JP2009118773A - 核酸分析法 - Google Patents

Abstract

【課題】操作が簡便で、迅速に多検体処理可能な核酸の精製方法及びＲＴ-ＰＣＲを実施する方法を提供すること。
【解決手段】核酸を分析する方法であって、核となる粒子の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該粒子と生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーを含む重合性成分を混合し、次いで重合反応を進行させることにより、該粒子表面に高分子化合物を含む層を形成し、次いで高分子化合物を含む層の前記生理活性物質を固定化する官能基を介して核酸プライマーを固定化した分析用粒子を有する反応空間において、標的核酸を含むサンプル溶液を反応空間に移し、標的核酸を固定化核酸プライマーによってハイブリダイズさせるステップ、緩衝液を用いて増幅反応を反応空間で行うステップ、及び目的増幅産物を検出するステップを含む核酸分析法。
【選択図】 なし

Description

本発明は、核酸を分析するための核酸分析法に関する。

核酸を分析する際に使用される増幅反応の内、ＲＴ-ＰＣＲ法は、逆転写酵素(Reverse Transcriptase)を用いてＲＮＡを相補的なＤＮＡ(ｃＤＮＡ)に転換した後に、ＰＣＲ法でｃＤＮＡを増幅する方法であり、微量のＲＮＡでも定量的に解析できるため、今日最も検出感度の高い解析法の1つとして、ＲＮＡを遺伝子として保有しているウイルスの検出、ｍＲＮＡの定量的検出や塩基配列決定による発現遺伝子の解析、さらにはｃＤＮＡのクローニングによる発現産物の解析および生産等には欠かせないものになっている。この方法は診断的分子病理学を含む種々の分野で極めて有用な技術である。

しかし、ＲＴ-ＰＣＲ法は細胞収集、生体サンプルからＲＮＡ抽出と精製、逆転写反応、ＰＣＲ及び遺伝子検出など操作が非常に煩雑で、各工程におけるサンプルロスやコンタミネーションなどの問題点を有し、安定した遺伝子発現レベルの定量を行うには研究者の技術の熟練を要するのが現状である。とくに、完全なＲＮＡ分子の精製はＲＴ-ＰＣＲの成功を決定する第一のステップであり、これには細胞及び組織中のリボヌクレアーゼを除去または不活性化するための作業が要求される。

これらの問題を解決するため、自動ＲＮＡ抽出装置、ｍＲＮＡ精製キット及びワンステップＲＴ-ＰＣＲ試薬キット等の製品開発が盛んに行なわれている。例えば、イオン交換樹脂、ガラスフィルター、ガラスビーズあるいはタンパク凝集作用を有する試薬等が使用されている。しかし、いかなる製品を用いても時間の懸かる困難な処理操作ステップが要求される。

担体表面上にオリゴｄＴを固定化し、ｍＲＮＡが持つポリＡさをハイブリダイゼーションにより捕捉し、精製を目的とする手法が一般的に用いられている。さらに、固相表面上で逆転写反応及びＰＣＲ反応を行うことで開発された(非特許文献１)。しかし、担体に対する非特異的吸着性のため、RNA分解酵素の失活に用いられるタンパク質分解酵素やカオトロピック剤のコンタミネーション、逆転写酵素、ＤＮＡ合成酵素の失活が問題となって十分な性能を得ていない。

Takashi Ishikawa et al. "Construction of cDNA bank from biopsy specimens for multiple gene analysis of cancer" ，Clinical Chemistry，1997，Vol．43，No.5，764

