JP2009011247A - 遺伝子の検出方法 - Google Patents

Abstract

【課題】操作が簡便かつハイスループットで、可視領域における測定が可能な、遺伝子の検出方法を提供すること。
【解決手段】リン酸エステルより誘導される基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する担体の表面に、（ａ）３’末端に２〜７塩基の反復部分と５’末端側に反復部分に連続する特異的な配列を有するＤＮＡプライマーで、反復回数が異なるＤＮＡプライマーの２種類以上が固定化された担体を作製する工程、（ｂ）検出する着目遺伝子のＤＮＡ断片と、ラベル化されたレポーターＤＮＡプライマー及びＤＮＡリガーゼを含む試料溶液を担体表面に接触させる工程、（ｃ）担体表面に固定化されているＤＮＡプライマーとレポーターＤＮＡプライマーを結合させる工程、（ｄ）結合したプライマーをレポーターＤＮＡプライマーのラベルによって検出する工程、を含む遺伝子の検出方法。
【選択図】 なし

Description

本発明は、プライマーＤＮＡ鎖を表面に固定化した担体を用いて、試料中の遺伝子を検出する遺伝子検出方法に関する。

マイクロサテライトは、最も短い反復単位が１〜５ヌクレオチドの長さである短い縦列反復を含むゲノムDNA領域である、様々な生物の遺伝子全体には反復ヌクレオチド配列が多く観察されている。ヒト遺伝子には何十万ものマイクロサテライトと呼ばれる遺伝子座が分散されており、統計的に、１００，０００塩基対ごとに約１回見出される。マイクロサテライトは遺伝的マッピング、医療診断および法医学的調査のための魅力的な遺伝子マーカとして研究が行われている。

このような多型マイクロサテライトを用いたゲノム多様性に関する大規模な研究は，疾患の治療と予防，創薬に役立つのみならず，学習， 記憶などの高次行動を始め， ヒトの遺伝子やゲノム機能など， 生物種としてのヒトの生命現象の分子レベルでの理解へと展開すると考えられている。

従来、マイクロサテライトの解析は、目的とするマイクロサテライトの位置をＰＣＲにより増幅し、その産物の大きさを電気泳動等によって検出を行っていた。しかしこの方法では、電気泳動にかかる時間が長くかかる上、専門的で煩雑な作業を行い、多検体の処理には適していないという問題点が挙げられる。

本発明の目的は、操作が簡便かつハイスループットで、可視領域における測定が可能な、遺伝子の検出方法を提供することにある。
本発明者らは、表面に所定の高分子物質を有する担体上でDNAの伸長反応を行う方法を用いることで本発明の完成に至った。

本発明は
（１）マイクロサテライトを有する遺伝子の検出方法であって、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する担体に、
（ａ）前記担体表面に３’末端に２〜７塩基の反復部分と５’末端側に反復部分に連続する特異的な配列を有するＤＮＡプライマーで、反復回数が異なるＤＮＡプライマーの２種類以上が５’末端側で固定化されたプライマー固定化担体を作製する工程、
（ｂ）検出する着目遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片と、ラベル化された５’末端側に２〜７塩基の反復部分と３’末端に隣接した配列を有するレポーターＤＮＡプライマー及びＤＮＡリガーゼを含む試料溶液を担体表面に接触させる工程、
（ｃ）前記試料溶液中のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を鋳型にして、担体表面に固定化されている前記ＤＮＡプライマー鎖とレポーターＤＮＡプライマーを結合させる工程、
（ｄ）結合したＤＮＡプライマー鎖とレポーターＤＮＡプライマーの結合をレポーターＤＮＡプライマーのラベルによって検出する工程
を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法、
（２）マイクロサテライトを有する遺伝子の検出方法であって、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する担体に、
（ａ）前記担体表面に３‘末端に２〜７塩基の反復部分と５’末端側に反復部分に連続する特異的な配列を有するＤＮＡプライマーで、反復回数が異なるＤＮＡプライマーの２種類以上が５’末端側で固定化されたプライマー固定化担体を作製する工程、
（ｂ）検出する着目遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片、ラベル化された５’末端側に２〜７塩基の反復部分と３’末端に隣接した配列を有するレポーターＤＮＡプライマーを含む試料溶液を担体表面に接触させる工程、
（ｃ）前記試料溶液を取り除き適当な緩衝液で洗浄を行った後、ＤＮＡリガーゼを含む緩衝液を接触させ、担体表面に固定化されている前記ＤＮＡプライマーとレポーターＤＮＡプライマーを結合させる工程、
（ｄ）結合したＤＮＡプライマー鎖とレポーターＤＮＡプライマーの結合をレポーターＤＮＡプライマーのラベルによって検出する工程、
を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法、
（３）上記（１）又は（２）に記載の遺伝子の検出方法において、
ＤＮＡリガーゼを含む調製物が少なくとも２種類以上のＤＮＡリガーゼを含むことを特徴とする遺伝子の検出方法、
（４）（１）〜（３）いずれかに記載の遺伝子の検出方法において、
前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とする遺伝子の検出方法、
（５）（１）〜（４）いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記ＤＮＡ伸長用プライマー鎖が、前記電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位の部位で共有結合していることを特徴とする遺伝子の検出方法、
（６）（１）〜（５）いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とする遺伝子の検出方法、
（７）（１）〜（６）いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記担体は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法、
（８）（１）〜（７）いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
前記担体が、プラスチック材料からなることを特徴とする遺伝子の検出方法、
（９）マイクロサテライトを分析するためのアレイであって、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する担体の表面に、
塩基配列において３’末端に２〜７塩基の反復部分と５’末端側に反復部分に連続する特異的な配列を有するＤＮＡプライマーで、反復回数が異なるＤＮＡプライマーの２種類以上が５’末端側で固定化されたアレイ、
（１０）前記担体の形態が、スライドガラス形状又はフィルム状又はマイクロタイタープレート状である（９）記載のアレイ、
（１１）前記担体の形態が、ビーズ形状である（９）記載のアレイ、
である。

