WO2002046759A1 - Dispositif de capture d'une molecule cible - Google Patents

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WO2002046759A1
WO2002046759A1 PCT/FR2001/003892 FR0103892W WO0246759A1 WO 2002046759 A1 WO2002046759 A1 WO 2002046759A1 FR 0103892 W FR0103892 W FR 0103892W WO 0246759 A1 WO0246759 A1 WO 0246759A1
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WO
WIPO (PCT)
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polymer
target molecule
monomer
boronic acid
acrylamide
Prior art date
Application number
PCT/FR2001/003892
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English (en)
Inventor
Pascale Hazot
Jean-Paul Chapel
Thierry Delair
Abdelhamid Elaissari
Original Assignee
Bio Merieux
Centre National De La Recherche
Universite Claude Bernard Lyon 1
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Filing date
Publication date
Application filed by Bio Merieux, Centre National De La Recherche, Universite Claude Bernard Lyon 1 filed Critical Bio Merieux
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C08F220/58—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide containing oxygen in addition to the carbonamido oxygen, e.g. N-methylolacrylamide, N-(meth)acryloylmorpholine
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F230/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and containing phosphorus, selenium, tellurium or a metal
    • C08F230/04—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and containing phosphorus, selenium, tellurium or a metal containing a metal
    • C08F230/06—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and containing phosphorus, selenium, tellurium or a metal containing a metal containing boron
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54353—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals with ligand attached to the carrier via a chemical coupling agent

Definitions

  • the subject of the present invention is a device for capturing target molecules, a method for capturing said target molecules as well as polymers which can be used for the preparation of such devices.
  • Patent FR 2 688 788 describes the synthesis and the use of ligand / maleic anhydride copolymer conjugates such as maleic anhydride / methyl vinyl ether (AMNE) copolymer for fixing the ligands on a solid support.
  • AMNE maleic anhydride / methyl vinyl ether
  • patent FR 2 707 010 describes a copolymer based on ⁇ -vinyl pyrrolidone such as the ⁇ -vinyl pyrrolidone / ⁇ -acryloxysuccinimide copolymer ( ⁇ NP ⁇ AS) always for fixing ligands on a solid support.
  • ⁇ NP ⁇ AS ⁇ -acryloxysuccinimide copolymer
  • This latex is then used for the capture of glucose or derivatives.
  • JP6324072 styrene-based latexes for capturing saccharified proteins
  • RU2093525 polymeric supports based on crosslinked polyvinyl alcohol comprising m-aminophenylboronic acids.
  • the present invention has demonstrated for the first time that hydrophilic polymers comprising boronic acid functions can be immobilized very effectively on solid supports while retaining specific fixing properties for target molecules, to result in a device for two-dimensional capture of target molecules, in which the hydrophilic polymer allows efficient capture of said target molecules.
  • a second advantage of the present invention is to provide a universal capture device, since the device is not limited to the capture of target molecules comprising a diol residue but the device can also be used to capture target molecules of any kind, via a ligand attached to the polymer if the ligand is capable of reacting with the target molecule to form a ligand / target molecule complex.
  • the present invention describes a device for capturing a target molecule.
  • the device comprises a solid support on which is immobilized a hydrophilic polymer which contains at least one monomer containing at least one boronic acid function, and this polymer is capable of binding directly or indirectly to the target molecule.
  • target molecule is meant a chemical compound or biological entity, the capture of which is of interest and in particular for the purposes of purification and / or detection and / or quantification.
  • monomer containing a boronic acid function is meant any monomer having a vinyl double bond and at least one boronic acid group such as, for example, the acrylates of phenoxyboronic acid or methacrylate of phenoxyboronic acid, N- (methylstyryl acid ) N-phenylboronic, styrylboronic acid, vinyl ethers of phenoxyboronic acid, N-vinyl N-phenylboronic acid, N- (phenylboronic acid) vinylbenzylarnide.
  • the monomer is a derivative of the acrylate, methacrylate, acrylamide or methacrylamide type of phenyl boronic acid.
  • hydrophilic polymer means a polymer whose second coefficient of virial in water is greater than zero (see for example “the physicochemistry of polymers” published by the GFP (French Group for the Study and Application of Polymers).
  • the polymer is a water-soluble polymer.
  • the polymer is a copolymer between an acrylamide or methacrylamide derivative of phenylboronic acid and an N-alkyl or N-alkoxy derivative of acrylamide or methacrylamide.
  • a derivative derived from N-alkylacrylamide or N-alkylmethacrylamide (which includes NN-dialkylacrylamide or NN-dialkylmethacrylamide), is chosen from N-isopropylacrylamide, N-methylacrylamide, N-ethyhnethacrylamide, Nn propylacrylamide, Nn-propylmethacrylamide, N-isopropylmethacrylamide, N-cyclopropylacrylamide, N, N-diethylacrylamide, N-methyl-N-isopropylacrylamide, N-methyl-Nn-propylacrylamide.
  • N-alkoxy derivative of acrylamide or methacrylamide is chosen from the compounds obtained by reaction of an acryloyl chloride or of mehacryloyl or of an activated ester, on an amine of general formula HN ((CH 2 -CH 2 -O) x - (CH 2 ) y -CH 3 ) z where x, y and z are whole numbers, x is greater than or equal to 1, y is greater than or equal to zero and z can take the values 1 or 2.
  • At least one of the monomers is a thermosensitive monomer.
  • the polymer is a water-soluble copolymer of m-methacrylamidophenyl boronic acid and N-methoxyethylmethacrylamide.
  • the polymer is in the form of hydrophilic particles.
  • particle is meant small parts of a substance insoluble in a liquid medium and in particular in an aqueous medium, and having a size of less than 10 micrometers.
  • the particles are colloidal particles or latexes.
  • the invention described aims to provide boronic acid groups on the surface by polymerization or copolymerization of a monomer derived from boronic acid during the synthesis of a latex or in a two-step process involving a first stage of preparation of a heart whose colloidal characteristics can be well controlled.
  • the particles are organic and resulting from the polymerization of at least one monomer carrying a boronic acid function with at least one monomer chosen from monomers derived from acrylamide, from methacrylamide , acrylate and methacrylate, in particular the N-alkylacrylamide and NN-dialkylacrylamide, such as N-isopropylacrylamide, N-methylacrylamide, N-ethylmethacrylamide, Nn-propylacrylamide, Nn-propylmethacrylamide, N-isopropylamide , N-cyclopropylacrylamide, N, N-diethylacrylamide, N-methyl-N-isopropylacrylamide, N-methyl-Nn-propylacrylamide; alkyl acrylates and methacrylates in which the alkyl group comprises from 1 to 3 carbon atoms;
  • Styrene, methylstyrene, ethylstyrene, tert-butylstyrene chloromethylstyrene, vinyltoluene derivatives thereof, acrylates and alkyl methacrylates in which the alkyl group comprises from 3 to 20 carbon atoms can be used in combination with another hydrophilic monomer such as acrylamide derivatives, methacrylamide, acrylates or methacrylates mentioned above.
  • the particles are organic and inorganic, the organic part originating from the polymerization of at least one monomer carrying a boronic acid function and of at least one monomer chosen from the monomers of acrylamide and acrylate, in particular N-alkylacrylamide and NN-dialkylacrylamide, such as N-isopropylacrylamide, N-methylacrylamide, N-ethylmethacrylamide, Nn-propylacrylamide, Nn-propylmethacrylamide, N-isopropyamide , N-cyclopropylacrylamide, N, N-diethylacrylamide, N-methyl-N-isopropylacrylamide, N-methyl-Nn-propylacrylamide; alkyl acrylates and methacrylates in which the alkyl group comprises from 3 to 20 carbon atoms; their derivatives and the copolymers of these monomers with one another; and the inorganic part originating from metal oxides, iron, titanium, co
  • the organic and / or inorganic colloidal particles, stable and functionalized comprise a core and an envelope.
  • the heart is essentially solid, organic and / or inorganic and can be hydrophilic or hydrophobic.
  • the hydrophilic envelope comprises at least the polymerized derivative of boronic acid.
  • the core is organic and comprises at least one organic polymer chosen from at least one homopolymer or a copolymer or their mixtures, resulting from the polymerization of at least one monomer chosen from the monomers d acrylamide and acrylate, in particular N-alkylacrylamide and NN-dialkylacrylamide, such as N-isopropylacrylamide, N-methylacrylamide, N-ethylmethacrylamide, Nn-propylacrylamide, Nn-propylmethacrylamide, N-isopropylm N-cyclopropylacrylamide, N, N-difhylacrylamide, N-methyl-N-isopropylacrylamide, N-methyl-Nn-propylacrylamide; alkyl acrylates and methacrylates in which the alkyl group comprises from 3 to 20 carbon atoms; styrene, methylstyrene, ethylstyrene, tert-but
  • the heart is organic and inorganic and comprises:
  • - inorganic particles chosen from particles of metal oxides, iron, titanium, cobalt, zinc, copper, manganese, nickel; magnetite; hematite, ferrites, such as manganese, nickel, manganese-zinc ferrites; cobalt, nickel alloys; zeolites; talc; clays such as bentonite and kaolin; alumina; silica; graphite; carbon black or other inorganic materials.
  • the hydrophilic envelope is a copolymer containing the monomer based on boronic acid with acrylate, methacrylate, acrylamide or methacrylamide derivatives.
  • an N-alkylacrylamide or N-alkylmethacrylamide derivative (which includes the NN-dialkylacrylamide and the NN-dialkylmethacrylamide), is chosen from N-isopropylacrylamide, N-methylacrylamide, N-ethylmethacrylamide, Nn-propyl Nn-propylmethacrylamide, N-isopropylmethacrylamide, N-cyclopropylacrylamide, N, N-diethylacrylamide, N-methyl-N-isopropylacrylamide, N-methyl-Nn-propylacrylamide.
  • This envelope can be introduced either from a seed of preformed particles, or by a “shot” process.
  • the envelope comprises at least one thermosensitive monomer such as the derivatives of N-alkylacrylamide or N-al
  • the monomers which constitute the core are hydrophobic monomers such as styrene and its derivatives or the acrylates and alkyl methacrylates in which the alkyl group comprises from 3 to 20 carbon atoms.
  • the envelope for its part, consists mainly of derivatives of alkylacrylamide or of alkylmethacrylamide with optionally the presence of crosslinking agent such as methylenebisacrylamide or ethylene glycoldimethacrylate.
  • the particle of the device is composed of at least one thermosensitive monomer such as derivatives of N-alkylacrylamide or N-alkylmethacrylamide and a monomer chosen from the acrylamide or methacrylamide derivatives of phenyl boronic acid.
  • thermosensitive monomer such as derivatives of N-alkylacrylamide or N-alkylmethacrylamide
  • monomer chosen from the acrylamide or methacrylamide derivatives of phenyl boronic acid is chosen from the acrylamide or methacrylamide derivatives of phenyl boronic acid.
  • thermosensitive monomer is understood to mean a monomer whose presence makes it possible to confer on a polymer in the form of a latex or a dispersion the ability to become under the influence of a change in temperature, suitable for a particular behavior, and in particular for gelling .
  • Biochips are very interesting because they have many advantages, in particular that of offering a large specific surface (several tens of m 2 ) per gram of particles.
  • the capture efficiency of the target molecules is therefore improved by the two-dimensional device in which a particle is immobilized on a solid support.
  • An advantageous application of these polymers in particulate form is the formation of biochips as described in applications WO 00/48000, WO 99/67641 or WO 00/39587.
  • biochip is meant a solid support of reduced size where a multitude of capture probes are fixed at predetermined positions.
  • examples of these biochips are given in the publications of [G. Ramsay, Nature Biotechnology, 1998, n ° 16, p.