本発明の目的は、操作が簡便で、迅速に多検体処理可能な核酸の精製方法及びＲＴ-ＰＣＲを実施する方法である。

本発明者らは、ＲＮＡ抽出及びＲＴ-ＰＣＲを行う際に非特異的吸着性の表面を有する粒子を用いることで本発明の完成に至った。
本発明は、以下の通りである。
（１）核酸を分析する方法であって、核となる粒子の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該粒子と生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーを含む重合性成分を混合し、次いで重合反応を進行させることにより、該粒子表面に高分子化合物を含む層を形成し、次いで高分子化合物を含む層の前記生理活性物質を固定化する官能基を介して核酸プライマーを固定化した分析用粒子を有する反応空間において、
標的核酸を含むサンプル溶液を反応空間に移し、
標的核酸を固定化核酸プライマーによってハイブリダイズさせるステップ、
緩衝液を用いて増幅反応を反応空間で行うステップ、
及び目的増幅産物を検出するステップを含む核酸分析法。
（２）前記標的核酸を含むサンプル溶液が、標的細胞の細胞溶解物である（１）記載の核酸分析法。
（３）前記重合性成分において、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含む（１）又は（２）記載の核酸分析法。
（４）前記固定化核酸プライマーがオリゴｄＴである（１）〜（３）いずれか記載の核酸分析法。
（５）前記固定化核酸プライマーが標的核酸配列に相補的な塩基配列を有するものである（１）〜（３）いずれか記載の核酸分析法。
（６）目的増幅産物を検出するステップにおいて、増幅産物を、核酸染色を用いて蛍光測定的にまたは蛍光若しくは化学ルミネセンスを発生させることによって定量する（１）〜（５）いずれかに記載の核酸分析法。
（７）前記増幅反応が、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、ＩＣＡ、ＮＡＳＢＡ、ＴＲＣのいずれかである（１）〜（６）いずれか記載の核酸分析法。
（８）前記核酸がｍＲＮＡであり、前記増幅反応が逆転写反応―ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法である（１）〜（６）いずれか記載の核酸分析法。
（９）前記ＲＴ−ＰＣＲステップが、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応溶液または、ｒＴｔｈポリメラーゼを含む反応溶液を用いて反応空間で緩衝液の交換なしにまたは固定化核酸プライマーとハイブリダイズさせたｍＲＮＡの除去なしに行う液相ＲＴ−ＰＣＲである（８）記載の核酸分析法。
（１０）前記ＲＴ−ＰＣＲステップが、固定化核酸プライマーとのハイブリダイゼーションの後、捕捉したｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、反応物を除去後、ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行うＲＴ−ＰＣＲである（８）記載の核酸分析法。
（１１）更に、液相に逆転写反応用プライマーを含む逆転写反応液を接触させ、逆転写された液相ｃＤＮＡを作製するステップを含む（８）〜（１０）いずれか記載の核酸分析法。

本発明によれば、迅速に多検体処理可能な核酸の検出、特にＲＴ-ＰＣＲ法による検出が可能となる。

本発明は、核酸を分析する方法であって、核となる粒子の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該粒子と生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーを含む重合性成分を混合し、次いで重合反応を進行させることにより、該粒子表面に高分子化合物を含む層を形成し、次いで高分子化合物を含む層の前記生理活性物質を固定化する官能基を介して核酸プライマーを固定化した分析用粒子を有する反応空間において、標的核酸を含むサンプル溶液を反応空間に移し、標的核酸を固定化核酸プライマーによってハイブリダイズさせるステップ、緩衝液を用いて増幅反応を反応空間で行うステップ、及び目的増幅産物を検出するステップを含む核酸分析法である。

本発明に使用する分析用粒子は、生体成分から目的核酸を回収・精製し、分析するための粒子であり、核となる粒子の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該粒子と生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーを含む重合性成分を混合し、次いで重合反応を進行させることにより、該粒子表面に高分子化合物を含む層を形成し、次いで高分子化合物を含む層の前記生理活性物質を固定化する官能基を介して核酸プライマーを固定化した分析用粒子である。

重合性モノマーとしては、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含むことが好ましい。核となる粒子表面に形成される高分子化合物は、特定の生理活性物質を固定化する性質をしている。また、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーはタンパク質等の非特異的吸着を抑制する性質を有する。さらに、核となる粒子表面と共有結合を形成した重合性官能基、または連鎖移動基に高分子化合物を形成させるため、核となる粒子表面に高密度で該高分子化合物をグラフトさせることが可能である。このようにして得られたグラフト化粒子は、洗浄工程により該高分子化合物が流出してしまうことがない。

本発明に用いる核酸を固定化する官能基を有する重合性モノマーの官能基としては、化学的に活性な基、受容体基、リガンド基などがあるが、これらに限定されない。具体的な例としては、アルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基、ビオチン、チオール基、アミノ基、イソシアネート基、イソチオシアネート基、ヒドロキシル基、アクリレート基、マレイミド基、ヒドラジド基、アジド基、アミド基、スルホネート基、ストレプトアビジン、金属キレートなどがある。これらの中でも核酸に多く含まれるアミノ基との反応性の点からアルデヒド基、活性エステル基、エポキシ基、ビニルスルホン基が好ましく、なかでもモノマーの保存安定性の点から活性エステル基が最も好ましい。

