JP2006322739A - 遺伝子の検出方法 - Google Patents

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健太郎 藤本
Toru Yakabe
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Abstract

【課題】操作が簡便で、可視領域で測定が可能な遺伝子の検出方法を提供すること。
【解決手段】ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体にDNA鎖を固定化させて、検出対象のDNA断片またはRNA断片をハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたDNA断片またはRNA断片に酵素を導入し、酵素の働きにより発色試薬を発色させ、発色の度合いにより検出対象のDNA断片又はRNAの断片の含有状況を判定する遺伝子の検出方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は、DNA鎖を所定の担体表面に固定化して、固定化したDNA鎖とハイブリダイズしたDNA断片又はRNA断片の有無および量を可視光領域で判定する遺伝子の検出方法に関するものである。
遺伝子の発現状況や、菌やウィルスの同定等遺伝子を用いた検出や診断が生化学の分野では、日常に行なわれている。従来遺伝子の検出には、電気泳動による方法が行なわれてきたが、近年になってDNAマイクロアレイにより複数の遺伝子を同時にみることが行なわれている。
従来からの電気泳動による方法では、PCRによる増幅反応や電気泳動時間等検出までに時間を要し、また電気泳動の操作に煩わしさがある。
また、マイクロアレイによる遺伝子検出においては、検出に高価な蛍光試薬を使用しなければならず、また検出にマイクロアレイ専用の高価な検出機を必要とし、使用も研究分野の一部の研究機関に限られ、臨床の検査分野や、食品検査等の分野ではなかなか使用されるまでいたっていない。
上記、問題を解決するために、可視による遺伝子の検出方法が、特許文献1に開示されている。本特許文献に記載されている方法は、LAMP法により遺伝子の増幅を行い、SYBR Green Iなどインターカレーターを用いて可視化を行うものであるが、本方法では、検出目的となる遺伝子の有無は判るが、検体中に存在する遺伝子の量の比較を行うことはできない。
特開2004−154008
本発明の目的は、操作が簡便で、可視領域における測定が可能な定量性のある、遺伝子の検出方法を提供することにある。
本発明者らは、表面に所定の高分子物質を有する担体を用いることにより、ハイブリダイズの効率が高くかつ高い酵素反応効率により、発色効率が高く、感度の高い可視化による検出が可能であることを見出し本発明の完成に至った。
本発明は、
(1)ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体を用いて、
(a)前記不溶性担体表面にDNA鎖を固定化させてDNA固定化担体を作製する工程、
(b)前記DNA固定化担体上に遺伝子のDNA断片またはRNA断片を含有する溶液を添加し、前記DNA鎖とハイブリダイズさせる工程、
(c)ハイブリダイズしたDNA断片またはRNA断片に酵素を標識する工程、
(d)発色基質を含有する溶液を添加し前記酵素の反応により発色基質を発色させる工程、
を含み、発色の度合いにより工程(b)における溶液中のDNA断片又はRNAの含有状況を判定することを特徴とする遺伝子の検出方法、
(2)工程(b)においてDNA断片又はRNA断片に予めビオチンが標識されていて、工程(c)において酵素標識されたアビジンを含む溶液を担体表面に接触させて、
DNA断片またはRNA断片に酵素を標識するものである(1)記載の遺伝子の検出方法、
(3)DNA断片またはRNA断片に標識される酵素が酸化又は還元酵素である(1)又は(2)記載の遺伝子の検出方法、
(4)標識される酵素が、ペルオキシダーゼ又はアルカリフォスファターゼである(1)〜(3)いずれか記載の遺伝子の検出方法、
(5)工程(a)においてDNA鎖が、前記担体表面のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、前記担体表面に固定化されるものである(1)〜(4)いずれか記載の遺伝子の検出方法、
(6)前記高分子物質が更にブチルメタクリレート基を含む第三単位を有するものである(1)〜(5)いずれか記載の遺伝子の検出方法、
(7)前記担体表面に前記高分子物質に加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を有する(1)〜(6)いずれか記載の遺伝子の検出方法、
(8)前記担体がプラスチック材料からなるものである(1)〜(7)いずれか記載の遺伝子の検出方法、
(9)発色した色素がDNA断片およびその近傍の担体表面に付着し、色素の付着の度合いを色の濃さとして測定することを特徴とする(1)〜(8)いずれか記載の遺伝子の検出方法、
(10)前記担体が板状をなし、板状表面に前記DNA鎖がスポット状に点着し固定されていることを特徴とする(9)記載の遺伝子の検出方法。
(11)発色の度合いを吸光により測定することを特徴とする(1)〜(8)いずれか記載の遺伝子の検出方法、
である。
本発明の検出方法によれば、電気泳動などの操作をすることなく簡便に、かつ、蛍光色素を用いることなく、可視領域で、特別な読み取り装置を用いることなく、遺伝子の検出が可能となる、さらに従来の遺伝子の有無の判定のみならず、定量することも可能となる。
