CN113150205A - 一种用于糖蛋白可控释放和信号放大策略温敏性苯硼酸微凝胶及其制备方法和应用 - Google Patents

一种用于糖蛋白可控释放和信号放大策略温敏性苯硼酸微凝胶及其制备方法和应用 Download PDF

Info

Publication number
CN113150205A
CN113150205A CN202110300185.8A CN202110300185A CN113150205A CN 113150205 A CN113150205 A CN 113150205A CN 202110300185 A CN202110300185 A CN 202110300185A CN 113150205 A CN113150205 A CN 113150205A
Authority
CN
China
Prior art keywords
microgel
phenylboronic acid
glycoprotein
temperature
antibody
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202110300185.8A
Other languages
English (en)
Other versions
CN113150205B (zh
Inventor
李攻科
苏日辉
肖小华
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Sun Yat Sen University
Original Assignee
Sun Yat Sen University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Sun Yat Sen University filed Critical Sun Yat Sen University
Priority to CN202110300185.8A priority Critical patent/CN113150205B/zh
Publication of CN113150205A publication Critical patent/CN113150205A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN113150205B publication Critical patent/CN113150205B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08F—MACROMOLECULAR COMPOUNDS OBTAINED BY REACTIONS ONLY INVOLVING CARBON-TO-CARBON UNSATURATED BONDS
    • C08F220/00—Copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical or a salt, anhydride ester, amide, imide or nitrile thereof
    • C08F220/02—Monocarboxylic acids having less than ten carbon atoms; Derivatives thereof
    • C08F220/52—Amides or imides
    • C08F220/54—Amides, e.g. N,N-dimethylacrylamide or N-isopropylacrylamide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J3/00—Processes of treating or compounding macromolecular substances
    • C08J3/02—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques
    • C08J3/03—Making solutions, dispersions, lattices or gels by other methods than by solution, emulsion or suspension polymerisation techniques in aqueous media
    • C08J3/075—Macromolecular gels
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/574—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer
    • G01N33/57476—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for cancer involving oncofetal proteins
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/58—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances
    • G01N33/581—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing involving labelled substances with enzyme label (including co-enzymes, co-factors, enzyme inhibitors or substrates)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C08—ORGANIC MACROMOLECULAR COMPOUNDS; THEIR PREPARATION OR CHEMICAL WORKING-UP; COMPOSITIONS BASED THEREON
    • C08J—WORKING-UP; GENERAL PROCESSES OF COMPOUNDING; AFTER-TREATMENT NOT COVERED BY SUBCLASSES C08B, C08C, C08F, C08G or C08H
    • C08J2333/00—Characterised by the use of homopolymers or copolymers of compounds having one or more unsaturated aliphatic radicals, each having only one carbon-to-carbon double bond, and only one being terminated by only one carboxyl radical, or of salts, anhydrides, esters, amides, imides, or nitriles thereof; Derivatives of such polymers
    • C08J2333/24—Homopolymers or copolymers of amides or imides
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N2333/00—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature
    • G01N2333/435—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans
    • G01N2333/46—Assays involving biological materials from specific organisms or of a specific nature from animals; from humans from vertebrates
    • G01N2333/47—Assays involving proteins of known structure or function as defined in the subgroups
    • G01N2333/4701—Details
    • G01N2333/471—Pregnancy proteins, e.g. placenta proteins, alpha-feto-protein, pregnancy specific beta glycoprotein
    • Y—GENERAL TAGGING OF NEW TECHNOLOGICAL DEVELOPMENTS; GENERAL TAGGING OF CROSS-SECTIONAL TECHNOLOGIES SPANNING OVER SEVERAL SECTIONS OF THE IPC; TECHNICAL SUBJECTS COVERED BY FORMER USPC CROSS-REFERENCE ART COLLECTIONS [XRACs] AND DIGESTS
    • Y02—TECHNOLOGIES OR APPLICATIONS FOR MITIGATION OR ADAPTATION AGAINST CLIMATE CHANGE
    • Y02A—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE
    • Y02A50/00—TECHNOLOGIES FOR ADAPTATION TO CLIMATE CHANGE in human health protection, e.g. against extreme weather
    • Y02A50/30—Against vector-borne diseases, e.g. mosquito-borne, fly-borne, tick-borne or waterborne diseases whose impact is exacerbated by climate change

