JP5155660B2 - cDNAおよびRNA鎖の製造方法 - Google Patents
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Description
しかし、mRNAは非常に不安定であり、種々のRNA分解酵素により、容易に分解を受ける。そこで、従来mRNAをもとに合成したDNA鎖(cDNA)が研究の材料に使われている。cDNAはターゲットのmRNAを鋳型として、1本鎖DNAを生産できる逆転写酵素を用いつくられる。
ポリペプチドをコードする配列を含むmRNA(すなわち、センスmRNA)の転写に関与するベクターのプロモーターの利用に加えて、相補的cDNA鎖から転写されたアンチセンスmRNAをつくることもできる。アンチセンスmRNAは、タンパク質の生物学的機能や、その作用が未だ知られていないmRNAを理解する有用な道具である。アンチセンスRNA分子はターゲットmRNAと共にアニールさせ、翻訳を阻害することによって、特異的タンパク質の生産をブロックする。それため、この型の翻訳阻害は種々の病状に関連するいろいろな遺伝子産物の研究に重要であろうと思われる。
1本鎖cDNAは、DNAポリメラーゼの触媒作用による2本鎖cDNAの合成の基礎として使用されるほか、ポリメラーゼ・チェイン・リアクション(以下、PCRという。)の鋳型として使用できる。この方法で、反対向きの複数のヌクレオチド・プライマーと熱安定性DNAポリメラーゼを用いて、特異的な遺伝子配列を迅速に増幅できる。アニーリングとDNA合成のサイクルを繰り返すことにより、ターゲット遺伝子のコピーが速やかにつくられる。こうして、センス1本鎖cDNAは、それに対応する2本鎖cDNAのセグメントを特異的に増幅させるため使われる。
液相法では、生じた2本鎖cDNAは分子の方向を決定するマーカーが含まれていない。したがって、新しくつくられた2本鎖cDNAクローンは、その50%に転写方向の誤りがあると思われ、そのままではクローニング・ベクターへ挿入できない。それゆえ、ベクターへ正しい方向で挿入し、mRNAを迅速にクローニングする方法が、望まれている。
1本鎖cDNAあるいは2本鎖cDNAは、固相を用いることによってもつくられる(非特許文献1)。固相法では、通常、多孔性ビーズに固定されたポリデオキシチミジル酸(ポリdT)がmRNAのポリアデニル酸(ポリA)テイルと相補し結合する。次いで、アンチセンス1本鎖cDNAが、結合されたmRNAから逆転写酵素によってつくられる。鋳型のRNAが消化分解されたのち、第2のcDNA鎖がDNAポリメラーゼによって合成される。生じた2本鎖cDNAは、ビーズに固定化されたアンチセンス鎖をもっている。
しかし固相法においては、2本鎖cDNA産物は不溶性担体から切り離すことができない。この問題を避けるためには、2本鎖cDNA産物を加熱し、担体に固定された2本鎖cDNAから1本鎖cDNAを遊離させ、この1本鎖cDNAを用いて、2本鎖cDNAがPCRで合成される。しかし、これは反応にもう一つのステップが加わることを意味し、PCR反応ごとに適当な一揃いのプライマーが必要となる。
それゆえ、単離されたmRNAから、結合型ではない2本鎖cDNAクローンを創る単純な方法が要求されている。
また、cDNAクローンからmRNAを合成できる種々の方法も知られており、その一つは液相法である(非特許文献2)。この方法においては、RNAプロモーターをもつベクターに2本鎖cDNAが挿入される。ベクターは次いで、制限酵素で消化されて直鎖状となり、RNAポリメラーゼの作用でmRNAが合成される。合成されたmRNAは、鋳型DNAを除去するためDNaseで処理される。必要ならばこのとき、新たに合成されたRNAの末端に、ターミナル・トランスフェラーゼ及びdATPを用いてポリアデニル酸テイルが付加される。
mRNAの固相合成法もまた、よく知られている。その一つは、非特許文献3に書かれている。この方法では、DNA配列が制限酵素によってバクテリオファージ・ラムダのゲノムから消化されて、粘着末端をもつランダムDNA断片が生じる。これをT4DNAポリメラーゼを用い、ビオチン化dUTPによって粘着末端を満たし平滑化する。
