodes d'introduction de fonctions réactives sur des haptènes sont données notamment dans "Préparation of antigenic steroid-protein conjugate", F Kohen et al, dans Steroid immunoassay, Proceedings of the fifth tenovus workshop, Cardiff, Avril 1974, éd. EHD Cameron, SH. Hillier, K. Griffiths, comme par exemple l'introduction d'une fonction hémisuccinate en position 6, 11, 20 ou 21, d'une fonction chloroformiate en position 11 ou d'une fonction carboxyméthyle en position 6, dans le cas de la progestérone. Il n'est pas forcément nécessaire d'introduire spécifiquement une fonction réactive sur le ligand. Par exemple, dans le cas d'un ligand biologique de type protéine possédant une composition en lysine suffisante, les aminés portées par la chaîne latérale de la lysine peuvent être utilisées pour le couplage.
Les conjugués ligands biologiques-polymère de la présente invention sont par exemple utilisés dans des tests de détection de molécules cibles par exemple dans le domaine du diagnostic ou dans des domaines thérapeutiques pour vectoriser des molécules actives ou des gènes. Dans ce cas, le ligand biologique est capable de former un complexe avec au moins une molécule cible.
Dans le cas du diagnostic, pour permettre la détection et/ou la quantification et/ou la purification de la molécule cible, le ligand biologique est capable de foπner un complexe de capture ligand/anti-ligand. En particulier, ledit anti-ligand constitue la molécule cible. En fonction de la nature de la cible à détecter, l'homme du métier choisira la nature du ligand biologique à fixer sur le polymère. A titre d'exemple, pour la mise en évidence d'une molécule cible de type acide nucléique, le ligand biologique peut être un acide nucléique suffisamment complémentaire de la cible pour s'hybrider spécifiquement en fonction des conditions de réaction et notamment la température ou la salinité du milieu réactionnel.
Les exemples qui suivent permettent d'illustrer quelques avantages de l'invention sans toutefois en limiter la portée.
Exemple 1 : synthèse et caractérisation du monomère di-NAS
La N-Acryloylmorpholine (NAM, Polysciences Inc, référence 21192) est distillée avant utilisation en polymérisation. Le chloroforme (Merck, référence 22711.290) est utilisé tel quel.
La triéthylamine (Acros référence 15791-0010) est utilisée tel quelle. L'azobis-isobutyronitrile ALBN (amorceur de polymérisation) (Fluka, référence 11630) est recristallisé dans l'éthanol.
Le trioxane (référence interne pour le suivi R.M.N. 'H, Acros, référence 14.029.5000) est utilisé tel quel. Les polymérisations sont effectuées dans le DMSO-d6 (99,5%, SDS, référence 520-4).
Les spectres R.M.N. lH et I3C sont réalisés à l'aide d'un spectromètre Brϋcker AC 200
(200 MHz et 50 MHz respectivement). Le tétraméthylsilane est utilisé comme référence interne. Les analyses élémentaires sont effectuées au "Service Central d'Analyses du
CNRS" (Solaize, France). L'analyse par spectrométrie de masse est effectuée à l'aide d'un spectromètre ZAB-SEQ (VG, Manchester, UK). Les masses molaires moyennes et les indices de polymolécularité sont déterminés par C.E.S. (Chromatographie d'Exclusion Stérique) dans le DMF (colonne Polymer Laboratories Gel Mixed,) sur la base d'un étalonnage polystyrène. La détection est assurée par un réfractomètre (DRI
Waters 410).
- Mode opératoire
Le N-hydroxysuccinimide (50,0 g, 0,430 mol, Aldrich, référence 13067-2) et la triéthylamine (65,9 g, 0,645 mol) sont dissous dans 650 mL de chloroforme. Le chlorure d'acryloyle (43,0 g, 0,470 mol, Aldrich, référence A2410-9) est ajouté goutte à goutte pendant 2hl5 au mélange maintenu à 0°C et sous agitation.
Après 30 minutes supplémentaires d'agitation, le mélange réactionnel est lavé à trois reprises avec 1 300 L d'une solution saturée en NaCl. La phase organique est séchée sur MgSO4, filtrée et concentrée jusqu'à obtenir un volume d'environ 150 mL. Le mélange ainsi obtenu est placé à 0°C pendant une nuit ou à température ambiante 12 heures. La présence de 1,5 équivalents de triéthylamine favorise la formation du di-
NAS.
- Purification
Les chromatographies sur couche mince sont réalisées sur gel de silice (Merck 60F254) déposé sur feuille d'aluminium (révélation UV et mélange EtOH/H2SO4 avec chauffage). Le produit brut est purifié sur gel de silice (Merck 40-63 μm) par chromatographie sur colonne. L'eluant utilisé est un mélange acétate d'éthyle/dichlorométhane (3/2 v/v). La purification permet d'isoler le produit di-NAS du NAS.
La structure du di-NAS est la suivante :
Figure imgf000009_0001
Le produit est caractérisé par RMN : R.M.N. 'H (200 MHz) du di-NAS (solvant CDC13). (voir figure 1) et R.M.N 13C du di-NAS (solvant CDC13, 50 MHz) (figure 2) et DEPT 135 du di-NAS (solvant CDC13) (figure 3).
Une caractérisation supplémentaire par spectrométrie de masse et par analyse élémentaire a confirmé sa structure (Tableau 1).
Tableau 1 : Caractérisation du di-NAS : analyse élémentaire et spectrométrie de masse.