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Dispersion Chemistry (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Polymers & Plastics (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Hospice & Palliative Care (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种用于糖蛋白可控释放和信号放大策略温敏性苯硼酸微凝胶及其制备方法和应用。本发明的微凝胶或复合凝胶的表面苯硼酸基团对糖蛋白酶具有特异性吸附作用，加上自身具备的温敏性，使其在低温时可以负载糖蛋白酶，当温度大于LCST时释放糖蛋白，释放后的糖蛋白酶经过催化酶底物产生放大的可检测信号。本发明复合凝胶用于血清甲胎蛋白和啤酒中葡萄糖氧化酶的检测，能有效地减少基质干扰，提高信噪比。

Description

一种用于糖蛋白可控释放和信号放大策略温敏性苯硼酸微凝 胶及其制备方法和应用
技术领域
本发明属于功能性微凝胶技术领域，具体涉及一种用于糖蛋白可控释放和信号放大策略温敏性苯硼酸微凝胶及其制备方法和应用。
背景技术
智能水凝胶是一种在水中溶胀并保持大量水分而又不溶解的交联高分子聚合物，它可感知外界环境的细微物理化学变化，并通过体积的溶胀和收缩、形状弯曲、颜色变化和释放目标物等来响应这些来自外界的刺激。智能微凝胶是一种微米级的水凝胶颗粒，具有分子内交联结构的聚合物微粒，相对于块状水凝胶，具有比表面积大和环境响应速度快的特点。智能微凝胶具有独特的生物兼容性和响应性，已在传感器、化学转换器、分子的分离分析、形状记忆开关、药物递送和酶的固定等方面得到应用。
酶联免疫吸附检测(ELISA)是一种基于抗原和抗体之间特异性结合的免疫分析方法，具有成本低，易操作的优点，常用于复杂样品的快速检测。为了提高灵敏度，通常从改善抗原与抗体的结合能力，对信号放大，以及降低背景等方面进行深入研究。但抗原与抗体往往不容易受控，因此提高灵敏度的主要手段仍然是信号放大和提高信噪比。目前采用酶标记的双抗夹心结构只连接少量的辣根过氧化物酶，虽然通过酶催化底物实现了信号放大，但对低浓度的抗原信号放大仍不理想。
发明内容
本发明旨在至少解决上述现有技术中存在的技术问题之一。为此，本发明提出一种微凝胶，能够用于糖蛋白可控释放和信号放大检测，微凝胶可在低温时负载糖蛋白酶，温度在大于低临界相转变温度(Lower Critical Solution Temperature，LCST)时，糖蛋白被释放，释放后的糖蛋白酶经过催化酶底物产生放大的可检测信号，从而提高检测的灵敏度。
本发明又一个方面提出上述微凝胶的制备方法。
本发明又一个方面提出上述微凝胶的应用。
根据本发明的一个方面，提出了一种微凝胶，所述微凝胶的原料包括N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)、丙烯酸(AAc)和苯硼酸单体。
本发明将苯硼酸单体引入温敏性聚N-异丙基丙烯酰胺(PNIPAM)中，苯硼酸单体的苯硼酸基团对糖蛋白具有特异性吸附作用，增强了微凝胶对糖蛋白的吸附能力，且这种吸附作用还可以通过温度进行调节，具体体现为：在低温时微凝胶发生吸水溶胀，微凝胶的网络结构通道变得宽敞，使得微凝胶可以负载糖蛋白；而当温度高于低临界相转变温度(LCST)时，微凝胶发生收缩，内部的糖蛋白及水分子被大量排出，释放糖蛋白。另一方面，本发明的微凝胶具有生物兼容性，可以负载具有酶活性的糖蛋白，并且能保持酶的催化活性。
在本发明的一些实施方式中，上述N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)、丙烯酸(AAc)和苯硼酸单体的质量浓度比为(7～29)：(1～2)：2：1。
在本发明的一些优选的实施方式中，上述苯硼酸单体选自4-乙烯基苯硼酸、3-乙烯基苯硼酸中的至少一种。
在本发明的一些更优选的实施方式中，上述微凝胶为纳米颗粒，所述微凝胶的平均粒径为323nm～600nm。
