JP2013019713A - 遺伝子物質固定化医療用粒子および遺伝子物質の捕捉方法 - Google Patents
遺伝子物質固定化医療用粒子および遺伝子物質の捕捉方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP2013019713A JP2013019713A JP2011151521A JP2011151521A JP2013019713A JP 2013019713 A JP2013019713 A JP 2013019713A JP 2011151521 A JP2011151521 A JP 2011151521A JP 2011151521 A JP2011151521 A JP 2011151521A JP 2013019713 A JP2013019713 A JP 2013019713A
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- medical
- repeating unit
- particle according
- gene
- polymer
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Pending
Links
Images
Landscapes
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
【解決手段】粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第1繰り返しユニットと、側鎖の末端に遺伝子物質を有する第2繰り返しユニットを有する、ことを特徴とする医療用粒子で、遺伝子物資を、前記第2繰り返しユニットの末端に導入した活性エステル基を介して固定化する医療用粒子を提供することが可能となった。
【選択図】図2
Description
た方法(特許文献2)を利用することができる。
(1)遺伝子物質を固定化した医療用粒子であって、
粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第1繰り返しユニットと、
側鎖の末端に遺伝子物質を有する第2繰り返しユニットを有する、
ことを特徴とする医療用粒子。
(2)前記第2繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものであり、その側鎖末端に遺伝子物質を結合させたものである(1)に記載の医療用粒子。
(3)前記重合体が前記第1繰り返しユニットと前記第2繰り返しユニットを有するランダム共重合体である(1)または(2)に記載の医療用粒子。
(4)前記第1繰り返しユニットと、前記第2繰り返しユニットとの共重合比(第1繰り返しユニット/第2繰り返しユニット)が、97/3〜50/50である(1)ないし(3)いずれか1項に記載の医療用粒子。
(5)前記遺伝子物資が、前記第2繰り返しユニットの末端に導入した活性エステル基を介して固定化する(1)ないし(4)いずれか1項に記載の医療用粒子。
(6)前記活性エステル基は、p−ニトロフェニル活性エステル基、N−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、5−ノルボルネン−2、3−ジカルボキシイミド活性エステル基より選ばれる一種以上である(1)ないし(5)いずれか1項に記載の医療用粒子。
(7)前記第1繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽
和重合性モノマーに由来するものである(1)ないし(6)いずれか1項に記載の医療用粒子。
(8)前記アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーが、下記式(1)で表されるモノマーである(7)に記載の医療用粒子。
(9)前記粒子状の基材が、無機材料または樹脂材料で構成されている(1)ないし(8)のいずれか記載の医療用粒子。
(10)前記無機材料が、無機酸化物である(9)に記載の医療用粒子。
(11)前記無機酸化物が、酸化ケイ素である(10)に記載の医療用粒子。
(12)前記樹脂材料が、アクリル酸エステル樹脂である(9)に記載の医療用粒子。
(13)前記アクリル酸エステル樹脂が、ポリメタクリル酸メチル樹脂である(12)記載の医療用粒子。
(14)前記重合体が、前記第1繰り返しユニット、前記第2繰り返しユニット、および側鎖にシランカップリング剤を有するユニットからなり、前記基材にシランカップリング剤を介して結合されている(1)ないし(13)いずれか1項に記載の医療用粒子。
(15)遺伝子物質が、DNA、cDNA、オリゴDNA、RNA、またはmRNAの少なくとも一種から選ばれる(1)ないし(14)いずれか1項に記載の医療用粒子。
(16)(1)ないし(15)いずれか1項に記載の医療用粒子上の遺伝子物質を介して、相補的遺伝子、または遺伝子結合性蛋白質を補足することを特徴とする、遺伝子の捕捉方法。
本発明の遺伝子物質固定化医療用粒子は、遺伝子物質固定化した医療用粒子であって、粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第1繰り返しユニットと、側鎖の末端に遺伝子物質を有する第2繰り返しユニットと、を有することを特徴とする。
また、本発明の遺伝子物質の捕捉方法は、上記に記載の遺伝子物質医療用粒子を用い、固定化した遺伝子物質に相補的な遺伝子を捕捉することを特徴とする。