本発明に使用する核酸を固定化する官能基を有する重合性モノマーとしては、特に構造を限定しないが、下記の一般式［１］で表される（メタ）アクリル基と活性エステル基が炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基の連鎖またはアルキル基を介して結合した化合物であることが好ましい。特に、アルキレングリコール残基の連鎖は、それ自体がタンパク質の非特異的吸着を抑制する性質を有している。このため、（メタ）アクリル基と活性エステル基がアルキレングリコール残基の連鎖を介して結合したモノマーは、生理活性物質を固定化する性質とタンパク質の非特異的吸着を抑制する性質とを併せ持つ。従ってこのようなモノマーの重合体は、たとえ単独の重合体であったとしても、少なくとも片側の末端に反応性官能基を有していれば、粒子表面に層を形成する高分子化合物として好適に用いることができる。

（式中R₁は水素原子またはメチル基を示し、Ｘは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基またはアルキレン基を示す。Ｗは活性エステル基を示す。ｐは１〜１００の整数を示す。ｐが２以上１００以下の整数である場合、繰り返されるＸは、それぞれ同一であっても、または異なる基の連鎖であってもよい。）

式［１］で、アルキレングリコール残基又はアルキレン基Ｘの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。Ｘの繰り返し数ｐは１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜９０の整数であり、最も好ましくは２〜８０の整数である。

本発明に使用する「活性エステル基」は、エステル基の片方の置換基に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応に対して活性化されたエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、例えば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。

このような活性エステル基としては、例えばｐ−ニトロフェニル活性エステル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基、フタル酸イミド活性エステル基、５−ノルボルネン−２、３−ジカルボキシイミド活性エステル基等が挙げられるが、中でもｐ−ニトロフェニル活性エステル基又はＮ−ヒドロキシスクシンイミド活性エステル基が好ましく、ｐ−ニトロフェニル活性エステル基が最も好ましい。

本発明に使用する生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーの高分子化合物中での組成比は特に制限されるものではないが、１〜９９．７ｍｏｌ％が好ましく、より好ましくは１〜８０ｍｏｌ％、最も好ましくは１〜７０ｍｏｌ％である。

本発明に使用する重合性成分には、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含むことが好ましい。構造は特に限定しないが、一般式［２］で表される（メタ）アクリル基と炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基Ｙの連鎖からなる化合物であることが好ましい。

（式中Ｒ_２は水素原子またはメチル基を示し、Ｒ_３は水素原子または炭素数１〜２０のアルキル基を示す。Ｙは炭素数１〜１０のアルキレングリコール残基を示し、ｑは１〜１００の整数を示す。ｑが２以上１００以下の整数の場合は、繰り返されるＹは、同一であっても、または異なるアルキレングリコール残基の連鎖であってもよい。）

式［２］中のアルキレングリコール残基Ｙの炭素数は１〜１０であり、好ましくは１〜６であり、より好ましくは２〜４であり、更に好ましくは２〜３であり、最も好ましくは２である。アルキレングリコール残基Ｙの繰り返し数ｑは、１〜１００の整数であり、より好ましくは２〜１００の整数であり、更に好ましくは２〜９５の整数であり、最も好ましくは２０〜９０の整数である。

アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーとしては、例えばメトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシエチル（メタ）アクリレート、２−ヒドロキシプロピル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、２−ヒドロキシブチル（メタ）アクリレート及びその水酸基の一置換エステル、グリセロールモノ（メタ）アクリレート、ポリプロピレングリコールを側鎖とする（メタ）アクリレート、２−メトキシエチル（メタ）アクリレート、２−エトキシエチル（メタ）アクリレート、メトキシジエチレングリコール（メタ）アクリレート、エトキシジエチレングリコール （メタ）アクリレート、エトキシポリエチレングリコール（メタ）アクリレート等が挙げられるが、目的とする生理活性物質以外の成分の非特異的吸着が少ないこと及び入手性からメトキシポリエチレングリコールメタクリレートまたはエトキシポリエチレングリコールメタクリレートが好ましい。

本発明において、核となる粒子表面に導入する重合性官能基としては、ビニル基、アリル基、メタクリル基、エポキシ基、スチレン基等が挙げられるが、重合性に優れている点でメタクリル基が好ましい。