根据本发明的又一个方面，提出了一种复合凝胶，所述复合凝胶包括上述微凝胶、链霉亲和素、生物素标记的抗体，所述链霉亲和素和所述生物素标记的抗体接枝在所述微凝胶上。
本发明的复合凝胶中，微凝胶中的苯硼酸单体可增强对辣根过氧化物酶的吸附，从而提高复合凝胶为糖蛋白的吸附能力，并通过接枝链霉亲和素和生物素标记的抗体，使复合凝胶同时具备识别抗原和可控释放糖蛋白的性能。在温度控制下，复合凝胶可释放所负载的糖蛋白，经过酶催化显色，在酶联免疫检测上可得到放大的光学信号，提高检测的灵敏度。
在本发明的一些实施方式中，上述复合凝胶中，微凝胶、链霉亲和素、生物素标记的抗体的质量比为(9000～18000)：(15～30)：1。
根据本发明的又一个方面，提出了一种上述微凝胶的制备方法，包括以下步骤：将N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、丙烯酸(AAc)、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)与苯硼酸单体加引发剂在真空惰性环境下反应制得。
在本发明的一些实施方式中，上述引发剂为选自过硫酸铵(APS)、过硫酸钾中的至少一种。
根据本发明的又一个方面，提出一种上述微凝胶在检测糖蛋白酶中的应用。
在本发明的一些实施方式中，上述糖蛋白酶为选自葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶中的至少一种。
根据本发明的又一个方面，提出了一种上述复合凝胶在检测甲胎蛋白中的应用。
根据本发明的又一个方面，提出了一种检测甲胎蛋白的方法，包括如下步骤：
S1：取权利要求4或5所述的复合凝胶在1℃～10℃下负载辣根过氧化物酶，制得修饰第二抗体；
S2：分别取标准品、待测品加入到固定有第一抗体的微孔板中，再分别加入S1中所述修饰第二抗体，35℃～41℃下孵育，洗涤微孔板后加入酶底物，测定发光值。
采用该检测方法，在温度控制下，苯硼酸微凝胶将释放大量的辣根过氧化物酶，加入酶底物进行显色，得到放大的光信号，从而提高检测的灵敏度和精确度，降低了甲胎蛋白的检出限。
在本发明的一些实施方式中，上述第一抗体为Human AFP ELISA KIT试剂盒孔板中的抗体。
在本发明的一些优选的实施方式中，上述酶底物为3,3',5,5'-四甲基联苯胺和过氧化氢。
本发明技术方案的有益效果为：
1.本发明微凝胶或复合凝胶的表面苯硼酸基团对糖蛋白酶具有特异性吸附作用，加上自身具备的温敏性，使其在低温时可以负载糖蛋白酶，当温度大于LCST时释放糖蛋白，释放后的糖蛋白酶经过催化酶底物产生放大的可检测信号。
2.本发明微凝胶或复合凝胶在使用剂量范围内对细胞存活率大于95.5％，具有良好的生物兼容性，可以使酶很好地吸附在微凝胶表面，还能保留酶的催化活性。
3.本发明复合凝胶用于甲胎蛋白的检测，能有效减少基质干扰，其检测结果与商用试剂盒检测结果一致。
附图说明
下面结合附图和实施例对本发明做进一步的说明，其中：
图1为本发明实施例2制得的微凝胶扫描电镜图。
图2为本发明实施例1制得的微凝胶在水中不同温度下粒径和时间的变化曲线图。
图3为本发明实施例1制得的微凝胶的相转变温度图。
图4为本发明实施例4检测人血清甲胎蛋白原理图。
图5为本发明实施例4中甲胎蛋白在浓度为0.5.0～32.0μg/L下的线性拟合图。
图6为实施例1制得的微凝胶在不同温度下释放葡萄糖氧化酶的上清液酶活力图。
图7为实施例1制得的微凝胶在不同温度下释放辣根过氧化物酶的响应信号值。
具体实施方式
以下将结合实施例对本发明的构思及产生的技术效果进行清楚、完整地描述，以充分地理解本发明的目的、特征和效果。显然，所描述的实施例只是本发明的一部分实施例，而不是全部实施例，基于本发明的实施例，本领域的技术人员在不付出创造性劳动的前提下所获得的其他实施例，均属于本发明保护的范围。
实施例1
本实施例制备了一种微凝胶，具体过程为：
S1：分别称取376mg的NIPAM，51.3mg的MBA，25.6mg的4-VPBA和47.9mg的AAc置于三口烧瓶中，加入25mL二次水超声溶解，磁性搅拌下使用双排管对预聚液抽真空，通入高纯氩气除氧，制得预聚液待用；