本発明によれば、本発明は操作が簡便かつハイスループットで、可視領域における測定が可能な、遺伝子の検出方法を提供することができる。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
ここで使用される基体の表面には、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質が存在するようになっている。

このリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を含む第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを有する高分子物質は、ＤＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基は鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はプライマーを化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プライマーは、この高分子物質からなるコーティング層のカルボン酸誘導基の部位で共有結合して、当該担体の表面に固定化される。

第一の単位は、たとえば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；
２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基；
等の基を有し、ホスホリルコリン基がこれらの基中に含まれている構成とすることができる。

また、これらの基のうち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、担体表面における鋳型ＲＮＡ断片の非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。

カルボン酸誘導体は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。カルボン酸誘導体は、具体的には、アルコキシル基よりも電子求引性の高い基がカルボニル基に結合して求核反応が活性化された化合物である。カルボン酸誘導基は、アミノ基、チオール基、水酸基等に対する反応性を有する化合物である。

活性化されたカルボン酸誘導体として、さらに具体的には、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、たとえば、ｐ−ニトロフェニル基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；
―Ｃｌ、−Ｆ等のハロゲン；
等の基を有することができる。

また、カルボン酸誘導基は、下記式（１）に示される基とすることができる。

（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く脱離基である。）

上記式（１）に示される一価の基は、たとえば下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基とすることができる。

（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ¹およびＲ²は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ¹はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ²はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）

上記式（ｐ）に示される基として、たとえば下記式（ｒ）、（ｓ）、および（ｗ）に示される基が挙げられる。また、上記式（ｑ）に示される基として、たとえば下記式（ｕ）に示される基が挙げられる。

上記式（１）に示される基は、たとえば下記式（ｒ）、式（ｓ）等に示される酸無水物由来の基；
下記式（ｔ）に示される酸ハロゲン化物由来の基；
下記式（ｕ）、式（ｗ）に示される活性エステル由来の基；または
下記式（ｖ）に示される活性化アミド由来の基とすることができる。

カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらにまた具体的にはｐＨ８．０とすることができる。

また、本明細書において規定するところの「活性エステル基」は、その定義について厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。なお、ペプチド合成の分野においては、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、「ペプチド合成の基礎と実験」、１９８５年発行、丸善、に記載されているように、活性エステル法はアミノ酸またはペプチドのＣ末端を活性化する方法の一つとして用いられている。

実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。

ここでは、高分子物質中の活性化カルボン酸誘導体基が活性エステル基である場合を例に、説明する。活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5−ノルボルネン-2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられるが、たとえばｐ−ニトロフェニル基が好ましく用いられる。

