CN116446055A - 一种具有高密度反应位点的基底的制备方法及应用 - Google Patents

Abstract

本发明适用于生物活性芯片制备技术领域，提供了一种具有高密度反应位点的基底的制备方法及应用，制备方法包括以下步骤：预先清洗基片，将引发剂共价固定于基片表面，通过简单的表面引发原子转移自由基聚合来实现基片表面高密度分子刷膜的均匀构筑，通过活化反应赋予分子刷高密度生物活性位点。采用本公开的方法制备的生物活性芯片，降低了生产成本，提高了生物组分固定率并且表面均一性好、稳定性强、背景信号低、非特异性吸附少，提高了生物芯片检测的灵敏度和信息获取的均匀性。本公开的方法制备的生物芯片可进一步应用于可视化生物样本中多组学信息的捕获和检测。

Description

一种具有高密度反应位点的基底的制备方法及应用

技术领域

本发明属于生物活性芯片制备技术领域，尤其涉及一种具有高密度反应位点的基底的制备方法及应用。

背景技术

生物芯片技术作为一种新兴技术领域，取得了突飞猛进的发展。生物芯片是将大量探针分子集成于固相支持物上，实现对各种生物信息组分，如寡核苷酸、核酸、多肽、蛋白质、糖分子、细胞、组织等的高通量快速定量检测。生物芯片的发展有着广阔的经济、社会及科研前景，在生物医药、环境保护、农业、军事等各个领域有着广泛的用途，特别在核酸测序、基因检测、疾病诊断、药物筛选、疫苗研发等方面发挥着重大作用，这些无疑将会产生巨大的社会和经济效益。

特别地，生物活性基底表面探针修饰密度的提高，对有高灵敏需求的生物检测至关重要，例如在单细胞测序和空间转录组测序中可以有效提高检测到的基因数量，从而提升测序的灵敏度和准确性，提高组学信息获取的完整性。而基底是芯片的基础，生物芯片研制的关键环节是基片的制备。将探针固定在基片表面的方法分为物理吸附法和共价固定法。物理吸附法主要依赖带负电的探针分子与正电基团包被的玻片通过静电吸引或者疏水作用结合而固定。以核酸芯片为例，具有孔性网络结构的硝酸纤维素膜、尼龙膜等由于吸附性强、样品容量大，被较早地用于固定DNA，但是存在样点渗透和扩散现象，造成点密度低、背景信号强等缺点。并且这种通过非共价作用结合的分子较易脱离表面，所以共价键合的方法更具有优势。目前常用的共价修饰方法有氨基、醛基或异硫氰酸基修饰法等，这类方法制备的玻片通过共价作用将DNA分子稳定的固定于表面，然而目前仍然存在一些待优化的问题。首先，尽管共价固定法极大地提高了修饰密度，但是二维平面结构可容纳探针量仍然有限，经常存在探针固定率低、信号弱的问题。其次，基片表面修饰效率的差异会降低表面均一性，导致样点形态不规则、信号分布不均匀、低信噪比问题出现。最后，基片表面修饰的活性基团与探针分子特异性结合能力不强，会与反应体系中的其他物质进行非特异性反应，这会进一步地影响生物芯片的检测灵敏度和重现性。

上述传统技术的缺陷和局限性是亟待优化和解决的，这也是行业的共同诉求和普遍共识。因此，开发出一种拥有生物组分固定率高、信号强、表面均一性好、背景低、非特异性吸附少等特点的生物芯片基片以及具有普适性的制备方法是很有必要且十分迫切的。

发明内容

本发明实施例的目的在于提供一种具有高密度反应位点的基底的制备方法及应用，以解决背景技术中存在的缺陷。

本发明实施例是这样实现的，一种具有高密度反应位点的基底的制备方法，其特征在于，所述具有高密度反应位点的基底的制备方法包括如下步骤：

步骤1、将基片先后置于丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗；

步骤2、将步骤1得到的基片置于食人鱼溶液中加热至没有气泡产生，并用去离子水进行清洗，随后用氮气吹干，再置于氧气等离子体清洗机中处理；

步骤3、在称量瓶中将一定体积浓度的氨基硅烷偶联剂充分混合于脱水干燥的有机溶剂中，并将步骤2所得到的基片置于称量瓶的液面以下，随后盖紧瓶盖，将称量瓶置于密封干燥器中静置浸泡基片，随后取出基片，用有机溶剂冲洗，氮气干燥，得到表面氨基化的基片；