S2：称取53.7mg的引发剂APS溶解在盛有25.0mL二次水的三口烧瓶中，磁性搅拌下使用双排管抽真空，通入高纯氩气除氧，继续搅拌升温至70℃，恒温30min；
S3：以0.21mL/min的流速将S1制得的预聚液滴加至S2制得的引发剂APS中。滴加结束后，70℃下继续反应2h，得到微凝胶。冷却至室温，25℃下以10000rpm离心30min，弃去上清液，重复离心3次，最后加入3.00mL二次水超声重悬待用。
实施例2
本实施例制备了一种微凝胶，具体过程为：
S1：分别称取753mg的NIPAM，77.0mg的MBA，25.6mg的4-VPBA和47.9mg的AAc置于三口烧瓶中，加入25mL二次水超声溶解，磁性搅拌下使用双排管对预聚液抽真空，通入高纯氩气除氧，制得预聚液待用；
S2：称取53.7mg的引发剂APS溶解在盛有25.0mL二次水的三口烧瓶中，磁性搅拌下使用双排管抽真空，通入高纯氩气除氧，继续搅拌升温至70℃，恒温30min；
S3：以0.21mL/min的流速将S1制得的预聚液滴加至S2制得的引发剂APS中。滴加结束后，70℃下继续反应2h，得到微凝胶。冷却至室温，25℃下以10000rpm离心30min，弃去上清液，重复离心3次，最后加入3.00mL二次水超声重悬待用。
实施例3
本实施例采用实施例1制得的微凝胶来检测啤酒中葡萄糖氧化酶，具体过程为：
称取90mg实施例1制得的微凝胶(湿)置于离心管中，分别加入6种不同品牌啤酒样品10.00mL，摇匀，4℃下振荡过夜负载酶。负载后，在4℃下以10000rpm离心10min，弃去上清液，加入0.50mL磷酸缓冲液(pH为6.0)重悬，并于37℃下释放酶10min，取液体采用分光光度法测定酶活力。
另采用传统酸碱滴定法对上述6种不同品牌啤酒的葡萄糖氧化酶进行测定。
检测结果发现，采用实施1制得的微凝胶的检测方法，6种不同品牌的啤酒中均检测出葡萄糖氧化酶，而采用传统酸碱滴定法仅能检测出其中3中含有葡萄糖氧化酶，其他3种啤酒中由于葡萄糖氧化酶含量低，传统酸碱滴定法未能检出。这说明本发明实施例1制得的微凝胶对啤酒中的葡萄糖氧化酶具备有效的富集作用，并在富集下能成功检测出含量低的葡萄糖氧化酶。
进一步分别对2种不同品牌的啤酒做加标回收实验，利用三个水平浓度标准品(0.250U/mL、0.600U/mL和1.50U/mL)进行加标回收率实验，回收率范围为78.7％～101.6％，RSD小于7.2。可见，采用本发明实施1制得微凝胶的检测方法误差较小。
实施例4
本实施例提供一种检测人血清中甲胎蛋白(AFP)的方法，图4为检测原理图，具体过程为：
S1：复合凝胶制备：取1.00mL实施例1制得的微凝胶，25℃下以10000rpm离心30min，弃去上清液，加入1.00mol/L的MES(2-(N-吗啡啉)乙磺酸)缓冲液(pH为5.5)超声重悬，分别加入0.230mg的N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)和0.380mg的1-乙基-(3-(二甲基氨基)丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)，25℃下振荡10h，取出，重复离心3次，加入1.00mL的PBS缓冲液超声重悬。再加入10.0μL质量浓度为10mg/mL的链霉亲和素，4℃下振荡过夜。重复离心3次，加入50μL质量浓度为100μg/mL的生物素标记的抗体(bsm-1622M-Bio)，4℃下振荡过夜，备用。
S2：修饰第二抗体制备：往S1制得的复合凝胶加入1.00mL质量浓度为100μg/mL的辣根过氧化物酶的PBS溶液，在4℃下振荡过夜，再介入2.00mL质量浓度为1％的牛血清白蛋白(BSA)的PBS溶液，4℃下封闭2h。取出离心清洗2次，最后加入1.00mL的PBS缓冲液重悬，4℃下保存备用。
S3：检测：从室温平衡20min后的HumanAFPELISAKIT从铝箔袋中取出微孔酶标板板条，设置标准品孔和样本孔，标准品孔中加入不同浓度的标准品50μL，样本孔中加入待测样品50μL，空白孔不加。除空白孔外，标准品孔和样本孔中每孔加入50μL修饰第二抗体，用封板膜封住反应孔，在37℃恒温箱中温育2h。取出，弃去液体，使用吸水纸拍干，每孔加满洗涤液，静置1min，甩去甩去洗涤液，吸水纸上拍干，如此重复洗板5次。再加入100μL酶底物，37℃下避光放置15min。加入50μL终止液，15min内在酶标仪上选择450nm波长测定其光密度(OD)值。