表面にプライマーが固定化される担体の場合、第一単位と第二単位のさらに具体的な構成の組み合わせとして、たとえば、ホスホリルコリン基を含む第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基である構成とすることができる。

また、本実施形態の担体のコーティング層に使用される高分子物質は、ホスホリルコリン基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、この高分子物質の担体表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。

具体的には、高分子物質を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体とすることができる。これらの共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）は、模式的に下記一般式（２）で示される。

ただし、上記一般式（２）において、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。また、上記一般式（２）において、第一〜第三単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。

上記一般式（２）で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、鋳型ＲＮＡ断片の非特異吸着を抑制する性質と、プライマーを固定化する性質とのバランスとに、より一層優れた構成である。このため、このような共重合体を用いることにより、担体表面をより一層確実に高分子物質で被覆するとともに、高分子物質がコーティングされた担体上への鋳型ＲＮＡ断片の非特異的吸着を抑制しつつ、プライマーをさらに確実に共有結合により固定化して担体上に導入することができる。

なお、上記一般式（２）で示される共重合体は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡの各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一般式（２）で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行うことができる。

溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒とすることができる。

また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；
過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物；
などが用いられる。

さらに具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒およびＡＩＢＮを用い、Ａｒ中、６０℃にて２〜６時間程度重合を行うことができる。

なお、本実施形態では、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有する例を説明したが、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を第一の高分子物質とし、これに加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位とブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含んでいてもよい。

なお、上記第一の高分子物質の第一単位と上記第二の高分子物質の第一単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、上記第一の高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を含むとき、この第一の高分子物質の第三単位と上記第二の高分子物質の第三単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。

このような第二の高分子物質は、鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制するポリマーとして用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が３０モル％、ブチルメタクリレート基が７０モル％の割合で含まれているものであるＭＰＣポリマー（日本油脂社製）を用いることができる。

なお、高分子物質が上記第一の高分子物質、第二の高分子物質からなる場合、これらの高分子物質が混合されている構成とすることができる。各々の高分子物質のポリマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。

以上のような高分子物質からなるコーティング層を表面に含む担体は、所定の形状に加工された担体の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に担体を浸漬し、乾燥してもよい。

また、担体として、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス担体のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材料としては、表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。

熱可塑性樹脂としては、ある程度耐熱性があれば特に制限はない、耐熱性のある樹脂としてたとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；環状ポリオレフィン；含フッ素樹脂；
等を用いることができる。

次に、担体の表面へのＤＮＡプライマーの固定化方法について説明する。
例えば、（ｉ）担体上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基とプライマーとを反応させて共有結合を形成させることにより、担体表面でプライマーを固定化し、続いて（ｉｉ）プライマーを固定化した以外の担体表面の活性エステル基を不活性化する、すなわち残りの活性エステル基を不活性化することにより、プライマーを担体の表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。

上記工程（ｉ）において、担体形状が、担体状の場合は、鋳型ＲＮＡ断片とアニールするプライマーを担体上に固定化する際には、プライマーを溶解または分散した液体を接触させ、高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がプライマーと反応して、プライマーの間で共有結合が形成される。

このプライマーを溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。

また、点着後、担体表面に固定化されなかったプライマーを除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。

また、上記工程（ｉｉ）に示したように、洗浄後はプライマーを固定化した以外のプラスチック担体表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。

アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。

一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５-アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。

また、担体に固定化するプライマーには、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基が導入されたプライマーを用いることにより、効率よくかつ強固に担体の表面上にプライマーを固定化することができる。アミノ基の導入位置はプライマーの分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが、相補的な鋳型核酸断片とのアニーリングをより一層効率よく行うことができるという観点からは、好ましい。

以上により、表面上にプライマーが固定化された担体が得られる。また、担体の表面に設けられる反応空間としては、チューブ、ウェル、液体流路などＤＮＡ鎖の伸長反応を行うことができる反応空間を提供できれば、どのような形状であってもよい。
ＤＮＡプライマーは、３’末端に２〜７塩基の反復部分と５’末端側に反復部分に連続する特異的な配列を有するものであり、反復回数が異なるＤＮＡプライマーの２種類以上を担体に固定化する。