特に、ポリメタクリル酸メチルの粒子が、硬度が高い、水中での遠心分離が可能、さらには架橋させると耐薬品性が高まるといった理由から好適である。
具体的に、本発明の医療用粒子に用いる基材の粒径としては、用途によっても異なるが、平均粒径が数nm〜100μm程度のものが好ましい。特には、100nm〜50μmが好ましく、最も1μm〜40μmが好ましい。前記基材の平均粒径が前記範囲内であると、特に生理活性物質の捕捉量とハンドリングの良さとのバランスに優れる。
このような平均粒径は、例えば粒度分布計で測定することができる。
また、粒径のそろったコア粒子を用いることによりフローサイトメトリーにも利用可能となる。
の官能基との共有結合を形成させる方法が好ましい。
)トリメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)メチルジメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)ジメチルメトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)トリエトキシシ
ラン、(3-メルカプトプロピル)メチルジエトキシシラン、(3-メルカプトプロピル)ジメチルエトキシシラン、(メルカプトメチル)トリメトキシシラン、(メルカプトメチル)メチルジメトキシシラン、(メルカプトメチル)ジメチルメトキシシラン、(メルカプトメチル)トリエトキシシラン、(メルカプトメチル)メチルジエトキシシラン、(メルカプトメチル)ジメチルエトキシシランなどが挙げられるが、入手性から(3-メルカ
プトプロピル)ジメチルメトキシシランや(3-メルカプトプロピル)ジメチルエトキシ
シランが好ましい。これらのメルカプトシラン化合物は、単独または2種以上の組み合わせで用いられる。これらのシランカップリング剤は、単独または2種以上の組み合わせで用いられる。
移動基を有するシランカップリング剤を0.01〜1.0mol/Lとなるように添加し、撹拌混合して加水分解した後、核となる粒子を投入して10〜100℃で5〜180分間撹拌し、次いで、20〜100℃に加熱して粒子を乾燥させて行う。
に含まれるタンパク質の非特異吸着を大きく抑制することができる。
また、アルキレングリコール残基Yの繰り返し数qは、特に限定されるものではないが、好ましくは1〜100の整数であり、より好ましくは2〜100の整数であり、更に好ましくは2〜95の整数であり、最も好ましくは20〜90の整数である。 前記繰り返し数qが前記範囲内であると、特に非特異吸着の抑制に優れる。
なお、繰り返し数qが、2以上100以下の場合は、繰り返されるアルキレングリコール残基Yの炭素数は同一であっても、異なっていてもよい。
前記共重合比は、例えばX線光電子分光分析(XPS)で元素組成を評価することで算出できる。
とができることから、医療用粒子しての使用において、繰り返される加熱処理や、洗浄工程において、ポリマーの溶解を防ぐことが可能であり、さらに、ポリマーの脱離に伴い発生する、非特異吸着の劣化が抑制され、化学的、物理的安定した医療用粒子を提供することが可能となる。
また、検出対象以外の物質等に対する非特異吸着が少なく、かつ、検出対象は、相補的な遺伝子の高い反応性により、粒子表面に捕捉することが可能であるので、S/N比の高い医療用粒子を提供することができる。
前記重合体固定ビーズの作製について述べる。本発明のビーズの合成方法は、特に限定されるものではないが、合成の容易さから、ビーズ粒子表面に、重合性官能基を有するシランカップリング剤を固定化し、前記の遺伝子物質を固定化する官能基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマー、および該ビーズを含む混合物を、重合開始剤存在下、溶媒中でラジカル重合することが好ましい。
溶媒としてはそれぞれのエチレン系不飽和重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、2−ブタノン、メタノール、エタノール、t−ブチルアルコール、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルムなどを挙げることができる。これらの溶媒は、単独または2種以上の組み合わせで用いられる。
重合開始剤としては通常のラジカル開始剤ならいずれでもよく、例えば、2,2’−アゾビスイソブチルニトリル(以下「AIBN」という)、1,1’−アゾビス(シクロヘキサン−1 −カルボニトリル)などのアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリルな
どの有機過酸化物などを挙げることができる。
本発明の高分子化合物の化学構造は、その結合方式がランダム、ブロック、グラフトなどいずれの形態をなしていてもかまわない。
本発明において遺伝子物質をビーズ上に固定化する際には、遺伝子物質を溶解または分散させた液中に重合体固定ビーズを分散させる方法が簡便で好ましい。なお、遺伝子物質を1本鎖にした後、溶解又は分散させた液体を付着する方法とより好ましい。この際、遺伝子物質を1本鎖にする方法は、DNAのTm以上の温度で加熱した後、氷冷する方法が簡便で好ましい。遺伝子物質を溶解する液体のpHは5.0〜11.0であることが好ましく、pH6.0〜10.0がより好ましい。この範囲外だと、遺伝子物質が変性、分解する恐れがある。また、固定化する際は重合体・遺伝子物質にダメージを与えない範囲で加熱してもよい。