步骤4、将步骤3得到的基片浸泡于四氢呋喃、胺类溶剂和有机卤代烷引发剂混合溶液中，并置于密封干燥器中，冰浴条件下反应30min后，在室温静置1h，随后取出基片，用四氢呋喃和去离子水进行超声清洗，氮气干燥，得到表面接枝引发剂的基片；

步骤5、将单体、极性溶剂、氮基配位剂、过渡金属催化剂按照50-100:400-600:3:1的摩尔比加入反应瓶中，同时加入质量分数1%-10%的步骤4中所用的有机卤化物引发剂，除氧后，将步骤4得到的基片悬挂于离反应瓶液面1-2cm以下处，将反应瓶置于恒温水浴40-70℃中，在保护气体氛围下进行反应，且反应过程中对反应液持续进行缓慢搅拌，反应结束后，撤除加热装置并加入乙醇使反应终止，随后从反应瓶中取约1ml反应液进行柱色谱纯化，再通过GPC测定分子量及分子量分布，然后取出反应后的基片，通过二氯甲烷对其进行超声清洗，除去物理吸附的聚合物质，氮气干燥，得到聚合物分子刷修饰的基片；

步骤6、在称量瓶中，将N,N'-碳酸二琥珀酰亚胺基溶解于吡啶中，并将步骤5得到的基片置于瓶中静置反应，随后取出基片，用吡啶、丙酮和去离子水依次清洗，并进行氮气干燥，获得具有高密度生物活性位点的聚合物分子刷。

作为本发明更进一步的方案，步骤1中所述基片材质包括硅片、石英片、玻璃片或者带有微纳结构的硅片、石英片、玻璃片等，例如微柱、微孔、微井结构等；此外基片可以是金片，具体地，在干净的石英基底蒸镀一层致密金膜，浸泡巯基引发剂后，继续进行步骤5和步骤6以及后续的实验操作。

作为本发明更进一步的方案，步骤2中所述的加热温度为80-150℃；所述的在氧气等离子体清洗机中的处理时间为3-5min。

作为本发明更进一步的方案，步骤3中所述的氨基硅烷偶联剂包括3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷或者其他类型的氨基硅烷偶联剂；所述氨基硅烷偶联剂的体积浓度在10%-50%之间，优选地，20%体积浓度效果较好；所述有机溶剂包含乙醇、异丙醇、丙酮、甲苯、己烷、四氢呋喃、N,N-二甲基甲酰胺或二甲基亚砜等可溶解氨基硅烷偶联剂的有机溶剂；所述溶剂脱水干燥方法包括干燥剂干燥法、蒸馏、精馏、膜分离等方法；所述浸泡时间为30-60min，优选地，45min效果较好。

作为本发明更进一步的方案，步骤4中所述的冰浴温度为-10-0℃；所述胺类溶剂包括但不限于异丁胺、乙二胺、正丙胺和三乙胺；所述引发剂包含任意一种α位上含有诱导共轭基团的卤代烷，例如α-卤代苯基化合物（如α-氯代苯乙烷、苄基氯等），α-卤代羰基化合物（如α-氯丙酸乙酯、α-溴代异丁酸乙酯等），α-卤代氰基化合物（如α-氯乙腈、α-氯丙腈等），多卤化物（四氯化碳、氯仿）等；所述室温温度为20-25℃。