次に、担体の表面に固定化されたＤＮＡプライマーにアニールさせる着目遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を含むサンプルが導入される。更にラベル化された２〜７塩基の反復部分と隣接した配列を有するレポーターＤＮＡプライマー及びＤＮＡリガーゼを含む溶液を加える。又は、レポーターＤＮＡプライマーを加えた後、試料溶液を取り除き適当な緩衝液で洗浄を行った後、ＤＮＡリガーゼを含む溶液を加える。

この導入されたサンプルの反応系としては、担体表面に固定化されたプライマーと着目遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片とレポーターＤＮＡプライマーの３種のハイブリダイゼーションを行い、ＤＮＡリガーゼ等の酵素による固定化されたＤＮＡプライマーとレポーターＤＮＡプライマー間の結合反応を行う。

この反応系には、管理された温度を必要とし、ＤＮＡ鎖の熱変性温度（Ｍｅｌｔｉｎｇ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ：Ｔｍ）以上、例えば８０℃〜９５℃まで上昇させる。この熱変性処理により、自己相補鎖などで見られる折りたたみ構造を有するＤＮＡ断片、ＲＮＡ断片やプライマーが直鎖状の一本鎖になる。
続いて、反応系の温度を着目遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片とプライマーとの最適なハイブリダイゼーション温度にまで下降される。例えば４℃〜７５℃、好ましくは６０℃〜７５℃まで下降させる。このハイブリダイゼーション温度により、ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片の一部と相補的な配列を有するプライマーと、ＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片とがハイブリダイズして二本鎖になる。
このとき固定化されたプライマーおよびレポーターＤＮＡがＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片の配列に対し、隙間なくハイブリダイゼーションを行われた場合のみ、反応系中のＤＮＡリガーゼによりライゲーション反応が行われ、固定化されたプライマーとレポーターＤＮＡが結合される。

反応温度並びに時間は特に限定されるものでなく、ＤＮＡリガーゼなどの特性、鋳型ＤＮＡまたはＲＮＡの安定性・品質・絶対量に依存し、適宜、反応条件を設定すればよい

本発明では、結合されたレポーターＤＮＡに修飾されたラベルによって、結合位置を検出を行うことができる。例えばラベルとしてＣｙ３、Ｃｙ５などの蛍光分子を用いることにより、蛍光スキャナーや蛍光検出用のＣＣＤカメラなどで検出を行うことができる。

また、発色試薬によって発色させることにより可視化することができる。例えば、レポーターＤＮＡプライマーにビオチンを修飾し、後の工程で酵素標識をしたストレプトアビジン溶液を添加し、ビオチン‐アビジン反応により酵素を導入する方法を用いても良い。発色試薬を発色させる酵素としては、発色試薬に何を用いるかによるが、発色試薬は、
酸化または還元反応により発色するものが多いことから、酸化または還元酵素から選ばれることが好ましい。ペルオキシダーゼやアルカリフォスファターゼは、従来から発色試薬用酵素として使用されており、これらを用いることは、発色試薬の入手のしやすさを考慮すると好適である。

発色試薬としては、ウェスタンブロットなどのメンブレンの発色によく用いられるNBT/BICP発色試薬やELISAの分野での発色によく用いられるTMBZ、OPDなどを用いることができる。

発色試薬による発色の度合いは、伸展したプライマーＤＮＡ鎖に導入された酵素量、すなわち伸展されたプライマーＤＮＡ鎖の量に応じたものとなる。NBT/BICP発色試薬は、伸長したＤＮＡや固定化しておいたプライマーＤＮＡ鎖に付着し、プライマーを点着した部分が着色する。この着色像を目視で確認し、検出対象となる遺伝子の有無を確認できる。また、この着色像を画像スキャナーやCCDカメラにより取り込み、画像処理ソフト（例えば
NIHイメージなど）で発色の度合いを数値化し、検出対象となる遺伝子量を比較することが出来る。さらに、検出対象となる遺伝子を複数種のターゲット遺伝子について同担体表面上で複数種同時に検出を行うことができる。

また、担体としてELISAに用いる９６穴のマイクロタイタープレートを用いることによって、EKISAと同様にマイクロプレートリーダーにより吸光度による測定も可能である。また、近年、1μｌ程度の試料溶液で吸光度の測定が可能な分光吸光光度計も市販されており、
担体に微細流路や微細ウェルを有するものを用いて吸光度を測定し、検出対象となる遺伝子量を比較することができる