将甲胎蛋白的浓度对数和OD值作图，得到图5的甲胎蛋白标准曲线线性拟合图，该方法对甲胎蛋白具有良好的线性关系，线性范围为0.50ng/mL～32.0μg/L，线性方程为y＝0.5428x+0.1772，R2为0.9958。本发明对甲胎蛋白的检出限为81ng/L。
进一步地，采用上述方法分别对7个实际血清样品的甲胎蛋白进行检测，并用商用ELISA试剂盒进行验证。结果表明，采用上述检测方法所得结果与商用ELISA试剂盒检测结果一致。再利用四个水平浓度标准品(1.0ng/mL、4.0ng/mL、8.0ng/mL和16.0ng/mL)进行加标回收率实验，回收率范围为84.6％～107.3％，RSD小于3.3％，可见，采用上述检测甲胎蛋白方法的误差较小。
试验例
1.本试验例对实施例2制得的微凝胶进行表征，具体过程为：将实施例2制得的微凝胶真空干燥后，采用扫描电镜对微凝胶进行表针，结果如图1所示。从图1可看出，实施例2制得的微凝胶为颗粒微球形状，平均粒径约为350nm。
2.本试验例对实施例1制得的微凝胶进行表征，具体过程为：将实施例1制得的微凝胶真空干燥后，采用动态光散射粒度仪对微凝胶进行表征，其在水中不同温度下的粒径变化曲线如图2所示。从图2可看出，常温下(25℃)的微凝胶的初始粒径为600nm，在受热0～5min时，每条温度曲线均呈快速下降的趋势，微凝胶急剧收缩，此时温度越高，粒径减小越明显。在受热15min后，微凝胶的粒径趋于稳定，不同温度下呈现出不同粒径的现象，在40℃时的粒径为353nm，体积变化了0.0897μm3。
进一步地，采用示差扫描量热法(DSC)测试来表征实施例1制得的微凝胶的相转变温度，微凝胶的相转变温度定义为DSC升温曲线上吸热峰出现时的温度。具体过程为：将实施例1制得的微凝胶密封在坩埚中，在氮气保护下以0.5℃/min的升温速率从18℃升温至55℃，观察微凝胶的升温曲线，结果如图3所示。从图3可看出，实施例1制得的微凝胶的相转变温度为35.0℃，接近生物体体温，适宜应用于生物体物质的检测。
3.为验证微凝胶具备温控释放葡萄糖氧化酶的性能，本试验例采用实施例1制得的微凝胶负载葡萄糖氧化酶，观察葡萄糖氧化酶在不同温度下的释放情况，具体过程为：
称取270mg实施例1制得的微凝胶于离心管中，加入3.0mL70U/mL葡萄糖氧化酶的磷酸缓冲液(pH为6.0)，振摇溶解，置于4℃冰箱中过夜负载酶。4℃下以10000rpm离心10min，弃去上清液，复溶，再重复离心2次，最后加入3.00mLPBS缓冲溶液(pH为6.0)复溶，各取1.00mL于离心管中，分别在4℃、25℃和37℃中释放酶10min，在相应温度下离心，取上清液测酶活力，结果如图6所示。
从图6可看出，当释放温度逐渐升高时，微凝胶释放葡萄糖氧化酶活力增高，当释放温度高于LCST(35.0℃)时，葡萄糖氧化酶的释放速率明显加快，可见，本发明制得的微凝胶具备温控释放葡萄糖氧化酶的性能。
4.为进一步验证微凝胶具备温控释放辣根过氧化物酶，本试验例采用实施例1制得的微凝胶负载辣根过氧化物酶，观察辣根过氧化物酶在不同温度下的释放情况，具体过程为：
取实施例1制得的微凝胶在4℃下吸附辣根过氧化物酶，取出，多次离心清洗微凝胶，直至上清液辣根过氧化物酶的酶底物反应OD值在0.25附近。再分别取3份2.5mL微凝胶于离心管中，分别置于4℃、25℃和37℃离心，每隔5min取50μL上清液做酶底物反应，用以检测微凝胶释放酶的速度，结果如图7所示。
从图7可看出，随着温度升高，微凝胶释放辣根过氧化物酶的速度越快，在温度为37℃，释放时间为5min时，辣根过氧化物酶的释放速度明显加快。可见，本发明制得的微凝胶具备可温控释放辣根过氧化物酶的性能。
上面结合附图对本发明实施例作了详细说明，但是本发明不限于上述实施例，在所属技术领域普通技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明宗旨的前提下作出各种变化。此外，在不冲突的情况下，本发明的实施例及实施例中的特征可以相互组合。