  • the initiator a chemical agent which makes it possible to trigger the polymerization reaction, is chosen, for example, from thermal initiators, photochemical initiators, redox initiators; cationic, anionic, nonionic, functional initiators (ie containing one or more phenylboronic groups), azobis amidino propane derivatives.
  • the crosslinking agent an adjuvant which promotes the formation of chemical bonds between the macromolecular chains, is chosen, for example, from N ', N methylene bisacrylamide, bis acrylamide, ethylene glycol dimethacrylate.
  • a preferred diameter for the particles of the device according to the present invention is between 100 and 800 nm.
  • thermosensitive polymer particles carrying boromic acid groups on the surface is that it can overcome the activation reaction and considerably reduce non-specific immobilization.
  • This thermosensitivity property can be used to promote the affinity between biological molecules and the support beyond the LCST ("low critical solubility temperature") of the polymer used (in the case of the polymer based on N-isopropylacrylamide, LCST is 32 ° C).
  • LCST low critical solubility temperature
  • a reduction in temperature makes it possible to release the entities not complexed by the groups of boronic acids.
  • thermosensitive monomer is meant a monomer which, incorporated in a polymer, confers this property of thermosensitivity.
  • the invention also relates to a water-soluble polymer composed of at least one acrylamide or methacrylamide derivative of phenyl boronic acid and an N-alkyl or N-alkoxy derivative of acrylamide or methacrylamide.
  • shot The delayed addition polymerization called "shot”: once the polymerization reaction is in progress, the functional monomer alone, or in the presence of the basic monomer, is introduced into the system in a controlled manner.
  • the success of the operation therefore depends on the degree of prior knowledge of the kinetics of copolymerization. It is an effective method to promote superficial incorporation.
  • the selection of the experimental conditions (degree of conversion at the time of addition, composition and concentration of the mixture of monomers) makes it possible to optimize the surface yields.
  • - Polymerization on seed it consists in introducing the functional monomer into the system containing an already constituted and perfectly characterized latex.
  • the functional monomer can be added alone or as a mixture with the basic monomer of the seed, in one step or semi-continuously.
  • the polymerization techniques on seed, polymerization by deferred addition, semi-continuous polymerization are preferred, because they lead to a maximum incorporation of the derivative carrying the phenylboronic residue. surface.
  • solid support includes all the materials on which the polymer can be immobilized, it is in the divided state or not.
  • Natural, synthetic, chemically modified or non-synthetic materials can be used as solid support, such as polyvinyl vinyl, polyolefins (polyethylene, polypropylene, polybutadiene, etc.), polystyrenes, polyacrylate, polyamide, or copolymers based on vinyl aromatic monomers, alkyl esters of unsaturated alpha-beta acids, esters of unsaturated carboxylic acids, vinylidene chloride, dienes or compounds having nitrile (acrylonitrile) functions; polymers of vinyl chloride and propylene, polymer of vinyl chloride and vinyl acetate; copolymers based on styrenes or substituted derivatives of styrene; synthetic fibers such as nylon; inorganic materials such as silica, glass, ceramic, quartz; latexes, magnetic particles; metal derivatives.
  • the solid support according to the invention can be, without limitation, in the form of a microtiter plate, a sheet, a cone, a tube, a well, a flat support such as a "wafer" of silica or silicon, or of particles.
  • the solid support is waterproof.
  • the material is hydrophilic or hydrophobic, either intrinsically or as a result of a chemical modification such as for example a hydrophobic support rendered hydrophilic.
  • the solid support comprises on the surface hydrophilic groups such as hydroxyl or amino groups.
  • the solid support is a planar derivative of bare silica (that is to say SiOH) or a silica derivative functionalized with an amine or hydroxylated silane reagent such as, for example and without limiting aspect, the amino propylmethyldiethoxysilane, l aminopropyl triethoxysilane, aminopropyl dimethylmethoxy silane, (3-amino phenoxy) -3 propyl trimethoxy silane, butylamine-4 dimethyl methoxy silane, hydroxymethyl triethoxysilane, N- (hydroxyethyl) -N-methylaminopropyl trimethoxysilane, 1 'aminoethyl) -3 -aminoisobutyl-methyl-trimethoxysilane, (aminoethylaminomethyl) - phenethyl trimethoxysilane, N- (2 aminoethyl) -3-aminopropyl methyl dime
  • the solid support consists of organic materials, such as polyethylene, polybutadiene, polystyrene, polypropylene; polyvinyl chloride, and their copolymers, functionalized by techniques known to those skilled in the art, such as irradiation with gamma rays or plasma treatments making it possible to introduce hydroxylated or amino functions.
  • organic materials such as polyethylene, polybutadiene, polystyrene, polypropylene; polyvinyl chloride, and their copolymers, functionalized by techniques known to those skilled in the art, such as irradiation with gamma rays or plasma treatments making it possible to introduce hydroxylated or amino functions.
  • a ligand capable of reacting with the target molecule is linked to the polymer via the boronic acid functions.
  • the polymer indirectly binds to the target molecule via the ligand which forms a complex with the target molecule, said ligand being fixed on the polymer.
  • the polymer is immobilized beforehand on the solid support, then the ligand is fixed on the polymer in a second step.
  • the ligand is fixed beforehand on the polymer then the ligand / polymer conjugate is immobilized on the solid support in a second step.
  • ligand is meant a compound which has at least one recognition site allowing it to react with a target molecule of interest to form a ligand / target molecule complex.
  • the complex is in particular chosen from antigen / antibody, antibody / hapten, hormone / receptor, chelating / chelated molecule, nucleic acid hybrid complexes.
  • ligands or target molecules of polynucleotides, antigens, antibodies, polypeptides, proteins, haptens.
  • polynucleotide means a chain of at least 2 deoxyribonucleotides or ribonucleotides optionally comprising at least one modified nucleotide, for example at least one nucleotide comprising a modified base such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino- 5-deoxyuridine, the deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base allowing hybridization.
  • a modified base such as inosine, methyl-5-deoxycytidine, dimethylamino- 5-deoxyuridine, the deoxyuridine, diamino-2,6-purine, bromo-5-deoxyuridine or any other modified base allowing hybridization.
  • This polynucleotide can also be modified at the level of the internucleotide bond such as for example phosphorothioates, H-phosphonates, alkyl-phosphonates, at the level of the backbone such as for example alpha-oligonucleotides (FR 2 607 507) or PNA (M Egholm et al., J. A. Chem.
  • the polynucleotide can be an ohgonucleotide, a natural nucleic acid or its fragment such as DNA, a ribosomal RNA, a messenger RNA, a transfer RNA, a nucleic acid obtained by an enzymatic amplification technique.
  • a ribosomal RNA a messenger RNA
  • a transfer RNA a nucleic acid obtained by an enzymatic amplification technique.
  • the enzymatic amplification technique is for example chosen from the NASBA (Nucleic Acid Sequence Based Amplification), TMA (Transcription Mediated Amplification) RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction), SDA techniques
  • polypeptide is meant a chain of at least two amino acids.
  • amino acids is meant the primary amino acids which code for proteins, amino acids derived after enzymatic action such as trans-4-hydroxyproline and natural amino acids but not present in proteins such as norvaline, N-methyl- Leucine, Stalin (see Hunt S. in Chemistry and Biochemistry of the amino acids, Barett GC, ed., Chapman and Hall, London, 1985), amino acids protected by chemical functions usable in synthesis on solid support or in liquid phase and unnatural amino acids.
  • hapten designates non-immunogenic compounds, that is to say incapable by themselves of promoting an immune reaction by production of antibodies, but capable of being recognized by antibodies obtained by immunization of animals in known conditions, in particular by immunization with a hapten-protein conjugate.
  • These compounds generally have a molecular mass of less than 3000 Da and can be, for example, glycosylated peptides, metabolites, vitamins, hormones, prostaglandins, toxins or various drugs, nucleosides and nucleotides.
  • antibody includes polyclonal or monoclonal antibodies, antibodies obtained by genetic recombination, and antibody fragments such as Fab or F (ab ') 2- fragments.
  • antigen denotes a compound capable of generating antibody.
  • protein includes holoproteins and heteroproteins such as nucleoproteins, lipoproteins, phosphoproteins, metalloproteins and both fibrous and globular glycoproteins in their characteristic conformational form.
  • the ligands which bind directly with the boronic derivatives are for example antibodies, enzymes, RNA, oligoribonucleotides, sugars or peptides.
  • the introduction of a function allowing the fixing of the ligand on the polymer is carried out by means known per se. For example, to fix an oligodeoxyribonucleotide ligand
  • the automatic synthesis of the ODN on a support is terminated by a ribonucleotide suitably protected to have a cis diol in position 5' or else the synthesis starts on a ribonucleotide to have on the ODN cis diol in position 3 '(see for example “Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties” edited by S. Agrawal, Humana Press, Totowa, New Jersey).
  • the invention also describes a method for capturing a target molecule using a device according to the invention in which a liquid sample containing the target molecule is brought into contact with the device, said target reacting directly with the boronic acid functions carried by the polymer.
  • the target molecules which react directly with the boronic acid derivatives are antibodies, RNAs, glycoproteins or peptides.
  • the immunoglobulins In their hinge region, the immunoglobulins have sugars which can be complexed by boronic acid derivatives, thus allowing a directed immobilization of the antibodies whose active site will remain fully accessible.
  • An example of application of this method is the simplification and improvement of the methods of fixing of antibodies on solid supports for the assay or the purification.
  • Any peptide having a serine in the NH 2 terminal position can be complexed in a specific way by derivatives of boronic acid, which will constitute a simple method of immobilization which will preserve the activity of the peptide, since no other function will be concerned by this mode. of fixation.
  • An application example concerns the improvement of the sensitivity, stability and specificity of diagnostic tests based on peptides.
  • Another example of use relates to the screening of therapeutic molecules on a large number of peptides, in particular peptides prepared by combinatorial chemistry as described by Gallop et al. in J. Médicinal Chem., 34 (10), pl234-1251, 1994 or Gordon et al., J. Médicinal Chem., 37 (10), pl385-1401, 1994.
  • the ribose at the 3 ′ end has a cis-diol function, the complexation of which with a boronic acid will allow the immobilization, on a support, of the RNA molecule, this in a specific way, even in the presence of DNA because, in deoxyribose series, there is no cis diol at the 3 'end, but only one alcohol function which cannot complex.
  • An example of application of this method is the specific extraction of TARN from a cell lysate.
  • Another example of application relates to the screening of expression genes such as messenger RNAs for the discovery of new drugs.
  • the invention also relates to a method for capturing a target molecule using a device according to the invention, in which a liquid sample containing the target molecule is brought into contact with the device, said target forming a complex with the ligand attached. on the polymer.
  • the ligand is previously fixed on the polymer before reacting with the target molecule.
  • the ligand and the target molecule react in solution to form a complex and the complex is fixed on the polymer.
  • the target molecule reacts in solution to form a complex with a first ligand itself linked covalently or non-covalently to an antiligand capable of forming a complex with a second ligand attached to the polymer.
  • the target molecule is a nucleic acid
  • the first ligand is an ohgonucleotide capable of hybridizing with the target and carrying a biotin (antiligand) at the 5 ′ or 3 ′ end
  • the second ligand is a streptavidin attached to the polymer.
  • the target molecule is a nucleic acid and the first ligand is an ohgonucleotide capable of hybridizing with the target linked to another oligonucleotide which does not hybridize with the target (antiligand) but which is capable of hybridizing with a complementary oligonucleotide (the second ligand) attached to the polymer.
  • the conditions for forming these complexes are known per se as well as certain conventional steps in a process according to the present invention such as the steps of passivation of the solid support or the washing steps.