（PMBNコート基板の作製）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物
、ＭＦＲ（Melt flow rate）：２１ｇ/１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形
温度１２３℃）を用い、射出成形によりスライドガラス形状の基板を得た。この基板を２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（ｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）、各基は、モル％で２５：７４：１）の０．５重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入して、プラスチック基板（PMBNコート基板）を得た。

（アルデヒド基板の製造）
飽和環状ポリオレフィン樹脂（５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物、ＭＦＲ：２１ｇ／１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度温度：１２３℃）を用い、射出成形によりスライドグラス状の基板を得た。この成形物に低温酸素プラズマ処理により表面に親水化処理を施した。次に、アミノアルキルシランとしてγ−アミノプロピルトリエトキシシランをメタノール中に５重量％の濃度で溶解させたものをアミノ基導入処理液として調製し、この溶液の中に２時間浸漬の後、基板を溶液から取り出し、超純水中に浸漬し放置後基板を取り出し乾燥した。グルタルアルデヒドをＰＢＳ（−）中に２重量％の濃度で溶解させてグルタルアルデヒド溶液を調製し、アミノアルキルシラン処理を行なった基板をグルタルアルデヒド溶液中に浸漬し、４時間放置した後、基板を取り出して超純水中に浸漬し、洗浄乾燥した。これにより、表面にアルデヒド基を有するアルデヒド基板が得られた。

（プライマーの固定）
５’末端がアミノ基で修飾された、
プライマー１配列：GATGGATGGATAGATAGATAGATAのDNAプライマー（２４塩基、）（配列番号１）
プライマー２配列：GATGGATGGATAGATAGATAGATAGATAのDNAプライマー（２８塩基）（配列番号２）
プライマー３配列：GATGGATGGATAGATAGATAGATAGATAGATAのDNAプライマー（３２塩基）（配列番号３）
プライマー４配列：GATGGATGGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAのDNAプライマー（３６塩基）（配列番号４）
プライマー５配列：GATGGATGGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAのDNAプライマー（４０塩基）（配列番号５）
プライマー６配列：GATGGATGGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAのDNAプライマー（４４塩基）（配列番号６）
プライマー７配列：GATGGATGGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAのDNAプライマー（４８塩基）（配列番号７）
プライマー８配列：GATGGATGGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAGATAのDNAプライマー（５２塩基）（配列番号８）
を０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１０μＭのオリゴＴ溶液を調製した。この溶液をスポッタ（日立ソフトウェアーエンジニアリング製Marks-I）を用い、１００μｍ径クロスカットピンでPNBNコート基板、およびアルデヒド基板の表面上に、それぞれスポットした。オリゴＤＮＡをスポットした各基板を、２００μｌの０．２５Ｍリン酸バッファ（ｐＨ８．５）で内部を湿らせた密閉容器（１０ｃｍ×１５ｃｍ×３ｃｍ）中で一昼夜浸して、プライマーを固定化させた。その後、各々の基板について、ブロッキング処理を施した。

鋳型ＤＮＡ断片として、配列TGTGTGCGCATATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCTATCCATCCATC（配列番号９）の６２塩基の鋳型ＤＮＡ断片の濃度が１００ｐＭとなるように溶液を調製した。また、レポーターＤＮＡプライマーとして３‘末端がリン酸化、５‘末端がビオチン化修飾された配列GATAGATAGATAGATAGATATGCGCACACA（配列番号１０）の３０塩基のＤＮＡプライマーを濃度が１０ｎＭとなるように溶液を調製した。

（レポーターＤＮＡのライゲーション反応）
反応液として、耐熱性DNA ligase、１０×Ligase Buffer、鋳型ＤＮＡ断片、レポーターＤＮＡプライマーを加えて調製したものを上記プライマーを固定化した基板表面に供給し、ＤＮＡマイクロアレイ用ハイブリダイゼーション用チャンバーにより密閉状態とした。続いて９５℃５分で熱変性処理し、更に、ライゲース反応温度を６５℃１５分とした反応条件で行った。

上記伸長反応の後、反応液の除去および洗浄を行い、ストレプトアビジンを標識したアルカリフォスファターゼ溶液を基板表面に供給し、３７℃で３０分放置後、アルカリフォスファターゼ溶液を除去後、基板の洗浄を行い、続いてNBT/BICP溶液を供給し、
３７℃で３０分放置後、基板を洗浄した。アルデヒド基板ではプライマーの点着部分の着色は肉眼では殆ど観察できないが、PNBM基板では明確に点着部分への着色が観察できた。
基板のプライマー点着部分の着色像をCCDカメラにより取り込み、取り込んだデジタルデータを画像処理ソフト（NIHイメージ）により処理し、着色度合いを数値化した。結果を表１に示す。