作为本发明更进一步的方案，步骤5中所述单体包含羟甲基丙烯酸甲酯、甲基丙烯酸羟乙酯、甲基丙烯酸羟丙酯、丙烯酸羟乙酯、丙烯酸羟丙酯等可发生可控活性自由基聚合的单体；所述极性溶剂包括但不限于去离子水、甲醇、异丙醇、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜；所述氮基配位剂包括但不限于联二吡啶、多胺（如五甲基二乙烯三胺）、亚胺（如2-吡啶甲醛缩正丙胺）和氨基醚类化合物；所述过渡金属催化剂包括氯化亚铜、溴化亚铜、氯化铜和溴化铜其中的一种；所述反应瓶包含Schlenk瓶或者普通三颈瓶；所述除氧方式包括液氮冷冻-抽真空-解冻法，抽真空-充氮气法、氮气鼓泡除氧法以及其他脱气除氧装置。保护气体可以是（高纯）氮气或者氩气。无氧条件并非需严格控制，反应瓶中允许20%左右的氧气存在。

作为本发明更进一步的方案，步骤6中所述反应时间为1-24h；所述生物活性位点包括但不限于环氧基、琥珀酰亚胺酯基、醛基、羧基、巯基、马来酰亚胺和1,4-苯二异硫氰酸酯。

一种如上述任一所述的具有高密度反应位点的基底的制备方法在生物芯片基片的制备、组织切片的空间转录组学研究和生物组学测试和分析中的应用。

本发明实施例提供的一种具有高密度反应位点的基底的制备方法及应用，具有以下有益效果：

本发明制备过程简单，通过简单表面修饰即可制备出基于高密度反应位点的生物活性基底，全部操作无需复杂仪器设备，有效降低了芯片制备的成本。

本发明所制备的活性基底具有高密度生物分子反应位点，且该反应位点具有极高的活性，与生物分子的反应极易进行，显著提高了探针固定率和信号强度，保证了生物芯片信息获取的完整性。

本发明所制备的生物活性基底稳定性好，耐高温且常温可保存较长时间，一方面有利于产品化，另一方面有利于芯片生物信息的保存、检验和复查。

本发明所制备的聚合物分子刷有较好的均一性，并且几乎无非特异性吸附，保证了生物芯片检测的灵敏度和信息获取的均匀性。

本发明提供的芯片应用广泛，可扩展应用于基因组学、表观基因组学、蛋白质组学、代谢组学等。

附图说明

图1为本发明实施例提供的一种具有高密度反应位点的基底的制备方法示意图；

图2为本发明实施例提供的聚合物分子刷的原子力显微镜厚度表征图像；

图3为本发明实施例提供的基底表面修饰荧光标记的单链DNA序列的荧光显微镜图像，A为点样法修饰，B为微流控孔道法修饰；

图4为本发明实施例提供的利用微孔道正交进样法在聚合物分子刷修饰的微孔阵列玻片表面连接两段DNA后的荧光显微镜图像；

图5为本发明实施例提供的利用本发明制备的核酸芯片实施组织样本高通量空间转录组测序中的小鼠脑嗅球组织HE染色图；

图6为本发明实施例提供的利用本发明制备的核酸芯片实施组织样本高通量空间转录组测序中的cDNA扩增产物的浓度测定图；

图7为利用本发明制备的核酸芯片实施组织样本高通量空间转录组测序中的核酸文库分析图。

具体实施方式

为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合附图及实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

以下结合具体实施例对本发明的具体实现进行详细描述。

一种具有高密度反应位点的基底的制备方法，其特征在于，所述具有高密度反应位点的基底的制备方法包括如下步骤：

步骤1、将基片先后置于丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗；

步骤2、将步骤1得到的基片置于食人鱼溶液中加热至没有气泡产生，并用去离子水进行清洗，随后用氮气吹干，再置于氧气等离子体清洗机中处理；

步骤3、在称量瓶中将一定体积浓度的氨基硅烷偶联剂充分混合于脱水干燥的有机溶剂中，并将步骤2所得到的基片置于称量瓶的液面以下，随后盖紧瓶盖，将称量瓶置于密封干燥器中静置浸泡基片，随后取出基片，用有机溶剂冲洗，氮气干燥，得到表面氨基化的基片；