  • the applicants' patents FR 2 707 010 and FR 2 710 075 the content of which is incorporated into the present application illustrate these aspects.
  • the invention also relates to a new water-soluble polymer composed of at least one acrylamide or methacrylamide derivative of phenylboronic acid and an N-alkyl or N-alkoxy derivative of acrylamide or methacrylamide.
  • the invention also relates to a new hydrophilic particle composed of at least one thermosensitive monomer such as N-alkylacrylamide derivatives, a monomer chosen from acrylamide or methacrylamide derivatives of phenyl boronic acid and a crosslinking agent.
  • thermosensitive monomer such as N-alkylacrylamide derivatives, a monomer chosen from acrylamide or methacrylamide derivatives of phenyl boronic acid and a crosslinking agent.
  • Figure 1 attached shows a photograph by atomic force microscopy of a bare silica support on which are immobilized particles not functionalized with a boronic acid derivative.
  • Figure 2 attached shows a photograph by atomic force microscopy of a bare silica support on which are immobilized particles functionalized with a derivative of boronic acid.
  • Figure 3 attached shows a photograph by atomic force microscopy of a SiNH 2 silica support on which are immobilized particles functionalized with a boronic acid derivative.
  • Example 1 Synthesis of an hydrophilic polymer containing a phenylboronic acid derivative.
  • Polyclonal IgGs in solution at 10 mg / l in 50 xnM sodium carbonate buffer pH 9J are incubated in wells of Nunc maxisorp immuno-modules for two hours at 37 ° C. After washing with PBS-tween, the wells are passive by incubation for two hours at 37 ° C. of 200 ⁇ l of 0.05% PBS-TWEEN, containing 10% goat serum.
  • the copolymer of Example 1 dissolved at 40 mg / 1 in a 50 mM sodium carbonate buffer pH 9.7, is then incubated for two hours at 37 ° C.
  • alkaline phosphatase diluted to 20 ⁇ g / ml in 50 mM carbonate buffer pH 9, 7 is then incubated at 37 ° C. After two washes with the 50/50 solution of sodium carbonate 50 mM pH 9.1 and PBS-Tween 0.05%) goat serum 10%, the substrate of alkaline phosphatase, paranitrophenylphosphate (pNPP), is then added dissolved in diethanolamine pH 9.8 at 4 g / 1. After 30 min, the reaction is stopped by adding 100 ⁇ l per well of a molar solution of soda. The optical density is read at 405 nm on the Axia spectrometer from bioMérieux.
  • Example 3 Device for the Specific Capture of Enzymes Two solutions of copolymer from Example 1, at respective concentrations of 40 and
  • Experiment 4 carried out in the presence of polymer at a concentration of 40 mg / 1.
  • Experiment 5 carried out in the presence of polymer at a concentration of 10 mg / 1.
  • Experiment 6 Control without enzyme.
  • Experiment 7 Control without polymer.
  • Example 4 device for the specific capture of glycoproteins from cell culture media.
  • the viral gpl20 as well as the extracellular region of gp41 are expressed as a unique protein called gpl60 delta as described in B. Moss in Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 16.5, John Wiley & Sons ed, 1994-1997.
  • This recombinant virus thus constructed uses the envelope of a primary isolate originating from a symptomatic primary infection.
  • Hamster kidney cells (BHK-21) are infected with the recombinant virus. Two days after infection, the culture supernatant, which contains gpl60 delta in soluble form at an average concentration of 1 mg / ml, is harvested, filtered through 0.1 mm and dialyzed for 36 hours in 50 mM carbonate buffer pH9.7, to remove the glucose from the culture medium. The cell supernatant is dialyzed for 36 hours against 50 mM carbonate buffer pH 9.1 to remove all traces of glucose. The NUNC microtiter plate wells are incubated as in Example 3 with a solution of the copolymer of Example 1 at 40 mg / 1 for two hours at 37 ° C.
  • the wells are passive by incubation for two hours at 37 ° C., of a solution of PBS-Tween 0.5% - 10% goat serum.
  • Cell culture supernatants are incubated for one hour at 37 ° C.
  • the anti-GP120 mouse monoclonal antibody is diluted to various concentrations in PBS- Tween 0.05% »10% goat serum before one hour incubation at 37 ° C.
  • the anti-mouse antibody-PAL detection conjugate is diluted in PBS-Tween 0.5% - 10% goat serum and then incubated for one hour at 37 ° C. After washing, detection is carried out as above.
  • Experiment 9 carried out with anti-GP120 IgG at a concentration of 10 ⁇ g / ml.
  • Experiment 10 carried out with anti-GP120 IgG at a concentration of 5 ⁇ g / ml.
  • Experiment 11 carried out with anti-GP120 IgG at a concentration of 1.6 ⁇ g / ml.
  • Experiment 12 carried out with anti-GP120 IgG at a concentration of 1 ⁇ g / ml.
  • Experiment 13 witnesses without anti-GP120 IgG.
  • the signals obtained are indeed due to the selective binding of the glycoprotein to the support, as shown in experiment 12 which constitutes a negative control without detection antibody. It should be noted that the signal of this negative control is of the order of the background noise due to the substrate alone. The signal observed decreases with the decrease in the concentration of anti-GP120 detection antibodies, which confirms the specificity of the signal obtained.
  • Example 5 Study of the dilution factor of the cell supernatant.
  • Experiment 13 carried out without dilution of the cell supernatant.
  • Experiment 14 carried out with a half dilution of the cell supernatant.
  • Experiment 15 carried out with a quarter dilution of the cell supernatant.
  • Experiment 16 carried out with one-eighth dilution of the cell supernatant.
  • Experiment 17 witnesses without the anti-GP120.
  • Example 6 preparation of thermosensitive particle based on NIPAM and PHBA.
  • KPS potassium persulfate initiator
  • the duration of the polymerization is one hour.
  • the conditions of introduction of the PHBA monomer, carrying the boronic acid function, are indicated for each reference under the table.
  • the formulation of the various particles prepared is given in the table below.
  • the common conditions for the syntheses are: polymerization temperature of 70 ° C. and stirring during the polymerization of 300 RPM.
  • BNIPAM-2 Introduction of PHBA (dissolved in 1 ml H 2 O at basic pH) after 11 minutes of polymerization.
  • BNIPAM-3 Introduction of PHBA (solubilized in 2.4 ml H 2 O at basic pH) semi-continuously (every 10 minutes) after 30 minutes of start of polymerization.
  • BNIPAM-4 Introduction of PHBA (dissolved in 2.5 ml H 2 O at basic pH) after
  • BNLPAM-5 The PHBA (dissolved in 2 ml H 2 O at basic pH) is added in several stages (every 2 minutes) after 10 minutes from the start of the polymerization.
  • BNIPAM-6 PHBA (solubilized in 2 ml H 2 O at basic pH) is added in two stages, adding 1 after 5 minutes from start of polymerization and the 2nd after 10 minutes.
  • Example 7 Semi-continuous polymerization of colloidal particles containing a phenylboronic derivative using NTPMAM as the main monomer.
  • the main monomer N-isopropylmethacrylamide (NIPMAM) is synthesized in the laboratory by condensation of methacryloyl chloride on the corresponding amine.
  • the conditions for the synthesis of the particle (reference HAM4) are as follows: total volume of boiled and degassed water 50 ml; NIPMAM 0.5g; 0.06g MBA; PHBA 0.025g; KPS 0.005g; Temperature 70 ° C.
  • the addition of the functional PHBA monomer is carried out after 1 h 30 min.
  • the polymerization takes place in a thermostatically controlled reactor, surmounted by a mechanical stirrer, under a nitrogen atmosphere.
  • the reaction temperature is set at 90 ° C, and the stirring speed at 280 rpm.
  • Three polymerization protocols are used.
  • the polymerization is stopped after 6 hours by soaking the reaction medium in an ice bath.
  • the polymerization is then initiated and the medium changes from colorless to a whitish color in a few minutes. After 40 min, the polymerization stage being at about 70% conversion, a solution containing X g of PHBA, 1.9 ml of KOH
  • the polymerization is stopped after 6 hours by soaking the reaction medium in an ice bath.
  • the polymerization is stopped after 6 hours by soaking the reaction medium in an ice bath.
  • AE stands for elementary analysis.
  • the rate of PHBA per AE is given in atomic percentage and represents the average rate by mass in the whole of the particle.
  • PHBA in ESCA Electrode Spectrometry for Chemical Analysis
  • ESCA Electrode Spectrometry for Chemical Analysis
  • Dl represents the diameter in nm determined at 20 ° C by photon correlation spectroscopy (Malvern Zetasizer, 3000 HS).
  • D2 represents the diameter in nm determined by transmission electron microscopy (TEM, on Philips CM 120 device, CME-ABG). The conversion is followed by Nuclear Magnetic Resonance at 500 MHz (Narian Unity + device) by monitoring the disappearance of the peaks corresponding to the vinyl protons of the monomer.
  • WSP corresponds to the mass percentage of water-soluble polymer not incorporated on or in the particles.
  • silica supports Silica plates are cut so as to have surfaces of 0.8 x 0.8 cm 2 .
  • the plates are activated in a piranah solution (mixture of hydrogen peroxide 30%> by volume and concentrated sulfuric acid in the respective volume proportions of 30/70) in boiling for 15-20 min (glossy side up, avoiding overlapping between the plates), then successive washes with distilled water are carried out (at least 11 liters).
  • This treatment regenerates the silanol functions of the silica.
  • This silica is also called naked silica
  • Some plates are then dried individually under a stream of nitrogen, then immersed in a solution of aminopropylmethyldiethoxysilane (AMPDES) at 2% (v / v) in anhydrous toluene for at least 2 hours (glossy side up, avoiding overlap between the plates).
  • AMPDES aminopropylmethyldiethoxysilane
  • the plates are then rinsed intensively with acetone (at least 500 ml) and then dried under a stream of nitrogen. These surfaces are called SiNH 2 surfaces.
  • the boronic acid functions present on the polymer therefore serve both to immobilize the polymer on the solid support and to fix the target molecule on the polymer.

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Abstract

L'invention concerne un dispositif de capture d'une molécule cible comprenant un support solide sur lequel est immobilisé un polymère susceptible de se lier directement ou indirectement à la molécule cible, caractérisé en ce que en combinaison fonction acide boronique. L'invention concerne également un procédé de capture d'une molécule cible utilisant un tel dispositif.

Description

La présente invention a pour objet un dispositif de capture de molécules cibles, un procédé de capture desdites molécules cibles ainsi que des polymères utilisables pour la préparation de tels dispositifs.
II est de pratique courante d'utiliser des supports sur lesquels sont immobilisés des ligands par exemple des protéines, haptènes, peptides, polypeptides, anticorps ou polynucléotides dans le but de les détecter et/ou les doser notamment dans la réalisation d'essais de diagnostic. Le brevet FR 2 688 788 décrit la synthèse et l'utilisation de conjugués ligands/copolymère à base d'anhydride maléique comme le copolymère anhydride maléique/méthyl-vinyléther (AMNE) pour la fixation des ligands sur un support solide. De même, le brevet FR 2 707 010 décrit un copolymère à base de Ν-vinyl pyrrolidone comme le copolymère Ν-vinyl pyrrolidone/Ν-acryloxysuccinimide (ΝNPΝAS) toujours pour la fixation de ligands sur un support solide. Les conjugués ainsi préparés présentent une structure agrégée (voir par exemple Erout
M. Ν. et al., Bioconjugate Chemistry, 7(5), p 568-575, 1996 ou Delair T. et al. , Polymers for Advanced Technologies, 9, p 349-361, 1998), ce qui nuit à la capture de molécules cibles. En effet, le couplage entre le ligand et le polymère est covalent et les ligands, tels que des acides nucléiques, les protéines ou des peptides, possèdent de multiples fonctions réactives susceptibles d'interférer avec la spécificité du couplage covalent, ce qui conduit à des réactions non contrôlées qui provoquent des phénomènes d'agrégation. Il existe donc un besoin pour de nouveaux dispositifs de capture plus spécifique.