遺伝子物質付着後は、固相表面の親水基の特性により、界面活性剤を含む水や緩衝液で洗浄することで、別の物質の固相表面への非特異吸着を抑制することが可能となる。また、遺伝子物質を固定化する官能基をブロッキングするとさらに非特異吸着を抑制することが可能となる。ブロッキング剤は遺伝子物質を固定化する官能基に応じて適宜選択できるが、たとえば活性エステル基の場合は、2−アミノエタノールなどが好適に用いられる。
(重合体固定ビーズの作製)
メタクリロキシプロピルジメチルメトキシシラン(Gelest社製SIM6486.5)13gをpH3.0の酢酸水溶液50mLとエタノール50mLとの混合液に添加し、シランカップリング剤を加水分解した後に、シリカビーズ(平均粒径5μm、宇部日東化成株式会社製 ハイプレシカTS)10gを投入し70℃で2時間攪拌した後、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、100℃で1時間加熱した。その後、エタノールで分散させてよく振盪した後、遠心分離により上澄みを除去し乾燥させた。
前記の重合体固定ビーズ5mgに、DNA固定化用バッファ(住友ベークライト製、DNA固定化用96ウェルプレートキット、BS−61602、付属)に溶解させたCy3標識オリゴDNA(ggaatttcgc taccttagga ccgttatagt tacg、34Mer、末端アミノ基
)を添加し、57℃で一晩加熱して固定化した。Cy3標識オリゴDNAを固定化したビーズを純水で3回洗浄し、固定化されていないオリゴDNAを除去した。ビーズを純水に分散させた後、スライドガラス上に滴下し分散させ、蛍光顕微鏡で観察した。
結果を図1に示す。
表面処理ビーズに対しオリゴDNA固定化を行った場合、明瞭な蛍光が観察された。
(オリゴDNA固定化ビーズのハイブリ)
まず、実施例1で作製した重合体固定ビーズにオリゴDNAを固定化した。具体的には当該ビーズ20mgを100pmolのオリゴDNA含有固定化液100μLに分散させ、57℃で一晩加熱。 反応終了後、純水で3回洗浄。さらに95℃で10分間加熱、氷で
急冷した。
次に、オリゴDNAを固定化したビーズにビオチン標識されたターゲットDNAをハイブリさせた。具体的には、所定量のビオチン標識されたターゲットDNAを溶解したハイブリ液100μLを95℃で10分間加熱、この溶液をオリゴDNA固定化ビーズ2mgに加え、65℃3時間転倒混和。固定されなかったターゲットDNAを洗浄により除去した。
さらに、ビオチン標識されたターゲットDNAをハイブリさせたビーズと、HRP標識ストレプトアビジンと反応させた。具体的には、0.1μg/mLに調製したHRP標識ス
トレプトアビジンのPBS溶液1mLを添加し、37℃15分転倒混和。反応しなかったHRP標識ストレプトアビジンは洗浄により除去した。
HRP標識ストレプトアビジンと反応させたビーズをぺルオキシダーゼ発色キットで発色させ、上清を純水で4倍に希釈して吸光度を測定した(450nm)。
本発明の遺伝子固定化ビーズにハイブリした遺伝子が、脱ハイブリが可能かどうかを検証した。具体的には、実施例2でハイブリさせたビーズを95℃で10分加熱、PBSで3回洗浄した。こうして得られたビーズを、実施例2と同様、0.1μg/mLに調製した
HRP標識ストレプトアビジンのPBS溶液1mLを添加し、37℃15分転倒混和。反応しなかったHRP標識ストレプトアビジンは洗浄により除去した。HRP標識ストレプトアビジン反応させたビーズをぺルオキシダーゼ発色キットで発色させ、上清を純水で4倍に希釈して吸光度を測定した(450nm)。
表面処理をしていないシリカビーズ(平均粒径5μm、宇部日東化成株式会社製、ハイプレシカTS)に対しても実施例1と同様のCy3標識オリゴDNA固定化の処理を行った。
図1によると、表面処理ビーズに対しオリゴDNA固定化を行った場合、明瞭な蛍光が観察された。
一方、未処理ビーズに対し同様にオリゴDNA固定化を行った場合は、蛍光がほとんど観察されなかった。 このことから、重合体固定ビーズには末端にアミノ基を有するオリゴ
DNAを固定化できることが分かった。
また、オリゴDNAの処方量の増加とともに、固定化量が増加した。
実施例2において、オリゴDNAを添加しないビーズを作製、このビーズに対しても実施例2と同様、ビオチン標識されたターゲットDNAをハイブリさせたのち、HRP標識ストレプトアビジン反応させ、ぺルオキシダーゼ発色キットで発色した。
たDNAにターゲットDNAをハイブリ可能であり、 また、実施例3に記載した加熱に
よる脱ハイブリも可能であることが示された。
Claims (16)
- 遺伝子物質を固定化した医療用粒子であって、
粒子状の基材の表面に、重合体が固定化されており、
前記重合体は、側鎖に親水性基を有する第1繰り返しユニットと、
側鎖の末端に遺伝子物質を有する第2繰り返しユニットを有する、
ことを特徴とする医療用粒子。 - 前記第2繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものであり、その側鎖末端に遺伝子物質を結合させたものである請求項1に記載の医療用粒子。
- 前記重合体が前記第1繰り返しユニットと前記第2繰り返しユニットを有するランダム共重合体である請求項1または2に記載の医療用粒子。
