JP2005239987A - 生体分子を固定化する反応性ポリマー、その製造方法及び用途 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】イソシアネート基を有するスチレン誘導体モノマーとリン脂質極性基を有するアクリル酸誘導体モノマーの二種類を少なくとも同時に含むモノマー組成物を、極性の反応媒体中でラジカル重合して得られるポリマーであって、得られるポリマー中にタンパク質、核酸、多糖などの生体由来の分子に対して簡便に反応するイソシアネート基を有するスチレン誘導体モノマーユニットが1〜40モル%、及びリン脂質モノマーユニットが5〜50モル%の範囲である水に不溶なポリマーを提供する。
【選択図】なし
Description
(1)下記式[1]で示されるイソシアネート基を有するスチレン誘導体モノマーと下記式[2]で示されるリン脂質極性基を有するアクリル酸誘導体モノマーとを少なくとも同時に含み、その他の疎水性モノマーも含むモノマー組成物を重合してなる非水溶性ポリマーで、化学式1で示されるイソシアネート基を有するスチレン誘導体ユニットの組成が1−40モル%であり、化学式2で示されるリン脂質モノマーユニットの組成が5−50モル%であることを特徴とするポリマー。
(2)記載のポリマー製造方法において、極性溶媒を主たる成分とする反応媒体中でラジカル重合して得られるポリマーの製造方法。
(3)前記のポリマーを有効成分とするタンパク質、核酸(オリゴヌクレオチド、アプタマーを含む)、多糖など生体由来の分子を反応固定化できる水に不溶な固定化担体。
フラスコに2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPCと略記する)284mgを秤量し、エタノール2.1gを仕込み、かき混ぜながら容器内を窒素で置換した。次いでm−(ジメチルメチルイソシアネート)−β−メチルスチレン(IPMSと略記する)388mg、n−ブチルメタクリレート(BMAと略記する)2.33gおよび2,2‘−アゾビスイソブチロニトリル15.9mgを添加し、さらにテトラヒドロフラン(THFと略記する)4.90gを入れて全体が均一になるように窒素雰囲気下にてかき混ぜた。その後、60℃に加温し、48時間かき混ぜた。得られた容液を取り出し、ヘキサン/クロロホルム(9/1)混合溶液300ml中に滴下して固形のポリマーを得た。収量は980mg、収率は33%であった。これを減圧乾燥し、ポリマーを得た。前記のポリマーのIR分析条件に従ってこのポリマーを分析した。結果は、イソシアネート基に由来する赤外吸収が2200〜2300cm一1に、エステル結合に由来する赤外吸収が1730cm−1に、ホスホリルコリン基に由来する赤外吸収が1200〜1100cm−1に確認できた。NMRの測定結果よりポリマー中の各モノマーユニットの組成はIPMS/MPC/BMA=14.3/17.8/67.9(モル%)であった。分子量は数平均分子量で30,000であった。
フラスコにMPC600mgを秤量し、エタノール3.2gを仕込み、かき混ぜながら容器内を窒素で置換した。次いでIPMS388mg、n−ブチルメタクリレート(BMAと略記する)2.33gおよび2、2‘−アゾビスイソブチロニトリル16.9mgを添加し、さらにTHF7.5gを入れて全体が均一になるように窒素雰囲気下にてかき混ぜた。その後、60℃に加温し、24時間かき混ぜた。得られた溶液を取り出し、ヘキサン/クロロホルム(9/1)混合溶液500ml中に滴下して固形のポリマーを得た。収量は1.80g、収率は54%であった。これを減圧乾燥し、ポリマーを得た。前記のポリマーのIR分析条件に従ってこのポリマーを分析した。結果は、イソシアネート基に由来する赤外吸収が2200〜2300cm−1に、エステル結合に由来する赤外吸収が1730cm−1に、ホスホリルコリン基に由来する赤外吸収が1200〜1100cm−1に確認できた。NMRの測定結果よりポリマー中の各モノマーユニットの組成はIPMS/MPC/BMA=11.3/33.8/65.9(モル%)であった。分子量は数平均分子量で52,000であった。