本発明の遺伝子の検出方法は、ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合して活性化されたカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する担体に、DNA鎖を固定化させ、サンプル中のDNA断片またはRNA断片鎖をハイブリダイズさせ、ハイブリダイズしたDNA断片鎖またはRNA断片鎖に酵素標識を施し、酵素反応により発色基質を発色させ、可視領域によりサンプル中の検出対象となるDNAまたはRNA配列の有無の判定および定量を行うことを特徴とする。
以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
先ず、担体の表面にDNA鎖を固定させる。
ここで使用される担体に表面には、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質が存在するようになっている。
このホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質は、DNA鎖およびRNA鎖の非特異的吸着を抑制する性質とDNA鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるホスホリルコリン基は鋳型RNA断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はDNA鎖を化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プライマーは、前記このコーティング層の活性エステル基の部位で共有結合して、当該担体の表面に固定化される。
第一の単位は、たとえば、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、6−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の(メタ)アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基;
2−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および10−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の(メタ)アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基;
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基;
等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。
また、これらの基のうち、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第一単位が2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、担体表面におけるRNA断片の非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。
カルボン酸誘導体は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、C=Oを介して脱離基を有するカルボン酸である。カルボン酸誘導体は、具体的には、アルコキシル基よりも電子求引性の高い基がカルボニル基に結合して求核反応が活性化された化合物である。カルボン酸誘導基は、アミノ基、チオール基、水酸基等に対する反応性を有する化合物である。
活性化されたカルボン酸誘導体として、さらに具体的には、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、たとえば、p−ニトロフェニル基やN−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基;
―Cl、−F等のハロゲン;
等の基を有することができる。
また、カルボン酸誘導基は、下記式(1)に示される基とすることができる。
(ただし、上記式(1)において、Aは水酸基を除く脱離基である。)
上記式(1)に示される一価の基は、たとえば下記式(p)または式(q)から選択されるいずれかの基とすることができる。
(ただし、上記式(p)および式(q)において、R1およびR2は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式(p)において、R1はCとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式(q)において、R2はNとともに環を形成する二価の基であってもよい。)
上記式(p)に示される基として、たとえば下記式(r)、(s)、および(w)に示される基が挙げられる。また、上記式(q)に示される基として、たとえば下記式(u)に示される基が挙げられる。
上記式(1)に示される基は、たとえば下記式(r)、式(s)等に示される酸無水物由来の基;
下記式(t)に示される酸ハロゲン化物由来の基;
下記式(u)、式(w)に示される活性エステル由来の基;または
下記式(v)に示される活性化アミド由来の基とすることができる。
カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはpH7.0以上10.0以下、さらに具体的にはpH7.6以上9.0以下、さらにまた具体的にはpH8.0とすることができる。