- 前記第1繰り返しユニットと、前記第2繰り返しユニットとの共重合比(第1繰り返しユニット/第2繰り返しユニット)が、97/3〜50/50である請求項1ないし3いずれか1項に記載の医療用粒子。
- 前記遺伝子物資が、前記第2繰り返しユニットの末端に導入した活性エステル基を介して固定化する請求項1ないし4いずれか1項に記載の医療用粒子。
- 前記活性エステル基は、p−ニトロフェニル活性エステル基、N−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、5−ノルボルネン−2、3−ジカルボキシイミド活性エステル基より選ばれる一種以上である請求項1ないし5いずれか1項に記載の医療用粒子。
- 前記第1繰り返しユニットは、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーに由来するものである請求項1ないし6いずれか1項に記載の医療用粒子。
- 前記粒子状の基材が、無機材料または樹脂材料で構成されている請求項1ないし8のいずれか記載の医療用粒子。
- 前記無機材料が、無機酸化物である請求項9に記載の医療用粒子。
- 前記無機酸化物が、酸化ケイ素である請求項10に記載の医療用粒子。
- 前記樹脂材料が、アクリル酸エステル樹脂である請求項9に記載の医療用粒子。
- 前記アクリル酸エステル樹脂が、ポリメタクリル酸メチル樹脂である請求項12記載の医療用粒子。
- 前記重合体が、前記第1繰り返しユニット、前記第2繰り返しユニット、および側鎖にシランカップリング剤を有するユニットからなり、前記基材にシランカップリング剤を介して結合されている請求項1ないし13いずれか1項に記載の医療用粒子。
- 遺伝子物質が、DNA、cDNA、オリゴDNA、RNA、またはmRNAの少なくとも一種から選ばれる請求項1ないし14いずれか1項に記載の医療用粒子。
- 請求項1ないし15いずれか1項に記載の医療用粒子上の遺伝子物質を介して、相補的遺伝子、または遺伝子結合性蛋白質を補足することを特徴とする、遺伝子の捕捉方法。
Priority Applications (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011151521A JP2013019713A (ja) | 2011-07-08 | 2011-07-08 | 遺伝子物質固定化医療用粒子および遺伝子物質の捕捉方法 |
Applications Claiming Priority (1)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
JP2011151521A JP2013019713A (ja) | 2011-07-08 | 2011-07-08 | 遺伝子物質固定化医療用粒子および遺伝子物質の捕捉方法 |
Publications (1)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2013019713A true JP2013019713A (ja) | 2013-01-31 |
Family
ID=47691300
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2011151521A Pending JP2013019713A (ja) | 2011-07-08 | 2011-07-08 | 遺伝子物質固定化医療用粒子および遺伝子物質の捕捉方法 |
Country Status (1)
Country | Link |
---|---|
JP (1) | JP2013019713A (ja) |
Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006123737A1 (ja) * | 2005-05-19 | 2006-11-23 | Sumitomo Bakelite Company, Ltd. | 医療材料用高分子化合物及び該高分子化合物を用いたバイオチップ用基板 |
JP2007218824A (ja) * | 2006-02-20 | 2007-08-30 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | バイオアッセイ用基材 |
JP2009148243A (ja) * | 2007-11-30 | 2009-07-09 | Wako Pure Chem Ind Ltd | smallRNAの取得用担体、取得方法及び取得用試薬 |
WO2009113158A1 (ja) * | 2008-03-11 | 2009-09-17 | 住友ベークライト株式会社 | 生理活性物質の固定化方法 |
US20110014473A1 (en) * | 2007-01-31 | 2011-01-20 | Ying Jackie Y | Polymer-coated nanoparticles |
-
2011
- 2011-07-08 JP JP2011151521A patent/JP2013019713A/ja active Pending
Patent Citations (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
WO2006123737A1 (ja) * | 2005-05-19 | 2006-11-23 | Sumitomo Bakelite Company, Ltd. | 医療材料用高分子化合物及び該高分子化合物を用いたバイオチップ用基板 |