L'interaction entre un dérivé d'acide boronique et un cis-diol, ou un α, β amino-alcool est spécifique et bien connue dans la chimie des sucres, cf. par exemple Wulff G. et al, J. Am. Chem. Soc, 108, pl089, 1986 ou Wulff G. et al, Macromol. Chem., 188, p741, 1987. La réactivité des dérivés phénylboroniques a été aussi démontrée pour des molécules d'acides ribonucléiques par Igloi G.L. et Kôssel H. dans Νucl. Acid. Res., 13(19), p 6881-6898, 1985.
Cette propriété a été utilisée pour préparer des gels pour chromatographie ou pour préparer des particules hydrophobes. Des travaux traitant de la polymérisation de monomère dérivé d'acide phénylboronique en présence du methacrylate de méthyle ont été notamment publiés par A. Sarhan et al, dans Reactive Polymers, 11, p 57-70, 1989. De même Tsukagoshi K. et al, Chemistry letters, p 681-684, 1994 décrivent la synthèse de particules présentant des groupements acide phénylboronique pour la complexation de sucres. Ces particules sont préparées par polymérisation en émulsion de styrène, acrylate de butyle et acide de m-acrylamidophénylboronique. Le latex obtenu est hydrophobe. Ce latex est ensuite utilisé pour la capture de glucose ou dérivés. On connaît également de JP6324072, des latex à base de styrène pour la capture de protéines saccharifiées, et de RU2093525 des supports polymériques à base d'alcool polyvinylique réticulé comportant des acides m-aminophénylboroniques. On connaît de
US5763203, un procédé d'immobilisation sur un support insoluble d'une cible qui peut être une cellule, du matériel cellulaire ou un virus, par l'intermédiaire d'un liaison hydroxyboryl/cis diol, ledit support comportant des groupes hydrophobes. Dans la plupart de ces travaux, les molécules cibles à capturer sont mises en contact directement en milieu liquide avec les particules de polymère ou les gels portant les fonctions acide boronique. D'autre part, du fait de leur hydrophobicité, les latex obtenus présentent l'inconvénient d'une adsorption non spécifique pour le matériel biologique. En effet, comme cela a été largement décrit dans la littérature notamment par J. Andrade dans Surface and Interfacial Aspects of Biomédical Polymers, volume 2, « Protein Adsorption », Plénum Press, New York, 1984, la nature et la charge de la surface d' adsorption et notamment son hydrophobicité ou hydrophilie ont une influence sur la cinétique d'adsorption et sur la conformation des molécules cibles. Cette influence sur la conformation des molécules cibles peut aller jusqu'à une légère dénaturation entraînant une diminution de la spécificité..
La présente invention a mis en évidence pour la première fois que des polymères hydrophiles comportant des fonctions acide boronique peuvent être immobilisés de manière très efficace sur des supports solides tout en gardant des propriétés de fixation spécifiques pour des molécules cibles, pour aboutir à un dispositif de capture bidimensionnel de molécules cibles, dans lequel le polymère hydrophile permet une capture efficace desdites molécules cibles. Un deuxième avantage de la présente invention est de proposer un dispositif universel de capture, puisque le dispositif n'est pas limité à la capture de molécules cibles comportant un résidu diol mais le dispositif peut servir aussi à la capture de molécules cibles de toute nature, par l'intermédiaire d'un ligand fixé sur le polymère si le ligand est capable de réagir avec la molécule cible pour former un complexe ligand/molécule cible.
La présente invention décrit un dispositif de capture d'une molécule cible. Le dispositif comprend un support solide sur lequel est immobilisé un polymère hydrophile qui contient au moins un monomère contenant au moins une fonction acide boronique, et ce polymère est susceptible de se lier directement ou indirectement à la molécule cible.
Par molécule cible, on entend un composé chimique ou entité biologique, dont la capture présente un intérêt et notamment à des fins de purification et/ou détection et/ou quantification.
Par monomère contenant une fonction acide boronique, on entend tout monomère possédant une double liaison vinylique et au moins un groupement acide boronique comme par exemple, les acrylate de l'acide phénoxyboronique ou methacrylate de l'acide phénoxyboronique, l'acide N-(méthylstyryl) N-phénylboronique, l'acide styrylboronique, les éthers vinyliques de l'acide phénoxyboronique, l'acide N-vinyl N- phénylboronique, le N-(acide phénylboronique) vinylbenzylarnide. De préférence, le monomère est un dérivé de type acrylate, methacrylate, acrylamide ou méthacrylamide de l'acide phényl boronique.
Par polymère hydrophile, on entend un polymère dont le second coefficient du viriel dans l'eau est supérieur à zéro (voir par exemple « la physicochimie des polymères » édité par le GFP (Groupe Français d'étude et d'application des Polymères).
Dans un premier mode de réalisation du dispositif, le polymère est un polymère hydrosoluble. Avantageusement, le polymère est un copolymère entre un dérivé acrylamide ou méthacrylamide de l'acide phénylboronique et un dérivé N-alkyl ou N-alcoxy de l' acrylamide ou du méthacrylamide. A titre d'exemple un dérivé dérivé N- alkylacrylamide ou N-alkylméthacrylamide (qui englobe les N-N-dialkylacrylamide ou les N-N-dialkylméthacrylamide), est choisi parmi le N-isopropylacrylamide, le N- méthylacrylamide, le N-éthyhnéthacrylamide, le N-n-propylacrylamide, le N-n- propylméthacrylamide, le N-isopropylméthacrylamide, le N-cyclopropylacrylamide, le N,N-diéthylacrylamide, le N-méthyl-N-isopropylacrylamide, le N-méthyl-N-n- propylacrylamide . Un dérivé N-alcoxy de l' acrylamide ou du méthacrylamide est choisi parmi les composés obtenus par réaction d'un chlorure d'acryloyl ou de méfhacryloyl ou d'un ester activé, sur une aminé de formule générale HN((CH2-CH2-O)x-(CH2)y-CH3)z où x, y et z sont des nombres entiers, x est supérieur ou égal à 1, y est supérieur ou égal à zéro et z peut prendre les valeurs 1 ou 2.
Avantageusement au moins un des monomères est un monomère thermosensible.
De préférence, le polymère est un copolymère hydrosoluble de l'acide m- méthacrylamidophényl boronique et le N-méthoxyéthylméthacrylamide.
Dans un deuxième mode de réalisation du dispositif, le polymère est sous forme de particules hydrophiles. Par particule, on entend de petites parties d'une substance insoluble en milieu liquide et notamment en milieu aqueux, et ayant une taille inférieure à 10 micromètres. De préférence, les particules sont des particules colloïdales ou des latex.
En particulier, l'invention décrite a pour but d'apporter des groupements d'acide boronique en surface par polymérisation ou copolymerisation d'un monomère dérivé d'acide boronique au cours de la synthèse d'un latex ou dans un procédé en deux étapes impliquant une première étape de préparation d'un cœur dont les caractéristiques colloïdales peuvent être bien contrôlées. Dans une première variante du deuxième mode de réalisation du dispositif, les particules sont organiques et issues de la polymérisation d'au moins un monomère porteur d'une fonction acide boronique avec au moins un monomère choisi parmi les monomères dérivés d'acrylamide, de méthacrylamide, d'acrylate et de methacrylate, en particulier les N-alkylacrylamide et N-N-dialkylacrylamide, tels que le N- isopropylacrylamide, le N-méthylacrylamide, le N-éthylméthacrylamide, le N-n- propylacrylamide, le N-n-propylméthacrylamide, le N-isopropylméthacrylamide, le N- cyclopropylacrylamide, le N,N-diéthylacrylamide, le N-méthyl-N-isopropylacrylamide, le N-méthyl-N-n-propylacrylamide ; les acrylates et les méthacrylates d'alkyle dans lesquels le groupement alkyle comprend de 1 à 3 atomes de carbone ;
Le styrène, le méthylstyrène, l'éthylstyrène, le tertio-butyl-styrène le chlorométhylstyrène, le vinyltoluène leurs dérivés, les acrylates et les méthacrylates d'alkyle dans lesquels le groupement alkyle comprend de 3 à 20 atomes de carbone sont utilisables en combinaison avec un autre monomère hydrophile tels que les dérivés d'acrylamide, de méthacrylamide, les acrylates ou les méthacrylates cités précédemment.
Dans une deuxième variante du deuxième mode de réalisation du dispositif, les particules sont organiques et inorganiques, la partie organique provenant de la polymérisation d'au moins un monomère porteur d'une fonction acide boronique et d'au moins un monomère choisi parmi les monomères d'acrylamide et d'acrylate, en particulier les N-alkylacrylamide et N-N-dialkylacrylamide, tels que le N- isopropylacrylamide, le N-méthylacrylamide, le N-éthylméthacrylamide, le N-n- propylacrylamide, le N-n-propylméthacrylamide, le N-isopropyhnéthacrylamide, le N- cyclopropylacrylamide, le N,N-diéthylacrylamide, le N-méthyl-N-isopropylacrylamide, le N-méthyl-N-n-propylacrylamide ; les acrylates et les méthacrylates d'alkyle dans lesquels le groupement alkyle comprend de 3 à 20 atomes de carbone ; leurs dérivés et les copolymères de ces monomères entre eux ; et la partie inorganique provenant d'oxydes métalliques, de fer, de titane, de cobalt, de zinc, de cuivre, de manganèse, de nickel ; la magnétite ; l'hématite, les ferrites, telles que les ferrites de manganèse, nickel, manganèse-zinc; les alliages de cobalt, nickel ; les zéolites ; le talc ; les argiles telles que bentonite et kaolin ; l'alumine ; la silice ; le graphite ; le noir de carbone ou autres matériaux inorganiques.
Dans une troisième variante du deuxième mode de réalisation du dispositif, les particules colloïdales organiques et/ou inorganiques, stables et fonctionnalisées, comprennent un coeur et une enveloppe. Le cœur est essentiellement solide, organique et/ou inorganique et peut être hydrophile ou hydrophobe. L'enveloppe hydrophile comporte au moins le dérivé polymérisé de l'acide boronique.
Dans un premier mode de réalisation de cette troisième variante, le cœur est organique et comprend au moins un polymère organique choisi parmi au moins un homopolymère ou un copolymère ou leurs mélanges, issu de la polymérisation d'au moins un monomère choisi parmi les monomères d'acrylamide et d'acrylate, en particulier les N- alkylacrylamide et N-N-dialkylacrylamide, tels que le N-isopropylacrylamide, le N- méthylacrylamide, le N-éthylméthacrylamide, le N-n-propylacrylamide, le N-n- propylméthacrylamide, le N-isopropylméthacrylamide, le N-cyclopropylacrylamide, le N,N-diéfhylacrylamide, le N-méthyl-N-isopropylacrylamide, le N-méthyl-N-n- propylacrylamide ; les acrylates et les méthacrylates d'alkyle dans lesquels le groupement alkyle comprend de 3 à 20 atomes de carbone ; le styrène, le méthylstyrène, l'éthylstyrène, le tertio-butyl-styrène, le chlorométhylstyrène vinyltoluène ; leurs dérivés et les copolymères de ces monomères entre eux et/ou avec d'autres comonomères.