步骤4、将步骤3得到的基片浸泡于四氢呋喃、胺类溶剂和有机卤代烷引发剂混合溶液中，并置于密封干燥器中，冰浴条件下反应30min后，在室温静置1h，随后取出基片，用四氢呋喃和去离子水进行超声清洗，氮气干燥，得到表面接枝引发剂的基片；

步骤5、将单体、极性溶剂、氮基配位剂、过渡金属催化剂按照50-100:400-600:3:1的摩尔比加入反应瓶中，同时加入质量分数1%-10%的步骤4中所用的有机卤化物引发剂，除氧后，将步骤4得到的基片悬挂于离反应瓶液面1-2cm以下处，将反应瓶置于恒温水浴40-70℃中，在保护气体氛围下进行反应，且反应过程中对反应液持续进行缓慢搅拌，反应结束后，撤除加热装置并加入乙醇使反应终止，随后从反应瓶中取约1ml反应液进行柱色谱纯化，再通过GPC测定分子量及分子量分布，然后取出反应后的基片，通过二氯甲烷对其进行超声清洗，除去物理吸附的聚合物质，氮气干燥，得到聚合物分子刷修饰的基片；

步骤6、在称量瓶中，将N,N'-碳酸二琥珀酰亚胺基溶解于吡啶中，并将步骤5得到的基片置于瓶中静置反应，随后取出基片，用吡啶、丙酮和去离子水依次清洗，并进行氮气干燥，获得具有高密度生物活性位点的聚合物分子刷。

本发明的另一目的在于提供利用本发明的技术方案制备生物芯片的方法。

具体地，将弱碱性的生物探针分子溶液上样于利用本发明的技术方案制备的具有高密度反应位点的活性基片，将上样后的基片置于湿盒中室温孵育，然后将基片置于钝化液中浸泡30min，用弱碱性的盐溶液清洗基片，氮气干燥，得到具有高密度探针分子的生物芯片，该芯片可进一步地用于核酸连接反应或者抗原抗体特异性结合实验等生物探针分子的特异性反应。

可选地，所述上样方式包括手动点样、点样仪点样，或者用微流控孔道通入生物探针分子溶液，样点尺寸为10μm至7000μm，微孔道宽度为0.1μm至1000μm。

可选地，本公开的方法所述探针分子包含核酸序列、蛋白质、多肽、氨基酸等，以及其他伯氨基或者仲氨基修饰的探针分子。

可选地，所述弱碱性生物探针分子溶液pH范围在7-11，例如50-200mM磷酸盐溶液。

可选地，所述湿盒的湿度值保持在30%以上。

可选地，所述室温范围为10-90℃。

可选地，所述孵育时间为1h以上，优选地，大于8h效果较佳。

可选地，所述弱碱性盐溶液可以是pH 7.2-8.5的磷酸盐缓冲液。

可选地，所述钝化液包括20 mg/ml BSA，1 mM 三羟甲基氨基甲烷缓冲液(Tris-HCl)或15mM乙醇胺，0.1M Tris-HCl，根据探针分子类型的不同，可灵活选择:

所述核酸杂交实验，选用15mM乙醇胺，0.1M Tris-HCl为钝化液，将已孵育单链核酸探针的基片钝化30min后，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液冲洗， 4×SSC，1%SDS清洗5min，氮气干燥，在互补链的核酸溶液中进行杂交实验，37℃杂交1h，4×SSC,1%SDS清洗5min，氮气干燥。

所述抗原抗体特异性反应实验，选用20 mg/ml BSA，1 mM Tris-HCl为钝化液，将已孵育抗体（抗原）的基片钝化30min后，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液冲洗，室温下放入相应抗原（抗体）溶液中孵育1h，pH 7.4的磷酸盐清洗5min，氮气干燥。