また、本明細書において規定するところの「活性エステル基」は、その定義について厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。なお、ペプチド合成の分野においては、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、「ペプチド合成の基礎と実験」、1985年発行、丸善、に記載されているように、活性エステル法はアミノ酸またはペプチドのC末端を活性化する方法の一つとして用いられている。
実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、N−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。
ここでは、高分子物質中の活性化カルボン酸誘導体基が活性エステル基である場合を例に、説明する。活性エステル基としては、たとえばp−ニトロフェニル基、N−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5−ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられるが、たとえばp−ニトロフェニル基が好ましく用いられる。
表面にプライマーが固定化される担体の場合、第一単位と第二単位のさらに具体的な構成の組み合わせとして、たとえば、ホスホリルコリン基を含む第一単位が2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がp−ニトロフェニル基である構成とすることができる。
また、本実施形態の担体のコーティング層に使用される高分子物質は、ホスホリルコリン基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、この高分子物質の担体表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。
具体的には、高分子物質を、2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン(MPC)基を有する第一単量体と、p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート(NPMA)基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート(BMA)基を有する第三単量体との共重合体とすることができる。これらの共重合体であるpoly(MPC−co−BMA−co−NPMA)(PMBN)は、模式的に下記一般式(2)で示される。
2−メタクリロイルオキシホスホリルコリンおよびn−ブチルメタクリレートおよびp−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレートよりなる重合体ポリマー
ただし、上記一般式(2)において、a、b、およびcは、それぞれ独立して、正の整数である。また、上記一般式(2)において、第一〜第三単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。
上記一般式(2)で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、ハイブリダイズさせるDNA断片またはRNA断片の非特異吸着を抑制する性質と、DNA鎖を固定化する性質とのバランスとに、より一層優れた構成である。このため、このような共重合体を用いることにより、担体表面をより一層確実に高分子物質で被覆するとともに、高分子物質がコーティングされた担体上へのサンプルDNA又はRNA断片の非特異的吸着を抑制しつつ、DNA鎖をさらに確実に共有結合により固定化して担体上に導入することができる。
なお、上記一般式(2)で示される共重合体は、MPC、BMA、およびNPMAの各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一般式(2)で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、Ar等の不活性ガス雰囲気にて、30℃以上90℃以下の温度条件で溶液重合を行うことができる。
溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で8対2とした混合溶媒とすることができる。
また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル(AIBN)、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤;
過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、t−ブチルペルオキシネオデカノエート、t−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物;
などが用いられる。
さらに具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で8対2とした混合溶媒およびAIBNを用い、Ar中、60℃にて2〜6時間程度重合を行うことができる。
なお、本実施形態では、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有する例を説明したが、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を第一の高分子物質とし、これに加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位とブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含んでいてもよい。
