WO2007020847A1 - ｃＤＮＡおよびＲＮＡ鎖の製造方法およびヌクレオチド固定化担体 - Google Patents

ｃＤＮＡおよびＲＮＡ鎖の製造方法およびヌクレオチド固定化担体 Download PDF

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WO2007020847A1
WO2007020847A1 PCT/JP2006/315734 JP2006315734W WO2007020847A1 WO 2007020847 A1 WO2007020847 A1 WO 2007020847A1 JP 2006315734 W JP2006315734 W JP 2006315734W WO 2007020847 A1 WO2007020847 A1 WO 2007020847A1
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group
carrier
nucleotide
immobilized
polynucleotide
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PCT/JP2006/315734
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Inventor
Kenji Kinoshita
Toru Yakabe
Kentaro Fujimoto
Kanehisa Yokoyama
Kazuhiko Fujiwara
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Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
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    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12P—FERMENTATION OR ENZYME-USING PROCESSES TO SYNTHESISE A DESIRED CHEMICAL COMPOUND OR COMPOSITION OR TO SEPARATE OPTICAL ISOMERS FROM A RACEMIC MIXTURE
    • C12P19/00—Preparation of compounds containing saccharide radicals
    • C12P19/26—Preparation of nitrogen-containing carbohydrates
    • C12P19/28—N-glycosides
    • C12P19/30—Nucleotides
    • C12P19/34—Polynucleotides, e.g. nucleic acids, oligoribonucleotides
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/10—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA
    • C12N15/1096—Processes for the isolation, preparation or purification of DNA or RNA cDNA Synthesis; Subtracted cDNA library construction, e.g. RT, RT-PCR
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6844—Nucleic acid amplification reactions
    • C12Q1/686—Polymerase chain reaction [PCR]