本发明的另一目的在于提供利用本发明制备的核酸芯片实施组织样本高通量空间转录组测序的方法。

具体地，构建微孔阵列玻片，利用本公开所述方法在微孔阵列表面修饰高密度生物活性位点，借助微流控技术，将平行排布的微孔道对准于微孔阵列，在孔道中分别通入彼此不同且相互可以区分的第一核酸分子标识符，利用本公开所述方法将第一核酸分子标识符连接于微孔表面，然后将平行排布的微孔道以垂直于上述孔道方向的方向重新对准于微孔阵列，在孔道中分别通入彼此不同且相互可以区分的第二核酸分子标识符，第一核酸分子标识符和第二核酸分子标识符按照Watson-Crick碱基互补配对原则产生互补，经过延伸、扩增或连接等方式赋予每一微孔唯一核酸分子标识符。其中，所述的第一分子标识符可为核酸序列，即第一核酸分子标识符，该序列由5’至3’方向上包括：通用域、第一定位域、连接域。所述的第二分子标识符可为核酸序列，即第二核酸分子标识符，由3’至5’方向上包括：连接域互补区、第二定位域、分子标记、捕获域前体。随后将组织切片贴附于微孔阵列表面使组织样本内嵌于微孔中，对组织样本成像，添加组织透化液，微孔通过唯一核酸分子标识符的捕获域对限域在微孔中组织的mRNA进行捕获；将逆转录反应混合液孵育于微孔阵列中，对已捕获组学信息的杂交链进行延伸与合成，使被捕获的mRNA与唯一核酸分子标识符形成cDNA，随后对cDNA进行扩增和建库测序；接下来，根据第一定位域和第二定位域信息，将被分析的源于组织样本的转录组学信息按位置信息对应于组织样本的空间位点上，从而得到组织样本的空间转录组信息。

可选地，所述微孔阵列玻片的材质包含可以用于制备形貌结构的材料，例如，玻璃、硅、石英、聚合物。

可选地，所述微孔玻片的制备方法包括可以构建形貌结构的方法。例如，通过自下而上方法在玻片内部刻蚀出凹陷形貌或通过将多孔膜覆盖于玻片表面而形成凹陷形貌。

可选地，所述微孔容积范围为0.1fm3-1cm3。

可选地，所述的分子标识符的种类包含核酸序列、蛋白分子以及其他生物分子，其中，第一核酸分子标识符为5’端氨基修饰的单链核酸序列。本公开对核酸分子标识符的分析、检测同样适用于蛋白、多糖分子标识符。

可选地，本公开的方法中的组织样本可以是生物体的各种类型的组织样本。

可选地，本公开的方法包含将该方法用于细胞的组学分析，例如组织细胞和单细胞，包括将单细胞引入唯一核酸分子标识符修饰的微孔。

可选地，本公开的方法包含将该方法用于生物样本中组学信息的捕获和检测，例如用于捕获细胞、组织、病毒样本中DNA、mRNA、蛋白分子、tRNA、rRNA等。

可选地，本公开的方法中包含将本公开方法用于生物组学测试和分析，例如转录组学、基因组学、表观基因组学、蛋白质组学、代谢组学以及多组学联合分析。

实施例1：一种具有高密度反应位点的基底制备

如图1和图2所示：

将石英片置于丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗各5min，然后置于质量分数为98%浓硫酸和质量分数为30%过氧化氢的混合溶液（体积比为7：3）中100℃加热1h，取出石英片，去离子水超声清洗3次，氮气干燥。随后将基片浸泡于体积分数为20%的3-氨丙基三乙氧基硅烷的正己烷溶液中，室温反应45min，得到氨基化的基片。然后在冰浴条件下，将氨基化石英片浸泡于5mL四氢呋喃、5mL异丁胺和10μL α-氯丙酸乙酯的混合溶液中，冰浴条件下反应30min，室温静置1h，四氢呋喃和去离子水清洗，氮气干燥，得到引发剂修饰的石英片。接下来将引发剂修饰的石英片置于7mL羟甲基丙烯酸甲酯、5mL去离子水、78mg五甲基二乙烯三胺、50mg氯化亚铜的除氧溶液中，水浴45℃，搅拌反应2h, 得到羟甲基丙烯酸甲酯聚合物分子刷修饰的石英片。最后将分子刷修饰的石英片在N,N'-碳酸二琥珀酰亚胺基的吡啶反应液中反应12h, 取出基片，依次用吡啶、丙酮、去离子水超声清洗5min，氮气干燥，获得厚度为59nm的具有高密度生物活性位点的聚合物分子刷。