なお、上記第一の高分子物質の第一単位と上記第二の高分子物質の第一単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、上記第一の高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を含むとき、この第一の高分子物質の第三単位と上記第二の高分子物質の第三単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。
このような第二の高分子物質は、鋳型DNA断片の非特異的吸着を抑制するポリマーとして用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が30モル%、ブチルメタクリレート基が70モル%の割合で含まれているものであるMPCポリマー(日本油脂社製)を用いることができる。
なお、高分子物質が上記第一の高分子物質、第二の高分子物質からなる場合、これらの高分子物質が混合されている構成とすることができる。各々の高分子物質のポリマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。
以上のような高分子物質からなるコーティング層を表面に含む担体は、所定の形状に加工された担体の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に担体を浸漬し、乾燥してもよい。
また、担体として、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス基板のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。
熱可塑性樹脂としては、ある程度耐熱性があれば特に制限はない、耐熱性のある樹脂としてたとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン;環状ポリオレフィン;含フッ素樹脂;
等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフィンは、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適であり、担体の材料として好ましく用いられる。
以上のような高分子物質を表面に含むプラスチック材料からなる担体は、所定の形状に加工された担体の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に担体を浸漬し、乾燥してもよい。
なお、担体の材料をプラスチックとした場合、形状は板状には限られず、96穴や384穴に代表されるマイクロタイタープレートの形状、スライドグラスに代表される基板状のもの、またビーズ状のもの、あるいはシート状のもの等特が上げられる。
次に、担体の表面へのDNA鎖の固定化方法について説明する。
例えば、(i)担体上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基とプライマーとを反応させて共有結合を形成させることにより、担体表面でプライマーを固定化し、続いて(ii)プライマーを固定化した以外の担体表面の活性エステル基を不活性化する、すなわち残りの活性エステル基を不活性化することにより、プライマーを担体の表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。
上記工程(i)において、担体形状が、基板状の場合は、DNA鎖を基板上に固定化する際には、DNA鎖を溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がDNAと反応して、DNAの間で共有結合が形成される。
このDNAを溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばpHが7.6以上とすることができる。
また、点着後、担体表面に固定化されなかったDNAを除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。
また、上記工程(ii)に示したように、洗浄後はDNAを固定化した以外のプラスチック担体表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。
アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。
一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、9−アミノアクアジン、アミノブタノール、4−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、5−アミノ2,3−ジヒドロー1,4−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、2−(2−アミノエチルアミノ)エタノール、リン酸二水素2−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、4−(2−アミノエチル)モルホリン、5-アミノフルオレセイン、6−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、p−アミノ馬尿酸、2−アミノ−2−ヒドロキシメチル−1,3−プロパンジオール、5−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、2−アミノオクタン、2−アミノオクタン酸、1−アミノ2−プロパノール、3−アミノ−1−プロパノール、3−アミノプロペン、3−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、11−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、4−アミノフタロニトリル、3−アミノフタルイミド、p−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