所定の高分子物質で表面処理したＰＭＢＮ基板では、基板上でＤＮＡプライマーとレポーターＤＮＡプライマーが結合し、検出された一方で、この高分子物質による表面処理がなされていないアルデヒド基板ではＤＮＡプライマーとレポーターＤＮＡプライマーの結合反応は殆ど起こらず、検出できなかった。本実施例では、プライマー３において正しい検出が行われている。

Claims (11)

1. マイクロサテライトを有する遺伝子の検出方法であって、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する担体に、
   （ａ）前記担体表面に３’末端に２〜７塩基の反復部分と５’末端側に反復部分に連続する特異的な配列を有するＤＮＡプライマーで、反復回数が異なるＤＮＡプライマーの２種類以上が５’末端側で固定化されたプライマー固定化担体を作製する工程、
   （ｂ）検出する着目遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片と、ラベル化された５’末端側に２〜７塩基の反復部分と３’末端に隣接した配列を有するレポーターＤＮＡプライマー及びＤＮＡリガーゼを含む試料溶液を担体表面に接触させる工程、
   （ｃ）前記試料溶液中のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片を鋳型にして、担体表面に固定化されている前記ＤＮＡプライマーとレポーターＤＮＡプライマーを結合させる工程、
   （ｄ）結合したＤＮＡプライマーとレポーターＤＮＡプライマーをレポーターＤＮＡプライマーのラベルによって検出する工程
   を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法。
2. マイクロサテライトを有する遺伝子の検出方法であって、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する担体に、
   （ａ）前記担体表面に３‘末端に２〜７塩基の反復部分と５’末端側に反復部分に連続する特異的な配列を有するＤＮＡプライマーで、反復回数が異なるＤＮＡプライマーの２種類以上が５’末端側で固定化されたプライマー固定化担体を作製する工程、
   （ｂ）検出する着目遺伝子のＤＮＡ断片またはＲＮＡ断片、ラベル化された５’末端側に２〜７塩基の反復部分と３’末端に隣接した配列を有するレポーターＤＮＡプライマーを含む試料溶液を担体表面に接触させる工程、
   （ｃ）前記試料溶液を取り除き適当な緩衝液で洗浄を行った後、ＤＮＡリガーゼを含む緩衝液を接触させ、担体表面に固定化されている前記ＤＮＡプライマーとレポーターＤＮＡプライマーを結合させる工程、
   （ｄ）結合したＤＮＡプライマーとレポーターＤＮＡプライマーをレポーターＤＮＡプライマーのラベルによって検出する工程、
   を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法。
3. 請求項１又は２に記載の遺伝子の検出方法において、
   ＤＮＡリガーゼを含む調製物が少なくとも２種類以上のＤＮＡリガーゼを含むことを特徴とする遺伝子の検出方法。
4. 請求項１〜３いずれかに記載の遺伝子の検出方法において、
   前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基のいずれかであることを特徴とする遺伝子の検出方法。
5. 請求項１〜４いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
   前記ＤＮＡプライマーが、前記電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位の部位で共有結合していることを特徴とする遺伝子の検出方法。
6. 請求項１〜５いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
   前記高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有することを特徴とする遺伝子の検出方法。
7. 請求項１〜６いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
   前記担体は、前記高分子物質に加えて、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と、ブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含むことを特徴とする遺伝子の検出方法。
8. 請求項１〜７いずれか記載の遺伝子の検出方法において、
   前記担体が、プラスチック材料からなることを特徴とする遺伝子の検出方法。
9. マイクロサテライトを分析するためのアレイであって、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する担体の表面に、
   塩基配列において３’末端に２〜７塩基の反復部分と５’末端側に反復部分に連続する特異的な配列を有するＤＮＡプライマーで、反復回数が異なるＤＮＡプライマーの２種類以上が５’末端側で固定化されたアレイ。
10. 前記担体の形態が、スライドガラス形状又はフィルム状又はマイクロタイタープレート状である請求項９記載のアレイ。
11. 前記担体の形態が、ビーズ形状である請求項９記載のアレイ。