Claims (10)

1.一种微凝胶，其特征在于，包括所述微凝胶的原料包括N-异丙基丙烯酰胺、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、丙烯酸和苯硼酸单体。
2.根据权利要求1所述的微凝胶，其特征在于，所述N-异丙基丙烯酰胺、所述N,N'-亚甲基双丙烯酰胺、所述丙烯酸和所述苯硼酸单体的质量浓度比为(7～29)：(1～2)：2：1。
3.根据权利要求1或2所述的微凝胶，其特征在于，所述苯硼酸单体选自4-乙烯基苯硼酸、3-乙烯基苯硼酸中的至少一种。
4.一种复合凝胶，其特征在于，所述复合凝胶包括权利要求1或2所述的微凝胶、链霉亲和素和生物素标记的抗体，所述链霉亲和素和所述生物素标记的抗体接枝在所述微凝胶上。
5.根据权利要求4所述的复合凝胶，其特征在于，所述微凝胶、所述链霉亲和素和所述生物素标记的抗体的质量比为(9000～18000)：(15～30)：1。
6.一种如权利要求1～3任一项所述微凝胶的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：将N-异丙基丙烯酰胺(NIPAM)、丙烯酸(AAc)、N,N'-亚甲基双丙烯酰胺(MBA)与苯硼酸单体加引发剂在真空惰性环境下反应制得。
7.一种如权利要求1～3任一项所述微凝胶在检测糖蛋白酶中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述糖蛋白酶为选自葡萄糖氧化酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶中的至少一种。
9.一种如权利要求4或5所述的复合凝胶在检测甲胎蛋白中的应用。
10.一种检测甲胎蛋白的方法，其特征在于，包括如下步骤：
S1：取权利要求4或5所述的复合凝胶在1℃～10℃下负载辣根过氧化物酶，制得修饰第二抗体；
S2：分别取标准品、待测品加入到固定有第一抗体的微孔板中，再分别加入S1中所述修饰第二抗体，35℃～41℃下孵育，洗涤微孔板后加入酶底物，测定发光值。
CN202110300185.8A 2021-03-22 2021-03-22 一种用于糖蛋白可控释放和信号放大策略温敏性苯硼酸微凝胶及其制备方法和应用 Active CN113150205B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110300185.8A CN113150205B (zh) 2021-03-22 2021-03-22 一种用于糖蛋白可控释放和信号放大策略温敏性苯硼酸微凝胶及其制备方法和应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202110300185.8A CN113150205B (zh) 2021-03-22 2021-03-22 一种用于糖蛋白可控释放和信号放大策略温敏性苯硼酸微凝胶及其制备方法和应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN113150205A true CN113150205A (zh) 2021-07-23
CN113150205B CN113150205B (zh) 2023-09-05

Family

ID=76887755

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202110300185.8A Active CN113150205B (zh) 2021-03-22 2021-03-22 一种用于糖蛋白可控释放和信号放大策略温敏性苯硼酸微凝胶及其制备方法和应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN113150205B (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113667721A (zh) * 2021-07-29 2021-11-19 南昌大学 一种高灵敏即时检测miRNA的分析方法
CN114354778A (zh) * 2021-12-08 2022-04-15 苏州大学 一种基于固相富集结合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法
CN115746196A (zh) * 2022-11-15 2023-03-07 电子科技大学长三角研究院(湖州) 一种异丙基甲基丙烯酰胺-氟基苯硼酸共聚葡萄糖响应微凝胶的制备方法及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002046759A1 (fr) * 2000-12-07 2002-06-13 Bio Merieux Dispositif de capture d'une molecule cible

