JP5030036B2 - 生体成分固定化ポリマー組成物および三次元架橋体 - Google Patents

Description

生体成分を常温、常圧で化学的処理をすることなく固定化できるポリマー組成物およびこれを利用した三次元架橋体に関する。

一般に、生体成分を固定化することは、バイオテクノロジー、バイオエンジニアリングを基礎としたバイオ産業に重要な技術である。しかしながらこれまでの手法では不溶性担体に吸着、包括、結合する方法が用いられてきたが、固定化する際には化学反応や物理的手法が不可欠であった。これらは生体成分の活性低下、構造変化を著しく引き起こすことが大きな問題として残されていた。また、利用する担体物質も、生体成分に対して親和性に乏しいために、構造変化と活性低下を招く一因であった。

この様な背景の中から、水溶液中で重合反応を生じ、三次元に架橋した網目構造を生成するモノマーと架橋剤の組み合わせで、生体成分を固定化することが行なわれてきているが、反応の活性種が生体成分と直接反応する、あるいは反応熱による生体成分の構造変化などの問題が残されていた。

また、水溶性高分子であるポリエチレングリコールなどを利用して化学的な架橋反応で高含水量の三次元架橋体を調製して、生成する網目構造に標的となる生体成分を固定化する方法がとられてきたが、架橋構造体を生成する反応により生体成分の活性が低下したり、細胞の機能が変化したりするという点が問題とされてきた。
川口春馬 監修：ナノ粒子・マイクロ粒子の最先端技術、シーエムシー出版、東京（２００４）

一方で、化学試薬を利用しない生体成分の固定化として、感光性ポリマーを用い、光照射による架橋反応の進行に伴う方法が提案されているが、一般に生体成分は光に対して過敏であるものもあり、この方法により高い活性維持が期待できない。

本発明では、水を主体とする媒体中で、化学的反応、熱、光、放射線照射などの物理的手法を利用することなく、かつ常温、常圧という生体成分に対して温和な条件のもと、ポリマーネットワークを生成することで生体成分をハイドロゲルネットワーク内に包括固定化する。これにより、固定化された生体成分は高い活性を維持でき、バイオ産業に有効に利用できる。

本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、ホスホリルコリン基とボロン酸基を同時に有するポリマーが、多価水酸基を持つ化合物と効果的に可逆的な共有結合を生成して、三次元の水に不溶な架橋体を形成することを見いだした。さらに、これを利用することにより、タンパク質、核酸、あるいは細胞、組織を常温、常圧、かつ水系溶媒中、しかも極めて短時間の処理で固定化できることを発見した。また、多価水酸基化合物を器材に固定化させることで、その表面においても三次元架橋体が生成することを見いだした。本発明はこのようにして完成された。

すなわち、本発明は以下のとおりである。（１）ポリビニルアルコールとホスホリルコリン基とフェニルボロン酸基を同時に含有するビニル系ポリマーからなる組成物
（２）該組成物より形成される三次元架橋体
（３）該三次元架橋体より形成される生体成分固定化膜、粒子および器材

本発明では、分子中に細胞膜表面と同じ構造を有するホスホリルコリン基を持つポリマーを持たせることにより生体親和性を与えるとともに、親水性を付与することができるポリマー組成物を提供できる。また、本発明によれば、水系、常温、常圧で一切の化学的、物理的手法を適用することなく三次元架橋体を調製でき、生体成分の固定化する簡便かつ効果的な方法を提供できる。さらにこのポリマー組成物および三次元架橋体を利用して、高活性を維持して生体成分を固定化した粒子、膜および器材を提供することで、従来技術の問題点を解決する。

以下、本発明について詳細に説明するが、本発明の範囲はこれらの説明に拘束されることはなく、以下の例示以外についても、本発明の趣旨を損なわない範囲で適宜変更し実施し得る。

１．ホスホリルコリン基とフェニルボロン酸基を同時に含有するビニル系ポリマーの製造方法
本発明は、ホスホリルコリン基とフェニルボロン酸基を同時に含有するビニル系ポリマーの製造方法であって、ホスホリルコリン基を含有するモノマーとボロン酸基を有するモノマーを溶液状態で混合し、ラジカル発生剤の存在下にてラジカル重合反応をすることにより製造することができる。なお適宜、第三のモノマーを添加して、生成するポリマーの性質を調製しても差し支えない。ホスホリルコリン基とフェニルボロン酸基を同時に含有するビニル系ポリマーは、下記一般式（１）：
〔式中、Ｒ_１は、水素原子、メチル基又はエチル基を表し、Ｒ_２は炭素数２から１２のアルキル基およびオキシエチレン基を示し、Ｒ_３は炭素数２から４のアルキル基を示し、Ｘは、置換基を有していてもよいフェニル基又は−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−もしくは−Ｓ−で示される結合を表し、Ａは、水素原子、ハロゲン原子あるいは任意の有機置換基を表し、ｎを０．５８〜０．７０、ｍを０．１１〜０．２７、ｌを０．０９〜０．３１，これらの和が１．００となる。〕
で示される構造をとることを特徴としている。

ホスホリルコリン基を有するモノマーとしては、ビニル基やアリル基などの炭素−炭素二重結合を重合性基として有し、かつホスホリルコリン基を同一分子中に有する化合物から選択することができる。

例えば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン、（３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−２´−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル−２´−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、５−（メタ）アクリロイルオキシペンチル−２´−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシル−２´−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−２´−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシブチル−２´−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシペンチル−２´−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシヘキシル−２´−（トリメチルアンモニオ）エチルホスフェート、２−（メタ）アクリロイルオキシエチル−３´−（トリメチルアンモニオ）プロピルホスフェート、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−３´−（トリメチルアンモニオ）プロピルホスフェート、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル−３´−（トリメチルアンモニオ）プロピルホスフェート、５−（メタ）アクリロイルオキシペンチル−３´−（トリメチルアンモニオ） プロピルホスフェート、６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシル−３´−（トリメチルアンモニオ）プロピルホスフェート、３−（メタ）アクリロイルオキシプロピル−４´−（トリメチルアンモニオ）ブチルホスフェート、４−（メタ）アクリロイルオキシブチル−４´−（トリメチルアンモニオ）ブチルホスフェート、５−（メタ）アクリロイルオキシペンチル−４´−（トリメチルアンモニオ）ブチルホスフェート及び６−（メタ）アクリロイルオキシヘキシル−４´−（トリメチルアンモニオ）ブチルホスフェート等を挙げることができ、特に、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（以下、ＭＰＣと略す。）が好ましい。ここで、「（メタ）アクリル」とは、メタクリル及び／またはアクリルを意味する。

フェニルボロン酸基を有するモノマーとしては、ビニル基やアリル基などの炭素−炭素二重結合を重合性基として有し、かつフェニルボロン酸基を同一分子中に有する化合物から選択することができる。

例えば、ｐ−ビニルフェニルボロン酸、ｍ−ビニルフェニルボロン酸、ｐ−（メタ）アクリロイルオキシフェニルボロン酸、ｍ−（メタ）アクリロイルオキシフェニルボロン酸、ｐ−（メタ）アクリルアミドフェニルボロン酸、ｍ−（メタ）アクリルアミドフェニルボロン酸、ｐ−ビニルオキシフェニルボロン酸、ｍ−ビニルオキシフェニルボロン酸、ビニルウレタンフェニルボロン酸などが挙げられるが、原料の入手の点でｐ−ビニルフェニルボロン酸あるいはｍ−ビニルフェニルボロン酸が望ましい。

添加可能な第三のモノマーとは、疎水性や荷電、器材への化学結合性を該ポリマーに付与する目的で使用される。

例えば、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、グリセロール（メタ）アクリレート、（メタ）アクリルアミド、ポリエチレングリコールモノ（メタ）アクリレート、ビニルベンゼンスルホン酸、ビニルベンゼンスルホン酸ナトリウム等の親水性単量体、メチル（メタ）アクリレート、エチル（メタ）アクリレート、ブチル（メタ）アクリレート、ドデシル（メタ）アクリレート、２−エチルヘキシル（メタ）アクリレート、酢酸ビニル等の疎水性単量体、３−メタクリロイルオキシプロピル）トリメトキシシラン、（３−メタクリロイルオキシプロピル）トリエトキシシラン、（３−メタクリロイルオキシプロピル）メチルジメトキシシラン、トリメトキシビニルシラン等のアルキルオキシシラン基を有する単量体、シロキサン基を有する単量体、グリシジルメタクリレート等のグリシル基を有する単量体、アミノエチル（メタ）アクリレート等のアミノ基を有する単量体、カルボキシル基、水酸基、スクシンイミド基、マレインイミド基等の置換基を有する単量体を挙げることができる。特に、ブチル（メタ）アクリレートが好ましい。これらは、単独で利用するだけでなく、混合物として利用できる。

重合反応の際に、モノマーが均一溶液になっていることが好ましく、固定状のモノマーを使用する際には、これらを均一に溶解する溶媒を添加することができる。さらに、生成するポリマーも溶解させることのできる溶媒を使用することが、構造の安定したポリマーを得るのに好ましい。また、溶媒は単一である必要はなく、二種類以上の混合溶媒でも良い。

ラジカル発生剤としては、モノマー混合液に溶解し、反応温度３０℃〜９０℃の範囲で分解し、ラジカルを発生するものであれば制限なく使用することができるが、安全性、安定性の点で、アゾビスイソブチロニトリル、４，４‘−アゾビス（４−シアノペンタン酸）等の脂肪族アゾ化合物、過酸化ベンゾイルやこはく酸パーオキシド等の過酸化物が好ましい。

さらに、光照射でラジカルを発生する開始剤、原子移動リビングラジカル重合反応、可逆的付加開裂連鎖移動重合法などを利用し、分子構造と分子量の制御を行なうことも妨げない。

該ポリマー中のホスホリルコリン基を有するモノマー単位のモル分率組成は、モノマー混合溶液中の組成で制御することができ、その範囲は０．５８〜０．７０である。この範囲以外であると、ポリマーの水媒体への溶解性、生体親和性の点で障害となる。

該ポリマー中のフェニルボロン酸基を有するモノマー単位のモル分率組成は、モノマー混合溶液中の組成で制御することができ、その範囲は０．１１〜０．２７である。この範囲以外であると、ポリビニルアルコールとの反応性、生成する三次元架橋体の強度および、ポリマーの水媒体への溶解性の点で障害となる。

添加可能な第三のモノマー単位のモル分率組成は、全体からホスホリルコリン基を有するモノマー単位のモル分率組成およびフェニルボロン酸を有するモノマー単位のモル分率組成の差で表される。

該ポリマーの分子量はゲル浸透クロマトグラフィーで測定した際に、ポリエチレンオキシドを標準物質として換算でき、その範囲は、１，０００〜１０，０００，０００であり、好ましくは１０，０００〜１，０００，０００、さらに三次元架橋体の生成能力と、水媒体への溶解性の観点から３０，０００〜５００，０００であることが望ましい。
２．多価水酸基を有する化合物の製造方法

ポリビニルアルコールとしては、水系媒体に溶解し、均一な溶液となることが好ましい。

これらの中で、ポリビニルアルコールが、
構造の安定した三次元架橋体を短時間で製造するために好適である。この際の分子量は、ゲル浸透クロマトグラフィーで測定した際に、ポリエチレンオキシドを標準物質として換算でき、その範囲は、１，０００〜１０，０００，０００であり、好ましくは５，０００〜１，０００，０００、さらに三次元架橋体の生成能力と、水系媒体への溶解性の観点から１０，０００〜６００，０００であることが望ましい。

ポリビニルアルコールを含む水系溶液と、ホスホリルコリン基とフェニルボロン酸基を同時に含有するビニル系ポリマーを含む水系溶液を混合することで、三次元架橋体が製造できる。水系溶液を調製す媒体としては、純水、緩衝液、細胞培養溶液および、３０％以下の有機溶媒を含有する水溶液が使用できる。有機溶媒の含有率が３０％以上になると、生体成分を固定化する際に障害となる。

調製する水溶液中のポリビニルアルコールおよびホスホリルコリン基とボロン酸基を同時に含有するビニル系ポリマーの濃度は、溶解できる範囲であれば使用可能であるが、粘性や得られる三次元架橋体の網目構造の安定性の観点から、いずれも０．５〜２０重量％の範囲であることが好ましく、より好ましくは０．７〜７重量％の範囲である。

三次元架橋体を得るための温度は、用途により制限を受けない場合は４〜９０℃であり、特に生体成分の固定化の際、構造変化や活性の低下を防止する観点から、１０〜４０℃が好ましく、さらに操作上好ましくは２０〜３７℃の室温近辺である。

三次元架橋体を形成するポリマー群の一成分を、粒子状担体、膜状担体あるいは平板器材に被覆、化学結合など物理的、化学的方法を利用して固定させることで、三次元架橋体をこれらの担体あるいは基材表面に安定に形成させることが可能である。また、三次元架橋体自体から、粒子、膜あるいは器材を生成させて利用してもよい。
４．生体成分の固定化方法

本発明の生体成分の固定化方法は、タンパク質、核酸、あるいは細胞、組織などを対象とすることができ、該ポリマー組成物より生成する三次元架橋体内に包括固定するものである。この際に、三次元架橋体を形成させる際のポリマー溶液に生体成分を予め混合させておくことが好ましいが、この方法に限定されることなく、三次元架橋体を形成させた後に、生体成分を拡散させることで固定化することもできる。また、適宜、インジェクターを使用して、三次元架橋体内に生体成分を注入してもよい。

生体成分を固定化した三次元架橋体は、生体環境に近い状態、あるいは低温で保存することが好ましい。

生体成分を固定化した該三次元架橋体から、溶質拡散性を利用して、内部に固定化させた生体成分を徐放させることができる。また、低分子量の多価水酸基化合物を添加することで、三次元架橋体が解離し、これに伴い架橋体内部に固定化された生体成分が放出できる。

以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。

実施例１（ホスホリルコリン基とフェニルボロン酸基を同時に含有するビニル系ポリマーの合成）
フラスコに２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣと略記する）５３ｇを秤量し、エタノール３００ｇを仕込み、かき混ぜながら容器内をアルゴンで置換した。次いでｐ−ビニルフェニルボロン酸（ｐ−ＶＰＢと略記する）４．４ｇ、ｎ−ブチルメタクリレート（ＢＭＡと略記する）１３ｇおよび２，２’−アゾビスイソブチロニトリル０．４９ｇを添加し全体が均一になるようにかき混ぜた。密栓をした後、６０℃に加温し、４８時間かき混ぜた。得られた溶液を取り出し、ジエチルエーテル／クロロホルム（８／２）混合溶液６０００ｍｌ中に滴下して固形のポリマーを得た。収量は５０ｇ、収率は７１％であった。これを減圧乾燥し、ポリマーを得た。前記のポリマーのＩＲ分析条件に従ってこのポリマーを分析した。結果は、フェニル基に由来する赤外吸収が３６００ｃｍ^−１に、エステル結合に由来する赤外吸収が１７３０ｃｍ^−１に、ホスホリルコリン基に由来する赤外吸収が１２００〜１１００ｃｍ^−１に確認できた。ＮＭＲの測定結果よリポリマー中の各モノマーユニットの組成はＭＰＣ／ｐ−ＶＰＢ／ＢＭＡ＝０．５８／０．１１／０．３１（モル分率）であった。分子量はゲル浸透クロマトグラフィーにより求め、ポリエチレンオキシドの標準物質を利用して計算した。その結果、数平均分子量で３９，０００であった。

実施例２（ホスホリルコリン基とフェニルボロン酸基を同時に含有するビニル系ポリマー の合成）
試験管にＭＰＣ５．３ｇを秤量し、エタノール２５ｇを仕込み、かき混ぜながら容器内を窒素で置換した。次いでｍ−ビニルフェニルボロン酸（ｍ−ＶＰＢと略記する）０．４４ｇ、ＢＭＡ１．３ｇおよび２，２’−アゾビスインブチロニトリル０．０４９ｇを添加し、さらにＴＨＦ５ｇを入れて全体が均一になるように窒素雰囲気下にてかき混ぜた。その後試験管を封管した。これを６０℃に加温し、２４時間かき混ぜた。得られた溶液を取り出し、ジエチルエーテル／クロロホルム（９／１）混合溶液５００ｍｌ中に滴下して固形のポリマーを得た。収量は４．２ｇ、収率は６０％であった。これを減圧乾燥し、ポリマーを得た。前記のポリマーのＩＲ分析条件に従ってこのポリマーを分析した。結果は、フェニル基に由来する赤外吸収が３６００ｃｍ^−１に、エステル結合に由来する赤外吸収が１７３０ｃｍ^−１に、ホスホリルコリン基に由来する赤外吸収が１２００〜１１００ｃｍ^−１に確認できた。ＮＭＲの測定結果よりポリマー中の各モノマーユニットの組成はＭＰＣ／ｍ−ＶＰＢ／ＢＭＡ＝０．６０／０．２７／０．１３（モル分率）であった。分子量はゲル浸透クロマトグラフィーにより求め、ポリエチレンオキシドの標準物質を利用して計算した。その結果、数平均分子量で５２，０００であった。

実施例３（ホスホリルコリン基とフェニルボロン酸基を同時に含有するビニル系ポリマーの合成）
試験管に２−アクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＡＰＣと略記する）１．６９ｇを秤量し、エタノール２０ｇを仕込み、かき混ぜながら容器内を窒素で置換した。次いでｐ−ＶＰＢ１４８ｍｇ、ＢＭＡ４２６ｍｇおよび過酸化ベンゾイル２３．４ｍｇを添加し、さらにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１．９０ｇを入れて全体が均一になるように窒素雰囲気下にてかき混ぜた。その後、試験管を溶封し、オイルバスにて７０℃に加温し、１２時間かき混ぜた。得られた溶液を取り出し、ジエチルエーテル／クロロホルム（８／２）混合溶液２００ｍｌ中に滴下して固形のポリマーを得た。収量は１．８１ｇ、収率は８０％であった。これを減圧乾燥し、ポリマーを得た。前記のポリマーのＩＲ分析条件に従ってこのポリマーを分析した。結果は、フェニル基に由来する赤外吸収が３６００ｃｍ^−１に、エステル結合に由来する赤外吸収が１７３０ｃｍ^−１に、ホスホリルコリン基に由来する赤外吸収が１２００〜１１００ｃｍ^−１に確認できた。ＮＭＲの測定結果よりポリマー中の各モノマーユニットの組成はＡＰＣ／ｐ−ＶＰＢ／ＢＭＡ＝０．７０／０．２１／０．０９（モル分率）であった。分子量はゲル浸透クロマトグラフィーにより求め、ポリエチレンオキシドの標凖物質を利用して計算した。その結果、数平均分子量で６４，０００であった。

実施例４（ホスホリルコリン基とフェニルボロン酸基を同時に含有するビニル系ポリマーの合成）
試験管にＡＰＣ１．６９ｇを秤量し、エタノール３０ｇを仕込み、かき混ぜながら容器内を窒素で置換した。次いでｍ−ＶＰＢ１４８ｍｇ、ＢＭＡ４２６ｍｇおよび過酸化ベンゾイル２３．４ｍｇを添加し、さらにＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミド１．９０ｇを入れて全体が均一になるように窒素雰囲気下にてかき混ぜた。その後、試験管を溶封し、オイルバスにて６５℃に加温し、８時間かき混ぜた。得られた溶液を取り出し、ジエチルエーテル／クロロホルム（８／２）混合溶液１００ｍｌ中に滴下して固形のポリマーを得た。収量は１．３６ｇ、収率は６０％であった。これを減圧乾燥し、ポリマーを得た。前記のポリマーのＩＲ分析条件に従ってこのポリマーを分析した。結果は、フェニル基に由来する赤外吸収が３６００ｃｍ^−１に、エステル結合に由来する赤外吸収が１７３０ｃｍ^−１に、ホスホリルコリン基に由来する赤外吸収が１２００〜１１００ｃｍ^−１に確認できた。ＮＭＲの測定結果よりポリマー中の各モノマーユニットの組成はＡＰＣ／ｍ−ＶＰＢ／ＢＭＡ＝０．６０／０．２７／０．１３（モル分率）であった。分子量はゲル浸透クロマトグラフィーにより求め、ポリエチレンオキシドの標準物質を利用して計算した。その結果、数平均分子量で４７，０００であった。

実施例５（ホスホリルコリン基とフェニルボロン酸基を同時に含有するビニル系ポリマーの合成）
ｐ−ＶＰＢの替わりにｍ−アクリルアミドフェニルボロン酸（以下ＡＰＢと略す）５．７ｇを使用した以外は実施例１と同じ操作にて、ポリマーを得た。収量は４１．５ｇ、収率は５８％であった。これを減圧乾燥し、ポリマーを得た。前記のポリマーのＩＲ分析条件に従ってこのポリマーを分析した。結果は、フェニル基に由来する赤外吸収が３６００ｃｍ^−１に、エステル結合に由来する赤外吸収が１７３０ｃｍ^−１に、ホスホリルコリン基に由来する赤外吸収が１２００〜１１００ｃｍ^−１に確認できた。ＮＭＲの測定結果よりポリマー中の各モノマーユニットの組成はＭＰＣ／ＡＰＢ／ＢＭＡ＝０．６１／０．２０／０．１９（モル分率）であった。分子量はゲル浸透クロマトグラフィーにより求め、ポリエチレンオキシドの標準物質を利用して計算した。その結果、数平均分子量で８１，０００であった。

実施例６（三次元架橋体の調製）
実施例１〜５で得られたポリマーを水に溶解し、所定濃度のポリマー水溶液を調製した。一方、ポリビニルアルコール（ＰＶＡと略記する。）を温水で溶解し、水溶液を調製した後、所定の濃度に水で希釈した。これらを室温で混合することにより、三次元架橋体を調製した。混合による三次元架橋体形成の写真を図１に、各濃度における三次元架橋体形成結果を表１に示す。液体から三次元架橋体となり、媒体を含んだまま固体（ゲル）状態となることがわかる。また、三次元架橋体はポリマー濃度、混合組成を変化させた場合でも生成できる。ここでは、判定基準に以下の官能指標を定めた。
○ ：液体全体が流動性を失い、ポリマーの三次元架橋体が完全に生成する。
△ ：一部分の液体が残存し、三次元架橋体が部分的に生成する。
× ：液体状態を維持し、三次元架橋体の生成が認められない。

実施例７（三次元架橋体の構造観察）
実施例６で得られた三次元架橋体を凍結乾燥して観察試料を作成し、その断面を走査電子顕微鏡にて観察した。結果を図２に示す。多孔質の三次元架橋体となっていることがわかる。また孔径は約１μｍであった。

実施例８（細胞の固定化）
実施例１で得られたポリマー５％水溶液を２４穴のマルチウェルプレートに入れ、これにマウス線維芽細胞Ｌ９２９を含む細胞培養液を添加し、混合した。次いで、等量となるようにポリビニルアルコール５％水溶液と混合して三次元架橋体を得た。これを、５％二酸化炭素を含む雰囲気下、３７℃にて培養した。２４時間後に取り出し、細胞の状態を位相差顕微鏡にて観察した。結果を図３に示す。細胞は球状を維持していることがわかる。これより三次元架橋体内部へのＬ９２９細胞の固定化が可能である。

実施例９（細胞の固定化）
実施例１で得られたポリマー５％水溶液を２４穴のマルチウエルプレートに入れ、これにマウス急性骨髄性白血病細胞ＨＬ６０を含む細胞培養液を添加し、混合した。次いで、等量となるようにポリビニルアルコール５％水溶液と混合して三次元架橋体を得た。これを、５％二酸化炭素を含む雰囲気下、３７℃にて培養した。２４時間後に取り出し、細胞の状態を位相差顕微鏡にて観察した。細胞は球状を維持していた。これより三次元架橋体内部へのＨＬ６０細胞の固定化が可能であった。

実施例１０（細胞の固定化）
実施例１で得られたポリマー５％水溶液を２４穴のマルチウエルプレートに入れ、これにマウス線維芽細胞ＮＩＨ３Ｔ３を含む細胞培養液を添加し、混合した。次いで、等量となるようにポリビニルアルコール水溶液と混合して三次元架橋体を得た。これを、５％二酸化炭素を含む雰囲気下、３７℃にて培養した。２４時間後に取り出し、細胞の状態を位相差顕微鏡にて観察した。細胞は球状を維持していた。これより三次元架橋体内部へのＮＩＨ３Ｔ３細胞の固定化が可能であった。

実施例１１（細胞の固定化）
実施例１で得られたポリマー５％水溶液を２４穴のマルチウエルプレートに入れ、これにヒト臍帯血管内皮細胞ＨＵＶＥＣを含む細胞培養液を添加し、混合した。次いで、等量となるようにポリビニルアルコール２．５％水溶液と混合して三次元架橋体を得た。これを、５％二酸化炭素を含む雰囲気下、３７℃にて培養した。２４時間後に取り出し、細胞の状態を位相差顕微鏡にて観察した。細胞は球状を維持していた。これより三次元架橋体内部へのＨＵＶＥＣ細胞の固定化が可能であった。

実施例１２（細胞の固定化）
実施例１で得られたポリマー５％水溶液を１２穴のマルチウエルプレートに入れ、これにマウス胚線維芽細胞ＳＴＯを含む細胞培養液を添加し、混合した。次いで、等量となるようにポリビニルアルコール２．５％水溶液と混合して三次元架橋体を得た。これを、５％二酸化炭素を含む雰囲気下、３７℃にて培養した。４８時間後に取り出し、細胞の状態を位相差顕微鏡にて観察した。細胞は球状を維持していた。これより三次元架橋体内部へのＳＴＯ細胞の固定化が可能であった。

実施例１３（細胞の固定化）
実施例２で得られたポリマー５％水溶液を６穴のマルチウエルプレートに入れ、これにラット褐色細胞ＰＣ１２を含む細胞培養液を添加し、混合した。次いで、等量となるようにポリビニルアルコール５％水溶液と混合して三次元架橋体を得た。これを、５％二酸化炭素を含む雰囲気下、３７℃にて培養した。４８時間後に取り出し、細胞の状態を位相差顕微鏡にて観察した。細胞は球状を維持していた。これより三次元架橋体内部へのＰＣ１２細胞の固定化が可能であった。

実施例１４（細胞の固定化）
実施例２で得られたポリマー５％水溶液を２４穴のマルチウエルプレートに入れ、これにマウス由来マクロファージ様細胞株ＲＡＷ２６４を含む細胞培養液を添加し、混合した。次いで、等量となるようにポリビニルアルコール５％水溶液と混合して三次元架橋体を得た。これを、５％二酸化炭素を含む雰囲気下、３７℃にて培養した。４８時間後に取り出し、細胞の状態を位相差顕微鏡にて観察した。細胞は球状を維持していた。これより三次元架橋体内部へのＲＡＷ２６４細胞の固定化が可能であった。

実施例１５（タンパク質の固定化）
ポリビニルアルコールの５％水溶液をポリエステル樹脂のフィルムに展開し、乾燥させることで表面に厚さ３００μｍの膜を作成する。これに実施例１で得られたポリマーの５％水溶液を滴下して、ゆっくり攪拌して三次元架橋体を形成させた。この膜に抗ヤギＩｇＧヒツジ抗体を含む緩衝液をスポットにより展開した。蛍光化合物（ＦＩＴＣ）にて標識したヤギＩｇＧを含む緩衝液を滴下することにより、蛍光性のスポットが観察できた。このことは、三次元架橋体内部で抗原抗体反応が進行していることを示している。これよりタンパク質が三次元架橋体内に固定化できることが示された。

実施例１６（タンパク質の固定化）
ポリビニルアルコールの５％水溶液をポリエステル樹脂のフィルムに展開し、乾燥させることで表面に厚さ３００μｍの膜を作成する。これに実施例１で得られたポリマーの２．５％水溶液を滴下して、ゆっくり攪拌して三次元架橋体を形成させた。この膜にマウス白血病阻害因子（ＬＩＦ）を含む緩衝液をスポットにより展開した。これに蛍光化合物（ＦＩＴＣ）にて標識した抗マウスＬＩＦ抗体を含む緩衝液を滴下することにより、蛍光性のスポットが観察できた。これよりＬＩＦが三次元架橋体内に固定化できることが示された。

実施例１７（タンパク質の固定化）
ポリビニルアルコールの２．５％水溶液をポリエステル樹脂のフィルムに展開し、乾燥させることで表面に厚さ１５０μｍの膜を作成する。これに実施例１で得られたポリマーの５％水溶液を滴下して、ゆっくり攪拌して三次元架橋体を形成させた。この膜にマウス繊維芽細胞成長因子（ＦＧＦ）を含む緩衝液をスポットにより展開した。続いて蛍光化合物（ＦＩＴＣ）にて標識した抗マウスＦＧＦ抗体を含む緩衝液を滴下することにより、蛍光性のスポットが観察できた。これよりＦＧＦが三次元架橋体内に固定化できることが示された。

実施例１８（タンパク質の固定化）
ポリビニルアルコールの５％水溶液をナイロンフィルムに展開し、乾燥させることで表面に厚さ３００μｍの膜を作成する。これに実施例１で得られたポリマーの５％水溶液を滴下して、ゆっくり攪拌して三次元架橋体を形成させた。この膜にマウス上皮細胞成長因子（ＥＧＦ）を含む緩衝液をスポットにより展開した。これに蛍光化合物（ＦＩＴＣ）にて標識した抗マウスＥＧＦ抗体を含む緩衝液を滴下することにより、蛍光性のスポットが観察できた。これよりＥＧＦが三次元架橋体内に固定化できることが示された。

実施例１９（タンパク質の固定化）
ポリビニルアルコールの５％水溶液を細胞培養用のポリスチレンシャーレに展開し、乾燥させることで表面に厚さ３００μｍの膜を作成する。これに実施例１で得られたポリマーの５％水溶液を滴下して、ゆっくり攪拌して三次元架橋体を形成させた。この膜に骨形成因子（ＢＭＰ）を含む緩衝液をスポットにより展開した。これに蛍光化合物（ＦＩＴＣ）にて標識した抗マウスＢＭＰ抗体を含む緩衝液を滴下することにより、蛍光性のスポットが観察できた。これよりＢＭＰが三次元架橋体内に固定化できることが示された。

実施例２０（タンパク質の固定化）
ポリビニルアルコールの５％水溶液をガラス基板に展開し、乾燥させることで表面に厚さ３００μｍの膜を作成する。これに実施例１で得られたポリマーの５％水溶液を滴下して、ゆっくり攪拌して三次元架橋体を形成させた。この膜にマウス神経細胞成長因子（ＮＧＦ）を含む緩衝液をスポットにより展開した。これに続いて蛍光化合物（ＦＩＴＣ）にて標識した抗マウスＮＧＦ抗体を含む緩衝液を滴下することにより、蛍光性のスポットが観察できた。これよりＮＧＦが三次元架橋体内に固定化できることが示された。

ポリビニルアルコール水溶液と実施例１で得られたポリマー水溶液からなる組成物を混合して三次元架橋体が形成される過程を示す図である。 三次元架橋体の走査電子顕微鏡写真を示す図である。 三次元架橋体内部に固定化された細胞の写真を示す図である。

Claims (9)

1. ポリビニルアルコールとホスホリルコリン基とフェニルボロン酸基を同時に含有するビニル系ポリマーからなる組成物。
2. ポリビニルアルコールとホスホリルコリン基とフェニルボロン酸基を同時に含有するビニル系ポリマーの組成物より形成される三次元架橋体。
3. ホスホリルコリン基とフェニルボロン酸基を同時に含有するビニル系ポリマーが、下記一般式（１）：
   〔式中、Ｒ_１は、水素原子、メチル基又はエチル基を表し、Ｒ_２は炭素数２から１２のアルキル基およびオキシエチレン基を示し、Ｒ_３は炭素数２から４のアルキル基を示し、Ｘは置換基を有していてもよいフェニル基又は−Ｃ（Ｏ）−、−Ｃ（Ｏ）Ｏ−、−Ｏ−、−Ｃ（Ｏ）ＮＨ−もしくは−Ｓ−で示される結合を表し、Ａは、水素原子、ハロゲン原子あるいは任意の有機置換基を表し、ｎを０．５８〜０．７０、ｍを０．１１〜０．２７、ｌを０．０９〜０．３１，これらの和が１．００となる。〕
   で示されるものである請求項１に記載の組成物または請求項２に記載の三次元架橋体。
4. 請求項１記載の組成物および請求項２記載の三次元架橋体を含む膜。
5. 請求項１記載の組成物および請求項２記載の三次元架橋体からなる粒子。
6. 請求項１記載の組成物および請求項２記載の三次元架橋体からなる表面を持つ器材。
7. 生体成分として細胞、タンパク質、核酸を包括固定化した請求項４の三次元架橋膜。
8. 生体成分として細胞、タンパク質、核酸を包括固定化した請求項５の三次元架橋体からなる粒子。
9. 生体成分として細胞、タンパク質、核酸を包括固定化した請求項６の三次元架橋体からなる表面を持つ器材。