試験管に2−アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(APCと略記する)270mgを秤量し、エタノール2.1gを仕込み、かき混ぜながら容器内を窒素で置換した。次いでIPMS388mg、n−ブチルメタクリレート(BMAと略記する)2、33gおよび過酸化ベンゾイル23、4mgを添加し、さらにジメチルホルムアミド4.90gを入れて全体が均一になるように窒素雰囲気下にてかき混ぜた。その後、試験管を溶封し、オイルバスにて70℃に加温し、12時間かき混ぜた。得られた溶液を取り出し、ヘキサン/クロロホルム(8/2)混合溶液300ml中に滴下して固形のポリマーを得た。収量は2.1g、収率は70%であった。これを減圧乾燥し、ポリマーを得た。前記のポリマーのIR分析条件に従ってこのポリマーを分析した。結果は、イソシアネート基に由来する赤外吸収が2200〜2300cm−1に、エステル結合に由来する赤外吸収が1730cm−1に、ホスホリルコリン基に由来する赤外吸収が1200〜1100cm−1に確認できた。NMRの測定結果よりポリマー中の各モノマーユニットの組成はIPMS/APC/BMA=10.5/12.8/76.7(モル%)であった。分子量は数平均分子量で64,000であった。
IPMSの替わりにp−(ジメチルメチルイソシアネート)スチレン(DMISと略記する)を361mg用いた以外は実施例1と同じ操作にてポリマーを得た。収量は1.9g、収率は64%であった。これを減圧乾燥し、ポリマーを得た。前記のポリマーのIR分析条件に従ってこのポリマーを分析した。結果は、イソシアネート基に由来する赤外吸収が2200〜2300cm−1に、エステル結合に由来する赤外吸収が1730cm−1に、ホスホリルコリン基に由来する赤外吸収が1200〜1100cm−1に確認できた。NMRの測定結果よりポリマー中の各モノマーユニットの組成はDMIS/MPC/BMA=15.9/12.8/71.3(モル%)であった。分子量は数平均分子量で44,000であった。
フラスコにIPMS311mg、MPC1.37g、BMA1.32gおよび2,2‘−アゾビスイソブチロニトリル12.8mgを添加し、さらにエタノール7.0gを入れて全体が均一になるように窒素雰囲気下にてかき混ぜた。その後、60℃に加温し、24時間かき混ぜた。得られた溶液を取り出し、ヘキサン/クロロホルム(9/1)混合溶液300ml中に滴下して固形のポリマーを得た。収量は1.98g、収率は66%であった。これを減圧乾燥し、ポリマーを得た。前記のポリマーのIR分析条件に従ってこのポリマーを分析した。結果は、イソシアネート基に由来する赤外吸収が2200〜2300cm−1に認められず、重合反応中に溶媒のエタノールと反応したと考えられる。
フラスコにIPMS370mg、MPC542mg、BMA2.01gおよび2,2‘−アゾビスイソブチロニトリル15.2mgを添加し、さらにエタノール7.0gを入れて全体が均一になるように窒素雰囲気下にてがき混ぜた。その後、60℃に加温し、24時間かき混ぜた。得られた溶液を取り出し、ヘキサン/クロロホルム(9/1)混合溶液300ml中に滴下して固形のポリマーを得た。収量は342mg、収率は11%であった。これを減圧乾燥し、ポリマーを得た。前記のポリマーのIR分析条件に従ってこのポリマーを分析した。結果は、イソシアネート基に由来する赤外吸収が2200〜2300cm−1に認められず、重合反応中に溶媒のエタノールと反応したと考えられる。
重合反応中のイソシアネート基の反応を抑制するために、重合溶媒の検討を行った。IPMSを組成の異なるエタノール/THF混合溶媒中に入れ、60℃にて反応させて、イソシアネート基に由来する赤外吸収の変化を観察した。その結果、エタノール中では12時間後43%、24時間後13%、48時間後には1%となることがわかった。エタノール/THF=4/6中では12時間後90%、24時間後70%となることがわかった。これらに対して、エタノール/THF=3/7中では12時間後97%、24時間後94%、48時間後でも99%となることがわかった。これにより重合反応について、イソシアネート基の反応が抑制できる溶媒としてエタノール組成30%以下が好適であることを見いだした。