实施例2：核酸芯片的制备

如图3所示：

将5’端氨基修饰的DNA探针分子充分溶解于pH 7.4的磷酸盐溶液，用移液枪吸取1μL探针溶液，点样于利用本发明的技术方案制备的生物活性基片，将点样后的基片置于相对湿度为60%的湿盒中室温孵育8h，将已孵育单链核酸探针的基片在15mM乙醇胺，0.1MTris-HCl溶液中钝化30min后，用pH 7.4的磷酸盐缓冲液冲洗，4×SSC，1%SDS清洗5min，氮气干燥，得到了具有DNA探针分子的核酸芯片，然后将芯片放入FAM荧光素标记的互补链的DNA溶液中进行杂交，37℃杂交1h后，用4×SSC,1%SDS清洗5min，氮气干燥后，得到修饰有高密度杂交链的核酸芯片，用荧光显微镜拍摄荧光图像，如图3A所示，样点形态规则且荧光亮度均匀，说明聚合物刷表面均一性好，荧光亮度较强，表明成功修饰了高密度的核酸分子，并且点外没有荧光，证明无非特异性吸附。

此外，利用聚二甲基硅氧烷（PDMS）微孔道将探针溶液通入基片表面特定位置，例如，横向通5’端氨基修饰的DNA探针分子溶液，纵向通FAM荧光素标记的互补链的DNA溶液，从而得到有序排列的DNA微阵列芯片，如图3B所示。PDMS微孔道的制备方法为：将带有铬膜和光刻胶层的玻璃板置于平行排布的条形图案的掩膜版下，紫外灯曝光20s，再将基片置于0.5% NaOH显影液中浸泡30s，得到铬层上的光刻胶微孔道图案的玻璃表面；之后置于铬刻蚀液中浸泡3min，再将表面置于玻璃刻蚀液(质量比HF：HNO3：NH4 F：H2O＝25:24:10:450)中浸泡30min得到具有微孔道形貌结构的玻璃孔道模具；将玻璃孔道模具用氧气等离子体清洗机清洗2min，然后浸泡于0.1%三氯(1H,1H,2H,2H-十三氟正辛基)硅烷的丙酮溶液中10min，乙醇清洗后氮气干燥，将PDMS预聚体与固化剂按质量比10:1的比例混合均匀，真空脱气30min后，倾倒至所述的玻璃模具表面，置于温度为60℃的烘箱中，固化4h，将其揭起便得到了平行排布的PDMS微流体孔道，其孔道高度为10μm，宽度为40μm，孔道中心间距为80μm。

实施例3：连接有唯一核酸分子标识符微孔的制备

如图4所示：

将带有铬膜和光刻胶层的玻璃板置于透明微圆形阵列的掩膜版下紫外灯曝光10s，再将基片置于显影液中浸泡30s，得到旋有铬层的图案化光刻胶阵列玻片表面；之后置于铬刻蚀液中浸泡3min，再将玻片置于玻璃刻蚀液中浸泡80min得到含有10000个微孔的阵列玻片，其中微孔深度为20μm，直径为30μm，微孔中心间距为80μm。利用本公开所述方法在微孔阵列表面修饰高密度琥珀酰亚胺酯基的聚合物分子刷，借助微流控技术，将平行排布的100条微孔道对准于微孔阵列，在孔道中分别通入彼此不同且相互可以区分的第一核酸分子标识符，75%相对湿度过夜孵育，利用本公开所述方法钝化、清洗后，将平行排布的100条微孔道以垂直于上述孔道方向的方向重新对准于微孔阵列，在孔道中分别通入彼此不同且相互可以区分的第二核酸分子标识符。其中，第一核酸分子标识符，该序列由5’至3’方向上包括：通用域、第一定位域、连接域。第二核酸分子标识符，由3’至5’方向上包括：连接域互补区、第二定位域、分子标记、捕获域前体。第一核酸分子标识符的连接域和第二核酸分子标识符的连接域互补区按照Watson-Crick碱基互补配对原则产生互补，经过延伸、扩增赋予每一微孔唯一核酸分子标识符。