Dans un deuxième mode de réalisation de cette troisième variante, le cœur est organique et inorganique et comprend :
- au moins un polymère organique choisi parmi au moins un homopolymère ou un copolymère ou leurs mélanges, issu de la polymérisation d'au moins un monomère choisi parmi les monomères d'acrylamide et d'acrylate, en particulier les N- alkylacrylamide et N-N-dialkylacrylamide, tels que le N-isopropylacrylamide, le N- méthylacrylamide, le N-éthylméthacrylamide, le N-n-propylacrylamide, le N-n- propylméthacrylamide, le N-isopropylméthacrylamide, le N-cyclopropylacrylamide, le N,N-diéthylacrylamide, le N-méthyl-N-isopropylacrylamide, le N-méthyl-N-n- propylacrylamide ; les acrylates et les méthacrylates d'alkyle dans lesquels le groupement alkyle comprend de 3 à 20 atomes de carbone ; le styrène, le méthylstyrène, l'éthylstyrène, le tertio-butyl-styrène, le chlorométhylstyrène vinyltoluène ; leurs dérivés et les copolymères de ces monomères ente eux et/ou avec d'autres comonomères ; et
- des particules inorganiques choisies parmi les particules d'oxydes métalliques, de fer, de titane, de cobalt, de zinc, de cuivre, de manganèse, de nickel ; la magnétite ; l'hématite, les ferrites, telles que les ferrites de manganèse, nickel, manganèse-zinc; les alliages de cobalt, nickel ; les zéolites ; le talc ; les argiles telles que bentonite et kaolin ; l'alumine ; la silice ; le graphite ; le noir de carbone ou autres matériaux inorganiques.
L'enveloppe hydrophile est un copolymère contenant le monomère à base d'acide boronique avec des dérivés acrylate, methacrylate, acrylamide ou méthacrylamide. A titre d'exemple un dérivé N-alkylacrylamide ou N-alkylméthacrylamide (qui englobe les N-N-dialkylacrylamideet les N-N-dialkylméthacrylamide), est choisi parmi le N- isopropylacrylamide, le N-méthylacrylamide, le N-éthylméthacrylamide, le N-n- propylacrylamide, le N-n-propylméthacrylamide, le N-isopropylméthacrylamide, le N- cyclopropylacrylamide, le N,N-diéthylacrylamide, le N-méthyl-N-isopropylacrylamide, le N-méthyl-N-n-propylacrylamide . Cette enveloppe peut être introduite soit à partir d'une semence de particules préformées, soit selon un procédé « shot ». Avantageusement, l'enveloppe comprend au moins un monomère thermosensible tels que les dérivés de N-alkylacrylamide ou N-alkylméthacrylamide.
Avantageusement dans la particule du dispositif, les monomères qui constituent le cœur sont des monomères hydrophobes tels que le styrène et ses dérivés ou les acrylates et les méthacrylates d'alkyle dans lesquels le groupement alkyle comprend de 3 à 20 atomes de carbone. L'enveloppe quant à elle est majoritairement constituée de dérivés d'alkylacrylamide ou d'alkylméthacrylamide avec éventuellement la présence de réticulant tels que le méthylènebisacrylamide ou éthylèneglycoldiméthacrylate.
De préférence, la particule du dispositif est composée d'au moins un monomère thermosensible comme les dérivés des N-alkylacrylamide ou N-alkylméthacrylamide et un monomère choisi parmi les dérivés acrylamide ou méthacrylamide de l'acide phényl boronique.
On entend par monomère thermosensible un monomère dont la présence permet de conférer à un polymère sous forme de latex ou de dispersion l'aptitude à devenir sous l'influence d'un changement de température, apte à un comportement particulier, et notamment à une gélification.
Les polymères sous forme de particules colloïdales ou latex sont très intéressants car ils présentent de nombreux avantages, en particulier celui d'offrir une grande surface spécifique (plusieurs dizaines de m2) par gramme de particules. L'efficacité de capture des molécules cibles est donc améliorée par le dispositif bidimensionnel dans lequel une particule est immobilisée sur un support solide. | Une application avantageuse de ces polymères sous forme particulaire est la formation de biopuces comme décrit dans les demandes WO 00/48000, WO 99/67641 ou WO 00/39587. Par biopuce, on entend un support solide de dimension réduite où sont fixés une multitude de sondes de capture à des positions prédéterminées. A titre d'illustration, des exemples de ces biopuces sont donnés dans les publications de [G. Ramsay, Nature Biotechnology, 1998, n°16, p. 40-44 ; F. Ginot, Human Mutation, 1997, n°10, ρ.1-10 ; J. Cheng et al, Molecular diagnosis, 1996, n°l(3), p.183-200 ; T. Livache et al, Nucleic Acids Research, 1994, n° 22(15), p. 2915-2921 ; J. Cheng et al, Nature Biotechnology, 1998, n° 16, p. 541-546] ou dans les brevets US-A-4,981,783,
US-A-5J00,637, US-A-5,445,934, US-A-5J44,305 et US-A-5,807,522.
D'autres réactifs sont utilisés dans la synthèse des particules comme par exemple un amorceur et un réticulant. L'amorceur, agent chimique qui permet de déclencher la réaction de polymérisation, est choisi par exemple parmi les amorceurs thermiques, amorceurs photochimiques, amorceurs redox ; amorceurs cationique, anionique, nonionique, fonctionnel (c'est à dire contenant un ou plusieurs groupements phénylboronique), les dérives azobis amidino propane. Le réticulant, adjuvant qui favorise la formation de liaisons chimiques entre les chaînes macromoléculaires, est choisi par exemple parmi le N',N méthylène bisacrylamide, le bis acrylamide, l'ethylène glycol diméthacrylate. Il est possible de faire varier la granulométrie des particules de manière reproductible dans une large gamme de 50 nm à 5000 nm en contrôlant les conditions expérimentales de la formulation utilisée, notamment les concentrations des divers composés entrant dans la formulation de la polymérisation et aussi la température. Un diamètre préféré pour les particules du dispositif selon la présente invention est compris entre 100 et 800 nm.
La bonne homogénéité en taille ainsi que l'importante surface spécifique développée font de ces particules des supports de choix pour l'immobilisation de molécules cibles. Leur hydrophilie permet de réduire considérablement les phénomènes d'adsorption non spécifique qui engendrent des problèmes de spécificité, sensibilité et de reproductibilité notamment pour des tests de diagnostic.
L'avantage des particules de polymère hydrophile et thermosensible portant en surface des groupements d'acides boromques est de pouvoir s'affranchir de la réaction d'activation et de réduire considérablement l'immobilisation non spécifique. Cette propriété de thermosensibilité peut être utilisée pour favoriser l'affinité entre les molécules biologiques et le support au delà de la LCST (« low critical solubility température ») du polymère utilisé (dans le cas du polymère à base de N- isopropylacrylamide, la LCST est de 32°C). Une réduction de la température permet de relarguer les entités non complexées par les groupements d'acides boroniques. Par monomère thermosensible, on entend un monomère qui, incorporé dans un polymère, confère cette propriété de thermosensibilité.
L'invention concerne également un polymère hydrosoluble composé d'au moins un dérivé acrylamide ou méthacrylamide de l'acide phényl boronique et un dérivé N-alkyl ou N-alcoxy de l' acrylamide ou du méthacrylamide.
Différents modes de polymérisation peuvent être utilisés pour préparer les particules de l' invention et notamment :
- La polymérisation à réacteur fermé appelée « batch » : les monomères sont introduits dans le réacteur avant le début de réaction avec les autres ingrédients et sans ajout ultérieur. En raison de la différence de réactivité des monomères, ce procédé conduit souvent à l'apparition d'une dérive de composition . Celle-ci se manifeste par l'obtention de macromolécules ayant des compositions qui varient considérablement en fonction de la conversion. Cette méthode est peu efficace pour l'incorporation en surface car une partie importante du monomère fonctionnel risque d'être perdue soit à l'intérieur des particules, soit sous forme de polymère hydrosoluble. Lorsque la copolymerisation est effectuée en « batch » avec des monomères de nature polaire, on obtient des particules plus petites, en grand nombre, mais avec une conversion limitée. Ce comportement est lié à l'importante solubilité dans l'eau de ces monomères, et il est attribué à la prépondérance du mécanisme de nucléation homogène.
- La polymérisation en semi-continu : une partie au moins des monomères est introduite dans le réacteur sur une période comprise entre le début de la réaction et la fin de celle-ci. Ce rajout peut être effectué à une vitesse fixe ou bien suivant un profil donné. Le but est de contrôler l'addition du mélange de monomères de façon à obtenir un copolymère de composition contrôlée (contrôle de la composition de l'interface); c'est ainsi qu'on se place souvent dans des conditions d'addition telles que la vitesse de polymérisation soit plus grande que celle d'addition.
- La polymérisation par addition différée appelée « shot » : une fois que la réaction de polymérisation est en cours, le monomère fonctionnel seul, ou en présence du monomère de base, est introduit dans le système d'une façon contrôlée. Le succès de l'opération dépend donc du degré de connaissance préalable de la cinétique de copolymerisation. C'est une méthode efficace pour favoriser l'incorporation superficielle. La sélection des conditions expérimentales (degré de conversion au moment de l'addition, composition et concentration du mélange des monomères) permet d'optimiser les rendements de surface.
- La polymérisation sur semence : elle consiste à introduire le monomère fonctionnel dans le système contenant un latex déjà constitué et parfaitement caractérisé. Le monomère fonctionnel peut être additionné seul ou en mélange avec le monomère de base de la semence, en une étape ou en semi-continu. Pour améliorer, les propriétés de fixation des molécules cibles sur le support solide, les techniques de polymérisation sur semence, polymérisation par addition différée, polymérisation en semi-continu sont préférées, car elles conduisent à un maximum d'incorporation du dérivé portant le résidu phénylboronique en surface.
Le terme "support solide" inclut tous les matériaux sur lesquels peut être immobilisé le polymère, il est à l'état divisé ou non. Des matériaux naturels, de synthèse, modifiés ou non chimiquement, peuvent être utilisés comme support solide, comme par exemple le polychlomre de vinyle, polyoléfines (polyéthylène, polypropylène, polybutadiène...), polystyrènes, polyacrylate, polyamide, ou copolymères à base de monomères vinyl aromatiques, alkylesters d'acides alpha-béta insaturés, esters d'acides carboxyliques insaturés, chlorure de vinylidène , diènes ou composés présentant des fonctions nitrile (acrylonitrile) ; des polymères de chlorure de vinyle et de propylène, polymère de chlorure de vinyle et acétate de vinyle ; copolymères à base de styrènes ou dérivés substitués du styrène; des fibres synthétiques telles que le nylon; des matériaux inorganiques tels que la silice, le verre, la céramique, le quartz; des latex, des particules magnétiques; des dérivés métalliques. Le support solide selon l'invention peut être, sans limitation, sous la forme d'une plaque de microtitration, d'une feuille, d'un cône, d'un tube, d'un puits, d'un support plan comme un "wafer" de silice ou silicium, ou de particules. De préférence, le support solide est imperméable à l'eau. Le matériau est hydrophile ou hydrophobe, soit intrinsèquement, soit par suite d'une modification chimique comme par exemple un support hydrophobe rendu hydrophile. Dans un mode préféré de réalisation de l'invention, le support solide comporte en surface des groupements hydrophiles comme des groupements hydroxyles ou aminés. En particulier, le support solide est un dérivé plan de silice nue (c'est à dire SiOH) ou un dérivé de silice fonctionnalisé par un réactif silane aminé ou hydroxylé tel que, par exemple et sans aspect limitatif, l'amino propylméthyldiéthoxysilane, l'aminopropyl triéthoxysilane, l'aminopropyl diméthylméthoxy silane, l'(amino-3 phénoxy)-3 propyl triméthoxy silane, le butylamine-4 diméthyl méthoxy silane, l'hydroxyméthyl triéthoxysilane, le N-(hydroxyéthyl)-N-méthylaminopropyl triméthoxysilane, 1 ' aminoéthyl)-3 -aminoisobutyl-méthyl-triméthoxysilane, l' (aminoéthylaminométhyl)- phénéthyl triméthoxysilane, le N-(2aminoéthyl)-3-aminopropyl méthyl diméthoxysilane, le N-(2aminoéthyl)-3-aminoproρyl triméthoxysilane. Dans un autre mode préféré, le support solide est constitué de matériaux organiques, tels que du polyéthylène, polybutadiène, polystyrène, polypropylène; polychlorure de vinyl, et leur copolymères, fonctionnalisés par des techniques connues de l'homme de l'art, telles que l'irradiation aux rayons gamma ou les traitements plasma permettant d'introduire des fonctions hydroxylé ou aminé.