本発明において、核となる粒子表面に導入する連鎖移動基としては、メルカプト基、アミノ基等が挙げられるが、反応性に優れている点でメルカプト基が好ましい。

粒子表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入する方法としては、特に限定されないが、重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤と核となる粒子表面の官能基との共有結合を形成させる方法が好ましい。

重合性官能基を有するシランカップリング剤としては、例えば、（３−メタクリロキシプロピル）ジメチルメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）ジエチルメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）ジメチルエトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）ジエチルエトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）メチルジメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）エチルジメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）メチルジエトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）エチルジエトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）トリメトキシシラン、（３−メタクリロキシプロピル）トリエトキシシラン等が挙げられるが、反応性、及び入手性の点から（３−メタクリロキシプロピル）トリメトキシシランや（３−メタクリロキシプロピル）トリエトキシシランが好ましい。これらのシランカップリング剤は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。

連鎖移動基を有するシランカップリング剤としては、例えば（３-メルカプトプロピル）トリメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）メチルジメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）ジメチルメトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）トリエトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）メチルジエトキシシラン、（３-メルカプトプロピル）ジメチルエトキシシラン、（メルカプトメチル）トリメトキシシラン、（メルカプトメチル）メチルジメトキシシラン、（メルカプトメチル）ジメチルメトキシシラン、（メルカプトメチル）トリエトキシシラン、（メルカプトメチル）メチルジエトキシシラン、（メルカプトメチル）ジメチルエトキシシランなどが挙げられるが、入手性から（３-メルカプトプロピル）トリメトキシシランや（３-メルカプトプロピル）トリエトキシシランが好ましい。これらのメルカプトシラン化合物は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。これらのシランカップリング剤は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。

重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤を用いて、重合性官能基、または連鎖移動基と核となる粒子表面の官能基との共有結合を形成させる方法は特に制限されるものではないが、例えば、ｐH２〜４の酸性水溶液に重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤を０．０１〜１．０ｍｏｌ／Ｌとなるように添加し、撹拌混合して加水分解した後、核となる粒子を投入して１０〜１００℃で５〜１８０分間撹拌し、次いで、２０〜１００℃に加熱して粒子を乾燥させて行う。核となる粒子と重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤の使用割合は特に制限されるものではないが、通常核となる粒子１ｇに対し、重合性官能基、または連鎖移動基を有するシランカップリング剤０．１〜１０ｍｍｏｌの割合で用いられる。酸性水溶液は特に限定されるものではないが、酢酸水溶液、塩酸水溶液等が用いられる。なかでも、取り扱いが比較的容易な酢酸水溶液が好ましい。

核となる粒子の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入した後に、該粒子と重合性モノマーを混合し、次いで重合反応を進行させる。この方法は特に限定されるものではないが、例えば重合性モノマー、及び重合開始剤を溶解した溶媒中に核となる粒子を投入し、撹拌下、０〜８０℃で１〜３０時間加熱することにより行われる。その後、核となる粒子は減圧下ろ過され、洗浄後乾燥される。

核となる粒子と重合性モノマー、及び重合開始剤の使用割合は特に制限されるものではないが、通常核となる粒子１ｇに対し、重合性モノマー０．１〜１０ｍｍｏｌ、重合開始剤０．０１〜１０ｍｍｏｌの割合で用いられる。

溶媒としてはそれぞれの重合性モノマーが溶解するものであればよく、例えば、メタノール、エタノール、イソプロパノール、ｎ−ブタノール、ｔ−ブチルアルコール、ｎ−ペンタノール等アルコール類、ベンゼン、トルエン、テトラヒドロフラン、ジオキサン、ジクロロメタン、クロロホルム、シクロヘキサノン、N，N−ジメチルホルムアミド、ジメチルスルホキシド、酢酸メチル、酢酸エチル、酢酸ブチル、メチルエチルケトン、メチルブチルケトン、エチレングリコールモノエチルエーテル、エチレングリコールモノメチルエーテル、エチレングリコールモノブチルエーテル等を挙げることができる。これらの溶媒は、単独または２種以上の組み合わせで用いられる。