また、担体に固定化するDNA鎖は、塩基数が100以下のオリゴDNAを用いることが好ましいが、無修飾のオリゴDNAを用いても固定化が可能であり、さらには、アミノ基を導入しておくとオリゴDNAの固定化効率が高くなる。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基が導入されたオリゴDNAを用いることにより、効率よくかつ強固に担体の表面上にプライマーを固定化することができる。アミノ基の導入位置はDNA鎖の分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが、相補的なDNA断片またはRNA断片とのハイブリダイズをより一層効率よく行うことができるという観点からは、好ましい。
以上により、担体の表面上にDNA鎖が固定化されたアレイが得られる。
次に、担体の表面に固定化されたDNA鎖にハイブリダイズさせるDNA断片またはRNA断片を含むサンプル溶液を準備する。
以下、DNAサンプル溶液の調製例について記載する。
細胞中の遺伝子の発現状況をみる場合、細胞から全RNAを抽出し、RT−PCR法によりDNAを増幅しサンプル溶液とする。PCRによるDNA鎖の増幅の際、ビオチン標識を施した塩基を用いることにより、ビオチン標識したDNA鎖を得る。このビオチン標識されたDNA鎖を含む溶液をサンプル溶液とする。
次に、上記サンプル溶液を上記DNA鎖を固定化した担体表面に供給し、ハイブリダイゼーションを行う。これにより、担体表面に固定化されたDNA鎖と相補するサンプル溶液中のDNA鎖の一部がハイブリダイズする。ハイブリダイゼーション後、例えば0.1%SDS含有2XSSC溶液、0.2XSSC溶液、0.02XSSCに順に浸漬し洗浄を行ってハイブリダイゼーション作業を終了する。
本発明では、発色試薬を発色させる酵素を導入し、導入した酵素により発色基質を発色することを特徴とする。以下酵素導入から発色についての一例を記載する。
上記、ハイブリダイゼーション終了後、酵素を標識したアビジンを含む溶液を供給し、いわゆるビオチン−アビジン反応により、ハイブリダイズしたDNA断片に酵素が導入される。導入する酵素として発色試薬を発色させる酵素が選択され、発色試薬に何を用いるかによるが、ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼは、従来から発色試薬用酵素として使用されており、これらを用いることは、発色試薬の入手のしやすさを考慮すると好適である。
発色試薬としては、ウェスタンブロットなどのメンブレンの発色によく用いられるNBT/BICP発色試薬やELISAの分野での発色によく用いられるTMBZ、OPDなどを用いることができる。
発色試薬による発色の度合いは、ハイブリダイズしたDNA断片に導入された酵素量、すなわちDNA断片の量に応じたものとなる。NBT/BICP発色試薬は、ハイブリダイズしたDNA断片や固定化しておいたDNA鎖に付着し、DNA鎖を点着した部分が着色する。この着色像を目視で確認し、検出対象となる遺伝子の有無を確認できる。また、この着色像を画像スキャナーやCCDカメラにより取り込み、画像処理ソフト(例えばNIHイメージなど)で発色の度合いを数値化し、検出対象となる遺伝子量を比較することが出来る。
また、担体としてELISAに用いる96穴のマイクロタイタープレートを用いることによって、EKISAと同様にマイクロプレートリーダーにより吸光度による測定も可能である。また、近年、1μl程度の試料溶液で吸光度の測定が可能な分光吸光光度計も市販されており、担体に微細流路や微細ウェルを有するものを用いて吸光度を測定し、検出対象となる遺伝子量を比較することができる。
(PMBNコート基板の作製)
飽和環状ポリオレフィン樹脂(5−メチル−2ノルボルネンの開環重合体の水素添加物
、MFR(Melt flow rate):21g/10分、水素添加率:実質的に100%、熱変形
温度123℃)を用い、射出成形によりスライドガラス形状の基板を得た。この基板を2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体(poly(MPC−co−BMA−co−NPMA)(PMBN)、各基は、モル%で25:74:1)の0.5重量%エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、プラスチック基板(PMBNコート基板)を得た。
(アルデヒド基板の作製)
飽和環状ポリオレフィン樹脂(5−メチル−2ノルボルネンの開環重合体の水素添加物、MFR:21g/10分、水素添加率:実質的に100%、熱変形温度温度:123℃)を用い、射出成形によりスライドグラス状の基板を得た。この成形物に低温酸素プラズマ処理により表面に親水化処理を施した。次に、アミノアルキルシランとしてγ−アミノプロピルトリエトキシシランをメタノール中に5重量%の濃度で溶解させたものをアミノ基導入処理液として調製し、この溶液の中に2時間浸漬の後、基板を溶液から取り出し、超純水中に浸漬し放置後基板を取り出し乾燥した。グルタルアルデヒドをPBS(−)中に2重量%の濃度で溶解させてグルタルアルデヒド溶液を調製し、アミノアルキルシラン処理を行なった基板をグルタルアルデヒド溶液中に浸漬し、4時間放置した後、基板を取り出して超純水中に浸漬し、洗浄乾燥した。これにより、表面にアルデヒド基を有するアルデヒド基板を得た。
(基板へのDNAの固定)
配列ACTCCCGGATTGCGCのDNA鎖(15塩基)、配列AAACTCCCGGATTGCGCTCCのDNAプライマー(20塩基)、配列TGTAAACTCCCGGATTGCGCTCCCTのDNAプライマー(25塩基)を0.25M炭酸バッファ(pH9.0)を用いて溶解し、10μMのオリゴDNA溶液を調製した。この溶液をスポッタ(日立ソフトウェアーエンジニアリング製Marks-I)を用い、100μm径クロスカットピンでPNBNコート基板およびアルデヒド基板の表面上に、それぞれスポットした。オリゴDNAをスポットした各基板を、200μlの0.25Mリン酸バッファ(pH8.5)で内部を湿らせた密閉容器(10cm×15cm×3cm)中で一昼夜放置して、オリゴDNAを固定化させた。その後、各々の基板について、ブロッキング処理を施した。
(ハイブリダイゼーション)
DNA断片として、ビオチン標識した配列AAGGCGGGAGGGAGCGCAATCCGGGAGTTTACAAATGGACAAACTTCTAT 50塩基のDNA断片の濃度が0.2μMとなるように溶液を調製した。このDNA溶液を上記オリゴDNA固定化済み基板上に供給し、DNAマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション用チャンバーにより密閉状態とした。続いて、65℃3時間放置し、ハイブリダイゼーションを行い。0.1%SDS含有2XSSC溶液、0.2XSSC溶液、0.02XSSCに順に浸漬して洗浄を行った。
(発色反応)
上記ハイブリダイゼーションの後、ストレプトアビジンを標識したアルカリフォスファターゼを100mMリン酸buffer(pH7.0)にて希釈し、基板表面に展開し、37℃30分間
放置し、2XSSC溶液、0.2XSSC溶液、0.02XSSCに順に浸漬し洗浄を行った後、BCIP/NBT溶液(パーキンエルマーNEL937)を基板表面に供給し、30分間放置した後、0.2XSSCに浸漬し洗浄した。
アルデヒド基板ではDNA鎖の点着部分の着色は肉眼では殆ど観察できないが、PNBM基板では明確に点着部分への着色が観察できた。
基板のDNA鎖の点着部分の着色像をCCDカメラにより取り込み、取り込んだデジタルデータを画像処理ソフト(NIHイメージ)により処理し、着色度合いを数値化した。結果を表1に示す。
所定の高分子物質で表面処理したPNBM基板では、基板上でのハイブリダイズによるDNA断片が検出された一方で、この高分子物質による表面処理がなされていないアルデヒド基板ではハイブリダイズ効率が悪くまた酵素反応効率が悪く、発色基質の発色反応効率が悪くDNA断片の検出ができなかった。

Claims (11)

  1. ホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体を用いて、
    (a)前記不溶性担体表面にDNA鎖を固定化させてDNA固定化担体を作製する工程、
    (b)前記DNA固定化担体上に遺伝子のDNA断片またはRNA断片を含有する溶液を添加し、前記DNA鎖とハイブリダイズさせる工程、
    (c)ハイブリダイズしたDNA断片またはRNA断片に酵素を標識する工程、
    (d)発色基質を含有する溶液を添加し前記酵素の反応により発色基質を発色させる工程、を含み、発色の度合いにより工程(b)における溶液中のDNA断片又はRNAの含有状況を判定することを特徴とする遺伝子の検出方法。
  2. 工程(b)においてDNA断片又はRNA断片に予めビオチンが標識されていて、工程(c)において酵素標識されたアビジンを含む溶液を担体表面に接触させて、
    DNA断片またはRNA断片に酵素を標識するものである請求項1記載の遺伝子の検出方法。
  3. DNA断片またはRNA断片に標識される酵素が酸化又は還元酵素である請求項1又は2記載の遺伝子の検出方法。
  4. 標識される酵素が、ペルオキシダーゼ又はアルカリフォスファターゼである請求項1〜3いずれか記載の遺伝子の検出方法。
  5. 工程(a)においてDNA鎖が、前記担体表面のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、前記担体表面に固定化されるものである請求項1〜4いずれか記載の遺伝子の検出方法。
  6. 前記高分子物質が更にブチルメタクリレート基を含む第三単位を有するものである請求項1〜5いずれか記載の遺伝子の検出方法。
  7. 前記担体表面に前記高分子物質に加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を有する請求項1〜6いずれか記載の遺伝子の検出方法。
  8. 前記担体がプラスチック材料からなるものである請求項1〜7いずれか記載の遺伝子の検出方法。
  9. 発色した色素がDNA断片およびその近傍の担体表面に付着し、色素の付着の度合いを色の濃さとして測定することを特徴とする請求項1〜8いずれか記載の遺伝子の検出方法。
  10. 前記担体が板状をなし、板状表面に前記DNA鎖がスポット状に点着し固定されていることを特徴とする請求項9記載の遺伝子の検出方法。
  11. 発色の度合いを吸光により測定することを特徴とする請求項1〜8いずれか記載の遺伝子の検出方法。
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