Dans un autre mode de réalisation du dispositif selon l'invention, un ligand susceptible de réagir avec la molécule cible est lié au polymère par l'intermédiaire des fonctions acides boroniques. Dans ce cas, le polymère se lie indirectement à la molécule cible par l'intermédiaire du ligand qui forme un complexe avec la molécule cible, ledit ligand étant fixé sur le polymère. Dans une première variante de réalisation de ce dispositif, le polymère est immobilisé au préalable sur le support solide, puis le ligand est fixé sur le polymère dans une deuxième étape.
Dans un deuxième mode de réalisation de ce dispositif, le ligand est fixé au préalable sur le polymère puis le conjugué ligand/polymère est immobilisé sur le support solide dans une deuxième étape.
Par ligand on entend un composé qui possède au moins un site de reconnaissance lui permettant de réagir avec une molécule cible d'intérêt pour former un complexe ligand/molécule cible. Le complexe est notamment choisi parmi les complexes antigène/anticorps, anticorps/haptène, hormone/récepteur, chélatant/molécule chélaté , hybride d'acides nucléiques.
A titre d'exemple on peut citer comme ligands ou molécules cibles, les polynucléotides, les antigènes, les anticorps, les polypeptides, les protéines, les haptènes.
Le terme « polynucléotide » signifie un enchaînement d'au moins 2 désoxyribonucléotides ou ribonucléotides comprenant éventuellement au moins un nucléotide modifié, par exemple au moins un nucléotide comportant une base modifiée tel que l'inosine, la méthyl-5-désoxycytidine, la diméthylamino-5-désoxyuridine, la désoxyuridine, la diamino-2,6-purine, la bromo-5-désoxyuridine ou toute autre base modifiée permettant l'hybridation. Ce polynucléotide peut aussi être modifié au niveau de la liaison internucléotidique comme par exemple les phosphorothioates, les H- phosphonates, les alkyl-phosphonates, au niveau du squelette comme par exemple les alpha-oligonucléotides ( FR 2 607 507) ou les PNA (M. Egholm et al., J. A . Chem.
Soc, 114, pl895-1897, 1992 ou les 2' O-alkyl ribose. Chacune de ces modifications peut être prise en combinaison. Le polynucléotide peut être un ohgonucléotide, un acide nucléique naturel ou son fragment comme un ADN, un ARN ribosomique, un ARN messager, un ARN de transfert, un acide nucléique obtenu par une technique d'amplification enzymatique. Les articles de Lewis (1992. Genetic Engineering News, 12, pl-9) d'une part, et d'Abramson et Myers (1993. Curr. Opin. Biotechnol., 4, ρ41- 47), d'autre part, donnent des exemples d'amplification de cible. La technique d'amplification enzymatique est par exemple choisie parmi les techniques NASBA (Nucleic Acid Séquence Based Amplification), TMA (Transcription Mediated Amplification) RT-PCR (Reverse Transcriptase-Polymerase Chain Reaction), SDA
(Strand Displacement Amplification) ou LCR (Ligase Chain Reaction).
Par « polypeptide » on entend un enchaînement d'au moins deux acides aminés. Par acides aminés, on entend les acides aminés primaires qui codent pour les protéines, les acides aminés dérivés après action enzymatique comme la trans-4-hydroxyproline et les acides aminés naturels mais non présents dans les protéines comme la norvaline, la N-methyl-L leucine, la Staline (voir Hunt S. dans Chemistry and Biochemistry of the amino acids, Barett G.C., éd., Chapman and Hall, London, 1985), les acides aminés protégés par des fonctions chimiques utilisables en synthèse sur support solide ou en phase liquide et les acides aminés non naturels.
Le terme "haptène" désigne des composés non immunogènes, c'est-à-dire incapables par eux mêmes de promouvoir une réaction immunitaire par production d'anticorps, mais capables d'être reconnues par des anticorps obtenus par immunisation d'animaux dans des conditions connues, en particulier par immunisation avec un conjugué haptène-protéine. Ces composés ont généralement une masse moléculaire inférieure à 3000 Da et peuvent être par exemple des peptides glycosylés, des métabolites, des vitamines, des hormones, des prostaglandines, des toxines ou divers médicaments, les nucléosides et nucléotides.
Le terme "anticorps" inclut les anticorps polyclonaux ou monoclonaux, les anticorps obtenus par recombinaison génétique, et des fragments d'anticorps tels que des fragments Fab ou F(ab')2- Le terme " antigène " désigne un composé susceptible de générer des anticorps. Le terme "protéine" inclut les holoprotéines et les hétéroprotéines comme les nucléoprotéines, les lipoprotéines, les phosphoprotéines, les métalloprotéines et les glycoprotéines aussi bien fibreuses que globulaires sous leur forme conformationnelle caractéristique.
Les ligands qui se fixent directement avec les dérivés boroniques sont par exemple les anticorps, les enzymes, les ARN, oligoribonucléotides, les sucres ou les peptides. Dans le cas où les ligands ne comportent pas une telle fonctionnalité, l'introduction d'une fonction permettant la fixation du ligand sur le polymère est réalisée par des moyens connus en soi. A titre d'exemple, pour fixer un ligand oligodésoxyribonucléotide
'(ODN), la synthèse automatique de l'ODN sur support est terminée par un ribonucléotide convenablement protégé pour disposer d'un cis diol en position 5' ou bien la synthèse démarre sur un support ribonucléotide pour disposer sur l'ODN d'un cis diol en position 3' (voir par exemple « Protocols for Oligonucleotides and Analogs, Synthesis and Properties » édité par S. Agrawal, Humana Press, Totowa, New Jersey).
De même les techniques de recombinaison génétique permettent d'exprimer une protéine avec une queue polypeptidique de type polyserine qui permettra la fixation de la protéine sur le polymère (voir par exemple le brevet FR 2 764 988 de la demanderesse).
L'invention décrit aussi un procédé de capture d'une molécule cible en utilisant un dispositif selon l'invention dans lequel un échantillon liquide contenant la molécule cible est mis en contact avec le dispositif, ladite cible réagissant directement avec les fonctions acides boroniques portées par le polymère.
A titre d'exemple, les molécules cibles qui réagissent directement avec les dérivés d'acide boronique sont les anticorps, les ARN, les 'glycoprotéines ou les peptides. Dans leur région charnière, les immunoglobulines possèdent des sucres qui peuvent être complexés par des dérivés d'acide boronique, permettant ainsi une immobilisation orientée des anticorps dont le site actif restera totalement accessible. Un exemple d'application de ce procédé est la simplification et l'amélioration des méthodes de fixation d'anticorps sur des supports solides pour le dosage ou la purification.
Tout peptide présentant une serine en position NH2 terminale pourra être complexé de façon spécifique par des dérivés d'acide boronique, ce qui constituera une méthode simple d'immobilisation qui conservera l'activité du peptide, puisque aucune autre fonction ne sera concernée par ce mode de fixation. Un exemple d'application concerne l'amélioration de la sensibilité, stabilité et spécificité des tests diagnostiques basés sur des peptides. Un autre exemple d'utilisation concerne le criblage de molécules thérapeutiques sur un grand nombre de peptides, notamment des peptides préparés par chimie combinatoire comme décrit par Gallop et al. dans J. Médicinal Chem., 34(10), pl234-1251, 1994 ou Gordon et al., J. Médicinal Chem., 37(10), pl385-1401, 1994.
Dans un ARN, le ribose en extrémité 3' présente une fonction cis-diol, dont la complexation avec un acide boronique permettra rimmobilisation, sur un support, de la molécule d'ARN, ceci d'une façon spécifique, même en présence d'ADN car, en série déoxyribose, il n'y a pas de cis diol à l'extrémité 3', mais une seule fonction alcool qui ne peut pas se complexer.
Un exemple d'application de ce procédé est l'extraction spécifique de TARN d'un lysat cellulaire. Un autre exemple d'application concerne le criblage de gènes d'expression comme les ARN messagers pour la découverte de nouveaux médicaments.
L'invention porte aussi sur un procédé de capture d'une molécule cible en utilisant un dispositif selon l'invention, dans lequel un échantillon liquide contenant la molécule cible est mis en contact avec le dispositif, ladite cible formant un complexe avec le ligand fixé sur le polymère.
Dans un premier mode de réalisation du procédé, le ligand est préalablement fixé sur le polymère avant de réagir avec la molécule cible. Dans un deuxième mode de réalisation, le ligand et la molécule cible réagissent en solution pour former un complexe et le complexe est fixé sur le polymère. Dans un troisième mode de réalisation, la molécule cible réagit en solution pour former un complexe avec un premier ligand lui même lié de manière covalente ou non covalente à un antiligand capable de former un complexe avec un deuxième ligand fixé sur le polymère. A titre d'exemple de ce troisième mode, la molécule cible est un acide nucléique, le premier ligand est un ohgonucléotide capable de s'hybrider avec la cible et portant une biotine (antiligand) à l'extrémité 5' ou 3' et le deuxième ligand est une streptavidine fixée sur le polymère.
Dans xm autre exemple, la molécule cible est un acide nucléique et le premier ligand est un ohgonucléotide capable de s'hybrider avec la cible liée à un autre oligonucléotide ne s'hybridant pas avec la cible (antiligand) mais capable de s'hybrider avec un oligonucléotide complémentaire (le deuxième ligand) fixé sur le polymère. Les conditions de formation de ces complexes sont connues en soi de même que certaines étapes classiques dans un procédé selon la présente invention comme les étapes de passivation du support solide ou les étapes de lavage. Les brevets de la demanderesse FR 2 707 010 et FR 2 710 075 dont le contenu est incorporé dans la présente demande illustrent ces aspects.
L'invention concerne également un nouveau polymère hydrosoluble composé d'au moins un dérivé acrylamide ou méthacrylamide de l'acide phénylboronique et un dérivé N-alkyl ou N-alcoxy de l' acrylamide ou du méthacrylamide.
L'invention concerne également une nouvelle particule hydrophile composée d'au moins un monomère thermosensible comme les dérivés des N-alkylacrylamide, un monomère choisi parmi les dérivés acrylamide ou méthacrylamide de l'acide phényl boronique et un réticulant.
La figure 1 annexée représente une photographie en microscopie à force atomique d'un support de silice nue sur lequel sont immobilisées des particules non fonctionnalisées par un dérivé d'acide boronique. La figure 2 annexée représente une photographie en microscopie à force atomique d'un support de silice nue sur lequel sont immobilisées des particules fonctionnalisées par un dérivé d'acide boronique. La figure 3 annexée représente une photographie en microscopie à force atomique d'un support de silice SiNH2 sur lequel sont immobilisées des particules fonctionnalisées par un dérivé d'acide boronique.
Les exemples suivants illustrent l'invention.
Exemple 1 : Synthèse d'un polymère hvdrophile contenant un dérivé d'acide phénylboronique.
Synthèse de l'acide m-méthacrylamidophénylboronique (PHBA :
Dans 10 ml d'acétone anhydre, on dissout 780 mg (5mmoles) de monohydrate de l'acide 3-aminophénylboronique (28J51-2 Aldrich). A température ambiante, on ajoute 1 ml (environ 1 mmole) du chlorure de méthacryloyle (52,321-6 Aldrich). On observe la formation d'un précipité et, après redissolution, on ajoute 1ml de N,N- diisopropyléthylamine (Aldrich, 29,896-4). Après trois heures d'agitation à température ambiante, le milieu réactionnel est dilué dans 150 ml d'éther éthylique puis il est lavé successivement par des solutions saturées en bicarbonate et chlorure de sodium. Après séchage de la phase éthérée sur sulfate de sodium, le solvant est éliminé sous vide partiel. Le produit brut est purifié sur colonne de silice (éluant acétone/pentane 25/75). Le produit est caractérisé par RMN du proton.
Synthèse du N-méthoxyéthylméthacrylamide :
Dans 50 ml d'éther anhydre refroidis à 0°C on verse rapidement 19,38 ml de chlorure de méthacryloyle (95,65 mmoles, Aldrich, 15,631-0)). On ajoute alors goutte à goutte, un mélange de 9,14 ml de 2-méthoxyéthylamine (105,22 mmoles, Aldrich, 24,106-7) et
20 ml de triéthylamine dans 50 ml d'éther anhydre. Après 18 heures d'agitation à température ambiante, le précipité formé est filtré. Le solvant du filtrat est évaporé et le brut est purifié sur colonne de silice (éluant : éther 100%). On récupère 12,54 g de produit (Rendement = 91%). Le produit est caractérisé par RMN du proton. RMN du proton ( 200 MHz, Brucker, référence TMS, ppm): 6,5 (singulet 1H, amide),
5J et 5,3 (deux singulets, 2 H , protons vinyliques), 3,48 (pic large, 4 H, protons méthyléniques), 3,36 (singulet, 3 H, protons méthoxy), 2 (singulet, 3 H, protons du méthyl vinylique).
Copolymerisation radicalaire du N-méthoxyéthylméthacrylamide et de l'acide m- méthacrylamidophenylboronique :
1,047 mmole de chacun des deux monomères est dissous dans 15 ml d'eau pour le N- méthoxyéthylméthacrylamide et 15 ml de méthanol pour l'acide m- méthacrylamidophénylboronique. Le mélange des deux solutions précédentes est dégazé pendant une heure à 50°C sous azote avant l'introduction de 0,17g (3% molaire) de 4, 4' azobis(acide 4-cyanovalérique). Le milieu réactionnel est agité 18 heures à
50°C avant concentration sous vide partiel et précipitation du polymère dans l'acétone. L'analyse RMN du polymère montre que sa composition est de 40% en dérivé d'acide boronique.
Exemple 2: Détection spécifiques d'anticorps immobilisés par un polymère hvdrosoluble
Des IgG polyclonales en solution à 10 mg/1 dans un tampon carbonate de sodium 50 xnM pH 9J sont incubées dans des puits d'immuno-modules Nunc maxisorp pendant deux heures à 37°C. Après lavage au PBS-tween, les puits sont passives par incubation pendant deux heures à 37°C de 200 μl de PBS-TWEEN 0,05%, contenant 10% de sérum de chèvre. Le copolymère de l'exemple 1, dissout à 40 mg/1 dans un tampon carbonate de sodium 50 mM pH 9.7, est ensuite incubé pendant deux heures à 37°C. Après lavage avec une solution 50/50 de carbonate de sodium 50 mM pH 9,7 et PBS- Tween 0,05% sérum de chèvre 10%, la phosphatase alcaline diluée à 20 μg/ml dans le tampon carbonate 50 mM pH 9,7 est ensuite incubée à 37°C. Après deux lavages avec la solution 50/50 de carbonate de sodium 50 mM pH 9,1 et PBS-Tween 0,05%) sérum de chèvre 10%, le substrat de la phosphatase alcaline, le paranitrophénylphosphate (pNPP), est alors ajouté en solution dans le diéthanolamine pH 9,8 à 4 g/1 . Au bout de 30 mn, la réaction est stoppée par ajout de 100 μl par puits d'une solution molaire de soude. La densité optique est lue à 405 nm sur le spectromètre Axia de bioMérieux.
Figure imgf000020_0001
Expérience 1 : réalisée en présence d'anticorps, de polymère et d'enzyme Expérience 2 : Témoin sans Anticorps Expérience 3 : Témoin sans polymère.
Les résultats décrits dans le tableau ci dessus montrent que le polymère contenant un dérivé d'acide phénylboronique réagit avec les anticorps et la phosphatase alcaline.
Exemple 3 : dispositif pour la capture spécifique d'enzymes Deux solutions de copolymère de l'exemple 1, aux concentrations respectives de 40 et
10 mg/1 dans un tampon carbonate 50 mM pH 9.7, sont incubées séparément dans les puits d'une plaque de microtitration NUNC pendant deux heures à 37°C. Après lavage par une solution PBS-Tween 0,05%> sérum de chèvre 10%, la phosphatase alcaline diluée à 20 μg/ml dans le tampon carbonate 50 mM pH 9,7 est ensuite incubée une heure à 37°C. Le substrat, pNPP, est ensuite ajouté après deux lavages avec une solution 50/50 de carbonate de sodium 50 mM pH 9,7 et PBS-Tween 0,05% sérum de chèvre 10%, et la réaction est stoppée par ajout de soude IN après 20 mn. La densité optique à 405 nm est lue sur un spectromètre Axia de bioMérieux.
Figure imgf000020_0002
Expérience 4 : réalisée en présence de polymère à la concentration de 40 mg/1. Expérience 5 : réalisée en présence de polymère à la concentration de 10 mg/1. Expérience 6 : Témoin sans enzyme. Expérience 7 : Témoin sans polymère. Comme le montrent les résultats ci-dessus, la phosphatase alcaline est bien capturée par le polymère immobilisé sur un support solide. Les bruits de fond observés aussi bien en absence d'enzyme que de polymère sont très faibles.
Exemple 4 : dispositif pour la capture spécifique de glycoprotéines issues de milieux de culture cellulaire.
La gpl20 virale ainsi que la région extracellulaire de la gp41 sont exprimées sous forme d'une protéine unique appelée gpl60 delta comme décrit dans B. Moss in Current Protocols in Molecular Biology, Chapter 16.5, John Wiley & Sons ed, 1994-1997. Ce virus recombinant ainsi construit utilise l'enveloppe d'un isolât primaire provenant d'une primo-infection symptomatique.
Des cellules de rein de hamster (BHK-21) sont infectées par le virus recombinant. Deux jours après infection, le surnageant de culture, qui contient la gpl60 delta sous forme soluble à une concentration moyenne de 1 mg/ml, est récolté, filtré sur 0,1mm et dialyse pendant une 36 heures en tampon carbonate 50mM pH9.7, pour éliminer le glucose présent dans le milieu de culture. Le surnageant cellulaire est dialyse pendant 36 heures contre du tampon carbonate 50 mM pH 9,1 pour éliminer toute trace de glucose. Les puits de plaque de microtitration NUNC sont incubés comme dans l'exemple 3 avec une solution du copolymère de l'exemple 1 à 40 mg/1 pendant deux heures à 37°C.
Après lavage au PBS-Tween, les puits sont passives par incubation pendant deux heures à 37°C, d'une solution de PBS-Tween 0,5% - sérum de chèvre 10%. Les surnageants de culture cellulaire sont incubés une heure à 37°C. Après lavages avec une solution 50/50 de carbonate de sodium 50 mM pH 9,7 et PBS-Tween 0,05% sérum de chèvre 10%, l'anticorps monoclonal de souris anti-GP120 est dilué à diverses concentrations dans du PBS-Tween 0,05%» sérum de chèvre 10% avant incubation une heure à 37°C. Après lavages avec du PBS-Tween 0,5%, le conjugué de détection anticorps anti-souris - PAL est dilué en de PBS-Tween 0,5% - sérum de chèvre 10% puis incubé une heure à 37°C. Après lavages, la détection est réalisée comme précédemment.
Figure imgf000022_0001
Expérience 9 : réalisée avec l'IgG anti-GP120 à la concentration de 10 μg/ml. Expérience 10 : réalisée avec l'IgG anti-GP120 à la concentration de 5 μg/ml. Expérience 11 : réalisée avec l'IgG anti-GP120 à la concentration de 1,6 μg/ml. Expérience 12 : réalisée avec l'IgG anti-GP120 à la concentration de 1 μg/ml. Expérience 13 : Témoin sans l'IgG anti-GP120.
Les signaux obtenus sont bien dus à la fixation sélective de la glycoprotéine sur le support, comme le montre l'expérience 12 qui constitue un témoin négatif sans anticorps de détection. Il faut noter que le signal de ce témoin négatif est de l'ordre du bruit de fond dû au substrat seul. Le signal observé décroît avec la diminution de la concentration en anticorps de détection anti GP120, ce qui confirme la spécificité du signal obtenu.
Exemple 5 :. Etude du facteur de dilution du surnageant cellulaire.
Les expériences de cet exemple sont réalisées dans les conditions opératoires de l'exemple 4.
Figure imgf000022_0002
Expérience 13 : réalisée sans dilution du surnageant cellulaire. Expérience 14 : réalisée avec dilution au demi du surnageant cellulaire.
Expérience 15 : réalisée avec dilution au quart du surnageant cellulaire. Expérience 16 : réalisée avec dilution au huitième du surnageant cellulaire. Expérience 17 : Témoin sans l'anti-GP120.
Lorsque que le surnageant cellulaire est dilué, le signal observé chute brutalement, mais reste toujours spécifique en comparaison avec le témoin négatif anticorps anti- GP120(expérience 17).
Exemple 6: préparation de particule thermosensible à base de NIPAM et de PHBA. Le monomère principal N-isopropylacrylamide (NIPAM, Accros, 41278-5000), le réticulant N,N'-Méthylènebisacrylamide (MBA, Aldrich, 14,607-2) et éventuellement l' acrylamide (AM, Aldrich, 14,866-0) sont introduits ensemble en une seule étape avant que la polymérisation ne soit amorcée par addition de l'amorceur persulfate de potassium (KPS, Sigma, P5592) qui se décompose sous l'effet de la chaleur. La durée de la polymérisation est de lheure. Les conditions d'introduction du monomère PHBA, portant la fonction acide boronique, sont indiquées pour chaque référence sous le tableau. La formulation des différentes particules préparées est donnée dans le tableau ci- dessous. Les conditions communes pour les synthèses sont : température de polymérisation de 70°C et agitation lors de la polymérisation de 300 RPM.
Figure imgf000023_0001
(a) :Le diamètre des particules est mesuré par diffusion de lumière dans une solution de lmM NaCl à 20°C.
(b)détermination par analyse élémentaire du Bore (c) volume réactionnel ND non déterminé BNIPAM-1 : polymérisation en batch, introduction des réactifs en même temps.
Témoin négatif sans monomère PHBA.
BNIPAM-2 : Introduction de PHBA (solubilisé dans 1 ml H2O à pH basique) après 11 minutes de la polymérisation. BNIPAM-3 : : Introduction de PHBA (solubilisé dans 2,4 ml H2O à pH basique) en semi-continu (toutes les 10 minutes) après 30 minutes de début de la polymérisation.