T4DNAポリメラーゼによるDNA合成のあいだ、ビオチン化dUTPがハイブリダイズするように、むき出しのdAヌクレオチドをもつ粘着末端が残るように、制限酵素が選ばれる。ランダム配列が次に、アビジンをもつアクリルアミド担体に固定化される。mRNAが天然のラムダ・プロモーター配列をもつ配列から、T7RNAポリメラーゼ又はSP6RNAポリメラーゼを用いて、合成される。この系は、バクテリオファージ・ラムダにおける転写の速度論的解析の研究のため設計されたものである。
mRNAの液相及び固相合成法はいずれも、欠点を有している。液相合成法は、RNAプロモーター含有のベクターの使用が必要な上、挿入の後、ベクターは、直鎖状の配列に変換されなければならない。固相合成法は、いつも完全な遺伝情報を提供するとは限らない。なぜなら、この情報は固定化されたゲノムDNAの情報であってmRNAの情報ではないからである。それゆえ、改良されたmRNAの合成方法が望まれている。
非特許文献4には、固相担体にアミノ結合を介して共有結合されたオリゴヌクレオチドは、PCRの実験に便利に使用できると記載されている。しかし、ここで記載されているテクニックは、cDNAやRNAの生産を特異的に提供するものではない。そのうえ、担体に共有結合されたオリゴヌクレオチドを除くメカニズムについては何ら提供されていない。
しかしながら、固相表面と液相間での酵素を用いた、核酸鎖の伸長反応は起こりにくく、生成させたcDNAが、鋳型となるmRNAの発現状況を正確に反映したものか疑問が残る。
(1)2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、
(a)少なくとも一つの、mRNAのポリAテイルに相補的な配列を含むDNA伸長用ポリヌクレオチドを、前記不溶性担体に結合させる工程、
(b)前記DNA伸長用ポリヌクレオチドが固定化された担体に、ポリAテイルをもつmRNA含有試料溶液、逆転写酵素を含む溶液およびヌクレオチドモノマーを含む溶液を加える工程、
(c)前記mRNAのポリAテイルと、ポリAテイルに相補的な配列をハイブリダイズさせる工程、
(d)前記mRNAを鋳型として、DNA伸長用ポリヌクレオチドを伸長させ、mRNAに相補的なアンチセンスcDNAを製造する工程、
を含み、
工程(c)、(d)を、同じ液相中で行行い、
前記高分子物質が、下記一般式(2)で表される共重合体であるcDNA鎖の製造方法、
〔式中、a、b、およびcは、それぞれ独立して、正の整数である。〕
(2)工程(c)、(d)が、所定の温度でのインキュベートを含んでいる(1)記載のcDNA鎖の製造方法、
(3)前記ヌクレオチドモノマーを含む溶液がdATP、dCTP、dGTP及びdTTPを含む(1)または(2)に記載のcDNA鎖の製造方法、
(4)前記DNA伸長用ポリヌクレオチドが、少なくとも一つのRNAプロモーターを更に含む(1)〜(3)いずれか記載のcDNA鎖の製造方法、
(5)(1)〜(4)いずれか記載のcDNA鎖の製造方法により1本鎖cDNAが固定化された担体を製造した後、液相を除去して得られる1本鎖cDNA固定化担体を使用して、前記担体上にセンス及びアンチセンスプライマー、DNAポリメラーゼ、及びヌクレオチドモノマーを含む溶液を接触させ、所定のヒートサイクルによりPCRを行い、担体に固定化されている1本鎖cDNAを鋳型にしてDNA鎖を伸長増幅することにより液相中にDNA鎖を製造することを特徴とするDNA鎖の製造方法、
(6)前記ヌクレオチドモノマーがdATP、dCTP、dGTP及びdTTPを含み、dATP、dCTP、dGTP、及びdTTPの内、少なくとも一つが標識されたものである(5)記載のDNA鎖の製造方法、
(7)(4)記載のcDNA鎖の製造方法により1本鎖cDNAが固定化された担体を製造した後、液相を除去して得られるRNAプロモーターを付加的に含んでいる1本鎖cDNA固定化担体に、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ及びヌクレオチドモノマーを含む溶液を前記cDNA固定化担体表面に接触させ、2本鎖のcDNAを形成させる工程を含むDNA鎖の製造方法、
(8)前記ヌクレオチドモノマーがdATP、dCTP、dGTP及びdTTPを含み、dATP、dCTP、dGTP、及びdTTPの内、少なくとも一つが標識されたものである(7)のDNA鎖の製造方法、
(9)(7)記載のDNA鎖の製造方法により2本鎖cDNAが固定化された担体を製造した後、液相を除去して得られるRNAプロモーターを付加的に含んでいる2本鎖のcDNA固定化担体に、RNAポリメラーゼおよびヌクレオチドモノマーを含む溶液を前記2本鎖cDNA固定化担体表面に接触させ、RNA鎖を製造する工程を含む、センスRNA鎖の製造方法、
(10)前記ヌクレオチドモノマーがATP、CTP、GTP、UTPを含み、ATP、CTP、GTP、UTPの内、少なくとも1つが標識されたものである(9)記載のセンスRNA鎖の製造方法、
である。
(第1の実施形態)
本発明は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、(1)DNA伸長用のポリヌクレオチドを固定化させてポリヌクレオチド固定化担体を形成する工程、(2)RNA断片、ヌクレオチドモノマー、及び逆転写酵素又はポリメラーゼ活性を有する酵素を含む溶液を前記不溶性担体表面に接触させる工程、(3)溶液中の前記RNA断片を鋳型にして担体表面に固定化されている前記DNA伸長用のポリヌクレオチドを伸長させて1本鎖のcDNAを形成する工程、を含むことを特徴とするcDNA鎖の製造方法を提供する。
2−メタクリロイルオキシエトキシエチルホスホリルコリン基および10−メタクリロイルオキシエトキシノニルホスホリルコリン基等の(メタ)アクリロイルオキシアルコキシアルキルホスホリルコリン基;
アリルホスホリルコリン基、ブテニルホスホリルコリン基、ヘキセニルホスホリルコリン基、オクテニルホスホリルコリン基、およびデセニルホスホリルコリン基等のアルケニルホスホリルコリン基;
等の基が挙げられる。
―Cl、−F等のハロゲン;
等の基を有することができる。
上記式(1)に示される一価の基は、たとえば下記式(p)または式(q)から選択されるいずれかの基とすることができる。
下記式(t)に示される酸ハロゲン化物由来の基;
下記式(u)、式(w)に示される活性エステル由来の基;または
下記式(v)に示される活性化アミド由来の基とすることができる。
過酸化ラウロイル、過酸化ベンゾイル、t−ブチルペルオキシネオデカノエート、t−ブチルペルオキシピバレート等の油溶性の有機過酸化物;
などが用いられる。
環状ポリオレフィン;
含フッ素樹脂;
等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフィンは、耐熱性、耐薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適であり、担体の材料として好ましく用いられる。
(i)担体上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部の活性エステル基とポリヌクレオチドとを反応させて共有結合を形成させることにより、担体表面でポリヌクレオチドを固定化し、続いて(ii)ポリヌクレオチドを固定化した以外の担体表面の活性エステル基を不活性化する、すなわち残りの活性エステル基を不活性化することにより、ポリヌクレオチドを担体の表面に固定することができる。以下、それぞれの工程について説明する。
担体形状が、マイクロタイタープレートの場合は、ウェル中にポリヌクレオチドを溶解または分散した液体を分注する。
高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がポリヌクレオチドと反応して、ポリヌクレオチドの間で共有結合が形成される。
すなわち、不溶性担体の表面に固定化されたDNA伸長用ポリヌクレオチドにアニールさせるためのDNA伸長用の鋳型RNA断片、dATP、dCTP、dGTPおよびdTTP(これらのうち一つが標識されていてもよい)を含むヌクレオチドモノマーおよび逆転写酵素又はポリメラーゼ活性を有する酵素を含むサンプルが導入される。
さらに、鋳型となるRNAの分解を抑える目的で、RNaseインヒビター を添加したほうがよい。
すなわち、前述の反応系の温度を制御することにより、DNA鎖の伸長反応が起こる、すなわち鋳型RNA断片に相補的なDNA断片が、担体上に形成され、RNA鎖とハイブリした形態のcDNA鎖が得られるようになる。
また、本発明は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、
(a)少なくとも一つの、mRNAのポリAテイルに相補的な配列を含むDNA伸長用ポリヌクレオチドを、前記不溶性担体に結合させる工程、
(b)前記DNA伸長用ヌクレオチドが固定化された担体に、ポリAテイルをもつmRNA含有試料溶液、逆転写酵素を含む溶液、およびヌクレオチドモノマーを含む溶液を加える工程、
(c)前記mRNAのポリAテイルと、ポリAテイルに相補的な配列をハイブリダイズさせる工程、
(d)前記mRNAを鋳型として、DNA伸長用ポリヌクレオチドを伸長させ、mRNAに相補的なアンチセンスcDNAを製造する工程、
を含むcDNA鎖の製造方法を提供する。
別の観点から、本発明は、このようにリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子吸引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、mRNAのポリAテイルに相補的な配列を少なくとも一つ含むポリヌクレオチドが固定化されたヌクレオチド固定化担体を提供する。また、この固定化されたヌクレオチドは、さらにRNAプロモーターを少なくとも一つ、好ましくは少なくとも二つ含むものである。
また、ポリヌクレオチドは、通常、マイクロタイタープレートのような不溶性皿に固定され、本発明はこのようなマイクロタイタープレートを提供する。
本発明の一つの好ましい形態におけるマイクロタイタープレートは、少なくとも、二つのウェルをもち、各々には異なるポリヌクレオチドが固定される。本発明のポリヌクレオチド固定化担体は、センスもしくはアンチセンス1本鎖cDNA、及びセンスもしくはアンチセンスmRNAの製造に使用できる。更に、本発明におけるポリヌクレオチド固定化担体上で製造された1本鎖cDNAは長期に安定であって、かつ安定的に基板表面に固定されておりcDNA又はmRNAの製造に何度もこれを繰り返して使用できる。
更に好ましい実施態様では、RNAプロモーターをもっている。本発明のもうひとつの実施態様は、少なくともひとつのRNAプロモーターを含む不溶性担体に、好ましくはポリヌクレオチドを結合させた、ポリヌクレオチド固定化担体である。最も好ましい実施態様は、T7もしくはSP6RNAプロモーターのいずれかを含むものである。
(1)固相に、RNAポリメラーゼ、ATP、CTP、GTP及びUTPと共に、好ましくは、ラベルされたNTP類の一つを含む反応混合物、好ましくは前記ヌクレオチドモノマーがATP、CTP、GTP及びUTPを含み、ATP、CTP、GTP、及びUTPの内、少なくとも一つが標識された混合物を加える。
(2)液相と反応混合物をインキュベートし、次いで、固相と反応混合物を加熱し、アンチセンスmRNAを含む液相をつくる。
そののち、液相を取得し、DNaseで処理することにより、反応をつづけることが望ましい。
(1)ポリヌクレオチド固定化担体にポリAテイルをもつmRNA含有サンプル液を加える;
(2)サンプル液と担体をインキュベートし、第1の液相と固相をつくる;
(3)逆転写酵素、ヌクレオチドモノマー(dATP、dCTP、dGTP及びdTTPと共に、ラベルされたヌクレオチド(dNTP))を含む第1の反応混合物を、固相に加える;
(4)RNase、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ、dATP、dCTP、dGTP及びdTTP含有の第2の反応混合物を固相に加え;
(5)第2の反応混合物と固相をインキュベートする。
5−メチル−2ノルボルネンの開環重合体の水素添加物(MFR:21g/10分、水素添加率:実質的に100%、熱変形温度:123℃)を用い、射出成形により96ウェルマイクロタイタープレートを成形した。各ウェルを2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン−ブチルメタクリレート−p−ニトロフェニルオキシカルボニルポリエチレングリコールメタクリレート共重合体(PNBM:各基は、モル%で25:74:1)の0.5重量%エタノール溶液でコートし、この成形物底面にPNBMをコートし、本発明の実施形態であるPNBMコート96穴マイクロタイタープレートロタイタープレートを作製した。以下PNBMプレートと称す。
5−メチル−2ノルボルネンの開環重合体の水素添加物(MFR:21g/10分、水素添加率:実質的に100%、熱変形温度:123℃)を用い、射出成形により96ウェルマイクロタイタープレートを成形した。成形した96ウェルタイタープレートに酸素プラズマを施した後、アミノシランによりアミノ基を導入の後、グルタルアルデヒドにより、アミノ基にアルデヒド基を導入し、アルデヒド基導入96穴マイクロタイタープレートを作製した。以下、アルデヒドプレートと称す。
5’末端がアミノ基で修飾された下記配列のオリゴT(T15、T20、T30)を0.25M炭酸バッファ(pH9.0)を用いて溶解し、10μMのオリゴT溶液を調製した。各オリゴT溶液を上記PNBMプレートおよびアルデヒドプレートの各ウェルに10μl分注し、直径5mmに打ち抜いたETFEシートでウェル底面を覆い、プレートを80℃で1時間放置した。ETFEのシートを各ウェルから取り除き、洗浄を行った。洗浄の後、各ウェルブロッキングをおこなった。PNBMプレートについては、各ウェルにブロッキング溶液として、1mol/lのNaOH溶液を各ウェルに400μl分注し、5分間室温で放置した。その後、ブロッキング液を除き、純水により洗浄をおこなった。アルデヒドプレートについては、180mlのリン酸緩衝液に0.6gの水素化ホウ素ナトリウムと50mlのエタノールを溶解させた溶液をブロッキング溶液とし、各ウェルに400μl分注し室温で5分間放置し、ブロッキング液を除き、純水により洗浄をおこなった。
各々のプレートを乾燥させ、次のトータルRNAからcDNAの合成実験に供した。
T15 TTTTTTTTTTTTTTT(配列番号1)
T20 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(配列番号2)
T30 TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT(配列番号3)
ヒト肝由来トータルRNATatal RNA(ヒト正常組織由来Liver:コスモバイオ CB-061009)1μgを含むDEPC処理水溶液100μlを65℃で5分間保温後、氷上で急冷する。反応液として、Reverse
Transcriptase M-MLV (Rnase H-)、5XReverse Transcriptase M-MLV Buffer 、RNAse Inhibitor(Super)、1mM Cy3標識dUTP、20mM dATP、20mM dGTP、20mM dCTP、DEPC treated waterを加えて調製しものを、ヒト肝由来トータルRNA(Tatal RNA)溶液に加えた。この溶液を各ウェルに5μlを分注し、上から直径5mmのETFE製シートで覆い、42℃で1時間インキュベートした。インキュベート後、TE buffer(10mMTris/HCl(pH8.5), 1mMEDTA)を200μl分注し、ETFEシートを浮かせ、除去した。TE
bufferにて2回洗浄し、純水にて洗浄し乾燥した。
各ウェルの底面の蛍光像を蛍光顕微鏡により撮り、画像処理にて蛍光量を数値化し、cDNAの合成の状況を比較した。即ち、蛍光が観察されれば、cDNAが合成されていることを示し、その蛍光強度が高ければ効率良く、cDNAの合成が出来ていることになる。
PNBMプレートとアルデヒドプレートでの各オリゴTを固定したウェルでの蛍光強度を表1に示す。なお、各ウェルの蛍光強度値は、オリゴTを固定していないウェルの蛍光強度値を差し引いたものをcDNA合成による蛍光強度とした。
リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、
(a)少なくとも一つの、mRNAのポリAテイルに相補的な配列を含むDNA伸長用ポリヌクレオチドを、前記不溶性担体に結合させる工程、
(b)前記DNA伸長用ヌクレオチドが固定化された担体に、ポリAテイルをもつmRNA含有試料溶液を加える工程、
(c)前記ポリAテイルをもつmRNA含有試料溶液に逆転写酵素を含む溶液を加える工程、
(d)前記ポリAテイルをもつmRNA含有試料溶液にヌクレオチドモノマーを含む溶液加える工程、
(e)前記mRNAのポリAテイルと、ポリAテイルに相補的な配列をハイブリダイズさせる工程、
(f)前記mRNAを鋳型として、DNA伸長用ポリヌクレオチドを伸長させ、mRNAに相補的なアンチセンスcDNAを製造する工程、
を含むcDNA鎖の製造方法。
Claims (10)
- 2−メタクリロイルオキシエチルホスホリルコリン基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、
(a)少なくとも一つの、mRNAのポリAテイルに相補的な配列を含むDNA伸長用ポリヌクレオチドを、前記不溶性担体に結合させる工程、
(b)前記DNA伸長用ポリヌクレオチドが固定化された担体に、ポリAテイルをもつmRNA含有試料溶液、逆転写酵素を含む溶液およびヌクレオチドモノマーを含む溶液を加える工程、
(c)前記mRNAのポリAテイルと、ポリAテイルに相補的な配列をハイブリダイズさせる工程、
(d)前記mRNAを鋳型として、DNA伸長用ポリヌクレオチドを伸長させ、mRNAに相補的なアンチセンスcDNAを製造する工程、
を含み、
工程(c)、(d)を、同じ液相中で行い、
前記高分子物質が、下記一般式(2)で表される共重合体であるcDNA鎖の製造方法。
- 工程(c)、(d)が、所定の温度でのインキュベートを含んでいる請求項1に記載のcDNA鎖の製造方法。
- 前記ヌクレオチドモノマーを含む溶液がdATP、dCTP、dGTP及びdTTPを含む請求項1または2に記載のcDNA鎖の製造方法。
- 前記DNA伸長用ポリヌクレオチドが、少なくとも一つのRNAプロモーターを更に含む請求項1乃至3いずれか一項に記載のcDNA鎖の製造方法。
- 請求項1乃至4いずれか一項に記載のcDNA鎖の製造方法により1本鎖cDNAが固定化された担体を製造した後、液相を除去して得られる1本鎖cDNA固定化担体を使用して、前記担体上にセンス及びアンチセンスプライマー、DNAポリメラーゼ、及びヌクレオチドモノマーを含む溶液を接触させ、所定のヒートサイクルによりPCRを行い、担体に固定化されている1本鎖cDNAを鋳型にしてDNA鎖を伸長増幅することにより液相中にDNA鎖を製造することを特徴とするDNA鎖の製造方法。
- 前記ヌクレオチドモノマーがdATP、dCTP、dGTP及びdTTPを含み、dATP、dCTP、dGTP、及びdTTPの内、少なくとも一つが標識されたものである請求項5に記載のDNA鎖の製造方法。
- 請求項4に記載のcDNA鎖の製造方法により1本鎖cDNAが固定化された担体を製造した後、液相を除去して得られるRNAプロモーターを付加的に含んでいる1本鎖cDNA固定化担体に、DNAポリメラーゼ、DNAリガーゼ及びヌクレオチドモノマーを含む溶液を前記cDNA固定化担体表面に接触させ、2本鎖のcDNAを形成させるDNA鎖の製造方法。
- 前記ヌクレオチドモノマーがdATP、dCTP、dGTP及びdTTPを含み、dATP、dCTP、dGTP、及びdTTPの内、少なくとも一つが標識されたものである請求項7記載のDNA鎖の製造方法。
- 請求項7記載のDNA鎖の製造方法により2本鎖cDNAが固定化された担体を製造した後、液相を除去して得られるRNAプロモーターを付加的に含んでいる2本鎖のcDNA固定化担体に、RNAポリメラーゼおよびヌクレオチドモノマーを含む溶液を前記2本鎖cDNA固定化担体表面に接触させ、RNA鎖を製造する工程を含む、センスRNA鎖の製造方法。
- 前記ヌクレオチドモノマーがATP、CTP、GTP及びUTPを含み、ATP、CTP、GTP、UTPの内、少なくとも1つが標識されたものである請求項9記載のセンスRNA鎖の製造方法。
Priority Applications (1)
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