JP2007218824A (ja) * | 2006-02-20 | 2007-08-30 | Sumitomo Bakelite Co Ltd | バイオアッセイ用基材 |
US20110014473A1 (en) * | 2007-01-31 | 2011-01-20 | Ying Jackie Y | Polymer-coated nanoparticles |
JP2009148243A (ja) * | 2007-11-30 | 2009-07-09 | Wako Pure Chem Ind Ltd | smallRNAの取得用担体、取得方法及び取得用試薬 |
WO2009113158A1 (ja) * | 2008-03-11 | 2009-09-17 | 住友ベークライト株式会社 | 生理活性物質の固定化方法 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US20170306072A1 (en) | Particles Containing Multi-Block Polymers | |
EP1858965B1 (en) | Polymer compound for biomedical use and biochip substrate using such a polymer compound | |
CN101044251A (zh) | 用于固定生物分子的粘合剂珠以及使用该粘合剂珠制造生物芯片的方法 | |
JP5866880B2 (ja) | 生理活性物質固定化用粒子、生理活性物質固定粒子及び糖親和性物質捕捉粒子 | |
JP5401989B2 (ja) | 医療用粒子、及び分析用粒子、並びにそれらの製造方法 | |
JP2003231648A (ja) | 生理活性物質担体用ポリマー粒子およびその製造方法 | |
JP6287847B2 (ja) | 分析用担体、その製造方法および使用方法 | |
CA2608792C (en) | High molecular compound for medical material, and biochip substrate using such high molecular compound | |
JP2010260877A (ja) | 有機ポリマー粒子およびプローブ結合粒子 | |
JP2006176720A (ja) | 医療材料用高分子化合物およびそれを用いた高分子溶液 | |
JP4811355B2 (ja) | バイオデバイスおよびその製造方法、並びにバイオセンサー | |
JP2008239874A (ja) | ビニルポリマー、ブロッキング剤、およびこれを用いたプローブ結合粒子の製造方法 | |
JP4376813B2 (ja) | バイオチップ用基板およびバイオチップ | |
JP2013019713A (ja) | 遺伝子物質固定化医療用粒子および遺伝子物質の捕捉方法 | |
JP4882408B2 (ja) | バイオアッセイ用基材 | |
JP5614179B2 (ja) | 医療材料用高分子化合物および該高分子化合物を用いたバイオチップ用基板 | |
JP2007279028A (ja) | 孔を有する生体物質構造体及びその製造方法、並びに、それを用いた生体物質担持体、対象物質の精製方法、アフィニティークロマトグラフィー用容器、分離用チップ、対象物質の解析方法、対象物質の解析用分離装置、及びセンサーチップ | |
JP4534818B2 (ja) | バイオマテリアル用高分子化合物およびそれを用いた高分子溶液 | |
JP2008001794A (ja) | 医療材料用高分子化合物および該高分子化合物を用いた医療材料 | |
JP6028488B2 (ja) | 分析用担体、その製造方法および使用方法 | |
JP2016180716A (ja) | アフィニティビーズ | |
JP2012093290A (ja) | 医療用粒子および生理活性物質の捕捉方法 | |
JP5217437B2 (ja) | 医療用粒子及びその製造方法 | |
US20160369123A1 (en) | Coating agent composition and utilization of same | |
JP2009118773A (ja) | 核酸分析法 |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20140526 |
|
A977 | Report on retrieval |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A971007 Effective date: 20141203 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150203 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20150327 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20150818 |
|
A02 | Decision of refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A02 Effective date: 20160112 |