実施例1で得られたポリマー10mgをイソプロパノール/THF(7/3)混合溶媒100mlに溶解した。これにガラス板(3x5cm)を浸漬し、直ちに引き上げ、室温にて徐々に溶媒を揮発させた。減圧下にて1時間乾燥したのち、表面をX線光電子分光測定した。その結果、リン原子のピークが133eVに,窒素原子のピークが399eVおよび403eVに観察された。これより表面にポリマーが被覆されていることを確認した。
実施例2で得られたポリマー5mgをイソプロパノール/THF(7/3)混合溶媒100mlに溶解した。これにポリエチレンテレフタレート板(2x2cm)に50μl滴下し、2000回転にてスピンコートした。その後減圧下にて1時間乾燥したのち、表面をX線光電子分光測定した。その結果、リン原子のピークが133eVに,窒素原子のピークが399eVおよび403eVに観察された。これより表面にポリマーが被覆されていることを確認した。
パパイン(20mg)をリン酸緩衝液(pH7.0)20mlに溶解し、これに実施例6で得られた固定化基板を浸漬し、4℃にて緩やかに4時間攪拌した。反応終了後、リン酸緩衝液で表面を十分に洗浄し、固定化タンパク質(パパイン)を得た。
実施例8で得られた固定化タンパク質(パパイン)及び未修飾のパパインの酵素活性をベンゾイル−L−アルギニン−エチルエステルを基質として、リン酸緩衝液(pH6.1)中で40℃にて測定した。酵素反応により基質が分解され、258nmの紫外吸収が増加するため、この経時的変化を追跡して、反応速度を求めた。その結果、未処理のパパインの活性は7日目に全く見られなくなり、パパインの安定性が悪いことが確認できた。これに対して、実施例9の固定化したパパインでは28日目においても100%の活性を維持することがわかった。これらより実施例1で得られたポリマーのタンパク質固定化材としての有効性が確認できた。
実施例7で得られた固体化基板を用いて、核酸(サケ精巣DNA)を固定化した。核酸を1mg/mlとなるようにトリス緩衝液に溶解し、基板上に500μl滴下した。4℃にて1時間放置後、表面をトリス緩衝液にて洗浄し、核酸を基盤に固定化した。 DNAの固定化はX線光電子分光測定およびIR測定により確認した。
実施例6で得られた固体化基板を用いて、多糖(キトサン)を固定化した。多糖を0.5mg/mlとなるようにリン酸緩衝液に溶解し、基板上に300μl滴下した.10℃にて1時間放置後、表面をトリス緩衝液にて洗浄し、固定化多糖を得た。多糖の固定化はX線光電子分光測定およびIR測定により確認した。
Claims (6)
- 下記式[1]で示されるイソシアネート基を有するスチレン誘導体モノマーと下記式[2]で示されるリン脂質極性基を有するアクリル酸誘導体モノマーとを少なくとも同時に含み、その他の疎水性モノマーも含むモノマー組成物を重合してなる非水溶性ポリマー。
- 請求項1に記載のイソシアネート基とリン脂質極性基とを同時に有するポリマーで、化学式1で示されるイソシアネート基を有するスチレン誘導体ユニットの組成が1−40モル%であり、化学式2で示されるリン脂質モノマーユニットの組成が5−50モル%であることを特徴とするポリマー。
- 請求項1に記載のポリマー製造方法において、極性溶媒を主たる成分とする反応媒体中でラジカル重合して得られるポリマーの製造方法。
- 請求項1に記載のポリマーを有効成分とするタンパク質固定化材。
- 請求項1に記載のポリマーを有効成分とする核酸(オリゴヌクレオチド、アプタマーを含む)固定化材。
- 請求項1に記載のポリマーを有効成分とする多糖固定化材。
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