BNIPAM-4 : Introduction de PHBA (solubilisé dans 2,5 ml H2O à pH basique) après
10 minutes de la polymérisation.
BNLPAM-5 : Le PHBA (solubilisé dans 2 ml H2O à pH basique) est ajouté en plusieurs étapes (toutes les 2 minutes) après 10 minutes à partir du début de la polymérisation.
BNIPAM-6 : Le PHBA (solubilisé dans 2 ml H2O à pH basique) est ajouté en deux étapes, 1er ajout après 5 minutes de début de la polymérisation et le 2eme après 10 minutes.
Exemple 7: Polymérisation en semi-continu de particules colloïdales contenant un dérivé phénylboronique en utilisant le NTPMAM comme monomère principal.
Le monomère principal N-isopropylméthacrylamide (NIPMAM) est synthétisé au laboratoire par condensation du chlorure de méthacryloyle sur l'aminé correspondante. Les conditions pour la synthèse de la particule (référence HAM4) sont les suivantes : volume total d'eau bouillie et dégazée 50ml ; NIPMAM 0.5g ; MBA 0.06g ; PHBA 0.025g ;KPS 0.005g ; Température 70°C. L'ajout du monomère fonctionnel PHBA est effectué après lh30mn.
Taille des particules :
Figure imgf000024_0001
(a) La taille mesixrée en diffusion dynamique de la lumière dans 10"3 M NaCl (b)MET : microscope électronique à transmission. Exemple 8 : synthèse de particule colloïdale comportant un dérivé phénylboronique en utilisant le NEMAM comme monomère principal.
La polymérisation se déroule dans un réacteur thermostaté, surmonté d'un agitateur mécanique, sous atmosphère d'azote. La température de réaction est fixée à 90°C, et la vitesse d'agitation à 280 rpm. Trois protocoles de polymérisation sont utilisés.
Polymérisation batch A 50 ml d'eau MQ, bouillie et dégazée pendant 2h, on ajoute lg de N- éthylméthacrylamide (NEMAM, Polyscience, 02322) 0,15 g d'éthylène glyco diméthacylate (EGDMA, Merck, 818847) et une solution contenant X g d'acide m- méthacrylamidophénylboronique (PHBA), 1,9 ml de KOH 0,1N, et 3,5 ml d'eau. Après stabilisation du système pendant 1/2 heure, on ajoute 0,01g de KPS. La polymérisation est alors amorcée et le milieu passe de l'incolore à une couleur blanchâtre en quelques minutes.
La polymérisation est stoppée au bout de 6 heures en trempant le milieu réactionnel dans un bain de glace.
Polymérisation addition différée selon la variante 1 :
A 50 ml d'eau MQ, bouillie et dégazée pendant 2h, on ajoute lg de NEMAM et 0,15 g d'EGDMA. Après stabilisation du système pendant 1/2 heure, on ajoute 0,01g de KPS.
La polymérisation est alors amorcée et le milieu passe de l'incolore à une couleur blanchâtre en quelques minutes. Au bout de 40 min, le stade de la polymérisation étant à environ 70% de conversion, une solution contenant X g de PHBA, 1,9 ml de KOH
0,1N, et 3,5 ml d'eau, est insérée à raison de 1ml toutes les 10 min.
La polymérisation est stoppée au bout de 6 heures en trempant le milieu réactionnel dans un bain de glace.
Polymérisation addition différée selon la variante 2 :
A 50 ml d'eau issu d'un système de purification de type MilliQ (Millipore) bouillie et dégazée pendant 2h, on ajoute lg de NEMAM et 0,15 g d'EGDMA. Après stabilisation du système pendant 1/2 heure, on retire 5ml du milieu réactionnel, et on ajoute 0,01g de KPS. La polymérisation est alors amorcée et le milieu passe de l'incolore à une couleur blanchâtre en quelques minutes. Au bout de 40 min, le stade de la polymérisation étant à environ 70% de conversion, une solution contenant X g de PHBA, 1,9 ml de KOH 0,1N, 3,5 ml d'eau, et les 5 ml du milieu réactionnel préalablement récupérés, est insérée à raison de 2ml toutes les 10 min.
La polymérisation est stoppée au bout de 6 heures en trempant le milieu réactionnel dans un bain de glace.
Les caractéristiques des polymères synthétisés sont donnés dans les tableaux ci- dessous :
Polymérisation batch
Figure imgf000026_0001
AE signifie analyse élémentaire. Le taux de PHBA par AE est donné en pourcentage atomique et représente le taux moyen en masse dans la totalité de la particule. Le taux
PHBA en ESCA (Electron Spectrometry for Chemical Analysis) est donné en pourcentage atomique et représente le taux en surface sur une profondeur d'une dizaine d'angstrôms.
Dl représente le diamètre en nm déterminé à 20°C par spectroscopie de corrélation de photon (Malvern Zetasizer, 3000 HS).
D2 représente le diamètre en nm déterminé par microscopie électronique en transmission (TEM, sur appareil Philips CM 120, CME-ABG). La conversion est suivie par Résonance Magnétique Nucléaire à 500 Mhz ( appareil Narian Unity+) en contrôlant la disparition des pics correspondant aux protons vinyliques du monomère.
WSP correspond au pourcentage massique de polymère hydrosoluble non incorporé sur ou dans les particules.
Polymérisation addition différée selon la variante 1
Figure imgf000027_0001
Définitions identiques au tableau précédent
Polymérisation addition différée selon la variante 2
Figure imgf000027_0002
Exemple 9 : Immobilisation des particules sur des supports solides
Fonctionnalisation des supports de silice : Des plaques de silice sont taillées de façon à avoir des surfaces de 0,8 x 0,8 cm2. Les plaques sont activées dans une solution piranah (mélange eau oxygénée 30%> en volume et acide sulfurique concentrée dans les proportions volumiques respectives de 30/70) en ébullition pendant 15-20 min (face brillante vers le haut en évitant le recouvrement entre les plaques), puis des lavages successifs à l'eau distillée sont effectués (au moins llitre). Ce traitement permet de régénérer les fonctions silanols de la silice. Cette silice est appelée aussi silice nue
Certaines plaques sont ensuite séchées individuellement sous un courant d'azote, puis immergées dans une solution d'aminopropylméthyldiéthoxysilane (AMPDES) à 2% (v/v) dans du toluène anhydre pendant au moins 2 heures (face brillante vers le haut en évitant le recouvrement entre les plaques). Les plaques sont ensuite rincées intensivement à l'acétone (au moins 500 ml) puis séchés sous courant d'azote. Ces surfaces sont appelées surfaces SiNH2.
Immobilisation des particules sur les surfaces Les plaques sont immergées dans une solution latex contenant es particlues telle que 20 μl de solution de particules à environ 2%> de taux de solide sont dissous dans 980 μl de solution tampon acétate 50 mM, pH=4,2, 1M KC1 (dilution 1/50 ).
Après une nuit d'immersion, les plaques sont rincées abondamment dans de l'eau distillée, puis immergées successivement dans de l'eau distillée en ébullition pendant
10 min, de l'éthanol en ébullition pendant 10 min, de l'acétone en ébullition pendant 10 min.
Ce type de lavage intensif a pour but de décrocher les particules faiblement adsorbées et non fixées de façon stable sur la surface. Les résultats sont visualisés par microscopie à force atomique (AFM) sur un appareil
Nanoscope 3 de Digital Instruments en mode « Tapping » et sont représentées sur les figures 1 à 3. La figure 1 représente une photo AFM d'une surface silice nue (SiOH), sur laquelle est immobilisée une dilution des particules non fonctionnalisées HAM5. (dilution 1/50 dans un tampon acétate, 50 mM, pH=4.2, 1M KC1).
La figure 2 représente une photo AFM d'une surface silice nue (SiOH)) sur laquelle est immobilisée une dilution des particules fonctionnalisées HAM 11 (dilution 1/50 dans un tampon acétate, 50 mM, pH=4.2, 1M KC1).
La figure 3 représente une photo AFM d'une surface S1NH2, sur laquelle est immobilisée une dilution des particules fonctionnalisées HAM13 (dilution 1/50 dans un tampon acétate, 50 mM, pH=4.2, 1M KC1).
L'amélioration apportée par l'incorporation de monomères portant des fonctions acides boroniques dans le polymère pour la réalisation d'un dispositif de capture apparaît clairement sur les photos puisque la densité de particules sur la surface est plus importante pour les particules comportant les fonctions acides boroniques. Les fonctions d'acides boroniques présentes sur le polymère servent donc à la fois à immobiliser le polymère sur le support solide et à fixer la molécule cible sur le polymère.

Claims

REVENDICATIONS
1. Dispositif de capture d'une molécule cible comprenant un support solide à l'état divisé ou non, sur lequel est immobilisé un polymère susceptible de se lier directement ou indirectement à la molécule cible, caractérisé en ce que en combinaison le polymère est hydrophile et contient au moins un monomère possédant au moins une fonction acide boronique.
2. Dispositif selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le polymère est un polymère hydrosoluble.
3. Dispositif selon la revendication 2 caractérisé par le fait que le polymère est un copolymère entre un dérivé acrylamide ou méthacrylamide de l'acide phényl boronique et un dérivé N-alkyl ou N-alcoxy de l' acrylamide ou du méthacrylamide.
4. Dispositif selon la revendication 3 caractérisé par le fait que le polymère est un copolymère de l'acide m-méthacrylamidophenyl boronique et du N- methoxyéthylméthacrylamide.
5. Dispositif selon la revendication 1 caractérisé par le fait que le polymère est une particule colloïdale ou un latex.
6. Dispositif selon la revendication 5 caractérisé par le fait que la particule est composée d'au moins un monomère thermosensible comme les dérivés des N- alkylacrylamide et d'un monomère choisi parmi les dérivés acrylamide ou méthacrylamide de l'acide phényl boronique et un réticulant.
7. Dispositif, selon l'une quelconque des revendication 1 à 6, caractérisé par le fait que le support solide comporte en surface des groupements hydrophiles comme des groupements hydroxyles ou aminés.
8. Dispositif, selon la revendication 7, caractérisé par le fait que le support solide est un dérivé plan de silice nue ou un dérivé de silice fonctionnalisé par un réactif silane aminé tel que l'amino propylméthyldiéthoxysilane.
9. Dispositif de capture, selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait qu'un ligand susceptible de former un complexe avec la molécule cible est lié aux fonctions d'acides boroniques portées par le polymère.
10. Procédé de capture d'une molécule cible en utilisant un dispositif selon l'une quelconque des revendications 1 à 8, caractérisé par le fait qu'un échantillon liquide contenant la molécule cible est mis en contact avec le dispositif et ladite cible réagit avec les fonctions d'acides boroniques portées par le polymère.
11. Procédé de capture d'une molécule cible en utilisant un dispositif selon la revendication 9, caractérisé par le fait qu'un échantillon liquide contenant la molécule cible est mis en contact avec le dispositif, ladite cible formant un complexe avec le ligand fixé sur le polymère.
12. Procédé de capture selon la revendication 11, caractérisé par le fait le complexe est choisi parmi les complexes antigènes/anticorps, anticorps/haptène, hormone/récepteur, chélatant/molécule chélaté, hybride d'acides nucléiques.
13. Polymère sous forme de particule hydrophile composée d'au moins un monomère thermosensible comme les dérivés des N-alkylacrylamide et d'un monomère choisi parmi les dérivés acrylamide ou méthacrylamide de l'acide phényl boronique.
14. Polymère hydrophile, hydrosoluble composé d'au moins un dérivé acrylamide ou méthacrylamide de l'acide phényl boronique et un dérivé N-alkyl ou N- alcoxy de l' acrylamide ou du méthacrylamide.
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