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002046759A1 (fr) * 2000-12-07 2002-06-13 Bio Merieux Dispositif de capture d'une molecule cible

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
刘紫薇: ""温度和葡萄糖双重敏感性共聚物微凝胶的研究"", 《中国优秀博硕士学位论文全文数据库（硕士）》, no. 8, 15 August 2008 (2008-08-15), pages 014 - 68 *
刘英超等主编: "《中枢神经系统疾病蛋白质组学》", 30 September 2010, 山东科学技术出版社, pages: 196 *
邓春辉等著: "《磁性微纳米材料在蛋白质组学中的应用》", 31 December 2017, 复旦大学出版社, pages: 461 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN113667721A (zh) * 2021-07-29 2021-11-19 南昌大学 一种高灵敏即时检测miRNA的分析方法
CN113667721B (zh) * 2021-07-29 2024-02-09 南昌大学 一种高灵敏即时检测miRNA的分析方法
CN114354778A (zh) * 2021-12-08 2022-04-15 苏州大学 一种基于固相富集结合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法
CN114354778B (zh) * 2021-12-08 2024-02-23 苏州大学 一种基于固相富集结合O-糖肽酶切分析Tn抗原的方法
CN115746196A (zh) * 2022-11-15 2023-03-07 电子科技大学长三角研究院(湖州) 一种异丙基甲基丙烯酰胺-氟基苯硼酸共聚葡萄糖响应微凝胶的制备方法及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
CN113150205B (zh) 2023-09-05

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN113150205B (zh) 一种用于糖蛋白可控释放和信号放大策略温敏性苯硼酸微凝胶及其制备方法和应用
Hucknall et al. Simple fabrication of antibody microarrays on nonfouling polymer brushes with femtomolar sensitivity for protein analytes in serum and blood
Gao et al. Recent advances and future trends in the detection of contaminants by molecularly imprinted polymers in food samples
Bora et al. Covalent immobilization of proteins onto photoactivated polystyrene microtiter plates for enzyme-linked immunosorbent assay procedures
NO170825B (no) Fastfasesystem og apparat for detektering av en eller flere analytter i en vaeskeproeve, samt anvendelse av apparatetfor immunoanalyse
US5330891A (en) Method for detection of a nucleic acid using particulate reagent having polyoxyalkylene side chains
Bora et al. Photoreactive cellulose membrane—A novel matrix for covalent immobilization of biomolecules
KR101990301B1 (ko) 광학 바이오센서
Chen et al. A novel chemiluminescence immunoassay of staphylococcal enterotoxin B using HRP-functionalised mesoporous silica nanoparticle as label
CN109342420B (zh) Fe3O4@C一维纳米线的应用
Escamilla-Gómez et al. Electrochemical immunosensor designs for the determination of Staphylococcus aureus using 3, 3-dithiodipropionic acid di (N-succinimidyl ester)-modified gold electrodes
Naqvi et al. Introduction of functional groups onto polypropylene and polyethylene surfaces for immobilization of enzymes
Prusak‐Sochaczewski et al. An improved ELISA method for the detection of Salmonella typhimurium
CN111693721A (zh) 基于普鲁士蓝纳米酶标记物的酶联免疫吸附实验的制备方法及应用
Zhang et al. Solid‐Phase Screening and Synthesis of Molecularly Imprinted Nanoparticles for Selective Recognition and Detection of Brain Natriuretic Peptide
CN114720515B (zh) 一种线性范围可调、聚多巴胺介导的免修饰便携式电导率免疫传感器的构建方法及应用
US10400233B2 (en) High load enzyme immobilization by crosslinking
US20150268234A1 (en) Density Amplification in Magnetic Levitation to Detect Binding Events of Large Molecules
CN114720437A (zh) 基于Fe-PDAN的高效荧光淬灭试纸条及其制备方法和检测方法
Su et al. A controlled recognizing and releasing glycoprotein based on temperature-responsive phenylboronic microgels for colorimetric analysis of complex samples
WO2000039582A1 (fr) Receptacle pour essais immunologiques
Du et al. Preparation and characterization of biotinylated and enzyme‐immobilized heterobifunctional latex particles as nanobio devices
CN110702763A (zh) 一种提高生物传感器检测灵敏度的方法
JP2000019178A (ja) 標識複合体
RU2265611C1 (ru) Способ получения иммуносорбента

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant