JP5155660B2

JP5155660B2 - ｃＤＮＡおよびＲＮＡ鎖の製造方法

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Publication number: JP5155660B2
Application number: JP2007530959A
Authority: JP
Inventors: 健司木下; 徹矢ヶ部; 健太郎藤本; 兼久横山; 一彦藤原
Original assignee: Sumitomo Bakelite Co Ltd
Current assignee: Sumitomo Bakelite Co Ltd
Priority date: 2005-08-19
Filing date: 2006-08-09
Publication date: 2013-03-06
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Also published as: EP1930422A1; US20100016566A1; EP1930422B1; WO2007020847A1; EP1930422A4; JPWO2007020847A1; US8822670B2

Description

本発明は、遺伝子の保存や分析に有用なポリヌクレオチド固定化担体、そのポリヌクレオチド固定化担体を用いるｃＤＮＡの製造方法、並びにｃＤＮＡを鋳型としたＤＮＡ鎖及びＲＮＡ鎖の製造方法に関する。

大部分の生物は、遺伝情報がＤＮＡの形で保存されている。このＤＮＡはメッセンジャーＲＮＡ（ｍＲＮＡ）に転写され、次いで、このｍＲＮＡはタンパク質に翻訳される。真核細胞においては、ゲノムＤＮＡが成熟ｍＲＮＡにプロセシングされるときに、通常、いくつかの遺伝情報の欠落が起こる。この欠落はイントロン／エキソン、すなわち、ＲＮＡスプライシングもしくはタンパク質のプロセシングによって起こる。したがって、タンパク質構造の遺伝的基礎的解析は、ゲノムＤＮＡよりもｍＲＮＡを使って研究するほうが有利である。
しかし、ｍＲＮＡは非常に不安定であり、種々のＲＮＡ分解酵素により、容易に分解を受ける。そこで、従来ｍＲＮＡをもとに合成したＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）が研究の材料に使われている。ｃＤＮＡはターゲットのｍＲＮＡを鋳型として、１本鎖ＤＮＡを生産できる逆転写酵素を用いつくられる。
ポリペプチドをコードする配列を含むｍＲＮＡ（すなわち、センスｍＲＮＡ）の転写に関与するベクターのプロモーターの利用に加えて、相補的ｃＤＮＡ鎖から転写されたアンチセンスｍＲＮＡをつくることもできる。アンチセンスｍＲＮＡは、タンパク質の生物学的機能や、その作用が未だ知られていないｍＲＮＡを理解する有用な道具である。アンチセンスＲＮＡ分子はターゲットｍＲＮＡと共にアニールさせ、翻訳を阻害することによって、特異的タンパク質の生産をブロックする。それため、この型の翻訳阻害は種々の病状に関連するいろいろな遺伝子産物の研究に重要であろうと思われる。
１本鎖ｃＤＮＡは、ＤＮＡポリメラーゼの触媒作用による２本鎖ｃＤＮＡの合成の基礎として使用されるほか、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション（以下、ＰＣＲという。）の鋳型として使用できる。この方法で、反対向きの複数のヌクレオチド・プライマーと熱安定性ＤＮＡポリメラーゼを用いて、特異的な遺伝子配列を迅速に増幅できる。アニーリングとＤＮＡ合成のサイクルを繰り返すことにより、ターゲット遺伝子のコピーが速やかにつくられる。こうして、センス１本鎖ｃＤＮＡは、それに対応する２本鎖ｃＤＮＡのセグメントを特異的に増幅させるため使われる。
液相法では、生じた２本鎖ｃＤＮＡは分子の方向を決定するマーカーが含まれていない。したがって、新しくつくられた２本鎖ｃＤＮＡクローンは、その５０％に転写方向の誤りがあると思われ、そのままではクローニング・ベクターへ挿入できない。それゆえ、ベクターへ正しい方向で挿入し、ｍＲＮＡを迅速にクローニングする方法が、望まれている。
１本鎖ｃＤＮＡあるいは２本鎖ｃＤＮＡは、固相を用いることによってもつくられる（非特許文献1）。固相法では、通常、多孔性ビーズに固定されたポリデオキシチミジル酸（ポリｄＴ）がｍＲＮＡのポリアデニル酸（ポリＡ）テイルと相補し結合する。次いで、アンチセンス１本鎖ｃＤＮＡが、結合されたｍＲＮＡから逆転写酵素によってつくられる。鋳型のＲＮＡが消化分解されたのち、第２のｃＤＮＡ鎖がＤＮＡポリメラーゼによって合成される。生じた２本鎖ｃＤＮＡは、ビーズに固定化されたアンチセンス鎖をもっている。
しかし固相法においては、２本鎖ｃＤＮＡ産物は不溶性担体から切り離すことができない。この問題を避けるためには、２本鎖ｃＤＮＡ産物を加熱し、担体に固定された２本鎖ｃＤＮＡから１本鎖ｃＤＮＡを遊離させ、この１本鎖ｃＤＮＡを用いて、２本鎖ｃＤＮＡがＰＣＲで合成される。しかし、これは反応にもう一つのステップが加わることを意味し、ＰＣＲ反応ごとに適当な一揃いのプライマーが必要となる。
それゆえ、単離されたｍＲＮＡから、結合型ではない２本鎖ｃＤＮＡクローンを創る単純な方法が要求されている。
また、ｃＤＮＡクローンからｍＲＮＡを合成できる種々の方法も知られており、その一つは液相法である（非特許文献２）。この方法においては、ＲＮＡプロモーターをもつベクターに２本鎖ｃＤＮＡが挿入される。ベクターは次いで、制限酵素で消化されて直鎖状となり、ＲＮＡポリメラーゼの作用でｍＲＮＡが合成される。合成されたｍＲＮＡは、鋳型ＤＮＡを除去するためＤＮａｓｅで処理される。必要ならばこのとき、新たに合成されたＲＮＡの末端に、ターミナル・トランスフェラーゼ及びｄＡＴＰを用いてポリアデニル酸テイルが付加される。
ｍＲＮＡの固相合成法もまた、よく知られている。その一つは、非特許文献３に書かれている。この方法では、ＤＮＡ配列が制限酵素によってバクテリオファージ・ラムダのゲノムから消化されて、粘着末端をもつランダムＤＮＡ断片が生じる。これをＴ４ＤＮＡポリメラーゼを用い、ビオチン化ｄＵＴＰによって粘着末端を満たし平滑化する。
Ｔ４ＤＮＡポリメラーゼによるＤＮＡ合成のあいだ、ビオチン化ｄＵＴＰがハイブリダイズするように、むき出しのｄＡヌクレオチドをもつ粘着末端が残るように、制限酵素が選ばれる。ランダム配列が次に、アビジンをもつアクリルアミド担体に固定化される。ｍＲＮＡが天然のラムダ・プロモーター配列をもつ配列から、Ｔ７ＲＮＡポリメラーゼ又はＳＰ６ＲＮＡポリメラーゼを用いて、合成される。この系は、バクテリオファージ・ラムダにおける転写の速度論的解析の研究のため設計されたものである。
ｍＲＮＡの液相及び固相合成法はいずれも、欠点を有している。液相合成法は、ＲＮＡプロモーター含有のベクターの使用が必要な上、挿入の後、ベクターは、直鎖状の配列に変換されなければならない。固相合成法は、いつも完全な遺伝情報を提供するとは限らない。なぜなら、この情報は固定化されたゲノムＤＮＡの情報であってｍＲＮＡの情報ではないからである。それゆえ、改良されたｍＲＮＡの合成方法が望まれている。
非特許文献４には、固相担体にアミノ結合を介して共有結合されたオリゴヌクレオチドは、ＰＣＲの実験に便利に使用できると記載されている。しかし、ここで記載されているテクニックは、ｃＤＮＡやＲＮＡの生産を特異的に提供するものではない。そのうえ、担体に共有結合されたオリゴヌクレオチドを除くメカニズムについては何ら提供されていない。

特許文献１には、固体担体上にオリゴヌクレオチドを固定し、RNAを鋳型にして固体表面上でｃＤＮＡを生成させる方法が開示されている。また、特許文献２には、担体上にRNAを固定し、逆転写酵素でｃDNAを製造する方法が開示されている。
しかしながら、固相表面と液相間での酵素を用いた、核酸鎖の伸長反応は起こりにくく、生成させたｃDNAが、鋳型となるｍRNAの発現状況を正確に反映したものか疑問が残る。

I．Raineriet al.、NucleicAcids Research, 19:4010, 1991 S. Shichijo et al., J. Neurosci. Res., 30:316-320, 1991 Hironori Terada（寺田博之）「固定化ＤＮＡによる転写の動的解析」（Biophysics（生物物理）、31:49-52、1991 Stamm et al., Nucleic Acids Res., 19:1350, 1991 特許公表平８−５００７２２特許公表２００３−５１９４８２

本発明の目的は、不溶性担体においてｍＲＮＡを鋳型にＤＮＡ鎖の伸長反応が効率よく行え、かつ鋳型ｍＲＮＡの発現状況を正確に反映したｃＤＮＡを製造する方法、及び製造したｃＤＮＡをもとにＲＮＡ鎖およびＤＮＡ鎖の製造が容易に行える方法を提供することである。

本発明は、
（１）２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、
（ａ）少なくとも一つの、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列を含むＤＮＡ伸長用ポリヌクレオチドを、前記不溶性担体に結合させる工程、
（ｂ）前記ＤＮＡ伸長用ポリヌクレオチドが固定化された担体に、ポリＡテイルをもつｍＲＮＡ含有試料溶液、逆転写酵素を含む溶液およびヌクレオチドモノマーを含む溶液を加える工程、
（ｃ）前記ｍＲＮＡのポリＡテイルと、ポリＡテイルに相補的な配列をハイブリダイズさせる工程、
（ｄ）前記ｍＲＮＡを鋳型として、ＤＮＡ伸長用ポリヌクレオチドを伸長させ、ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスｃＤＮＡを製造する工程、
を含み、
工程（ｃ）、（ｄ）を、同じ液相中で行行い、
前記高分子物質が、下記一般式（２）で表される共重合体であるｃＤＮＡ鎖の製造方法、

〔式中、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。〕
（２）工程（ｃ）、（ｄ）が、所定の温度でのインキュベートを含んでいる（１）記載のｃＤＮＡ鎖の製造方法、
（３）前記ヌクレオチドモノマーを含む溶液がｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含む（１）または（２）に記載のｃＤＮＡ鎖の製造方法、
（４）前記ＤＮＡ伸長用ポリヌクレオチドが、少なくとも一つのＲＮＡプロモーターを更に含む（１）〜（３）いずれか記載のｃＤＮＡ鎖の製造方法、
（５）（１）〜（４）いずれか記載のｃＤＮＡ鎖の製造方法により１本鎖ｃＤＮＡが固定化された担体を製造した後、液相を除去して得られる１本鎖ｃＤＮＡ固定化担体を使用して、前記担体上にセンス及びアンチセンスプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、及びヌクレオチドモノマーを含む溶液を接触させ、所定のヒートサイクルによりＰＣＲを行い、担体に固定化されている１本鎖ｃＤＮＡを鋳型にしてＤＮＡ鎖を伸長増幅することにより液相中にＤＮＡ鎖を製造することを特徴とするＤＮＡ鎖の製造方法、
（６）前記ヌクレオチドモノマーがｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含み、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰの内、少なくとも一つが標識されたものである（５）記載のＤＮＡ鎖の製造方法、
（７）（４）記載のｃＤＮＡ鎖の製造方法により１本鎖ｃＤＮＡが固定化された担体を製造した後、液相を除去して得られるＲＮＡプロモーターを付加的に含んでいる１本鎖ｃＤＮＡ固定化担体に、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ及びヌクレオチドモノマーを含む溶液を前記ｃＤＮＡ固定化担体表面に接触させ、２本鎖のｃＤＮＡを形成させる工程を含むＤＮＡ鎖の製造方法、
（８）前記ヌクレオチドモノマーがｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含み、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰの内、少なくとも一つが標識されたものである（７）のＤＮＡ鎖の製造方法、
（９）（７）記載のＤＮＡ鎖の製造方法により２本鎖ｃＤＮＡが固定化された担体を製造した後、液相を除去して得られるＲＮＡプロモーターを付加的に含んでいる２本鎖のｃＤＮＡ固定化担体に、ＲＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドモノマーを含む溶液を前記２本鎖ｃＤＮＡ固定化担体表面に接触させ、ＲＮＡ鎖を製造する工程を含む、センスＲＮＡ鎖の製造方法、
（１０）前記ヌクレオチドモノマーがＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰを含み、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰの内、少なくとも1つが標識されたものである（９）記載のセンスＲＮＡ鎖の製造方法、
である。

本発明によれば、担体上でＲＮＡを鋳型にＤＮＡ鎖の伸長反応が効率よく行え、ｍＲＮＡの発現状況を正確に反映したｃＤＮＡを生成し、ｃＤＮＡとして安定した保存が可能になり、さらに保存されたｃＤＮＡをもとにRNA鎖およびＤＮＡ鎖の製造が容易に行える、ｃＤＮＡの合成方法を提供することができる。

以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
（第１の実施形態）
本発明は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、（１）ＤＮＡ伸長用のポリヌクレオチドを固定化させてポリヌクレオチド固定化担体を形成する工程、（２）ＲＮＡ断片、ヌクレオチドモノマー、及び逆転写酵素又はポリメラーゼ活性を有する酵素を含む溶液を前記不溶性担体表面に接触させる工程、（３）溶液中の前記ＲＮＡ断片を鋳型にして担体表面に固定化されている前記ＤＮＡ伸長用のポリヌクレオチドを伸長させて１本鎖のｃＤＮＡを形成する工程、を含むことを特徴とするｃＤＮＡ鎖の製造方法を提供する。

まず、（１）不溶性担体の表面にプライマーとしてＤＮＡ伸長用のポリヌクレオチドを固定化させてポリヌクレオチド固定化担体を形成する。

ここで使用される担体の表面には、ホスホリルコリン基に代表されるリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質が存在するようになっている。

ホスホリルコリン基に代表されるリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質は、ＲＮＡ鎖の非特異的吸着を抑制する性質とＤＮＡ鎖を固定化する性質とを併せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるホスホリルコリン基に代表されるリン脂質の親水部を構成するリン酸エステル基は鋳型ＲＮＡ断片の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はプライマーを化学的に固定化する役割を果たす。すなわち、プライマーは、前記このコーティング層の活性エステル基の部位で共有結合して、当該担体の表面に固定化される。

第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルグリセロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基が挙げられ、特にホスホリルコリン基が好適であり。ホスホリルコリン基として、たとえば、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基、６−メタクリロイルオキシヘキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルキルホスホリルコリン基；
２−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および１０−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の（メタ）アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基；
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基；
等の基が挙げられる。

また、これらのホスホリルコリン基のうち、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンが好ましい。第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリンを有する構成とすることにより、担体表面における鋳型ＲＮＡ断片の非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。

なお、ここでは基本骨格として下記式（ａ）に示すホスホリルコリン基である例を挙げたが、このホスホリルコリンを下記式（ｂ）のホスホリルエタノールアミン基、下記式（ｃ）のホスホリルイノシトール基、下記式（ｄ）のホスホリルセリン基、下記式（ｅ）のホスホリルグリセロール基、下記式（ｆ）に示したホスファチジルホスホリルグリセロール基などのリン酸基に置き換えてもよい（以下についても同様）。

（化１）

カルボン酸誘導体は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、Ｃ＝Ｏを介して脱離基を有するカルボン酸である。カルボン酸誘導体は、具体的には、アルコキシル基よりも電子求引性の高い基がカルボニル基に結合して求核反応が活性化された化合物である。カルボン酸誘導基は、アミノ基、チオール基、水酸基等に対する反応性を有する化合物である。

活性化されたカルボン酸誘導体として、さらに具体的には、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性化アミドに変換された化合物が挙げられる。カルボン酸誘導基は、こうした化合物に由来する活性化された基であり、たとえば、ｐ−ニトロフェニル基やＮ−ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；
―Ｃｌ、−Ｆ等のハロゲン；
等の基を有することができる。

また、カルボン酸誘導基は、下記式（１）に示される基とすることができる。

（化２）

（ただし、上記式（１）において、Ａは水酸基を除く脱離基である。）
上記式（１）に示される一価の基は、たとえば下記式（ｐ）または式（ｑ）から選択されるいずれかの基とすることができる。

（化３）

（ただし、上記式（ｐ）および式（ｑ）において、Ｒ¹およびＲ²は、それぞれ独立して、一価の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記式（ｐ）において、Ｒ¹はＣとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式（ｑ）において、Ｒ²はＮとともに環を形成する二価の基であってもよい。）

上記式（ｐ）に示される基として、たとえば下記式（ｒ）、（ｓ）、および（ｗ）に示される基が挙げられる。また、上記式（ｑ）に示される基として、たとえば下記式（ｕ）に示される基が挙げられる。

上記式（１）に示される基は、たとえば下記式（ｒ）、式（ｓ）等に示される酸無水物由来の基；
下記式（ｔ）に示される酸ハロゲン化物由来の基；
下記式（ｕ）、式（ｗ）に示される活性エステル由来の基；または
下記式（ｖ）に示される活性化アミド由来の基とすることができる。

（化４）

カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ性の条件、具体的にはｐＨ７．０以上１０．０以下、さらに具体的にはｐＨ７．６以上９．０以下、さらにまた具体的にはｐＨ８．０とすることができる。

また、本明細書において規定するところの「活性エステル基」は、その定義について厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコール側に酸性度の高い電子求引性基を有して求核反応を活性化するエステル群、すなわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。なお、ペプチド合成の分野においては、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、「ペプチド合成の基礎と実験」、１９８５年発行、丸善、に記載されているように、活性エステル法はアミノ酸またはペプチドのＣ末端を活性化する方法の一つとして用いられている。

実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエステルよりも活性化されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フェノールエステル類、チオフェノールエステル類、Ｎ−ヒドロキシアミンエステル類、シアノメチルエステル、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活性を有する活性エステル基として知られている。

ここでは、高分子物質中の活性化カルボン酸誘導体基が活性エステル基である場合を例に、説明する。活性エステル基としては、たとえばｐ−ニトロフェニル基、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、5−ノルボルネン−２，３−ジカルボキシイミド基等が挙げられるが、たとえばｐ−ニトロフェニル基が好ましく用いられる。

表面にプライマーが固定化される担体の場合、第一単位と第二単位のさらに具体的な構成の組み合わせとして、たとえば、ホスホリルコリン基を含む第一単位が２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基がｐ−ニトロフェニル基である構成とすることができる。

また、本実施形態の担体のコーティング層に使用される高分子物質は、ホスホリルコリン基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む共重合体であることが好ましい。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、この高分子物質の担体表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。

具体的には、高分子物質を、２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン（ＭＰＣ）基を有する第一単量体と、ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート（ＮＰＭＡ）基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（ＢＭＡ）基を有する第三単量体との共重合体とすることができる。これらの共重合体であるｐｏｌｙ（ＭＰＣ−ｃｏ−ＢＭＡ−ｃｏ−ＮＰＭＡ）（ＰＭＢＮ）は、模式的に下記一般式（２）で示される。

（化５）

ただし、上記一般式（２）において、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。また、上記一般式（２）において、第一〜第三単量体がブロック共重合していてもよいし、これらの単量体がランダムに共重合していてもよい。

上記一般式（２）で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、鋳型ＲＮＡ断片の非特異吸着を抑制する性質と、プライマーを固定化する性質とのバランスとに、より一層優れた構成である。このため、このような共重合体を用いることにより、担体表面をより一層確実に高分子物質で被覆するとともに、高分子物質がコーティングされた担体上への鋳型ＲＮＡ断片の非特異的吸着を抑制しつつ、プライマーをさらに確実に共有結合により固定化して担体上に導入することができる。

なお、上記一般式（２）で示される共重合体は、ＭＰＣ、ＢＭＡ、およびＮＰＭＡの各単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一般式（２）で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、Ａｒ等の不活性ガス雰囲気にて、３０℃以上９０℃以下の温度条件で溶液重合を行うことができる。

溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール、イソプロパノール等のアルコールや、ジエチルエーテル等のエーテル、クロロホルム等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒とすることができる。

また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用されるものを用いることができる。たとえば、アゾビスイソブチロニトリル（ＡＩＢＮ）、アゾビスバレロニトリル等のアゾ系開始剤；
過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、ｔ−ブチルペルオキシネオデカノエート、ｔ−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物；
などが用いられる。

さらに具体的には、ジエチルエーテルとクロロホルムを体積比で８対２とした混合溶媒およびＡＩＢＮを用い、Ａｒ中、６０℃にて２〜６時間程度重合を行うことができる。

なお、本実施形態では、高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を有する例を説明したが、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を第一の高分子物質とし、これに加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位とブチルメタクリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を含んでいてもよい。

なお、上記第一の高分子物質の第一単位と上記第二の高分子物質の第一単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、上記第一の高分子物質がブチルメタクリレート基を含む第三単位を含むとき、この第一の高分子物質の第三単位と上記第二の高分子物質の第三単位とは同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。

このような第二の高分子物質は、鋳型ＤＮＡ断片の非特異的吸着を抑制するポリマーとして用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が３０モル％、ブチルメタクリレート基が７０モル％の割合で含まれているものであるＭＰＣポリマー（日本油脂社製）を用いることができる。

なお、高分子物質が上記第一の高分子物質、第二の高分子物質からなる場合、これらの高分子物質が混合されている構成とすることができる。各々の高分子物質のポリマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。

以上のような高分子物質からなるコーティング層を表面に含む担体は、所定の形状に加工された担体の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に担体を浸漬し、乾燥してもよい。

また、担体として、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対する柔軟性が確保される上に、ガラス担体のものに比べて安価で提供することができるという観点から好ましい。このようなプラスチック材料としては、１００℃以上のガラス転移点を有するものが好ましく、特に表面処理の容易性および量産性の観点から、熱可塑性樹脂を用いることができる。

熱可塑性樹脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることができる。蛍光発生量の少ない樹脂を用いることにより、ＤＮＡ鎖の検出反応におけるバックグランドを低下させることができるため、検出感度をさらに向上させることができる。蛍光発生量の少ない熱可塑性樹脂としては、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポリオレフィン；
環状ポリオレフィン；
含フッ素樹脂；
等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフィンは、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適であり、担体の材料として好ましく用いられる。

ここで、飽和環状ポリオレフィンとは、環状オレフィン構造を有する重合体単独または環状オレフィンとα−オレフィンとの共重合体を水素添加した飽和重合体を指す。前者の例としては、たとえばノルボルネン、ジシクロペンタジエン、テトラシクロドデセンに代表されるノルボルネン系モノマー、及び、これらのアルキル置換体を開環重合して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。後者の共重合体はエチレンやプロピレン、イソプロピレン、１−ブテン、３−メチル−１−ブテン、１−ペンテン、３−メチル−１−ペンテン、１−ヘキセン、１−オクテン等のα−オレフィンと環状オレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。これらの樹脂は単独で用いてもよく、２種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよい。また、環状オレフィン構造を有する単量体が開環重合して得られる飽和環状ポリオレフィンだけでなく、環状オレフィン構造を有する単量体の付加重合により得られる飽和環状ポリオレフィンを用いることもできる。

以上のような高分子物質を表面に含むプラスチック材料からなる担体は、所定の形状に加工された担体の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得られる。また、高分子物質を含む液体中に担体を浸漬し、乾燥してもよい。

なお、担体の材料をプラスチックとした場合、９６穴や３８４穴に代表されるマイクロタイタープレートの形状、スライドグラスに代表される基板状のもの、またビーズ状のもの、あるいはシート状のもの等への加工が容易であるが、液相での反応を含むにあたっては、９６穴や３８４穴に代表されるマイクロタイタープレートの形状のものが好適である。

ここで、不溶性担体に固定化するＤＮＡ伸長用ポリヌクレオチドは、プライマーとして用いられ、後述するように、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列を少なくとも一つ、および少なくとも一つのＲＮＡプロモーターを含んでいるものが好適に使用される。

次に、担体の表面へＤＮＡ伸長用ポリヌクレオチドを固定化する。以下、この固定化方法の一具体例について説明する。
（ｉ）担体上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基とポリヌクレオチドとを反応させて共有結合を形成させることにより、担体表面でポリヌクレオチドを固定化し、続いて（ｉｉ）ポリヌクレオチドを固定化した以外の担体表面の活性エステル基を不活性化する、すなわち残りの活性エステル基を不活性化することにより、ポリヌクレオチドを担体の表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。

上記工程（ｉ）において、担体形状が、基板状の場合は、鋳型ＲＮＡ断片とアニールするポリヌクレオチドを基板上に固定化する際には、ポリヌクレオチドを溶解または分散した液体を点着する方法が好ましい。
担体形状が、マイクロタイタープレートの場合は、ウェル中にポリヌクレオチドを溶解または分散した液体を分注する。
高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がポリヌクレオチドと反応して、ポリヌクレオチドの間で共有結合が形成される。

このポリヌクレオチドを溶解または分散した液体は、例えば中性からアルカリ性、例えばｐＨが７．６以上とすることができる。

また、ポリヌクレオチドの固定化後、担体表面に固定化されなかったポリヌクレオチドを除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。

また、上記工程（ｉｉ）に示したように、洗浄後はポリヌクレオチドを固定化した以外のプラスチック担体表面の活性エステルの不活性化処理をアルカリ化合物、あるいは一級アミノ基を有する化合物で行う。

アルカリ化合物としては、水酸化ナトリウム、水酸化カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水素ナトリウム、リン酸水素二ナトリウム、水酸化カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。

一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、９−アミノアクアジン、アミノブタノール、４−アミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、５−アミノ２，３−ジヒドロー１，４−ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、２−（２−アミノエチルアミノ）エタノール、リン酸二水素２−アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、４−（２−アミノエチル）モルホリン、５−アミノフルオレセイン、６−アミノヘキサン酸、アミノヘキシルセルロース、ｐ−アミノ馬尿酸、２−アミノ−２−ヒドロキシメチル−１，３−プロパンジオール、５−アミノイソフタル酸、アミノメタン、アミノフェノール、２−アミノオクタン、２−アミノオクタン酸、１−アミノ２−プロパノール、３−アミノ−１−プロパノール、３−アミノプロペン、３−アミノプロピオニトリル、アミノピリジン、１１−アミノウンデカン酸、アミノサリチル酸、アミノキノリン、４−アミノフタロニトリル、３−アミノフタルイミド、ｐ−アミノプロピオフェノン、アミノフェニル酢酸、アミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。

また、担体に固定化するポリヌクレオチドには、活性エステル基との反応性を高めるため、アミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に優れるため、アミノ基が導入されたことにより、効率よくかつ強固に担体の表面上にポリヌクレオチドを固定化することができる。アミノ基の導入位置はプライマーの分子鎖末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが、相補的な鋳型ＲＮＡ断片とのアニーリングをより一層効率よく行うことができるという観点からは、好ましい。

以上により、担体の表面上にポリヌクレオチドが固定化されたアレイが得られる。このように１本鎖ｃＤＮＡが固定化された後、液相を除去することにより１本鎖ｃＤＮＡ固定化担体が得られる。

次に、（２）ＲＮＡ断片、ヌクレオチドモノマー、及び逆転写酵素又はポリメラーゼ活性を有する酵素を含む溶液を前記不溶性担体表面に接触させる。
すなわち、不溶性担体の表面に固定化されたＤＮＡ伸長用ポリヌクレオチドにアニールさせるためのＤＮＡ伸長用の鋳型ＲＮＡ断片、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（これらのうち一つが標識されていてもよい）を含むヌクレオチドモノマーおよび逆転写酵素又はポリメラーゼ活性を有する酵素を含むサンプルが導入される。

この導入されたサンプルの反応系としては、逆転者酵素および／またはポリメラーゼ活性をもつ酵素によるＲＮＡを鋳型にした伸長反応を行うが、本発明で使用される逆転写酵素および／またはポリメラーゼ活性を有する酵素は、モロニーマウス白血球ウィルス（Ｍ−ＭＬＶ）逆転写酵素、ラウス肉腫ウィルス（ＲＳＶ）逆転写酵素、トリ骨髄芽球症（ＡＭＶ）逆転写酵素、ラウスアンシェーテッドウィルス（ＲＡＶ）逆転写酵素、骨髄芽球症アンシエーテッドウィルス（ＭＡＶ）逆転写酵素、ヒト免疫不全ウィルス（ＨＩＶ）逆転写酵素、レトロウィルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイク逆転写酵素、バクテリア逆転写酵素、Thermus thermophilus(Tth)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermus aquaticus(Taq)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermotoga neopolitana(Tne)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermotoga maritime(Tma)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermococcus litoralis(Tli、例えばVENT（登録商標）ブランド)ＤＮＡポリメラーゼ、Pyrococcus furiosus(Pfu)ＤＮＡポリメラーゼ、Pyrococus species GBD(例えば、DEEPVENT^TMブランド)ＤＮＡポリメラーゼ、Pyrococcus woosii(Pwo)ＤＮＡポリメラーゼ、Bacillus sterothermophilus(Bst)ＤＮＡポリメラーゼ、Sulfolobus acidocaldarius(Sac)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermoplasma acidophilum(Tac)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermus flavus(Tfl/Tub)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermus rubber(Tru)ＤＮＡポリメラーゼ、Thermus brockianus(例えば、DYNAZYME（登録商標）ブランド)ＤＮＡポリメラーゼ、Methanobacterium thermoautotrohicum(Mth)ＤＮＡポリメラーゼＤＮＡ、その変異体、変形体、派生体を含むがこれに限定されるものではない。
さらに、鋳型となるＲＮＡの分解を抑える目的で、RNaseインヒビターを添加したほうがよい。

続いて、（３）溶液中の前記ＲＮＡ断片を鋳型にして担体表面に固定化されている前記ＤＮＡ伸長用のポリヌクレオチドを伸長させて１本鎖のｃＤＮＡを形成する。
すなわち、前述の反応系の温度を制御することにより、ＤＮＡ鎖の伸長反応が起こる、すなわち鋳型ＲＮＡ断片に相補的なＤＮＡ断片が、担体上に形成され、ＲＮＡ鎖とハイブリした形態のｃＤＮＡ鎖が得られるようになる。

反応温度並びに時間は特に限定されるものでなく、ＤＮＡポリメラーゼ、制限酵素などの特性、鋳型ＤＮＡまたはＲＮＡの安定性・品質・絶対量に依存し、適宜、反応条件を設定すればよい。

伸長反応後は例えば０．１ｗｔ％のＳＤＳ溶液を用いて洗浄して、ｃＤＮＡの生成反応を終了する。

以上のように、本発明は、前述した１本鎖ＤＮＡ固定化担体を使用して、前記担体上にセンス及びアンチセンスプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、及びヌクレオチドモノマーを含む溶液を接触させ、所定のヒートサイクルによりＰＣＲを行い、担体に固定化されている１本鎖ＤＮＡを鋳型にしてＤＮＡ鎖を伸長増幅することをことにより液相中にＤＮＡ鎖を製造することを特徴とするＤＮＡ鎖の製造方法を提供する。

（第２の実施形態）
また、本発明は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、
（ａ）少なくとも一つの、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列を含むＤＮＡ伸長用ポリヌクレオチドを、前記不溶性担体に結合させる工程、
（ｂ）前記ＤＮＡ伸長用ヌクレオチドが固定化された担体に、ポリＡテイルをもつｍＲＮＡ含有試料溶液、逆転写酵素を含む溶液、およびヌクレオチドモノマーを含む溶液を加える工程、
（ｃ）前記ｍＲＮＡのポリＡテイルと、ポリＡテイルに相補的な配列をハイブリダイズさせる工程、
（ｄ）前記ｍＲＮＡを鋳型として、ＤＮＡ伸長用ポリヌクレオチドを伸長させ、ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスｃＤＮＡを製造する工程、
を含むｃＤＮＡ鎖の製造方法を提供する。

工程（ａ）において、不溶性担体は第１の実施形態で説明したものが使用可能である。ＤＮＡ伸長用ポリヌクレオチドとしては、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列を含むものが使用され、好ましくはさらに少なくとも一つのＲＮＡプロモーターを含んでいてもよい。また、ポリヌクレオチドを不溶性担体の表面への結合は、第１の実施形態と同様に行うことができる。

本発明で担体に固定化されるポリヌクレオチドは、少なくとも、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的なひとつの配列を含むことが好ましい。このポリヌクレオチド固定化担体は、またセンスもしくはアンチセンスｃＤＮＡの製造を含む、いろいろな方法に有用である。このポリヌクレオチド固定化担体は、また、センスもしくはアンチセンスｍＲＮＡの製造にも有用である。