重合開始剤としては特に限定されないが、例えば、２，２’−アゾビスイソブチルニトリル（以下「ＡＩＢＮ」という）、１，１’−アゾビス（シクロヘキサン−１ −カルボニトリル）等のアゾ化合物、過酸化ベンゾイル、過酸化ラウリル等の有機過酸化物等を挙げることができる。

本発明において、粒子表面に形成される高分子化合物の化学構造は、少なくとも生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーからなる（共）重合体であって、少なくとも片側の末端に反応性の官能基を有するものであれば、その結合方式がランダム、ブロック、グラフト等いずれの形態をなしていてもかまわない。

本発明に使用する核となる粒子の素材は、特に限定されるものではなく、有機物、無機物を問わず用いることができる。有機物の担体としては、アフィニティクロマトグラフィーの担体として用いられる、多孔性のアガロース粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ）、デキストラン粒子（商品名：Ｓｅｐｈａｄｅｘ）の他に、ポリアクリルアミドゲル（商品名：Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ｐ、バイオラッド社）、ポリスチレン、エチレン−無水マレイン酸共重合物、ポリメタクリル酸メチルなどからなる粒子などが使用できる。一方、無機物としては、無機酸化物が粒子自体の強度が高く、好ましい。中でも、酸化ケイ素が取り扱いやすく最も好ましい。また、粒子の大きさは何ら制限を受けるものではなく、目的・用途に合わせて適宜選択できる。このことは核となる粒子の大きさを選択すれば、いかなる大きさの粒子でも作製できることを意味している。この点は粒径の制御が困難な乳化重合や懸濁重合で粒子を作製する方法に比較して、大きな利点となっている。実際に粒子として用いる場合には、用途によっても異なるが、粒径が数ｎｍから１００μｍ程度のものが好ましい。

以上のように高分子化合物を含む層を表面に形成した粒子は、生理活性物質の固定化能力に優れた粒子である。高分子化合物を含む層の生理活性物質を固定化する官能基を介して、粒子と標的核酸の相補的な配列を有する核酸プライマーとを結合させることにより、標的核酸をハイブリダイゼーションにより捕捉可能な非特異的吸着を抑制する粒子を得ることができる。結合させる核酸プライマーの長さは、目的や用途に応じて任意に決定することができ、例えば５〜５０塩基とすることができる。

上記により得られる核酸プライマーが固定化された分析用粒子は、一般的な粒子担体表面に比べ、ポリマーの親水性基の効果により担体表面への非特異的吸着が抑制されている。このため、この粒子は細胞溶解液などの生体由来成分が混在する系から表面に固定化されたプライマーに相補的なＲＮＡ及びＤＮＡのみが捕捉される。その後、この粒子を洗浄することで捕捉されたＲＮＡ及びＤＮＡの精製を行うことができる。細胞溶解液として血液、血漿、血清、細胞破砕液、細胞培養液、組織溶解液、糞便溶解液等の溶液が挙げられる。また、食品原料、加工性食品等や、土壌、上下水道等からの溶液が挙げられる。一般的な粒子担体表面では非特異的吸着があるために、捕捉されたＲＮＡ及びＤＮＡ以外にも表面への吸着がおこり、十分に精製することができない。ゆえに、非特異的な吸着が定量検出に悪影響を与える。
また、上記ポリマーを構成する親水性基はタンパク質の非特異的な吸着を抑えるため、固層表面において酵素反応を阻害しない。この効果により、捕捉したｍＲＮＡを鋳型として逆転写反応を効率よく行うことができ、ｃＤＮＡを作製することができる。さらに、ｃＤＮＡを鋳型として定量的ＰＣＲ反応を行うことにより出発物質に含まれるｍＲＮＡを定量することができる。

一般的に有機溶媒による抽出方法や磁気ビーズによる精製などのＲＮＡの精製方法では、工程が煩雑であり熟練の作業者が行わなくてはならない。また、精製工程におけるｍＲＮＡのロスや、ＲＮａｓｅやサンプル輸送におけるコンタミネーションの危険があるので、出発物質として大量のサンプル量を必要とし、また精製効率のばらつきが大きいために、分光光度計による精製物ごとのＲＮＡ量の定量を行う必要がある。しかしながら、本方法は、細胞溶解液から簡便な作業によりｍＲＮＡ精製、逆転写反応、ＰＣＲ反応を同一の反応溶液中で行うことができるため、精製工程におけるｍＲＮＡのロスや、ＲＮａｓｅやサンプル輸送におけるコンタミネーションの危険が軽減される。その結果、少量の出発物質からＲＮＡの定量を行うことができる。

本発明において、核酸プライマーを固定化した分析用粒子を有する反応空間において、核酸を増幅させる。反応空間の形状については、マイクロチューブ、ＰＣＲ用及び定量的ＰＣＲ用のマイクロチューブ、また９６ウェル、３８４ウェル、１５３６ウェルマイクロタイタープレートなどを用いることができる。また、板状プラスチック表面を用いることができる。また、これらの担体に微細加工を施した微細流路内を用いることが出来る。特にＰＣＲ用及び定量的ＰＣＲ用のマイクロチューブは容器厚みが薄く、ＰＣＲ反応装置による反応温度コントロールの面で用いることが好ましい。

（粒子の作製）
《合成例１》
（ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（ＭＥＯＮＰ）の合成）
０．０１ｍｏｌのポリエチレングリコールモノメタクリレート（日本油脂株式会社製Ｂｌｅｎｍｅｒ ＰＥ−２００）を２０ｍLのクロロホルムに溶解させた後、−３０℃まで冷却した。−３０℃に保ちながらこの溶液に、予め作製しておいた０．０１ｍｏｌのｐ−ニトロフェニルクロロフォーメート（Ａｌｄｒｉｃｈ社製）と０．０１ｍｏｌのトリエチルアミン（和光純薬工業株式会社製）及びクロロホルム２０ｍLの均一溶液をゆっくりと滴下した。−３０℃にて１時間反応させた後、室温でさらに２時間溶液を撹拌した。その後反応液から塩をろ過により除去し、溶媒を留去してｐ−ニトロフェニルオキシカルボニル−ポリエチレングリコールメタクリレート（以下ＭＥＯＮＰと記載）粗体を得た。さらに、得られた粗体をシリカゲルカラムにて精製を行った。得られたモノマーを重クロロホルム溶媒中１Ｈ―ＮＭＲで測定し、エチレングリコール残基が４．５単位含まれていることを確認した。

《合成例２》（ポリマー修飾粒子の作製）
メタクリロキシプロピルトリメトキシシラン（信越化学工業株式会社製ＬＳ３３８０）７．４５ｇをｐH３．０の酢酸水溶液３９．３ｇに添加し、室温で１時間攪拌した。そこにシリカビーズ（平均粒径５μｍ、細孔径７０Å、富士シリシア化学株式会社製ＳＭＢ７０−５）５ｇを投入し８５℃で２時間攪拌した後、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、１００℃で１時間加熱した。その後、エタノールで分散させて、室温で１時間振とうし、遠心分離により上澄みを除去する操作を２回繰り返し、さらに、エタノールで分散させてボルテックスミキサーで攪拌し、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回繰り返した後乾燥させた。
数平均分子量Ｍｎ＝約４７５のポリエチレングリコールメチルエーテルメタクリレート（別名メトキシポリエチレングリコールメタクリレート、以下ＰＥＧＭＡ４７５と記載、Ａｌｄｒｉｃｈ社製）、合成例１で得られたＭＥＯＮＰを脱水エタノールに溶解させ、モノマー混合溶液を作製した。総モノマー濃度は０．２ｍｏｌ／Ｌ、それぞれのモル比はＰＥＧＭＡ４７５、ＭＥＯＮＰの順に８０：２０である。そこにＡＩＢＮを０．００４ｍｏｌ／Ｌになるように添加し、均一になるまで撹拌した。その後、上記のメタクリロキシプロピルトリメトキシシランで処理したシリカビーズ１ｇを投入し、アルゴンガス雰囲気下、６０℃で２２時間反応させた。次いで、吸引ろ過により反応溶液からシリカビーズを回収し、エタノールで分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回繰り返した後、吸引ろ過によりビーズを回収し、よく乾燥させた。