实施例4：组织样本的空间转录组测序

如图5、图6和图7所示：

将微孔阵列放置在冷冻切片机中预冷，并将OCT冻结的小鼠脑嗅球组织样本放置在微孔阵列上，切取厚度为10μm的组织切片。依次滴加苏木精染色液、返蓝染色液和伊红染色液覆盖切片样本，分别孵育5min，弃掉染色液并充分清洗微孔阵列。如图5所示，使用明场显微镜对染色的组织切片进行拍照。在微孔上滴加组织透化液(0.1％的胃蛋白酶，0.1M盐酸)，在37℃下孵育30min后移除液体，添加逆转录反应液(含有热启动的逆转录酶及相应缓冲体系、模板转换引物，模板转换引物)，在50℃下孵育1h后，移除逆转录反应液。在微孔阵列上滴加100mM KOH溶液，室温孵育3min后移除并加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液(10mMTris-HCl，pH＝8.5)，移除缓冲液，加入第二链合成反应液(含有Bst 2.0聚合酶及相应缓冲体系及相应引物，在65℃的条件下孵育30min后移除反应液，并加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液(10mM Tris-HCl，pH＝8.5)，再次移除缓冲液，加入100mM KOH溶液，室温孵育5min，然后将该溶液转移至无核酸酶污染的EP管中，加入三羟甲基氨基甲烷缓冲液(1M Tris-HCl，pH＝7.2)，4℃保存。将该混合物置于冰上，加入cDNA第二链扩增反应液(Taq酶、dNTP及相应缓冲体系)和引物，充分混合后，进行聚合酶链式反应，产物储存于-20℃条件下备用。采用商业化试剂盒将cDNA扩增产物纯化并进行cDNA扩增产物建库。使用自动化电泳系统测定核酸片段大小分布，使用NanoDrop测定核酸浓度。扩增后核酸文库的浓度和分布如图6所示。选用Novaseq对文库进行测序，对测序数据进行处理，将每个空间点的唯一核酸分子标识符阵列与组织切片的组织染色图像进行匹配，从而将核酸文库的测序数据在组织切片的空间位置进行可视化。结果表明可以在核酸文库分析结果中找到所有对应的核酸分子标识符信息，第一定位域、第二定位域及分子标记的序列信息正确，数据质量可以达到分析要求，数据分析结果表明每个微井反应室均能可以捕获到4000个基因以上。如图7所示，nFeature、nCount、mito统计数据质量较好，umap分群结果正确。

以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (8)

1.一种具有高密度反应位点的基底的制备方法及应用，其特征在于，所述具有高密度反应位点的基底的制备方法包括如下步骤：

步骤1、将基片先后置于丙酮、无水乙醇、去离子水中超声清洗；

步骤2、将步骤1得到的基片置于食人鱼溶液中加热至没有气泡产生，并用去离子水进行清洗，随后用氮气吹干，再置于氧气等离子体清洗机中处理；

步骤3、在称量瓶中将一定体积浓度的氨基硅烷偶联剂充分混合于脱水干燥的有机溶剂中，并将步骤2所得到的基片置于称量瓶的液面以下，随后盖紧瓶盖，将称量瓶置于密封干燥器中静置浸泡基片，随后取出基片，用有机溶剂冲洗，氮气干燥，得到表面氨基化的基片；

步骤4、将步骤3得到的基片浸泡于四氢呋喃、胺类溶剂和有机卤代烷引发剂混合溶液中，并置于密封干燥器中，冰浴条件下反应30min后，在室温静置1h，随后取出基片，用四氢呋喃和去离子水进行超声清洗，氮气干燥，得到表面接枝引发剂的基片；