本発明で担体に固定化されるポリヌクレオチドは、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列、例えばオリゴｄＴ、を含むことが好ましい。更に、ｍＲＮＡのプロモーター配列を含むことが好ましい。
別の観点から、本発明は、このようにリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子吸引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列を少なくとも一つ含むポリヌクレオチドが固定化されたヌクレオチド固定化担体を提供する。また、この固定化されたヌクレオチドは、さらにＲＮＡプロモーターを少なくとも一つ、好ましくは少なくとも二つ含むものである。
また、ポリヌクレオチドは、通常、マイクロタイタープレートのような不溶性皿に固定され、本発明はこのようなマイクロタイタープレートを提供する。
本発明の一つの好ましい形態におけるマイクロタイタープレートは、少なくとも、二つのウェルをもち、各々には異なるポリヌクレオチドが固定される。本発明のポリヌクレオチド固定化担体は、センスもしくはアンチセンス１本鎖ｃＤＮＡ、及びセンスもしくはアンチセンスｍＲＮＡの製造に使用できる。更に、本発明におけるポリヌクレオチド固定化担体上で製造された１本鎖ｃＤＮＡは長期に安定であって、かつ安定的に基板表面に固定されておりｃＤＮＡ又はｍＲＮＡの製造に何度もこれを繰り返して使用できる。

本発明の好ましい実施態様において、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列を少なくとも一つ含むポリヌクレオチドは、不溶性担体に結合されていて、ヌクレオチド固定化担体を構成する。これらの配列は、好ましくは６〜１００ヌクレオチド長さである。より好ましい実施態様では、固定化ポリヌクレオチドは、更にＲＮＡプロモーター、及び／又は制限酵素認識サイトを含む。好ましくは、その５’末端は不溶性担体に固定され、その３’末端はｍＲＮＡのポリＡテイルに相補する。

本発明のひとつの実施態様は、不溶性皿、好ましくはマイクロタイタープレートにポリヌクレオチドを固定化させた、ポリヌクレオチド固定化担体である。固定化されたポリヌクレオチドは、少なくとも、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的なひとつの配列、例えば、ポリｄＴを含む。
更に好ましい実施態様では、ＲＮＡプロモーターをもっている。本発明のもうひとつの実施態様は、少なくともひとつのＲＮＡプロモーターを含む不溶性担体に、好ましくはポリヌクレオチドを結合させた、ポリヌクレオチド固定化担体である。最も好ましい実施態様は、Ｔ７もしくはＳＰ６ＲＮＡプロモーターのいずれかを含むものである。

本発明の更に別の実施態様では、不溶性担体、好ましくは不溶性担体と、それに結合された１本鎖ＤＮＡから成る１本鎖ＤＮＡ固定化担体の、その１本鎖ＤＮＡは、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補する配列を少なくとも含んでいる。本発明の好ましい実施態様においては、１本鎖ＤＮＡは、ＲＮＡプロモーターをもっており、更に好ましくは、１本鎖ＤＮＡは少なくとも二つの異なるＲＮＡプロモーターを含んでいる。もっと好ましくは、これらのプロモーターは、Ｔ７もしくはＳＰ６ＲＮＡプロモーターである。

続いて、工程（ｂ）において、ポリＡテイルを有するｍＲＮＡ含有試料溶液を、ＤＮＡ鎖伸長用ポリヌクレオチドを固定化した担体に添加し、そこに逆転写酵素を含む溶液、およびｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰおよびｄＴＴＰ（これらのうち一つが標識されていてもよい）を含むヌクレオチドモノマーを含む溶液を加える。

工程（ｃ）において、ｍＲＮＡのポリＡテイルの部分と、当該担体に固定化されたＤＮＡ伸長用ポリヌクレオチドのポリＡテイルに相補的な配列との間でハイブリダイズさせる。また、工程（ｄ）において、ｍＲＮＡを鋳型として、ＤＮＡ伸長用ポリヌクレオチドを伸長させて、当該ｍＲＮＡに相補的なｃＤＮＡ鎖を得る。なお、工程（ｃ）、（ｄ）を、同じ液相中で行うことができ、また工程（ｃ）、（ｄ）が、所定の温度、例えば３７℃でのインキュベートを含んでいてもよい。

すなわち、第２の実施形態によれば、ポリヌクレオチド、好ましくは、少なくとも一つのＲＮＡプロモーターをもつポリヌクレオチドを不溶性担体に結合させて得られる、１本鎖ｃＤＮＡ固定化担体の製造方法である。このポリヌクレオチドは、好ましくはｍＲＮＡのポリＡテイルに相補する配列を少なくとも一つもっており、ヌクレオチド固定化担体を形成する。そこへ、細胞溶解液のようなポリＡテイルのｍＲＮＡ含有溶液を加え、ｍＲＮＡのポリアデニル酸テイル（ポリＡテイル）を固定化ポリヌクレオチド配列にハイブリダイズさせ、更に好ましくは、担体と溶液をインキュベートする。アニール処理されたｍＲＮＡに相補的なアンチセンスｃＤＮＡがつくられる。

また、このように１本鎖ｃＤＮＡが固定化された担体を製造した後、液相を除去して得られるＲＮＡプロモーターを付加的に含んでいる１本鎖ｃＤＮＡ固定化担体に、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ及びヌクレオチドモノマーを含む溶液を１本鎖ｃＤＮＡ固定化担体の表面に接触させ、２本鎖のｃＤＮＡを形成させることができ、本発明はこのようなＤＮＡ鎖の製造方法を提供する。このＤＮＡ鎖の製造方法において、１本鎖ｃＤＮＡ固相化担体に接触させる溶液に含めるヌクレオチドモノマーとしては、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰが挙げられる。また、得られる２本鎖ｃＤＮＡにラベルを導入する場合には、これらヌクレオチドモノマーのうち、少なくとも一つが標識されたものを用いる。

また、このように２本鎖ｃＤＮＡが固定化された担体を製造した後、液相を除去して得られるＲＮＡプロモーターを付加的に含んでいる２本鎖のｃＤＮＡ固定化担体に、ＲＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドモノマーを含む溶液を２本鎖ｃＤＮＡ固定化担体の表面に接触させることにより、ＲＮＡ鎖を製造することができ、本発明は、このような製造工程を含む、センスＲＮＡ鎖の製造方法を提供する。このＲＮＡ鎖の製造方法において、２本鎖ｃＤＮＡ固相化担体に接触させる溶液に含めるヌクレオチドモノマーとしては、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰが挙げられる。また、得られるセンスＲＮＡ鎖にラベルを導入する場合には、これらヌクレオチドモノマーのうち、少なくとも一つが標識されたものを用いる。

プロモーターが転写を始めるような試薬を含むサンプル液を加えると、アンチセンスｍＲＮＡが生産される。アンチセンスｍＲＮＡの好ましい生産方法では、担体とサンプル液をインキュベートすることによって、最初の液相と固相をつくり、次いで以下のステップで反応を始める。
（１）固相に、ＲＮＡポリメラーゼ、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰと共に、好ましくは、ラベルされたＮＴＰ類の一つを含む反応混合物、好ましくは前記ヌクレオチドモノマーがＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰを含み、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、及びＵＴＰの内、少なくとも一つが標識された混合物を加える。
（２）液相と反応混合物をインキュベートし、次いで、固相と反応混合物を加熱し、アンチセンスｍＲＮＡを含む液相をつくる。
そののち、液相を取得し、ＤＮａｓｅで処理することにより、反応をつづけることが望ましい。

以上のように、別の観点から、本発明は、前述したようにｃＤＮＡ鎖の製造方法により１本鎖ｃＤＮＡが固定化された担体を製造した後、液相を除去して得られるＲＮＡプロモーターを付加的に含んでいる１本鎖ｃＤＮＡ固定化担体に、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、及びヌクレオチドモノマーを含む溶液を前記ｃＤＮＡ固定化担体表面に接触させ、前記ＲＮＡプロモーターからアンチセンスｍＲＮＡを製造することを特徴とするＲＮＡ鎖の製造方法を提供する。

また、本発明は、下記のような方法で２本鎖ｃＤＮＡをつくり、次いで第２の反応混合物と固相を加熱する、センス１本鎖ｃＤＮＡの製造方法を提供する。このとき、センス１本鎖ｃＤＮＡを含む第２の液相が得られる。
（１）ポリヌクレオチド固定化担体にポリＡテイルをもつｍＲＮＡ含有サンプル液を加える；
（２）サンプル液と担体をインキュベートし、第１の液相と固相をつくる；
（３）逆転写酵素、ヌクレオチドモノマー（ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰと共に、ラベルされたヌクレオチド（ｄＮＴＰ））を含む第１の反応混合物を、固相に加える；
（４）ＲＮａｓｅ、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰ含有の第２の反応混合物を固相に加え；
（５）第２の反応混合物と固相をインキュベートする。

さらに別の観点から、本発明は、上記したような２本鎖ｃＤＮＡ固定化担体を用いる、センスｃＤＮＡの製造方法を提供する。センスｃＤＮＡとアンチセンスｃＤＮＡが液相で２本鎖ｃＤＮＡを形成したのちに、その２本鎖ｃＤＮＡは変性され、液相中にセンスのｃＤＮＡが得られる。

本発明の実施態様の特徴一つは、センス１本鎖ｃＤＮＡの製造方法である。この方法は、液相での２本鎖ｃＤＮＡ固定化担体の生産を含むもので、そこでは、２本鎖ｃＤＮＡ鎖の一方の鎖が不溶性担体に固定され、２本鎖ｃＤＮＡ鎖の一方の鎖は、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列を少なくとも一つ含んでいる。その後、２本鎖ｃＤＮＡ固定化担体を変性し、液相中にセンスのｃＤＮＡを得る。

本願発明において、センスｍＲＮＡとは遺伝情報と同等なｍＲＮＡを意味し、一方、アンチセンスｍＲＮＡとはセンスｍＲＮＡに相補的なポリヌクレオチドを意味する。センス１本鎖ｃＤＮＡは、センスｍＲＮＡの遺伝情報と同等な遺伝情報を含んでいる。ただし、そのｃＤＮＡにおいては、ｍＲＮＡのウラシルはチミンに置き代わり、ヌクレオチドはデオキシリボヌクレオチドであってリボヌクレオチドではない。

（ＰＮＢＭコート９６穴マイクロタイタープレートの作製）
５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ：２１ｇ／１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度：１２３℃）を用い、射出成形により９６ウェルマイクロタイタープレートを成形した。各ウェルを２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−ｐ−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体（ＰＮＢＭ：各基は、モル％で２５：７４：１）の０．５重量％エタノール溶液でコートし、この成形物底面にPNBMをコートし、本発明の実施形態であるＰＮＢＭコート９６穴マイクロタイタープレートロタイタープレートを作製した。以下ＰＮＢＭプレートと称す。

（アルデヒド基導入９６穴マイクロタイタープレートの作製）
５−メチル−２ノルボルネンの開環重合体の水素添加物（ＭＦＲ：２１ｇ／１０分、水素添加率：実質的に１００％、熱変形温度：１２３℃）を用い、射出成形により９６ウェルマイクロタイタープレートを成形した。成形した９６ウェルタイタープレートに酸素プラズマを施した後、アミノシランによりアミノ基を導入の後、グルタルアルデヒドにより、アミノ基にアルデヒド基を導入し、アルデヒド基導入９６穴マイクロタイタープレートを作製した。以下、アルデヒドプレートと称す。

（オリゴＴの固定）
５’末端がアミノ基で修飾された下記配列のオリゴＴ（Ｔ１５、Ｔ２０、Ｔ３０）を０．２５Ｍ炭酸バッファ（ｐＨ９．０）を用いて溶解し、１０μＭのオリゴＴ溶液を調製した。各オリゴＴ溶液を上記ＰＮＢＭプレートおよびアルデヒドプレートの各ウェルに１０μｌ分注し、直径５ｍｍに打ち抜いたＥＴＦＥシートでウェル底面を覆い、プレートを80℃で１時間放置した。ＥＴＦＥのシートを各ウェルから取り除き、洗浄を行った。洗浄の後、各ウェルブロッキングをおこなった。ＰＮＢＭプレートについては、各ウェルにブロッキング溶液として、１mol／ｌのＮａＯＨ溶液を各ウェルに４００μｌ分注し、5分間室温で放置した。その後、ブロッキング液を除き、純水により洗浄をおこなった。アルデヒドプレートについては、１８０ｍｌのリン酸緩衝液に０．６ｇの水素化ホウ素ナトリウムと５０ｍｌのエタノールを溶解させた溶液をブロッキング溶液とし、各ウェルに４００μｌ分注し室温で5分間放置し、ブロッキング液を除き、純水により洗浄をおこなった。
各々のプレートを乾燥させ、次のトータルＲＮＡからｃＤＮＡの合成実験に供した。

オリゴＴ配列
T15 TTTTTTTTTTTTTTT（配列番号１）
T20 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT（配列番号２）
T30 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT（配列番号３）