《合成例３》（アルデヒドビーズの作製）
シリカビーズ（平均粒径５μｍ、細孔径７０Å、富士シリシア化学株式会社製ＳＭＢ７０−５）５ｇに対しアミノアルキルシランとしてγ−アミノプロピルトリエトキシシランをメタノール中に５重量％の濃度で溶解させたものをアミノ基導入処理液として調製し、この溶液の中に２時間浸漬の後、粒子を溶液から取り出し、超純水中に浸漬し放置後基板を取り出し乾燥した。グルタルアルデヒドをＰＢＳ（−）中に２重量％の濃度で溶解させてグルタルアルデヒド溶液を調製し、アミノアルキルシラン処理を行った基板をグルタルアルデヒド溶液中に浸漬し、４時間放置した後、粒子を取り出して超純水中に浸漬し、洗浄乾燥した。これにより、表面にアルデヒド基を有するアルデヒド修飾粒子が得られた。

《プライマーの固定》
２．４Ｍのリン酸水素二カリウム（和光純薬製：１６４−０４２９５）水溶液中に下記表１に示す５’末端がアミノ基で修飾された配列１のオリゴDNAが１００ｎMになるように調製した。この溶液５００μリットルに対し、合成例２で得られたポリマー修飾粒子と合成例３で得られたアルデヒド修飾粒子をそれぞれ約１０ｍｇ入れ、３７℃で４時間攪拌し、オリゴDNAを固定化した。遠心分離後、上澄みを除去した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行い乾燥させた。次いで０．１ｍｏｌ／Ｌの２−アミノエタノール（溶媒：ｐＨ９．５、０．０５ｍｏｌ／ＬのＴｒｉｓ−ＨＣｌ緩衝液）で室温下、１時間処理し、未反応の官能基の不活性化を行った。遠心分離により上澄みを除去した後、リン酸緩衝液（ＰＢＳ）で分散させ、遠心分離により上澄みを除去する操作を５回行い乾燥させて、分析用粒子を得た。以下、ポリマー修飾分析粒子およびアルデヒド修飾分析粒子とする。

（HeLa細胞からｍＲＮＡの精製）
培養したＨｅＬａ細胞を数回洗浄後、遠心分離によりチューブにペレットを作製し、グアニジンなどのタンパク質変性剤とSDSなどの界面活性剤を含む細胞溶解液を加え、ピペッティング等によりよく攪拌し、ＨｅＬａ細胞の細胞溶解液を得た。チューブ中でポリマー修飾分析粒子とアルデヒド修飾分析粒子をそれぞれ１ｍｇに対して調製した細胞溶解液を５０μｌを分注し、室温で15分攪拌した。攪拌後、界面活性剤を含む緩衝液を２００μｌ分注、遠心を繰り返し2回洗浄した。
このとき、粒子表面上のｄＴプライマーによりポリＡを有するｍＲＮＡが捕捉・洗浄されており、細胞溶解液に含まれるｍＲＮＡ以外の生体由来物質を除去することができる。

（ｍＲＮＡから固相ｃＤＮＡの合成）
反応液として、Reverse Transcriptase M-MLV (Rnase H-)、５×Reverse Transcriptase M-MLV Buffer 、RNAse Inhibitor(Super)、２０ｍＭｄＴＴＰ、２０ｍＭｄＡＴＰ、２０ｍＭｄＧＴＰ、２０ｍＭｄＣＴＰ、ＤＥＰＣ処理水（treated water）を加えて調製した。この溶液をチューブ中で各粒子１ｍｇに対し５０μｌを分注し、４２℃で１５分以上インキュベートした。インキュベート後、遠心を溶液の除去を行った。
このとき、粒子表面に捕捉されたｍＲＮＡとプライマーによって逆転写反応がおこり、ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡが作製される。

（固相ｃＤＮＡからＰＣＲ反応）
反応液として、ExTaq HS（タカラバイオ製）、10×ExTaq Buffer、１０μM PCR Forwardプライマー、１０μM PCR Reverseプライマー、２０ｍMｄＴＴＰ、２０ｍＭｄＡＴＰ、２０ｍＭｄＧＴＰ、２０ｍＭｄＣＴＰ、ＤＥＰＣ処理水（treated water）を加えて調製したものをチューブ中で各粒子１ｍｇに対し、５０μｌを分注し、定量的PCRを行った。なお、Forwardプライマー、Reverseプライマーは人由来β Actin配列内から選択した。プライマーの配列について表２に示す。
反応後、粒子のPCR反応液を電気泳動によってPCR産物を確認した。

現在、試薬メーカー各社から逆転写反応用酵素類及びPCR反応用の酵素類が混合された１ステップ型のRT-PCR反応液が市販されている。この試薬を用いることによりｍＲＮＡから固相ｃＤＮＡの合成の工程と固相ｃＤＮＡからＰＣＲ反応及び定量的ＰＣＲの工程を同一反応溶液で行うことができる。

（1ステップ試薬によるＲＴ−ＰＣＲ反応）
反応液として、One Step SYBR PrimeScript RT-PCR Kit（タカラバイオ製）、１０μM PCR Forwardプライマー、１０μM PCR Reverseプライマー、ＤＥＰＣ処理水（treated water）を加えて調製したものをチューブ中で、ｍＲＮＡが捕捉された各粒子に対し５０μｌを分注し、定量的PCRを行った。なお、Forwardプライマー、Reverseプライマーは人由来βActin配列内から選択した。プライマーの配列について表２に示す。

1ステップ試薬によるＲＴ−ＰＣＲのテストを３回行い、各々のＰＣＲ産物について電気泳動を行った。電気泳動より得られるＰＣＲ産物のバンドの濃さの数値化を行った。アルデヒド修飾粒子を用いたテスト１でのＰＣＲ産物のバンドの濃さを１００として、表３に示す。この数値を比較することによりＰＣＲ反応によって得られた産物の量を知ることができる。数値が高いほど多くの産物を得ることができており、効率よくＰＣＲ反応がおきていることになる。

Claims (11)

1. 核酸を分析する方法であって、核となる粒子の表面に重合性官能基、または連鎖移動基を導入し、該粒子と生理活性物質を固定化する官能基を有する重合性モノマーを含む重合性成分を混合し、次いで重合反応を進行させることにより、該粒子表面に高分子化合物を含む層を形成し、次いで高分子化合物を含む層の前記生理活性物質を固定化する官能基を介して核酸プライマーを固定化した分析用粒子を有する反応空間において、
   標的核酸を含むサンプル溶液を反応空間に移し、
   標的核酸を固定化核酸プライマーによってハイブリダイズさせるステップ、
   緩衝液を用いて増幅反応を反応空間で行うステップ、
   及び目的増幅産物を検出するステップを含む核酸分析法。
2. 前記標的核酸を含むサンプル溶液が、標的細胞の細胞溶解物である請求項１記載の核酸分析法。
3. 前記重合性成分において、アルキレングリコール残基を有するエチレン系不飽和重合性モノマーを含む請求項１又は２記載の核酸分析法。
4. 前記固定化核酸プライマーがオリゴｄＴである請求項１〜３いずれか記載の核酸分析法。
5. 前記固定化核酸プライマーが標的核酸配列に相補的な塩基配列を有するものである請求項１〜３いずれか記載の核酸分析法。
6. 目的増幅産物を検出するステップにおいて、増幅産物を、核酸染色を用いて蛍光測定的にまたは蛍光若しくは化学ルミネセンスを発生させることによって定量する請求項１〜５いずれかに記載の核酸分析法。
7. 前記増幅反応が、ＰＣＲ、ＬＣＲ、ＳＤＡ、ＲＣＡ、ＴＭＡ、ＩＣＡ、ＮＡＳＢＡ、ＴＲＣのいずれかである請求項１〜６いずれか記載の核酸分析法。
8. 前記核酸がｍＲＮＡであり、前記増幅反応が逆転写反応―ポリメラーゼ連鎖反応（ＲＴ−ＰＣＲ）法である請求項１〜６いずれか記載の核酸分析法。
9. 前記ＲＴ−ＰＣＲステップが、逆転写酵素およびＤＮＡポリメラーゼを含む反応溶液または、ｒＴｔｈポリメラーゼを含む反応溶液を用いて反応空間で緩衝液の交換なしにまたは固定化核酸プライマーとハイブリダイズさせたｍＲＮＡの除去なしに行う液相ＲＴ−ＰＣＲである請求項８記載の核酸分析法。
10. 前記ＲＴ−ＰＣＲステップが、固定化核酸プライマーとのハイブリダイゼーションの後、捕捉したｍＲＮＡをｃＤＮＡに逆転写し、反応物を除去後、ＤＮＡポリメラーゼを用いてＰＣＲを行うＲＴ−ＰＣＲである請求項８記載の核酸分析法。
11. 更に、液相に逆転写反応用プライマーを含む逆転写反応液を接触させ、逆転写された液相ｃＤＮＡを作製するステップを含む請求項８〜１０いずれか記載の核酸分析法。