步骤5、将单体、极性溶剂、氮基配位剂、过渡金属催化剂按照50-100:400-600:3:1的摩尔比加入反应瓶中，同时加入质量分数1%-10%的步骤4中所用的有机卤化物引发剂，除氧后，将步骤4得到的基片悬挂于离反应瓶液面1-2cm以下处，将反应瓶置于恒温水浴40-70℃中，在保护气体氛围下进行反应，且反应过程中对反应液持续进行缓慢搅拌，反应结束后，撤除加热装置并加入乙醇使反应终止，随后从反应瓶中取约1ml反应液进行柱色谱纯化，再通过GPC测定分子量及分子量分布，然后取出反应后的基片，通过二氯甲烷对其进行超声清洗，除去物理吸附的聚合物质，氮气干燥，得到聚合物分子刷修饰的基片；

步骤6、在称量瓶中，将N,N'-碳酸二琥珀酰亚胺基溶解于吡啶中，并将步骤5得到的基片置于瓶中静置反应，随后取出基片，用吡啶、丙酮和去离子水依次清洗，并进行氮气干燥，获得具有高密度生物活性位点的聚合物分子刷。

2.根据权利要求1所述的具有高密度反应位点的基底的制备方法，其特征在于，步骤1中所述的基片材质包括硅片、石英片、玻璃片和带有微纳结构的硅片、石英片、玻璃片，且基片可以是金片，具体地，在干净的石英基底蒸镀一层致密金膜，浸泡巯基引发剂后，继续进行后续步骤的实验操作。

3.根据权利要求1所述的具有高密度反应位点的基底的制备方法，其特征在于，步骤2中所述的加热温度为80-150℃；所述的在氧气等离子体清洗机中的处理时间为3-5min。

4.根据权利要求1所述的具有高密度反应位点的基底的制备方法，其特征在于，步骤3中所述的氨基硅烷偶联剂包括但不限于3-氨丙基三甲氧基硅烷、3-氨丙基三乙氧基硅烷；所述氨基硅烷偶联剂的体积浓度在10%-50%之间；所述有机溶剂包括但不限于乙醇、异丙醇、丙酮、甲苯、己烷、四氢呋喃和N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜；所述溶剂脱水干燥方法包括但不限于干燥剂干燥法、蒸馏、精馏和膜分离；所述浸泡时间为30-60min。

5.根据权利要求1所述的具有高密度反应位点的基底的制备方法，其特征在于，步骤4中所述的冰浴温度为-10-0℃；所述胺类溶剂包括但不限于异丁胺、乙二胺、正丙胺和三乙胺；所述引发剂包含任意一种α位上含有诱导共轭基团的卤代烷；所述室温温度为20-25℃。

6.根据权利要求1所述的具有高密度反应位点的基底的制备方法，其特征在于，步骤5中所述的单体包括可发生可控活性自由基聚合的单体；所述极性溶剂包括但不限于去离子水、甲醇、异丙醇、丙酮、N,N-二甲基甲酰胺和二甲基亚砜；所述氮基配位剂包括但不限于联二吡啶、多胺（如五甲基二乙烯三胺）、亚胺（如2-吡啶甲醛缩正丙胺）和氨基醚类化合物；所述过渡金属催化剂包括氯化亚铜、溴化亚铜、氯化铜和溴化铜其中的一种；所述除氧方式包括液氮冷冻-抽真空-解冻法，抽真空-充氮气法、氮气鼓泡除氧法以及其他脱气除氧装置；保护气体可以是（高纯）氮气或者氩气；其中无氧条件并非需严格控制，反应瓶中允许20%左右的氧气存在。

7.根据权利要求1所述的具有高密度反应位点的基底的制备方法，其特征在于，步骤6中所述反应时间为1-24h；所述生物活性位点包括但不限于环氧基、琥珀酰亚胺酯基、醛基、羧基、巯基、马来酰亚胺和1,4-苯二异硫氰酸酯。

8.一种如权利要求1-7任一所述的具有高密度反应位点的基底的其制备方法在生物芯片基片的制备、组织切片的空间转录组学研究和生物组学测试和分析中的应用。