Figure imgf000009_0002
Exemple 2 Copolymerisation du di-NAS (avec la NAM)
Mode opératoire : Un essai de copolymerisation du di-NAS avec la NAM a été effectué avec un rapport molaire di-NAS/NAM de 33/67. La concentration totale des monomères est de 0,77 mol.L"1 avec un pourcentage molaire d'amorceur de 0,35%.
Les polymérisations sont effectuées directement à l'intérieur d'un tube R.M.N. Dans un premier temps, une solution homogène de di-NAS (170 mg, 0,25 mol.L"1), de NAM (148 mg, 0,52 mol.L"1), d'AIBN (0,9 mg, 2,7.10"3 mol.L"1) et de trioxane (3,5 mg,
1,9.10"2 mol.L"1) dans le DMSO-d6 (2 mL) est dégazée à l'aide d'un courant d'azote pendant une heure à température ambiante. Puis, une partie de cette solution est introduite dans un tube R.M.N. (préalablement dégazé à l'aide d'un courant d'azote) à l'aide d'une canule. Un premier spectre est enregistré à 300 K. La température est alors augmentée à 340 K. Des spectres de R.M.N. !H sont successivement enregistrés dans le but de suivre la cinétique de consommation des monomères.
Les copolymères sont précipités dans l'éther, récupérés par fîltration, lavés plusieurs fois à l'aide d'éther et finalement séchés sous vide jusqu'à masse constante.
Suivi cinétique
La conversion de chacun des monomères est déterminée par RMN !H par comparaison des protons vinyliques du di-NAS et de la NAM avec les protons du trioxane (référence interne) à l'aide des équations suivantes :
Figure imgf000010_0001
Hdi.NAS, HNAM sont les valeurs des intégrales correspondant à un proton vinylique du di- NAS et de la NAM respectivement, H^,,, est la valeur de l'intégrale d'un proton du trioxane, Cdi.NASt, CNAMt sont les conversions du di-NAS et de la NAM après t minutes de polymérisation.
La figure 6 montre le spectre R.M.N. 'H (200 MHz) (zone des vinyliques) du mélange réactionnel lors la copolymerisation du di-NAS avec la NAM (solvant DMSO-d6).
Les résultats du suivi cinétique par R.M.N. *H ont permis de tracer la courbe de conversion en fonction du temps pour chacun des deux monomères. La figure 4 montre la variation de la conversion des monomères en fonction du temps lors de la copolymerisation radicalaire en solution dans le DMSO-d6 du di-NAS (représenté par le signe • sur la figure 4) avec la NAM (représenté par le signe o sur la figure 4)
(rapport molaire 33/67).
La copolymerisation du di-NAS avec la NAM est aisée puisqu'une conversion globale de 92%> est atteinte en deux heures environ. De plus, les vitesses de conversion de la NAM et du di-NAS sont proches l'une de l'autre indiquant une incorporation statistique des comonomères dans la chaîne et donc une composition homogène des macromolécules formées en fonction de la conversion.
Caractérisation des polymères à base de di-NAS
La figure 5 montre le spectre R.M.N 'H (200 Mz, solvant DMSO d6) du copolymère à base de NAM et de di-NAS, précipité à 92% de conversion globale.
La composition molaire de ce copolymère, correspond à un rapport molaire NAM/di- NAS de 66/34, proche de la composition molaire initiale du mélange de monomères (67/33). Sa masse molaire moyenne en nombre Mn est de l'ordre de 110 000 g.mol"1 avec un indice de polymolécularité Ip de 2,4 (Tableau 2). Ce copolymère est soluble dans des solvants organiques peu (CHC13) ou très polaires (DMF, DMSO). Tableau 2 : Caractérisation du copolymère à base de NAM et de di-NAS
Figure imgf000012_0001
Le couplage avec des acides nucléiques portant une fonction aminé à l'extrémité 5' est réalisé dans un mélange eau/solvant polaire comme le DMF ou le DMSO comme décrit dans les brevets FR 2 707 010 et FR 2 710 075 déposés par la demanderesse.

Claims

REVENDICATIONS
1. Monomère polymérisable de formule générale
Figure imgf000013_0001
dans laquelle R est H ou un alkyl de Cl à C6, de préférence R est H ou un alkyl linéaire de Cl à C4.
2. Monomère selon la revendication 1 de formule
Figure imgf000013_0002
3. Polymère incorporant un monomère selon l'une quelconque des revendications l à 2.
4. Polymère selon la revendication 3, caractérisé par le fait qu'au moins un deuxième monomère est copolymérisé et que ledit deuxième monomère est choisi parmi les dérivés éthylène, propylène, vinyl aromatique, vinyl éther, acrylate, méthacrylate, (méth)acrylamide, styrène ou dérivé substitué du styrène, halogénure de vinyle, acétate de vinyle, diène ou des monomères présentant des fonctions nitriles, la N-vinyl pyrrolidone, de préférence ledit deuxième monomère est la N-acryloyl morpholine.
5. Conjugué polymère-réactif chimique comprenant au moins un réactif chimique fixé sur un polymère tel que défini dans l'une quelconque des revendications 3 à 4.
6. Conjugué selon la revendication 5 caractérisé par le fait que le réactif chimique est un ligand biologique.
7. Conjugué polymère-ligand biologique, selon la revendication 6, caractérisé par le fait que la fixation du ligand biologique sur le polymère est réalisée directement par couplage covalent.
8. Conjugué polymère-ligand biologique, selon la revendication 6, caractérisé par le fait que la fixation du ligand biologique sur le polymère est réalisée indirectement par une interaction non covalente.
9. Utilisation d'un conjugué selon l'une quelconque des revendications 6 à 8 pour former un complexe avec une molécule cible.
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