（トータルｍＲＮＡからｃＤＮＡ鎖の合成）
ヒト肝由来トータルＲＮＡTatal RNA（ヒト正常組織由来Liver:コスモバイオ CB-061009）1μgを含むDEPC処理水溶液１００μlを６５℃で5分間保温後、氷上で急冷する。反応液として、Reverse
Transcriptase M-MLV (Rnase H-)、5XReverse Transcriptase M-MLV Buffer 、RNAse Inhibitor(Super)、1mM Ｃｙ３標識dUTP、20mM dATP、20mM dGTP、20mM dCTP、DEPC treated waterを加えて調製しものを、ヒト肝由来トータルＲＮＡ（Tatal RNA）溶液に加えた。この溶液を各ウェルに5μｌを分注し、上から直径５ｍｍのＥＴＦＥ製シートで覆い、42℃で1時間インキュベートした。インキュベート後、TE buffer(10mMTris/HCl(pH8.5), 1mMEDTA)を２００μｌ分注し、ＥＴＦＥシートを浮かせ、除去した。TE
bufferにて2回洗浄し、純水にて洗浄し乾燥した。
各ウェルの底面の蛍光像を蛍光顕微鏡により撮り、画像処理にて蛍光量を数値化し、ｃＤＮＡの合成の状況を比較した。即ち、蛍光が観察されれば、ｃＤＮＡが合成されていることを示し、その蛍光強度が高ければ効率良く、ｃＤＮＡの合成が出来ていることになる。
ＰＮＢＭプレートとアルデヒドプレートでの各オリゴＴを固定したウェルでの蛍光強度を表１に示す。なお、各ウェルの蛍光強度値は、オリゴＴを固定していないウェルの蛍光強度値を差し引いたものをｃＤＮＡ合成による蛍光強度とした。

（表１）

本発明の実施形態の一つとなるＰＮＢＭプレートでｃＤＮＡ鎖伸長が検出された一方で、アルデヒド基板ではｃＤＮＡ鎖伸長は検出されていない。

以下、本発明の具体的な態様を挙げる。
リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、
（ａ）少なくとも一つの、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列を含むＤＮＡ伸長用ポリヌクレオチドを、前記不溶性担体に結合させる工程、
（ｂ）前記ＤＮＡ伸長用ヌクレオチドが固定化された担体に、ポリＡテイルをもつｍＲＮＡ含有試料溶液を加える工程、
（ｃ）前記ポリＡテイルをもつｍＲＮＡ含有試料溶液に逆転写酵素を含む溶液を加える工程、
（ｄ）前記ポリＡテイルをもつｍＲＮＡ含有試料溶液にヌクレオチドモノマーを含む溶液加える工程、
（ｅ）前記ｍＲＮＡのポリＡテイルと、ポリＡテイルに相補的な配列をハイブリダイズさせる工程、
（ｆ）前記ｍＲＮＡを鋳型として、ＤＮＡ伸長用ポリヌクレオチドを伸長させ、ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスｃＤＮＡを製造する工程、
を含むｃＤＮＡ鎖の製造方法。

Claims

２−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、
（ａ）少なくとも一つの、ｍＲＮＡのポリＡテイルに相補的な配列を含むＤＮＡ伸長用ポリヌクレオチドを、前記不溶性担体に結合させる工程、
（ｂ）前記ＤＮＡ伸長用ポリヌクレオチドが固定化された担体に、ポリＡテイルをもつｍＲＮＡ含有試料溶液、逆転写酵素を含む溶液およびヌクレオチドモノマーを含む溶液を加える工程、
（ｃ）前記ｍＲＮＡのポリＡテイルと、ポリＡテイルに相補的な配列をハイブリダイズさせる工程、
（ｄ）前記ｍＲＮＡを鋳型として、ＤＮＡ伸長用ポリヌクレオチドを伸長させ、ｍＲＮＡに相補的なアンチセンスｃＤＮＡを製造する工程、
を含み、
工程（ｃ）、（ｄ）を、同じ液相中で行い、
前記高分子物質が、下記一般式（２）で表される共重合体であるｃＤＮＡ鎖の製造方法。

〔式中、ａ、ｂ、およびｃは、それぞれ独立して、正の整数である。〕
工程（ｃ）、（ｄ）が、所定の温度でのインキュベートを含んでいる請求項１に記載のｃＤＮＡ鎖の製造方法。
前記ヌクレオチドモノマーを含む溶液がｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含む請求項１または２に記載のｃＤＮＡ鎖の製造方法。
前記ＤＮＡ伸長用ポリヌクレオチドが、少なくとも一つのＲＮＡプロモーターを更に含む請求項１乃至３いずれか一項に記載のｃＤＮＡ鎖の製造方法。
請求項１乃至４いずれか一項に記載のｃＤＮＡ鎖の製造方法により１本鎖ｃＤＮＡが固定化された担体を製造した後、液相を除去して得られる１本鎖ｃＤＮＡ固定化担体を使用して、前記担体上にセンス及びアンチセンスプライマー、ＤＮＡポリメラーゼ、及びヌクレオチドモノマーを含む溶液を接触させ、所定のヒートサイクルによりＰＣＲを行い、担体に固定化されている１本鎖ｃＤＮＡを鋳型にしてＤＮＡ鎖を伸長増幅することにより液相中にＤＮＡ鎖を製造することを特徴とするＤＮＡ鎖の製造方法。
前記ヌクレオチドモノマーがｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含み、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰの内、少なくとも一つが標識されたものである請求項５に記載のＤＮＡ鎖の製造方法。
請求項４に記載のｃＤＮＡ鎖の製造方法により１本鎖ｃＤＮＡが固定化された担体を製造した後、液相を除去して得られるＲＮＡプロモーターを付加的に含んでいる１本鎖ｃＤＮＡ固定化担体に、ＤＮＡポリメラーゼ、ＤＮＡリガーゼ及びヌクレオチドモノマーを含む溶液を前記ｃＤＮＡ固定化担体表面に接触させ、２本鎖のｃＤＮＡを形成させるＤＮＡ鎖の製造方法。
前記ヌクレオチドモノマーがｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ及びｄＴＴＰを含み、ｄＡＴＰ、ｄＣＴＰ、ｄＧＴＰ、及びｄＴＴＰの内、少なくとも一つが標識されたものである請求項７記載のＤＮＡ鎖の製造方法。
請求項７記載のＤＮＡ鎖の製造方法により２本鎖ｃＤＮＡが固定化された担体を製造した後、液相を除去して得られるＲＮＡプロモーターを付加的に含んでいる２本鎖のｃＤＮＡ固定化担体に、ＲＮＡポリメラーゼおよびヌクレオチドモノマーを含む溶液を前記２本鎖ｃＤＮＡ固定化担体表面に接触させ、ＲＮＡ鎖を製造する工程を含む、センスＲＮＡ鎖の製造方法。
前記ヌクレオチドモノマーがＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ及びＵＴＰを含み、ＡＴＰ、ＣＴＰ、ＧＴＰ、ＵＴＰの内、少なくとも1つが標識されたものである請求項９記載のセンスＲＮＡ鎖の製造方法。