Definitions

  • the present invention relates to a polynucleotide-immobilized carrier useful for gene storage and analysis, a method for producing cDNA using the polynucleotide-immobilized carrier, and production of DNA strands and RNA strands using cDNA as a cage. Regarding the method.
  • mRNA messenger RNA
  • mRNA messenger RNA
  • intron Z exons ie R pricing or protein processing. Therefore, the basic genetic analysis of protein structure is more likely to study using mRNA rather than genomic DNA.
  • cDNA DNA strands synthesized based on mRNA have been used as research materials.
  • cDNA is created using reverse transcriptase, which can produce single-stranded DNA, using the target mRNA as a saddle.
  • a complementary cDNA chain strength transcribed antisense mRNA can also be produced.
  • Antisense mRNA is a useful tool for understanding mRNA, even though the biological functions and actions of proteins are still unknown. Antisense RNA molecules anneal with the target mRNA and block specific protein production by inhibiting translation. Therefore, this type of translational inhibition may be important for the study of various gene products associated with various disease states.
  • Single-stranded cDNA is a truncated form of the polymerase “chain” reaction (hereinafter referred to as PCR) used as the basis for the synthesis of double-stranded cDNA catalyzed by DNA polymerase.
  • PCR polymerase “chain” reaction
  • DNA polymerase a polymerase “chain” reaction
  • specific gene sequences can be rapidly amplified using multiple nucleotides primers in opposite directions and a thermostable DNA polymerase. By repeating the cycles of DNA and DNA synthesis, a copy of the target gene can be made quickly.
  • the sense single-stranded cDNA is used to specifically amplify the corresponding double-stranded cDNA segment.
  • the resulting double-stranded cDNA does not contain markers that determine the orientation of the molecule. Therefore, it seems that 50% of newly created double-stranded cDNA clones are misdirected and cannot be inserted into the cloning 'vector as it is. Therefore, there is a demand for a method that can be inserted into a vector in the correct direction and rapidly cleaved mRNA.
  • Single-stranded cDNA or double-stranded cDNA can also be produced by using a solid phase (Non-patent Document 1).
  • polydeoxythymidylic acid (poly dT) immobilized on porous beads is usually complementary to and bound to the polyaduric acid (poly A) till of mRNA.
  • Antisense single-stranded cDNA force is then made by the combined mRNA force reverse transcriptase. After digestion and degradation of the RNA, the second cDNA strand is synthesized by DNA polymerase. The resulting double-stranded cDNA has an antisense strand immobilized on the bead.
  • the double-stranded cDNA product cannot be separated from the insoluble carrier force.
  • heat the double-stranded cDNA product release the single-stranded cDNA from the double-stranded cDNA immobilized on the carrier, and use this single-stranded cDNA to convert the double-stranded cDNA into PCR. Is synthesized. However, this means that another step is added to the reaction, and an appropriate set of primers is required for each PCR reaction.
  • Non-patent Document 2 There are also various known methods for synthesizing mRNA from cDNA clones, one of which is the liquid phase method (Non-patent Document 2).
  • this method double-stranded cDNA is inserted into a vector with an RNA promoter.
  • the vector is then digested with restriction enzymes to linearize and mRNA is synthesized by the action of RNA polymerase.
  • the synthesized mRNA is treated with DNase to remove the cage DNA. If necessary, the newly synthesized Polyadenylate tyll is added to the ends of the RNA using terminal transferase and dATP.
  • Solid phase synthesis of mRNA is also well known.
  • the DNA sequence is digested with restriction enzymes from the genome of Bacteriophage lambda to produce random DNA fragments with sticky ends.
  • T4DN A polymerase fill the sticky ends with piotin dUTP and smooth.
  • restriction enzymes are selected so that sticky ends with bare dA nucleotides remain so that the piotinylated dUTP will hybridize.
  • the random sequence is then immobilized on an acrylamide carrier with avidin.
  • mRNA is synthesized from a sequence having the natural lambda 'promoter sequence using T7 RNA polymerase or SP6 RNA polymerase. This system was designed for the study of kinetic analysis of transcription in Butteriophage lambda.
  • Solution phase synthesis requires the use of a vector containing an RNA promoter, and after insertion, the vector must be converted to a linear sequence.
  • Solid-phase synthesis methods do not always provide complete genetic information. This is because this information is information on fixed genomic DNA, not mRNA. Therefore, an improved method for synthesizing mRNA is desired.
  • Non-Patent Document 4 describes that an oligonucleotide covalently bonded to a solid phase carrier via an amino bond can be conveniently used for PCR experiments.
  • the techniques described here do not specifically provide for the production of cDNA or RNA.
  • no mechanism is provided for the removal of oligonucleotides covalently bound to a carrier.
  • Patent Document 1 discloses a method of immobilizing oligonucleotides on a solid support and forming RNA on a solid surface using RNA as a cage.
  • Patent Document 2 discloses a method for producing cDNA using reverse transcriptase by immobilizing RNA on a carrier.
  • nucleic acid chain extension reaction using an enzyme between the solid surface and the liquid phase is an accurate reflection of the expression of mRNA that is difficult to generate and becomes a cDNA-strengthened type of cDNA. The question remains.
  • Non-Patent Document 1 1. Raineriet al., NucleicAcids Research, 19: 4010, 1991
  • Non-Patent Document 2 S. Shichijo et al, J. Neurosci. Res., 30: 316-320, 1991
  • Non-patent document 3 Hironori Terada (Hiroyuki Terada) “Dynamic analysis of transcription by immobilized DNA” (Bi ophysics (Biophysics), 31: 49-52, 1991)
  • Non-Patent Document 4 Stamm et al., Nucleic Acids Res., 19: 1350, 1991
  • Patent Document 1 Patent Publication No. 8-500722
  • Patent Document 2 Patent Publication 2003-519482
  • An object of the present invention is to provide a method for producing a cDNA that can efficiently perform an elongation reaction of a DNA strand using an insoluble carrier and a mRNA in a cage shape and accurately reflects the expression state of the cage mRNA, and It is to provide a method that can easily produce RNA and DNA strands based on the produced cDNA.
  • the present invention provides:
  • a first unit having a group derived from a phosphate ester constituting the hydrophilic part of a phospholipid and an electron-withdrawing substituent force A second unit having a carboxylic acid derivative group bonded to an S-carbonyl group (1) a step of immobilizing a polynucleotide for DNA elongation to form a polynucleotide-immobilized carrier, on an insoluble carrier having a polymer substance comprising: (2) an RNA fragment, a nucleotide monomer, and A step of bringing a solution containing an enzyme having reverse transcriptase or polymerase activity into contact with the surface of the insoluble carrier; (3) the RNA fragment in the solution is formed into a bowl shape and immobilized on the surface of the carrier.
  • a method for producing a cDNA strand comprising the step of extending a polynucleotide to form a single-stranded cDNA,
  • a first unit having a group derived from a phosphate ester constituting the hydrophilic part of a phospholipid and an electron-withdrawing substituent force A second unit having a carboxylic acid derivative group bonded to an S-carbonyl group
  • a method for producing a cDNA strand comprising
  • steps (c) and (d) include incubation at a predetermined temperature
  • the groups derived from the phosphate ester contained in the first unit of the polymer substance include phosphorylcholine group, phosphorylethanolamine group, phosphorylserine group, phosphorylinositol group, phosphorylglycerol group, and phosphatidyl group.
  • the DNA extension polynucleotide force further comprising at least one RNA promoter (1) to (6) V, The method for producing a cDNA strand according to any one of V,
  • the nucleotide monomer contains dATP, dCTP, dGTP and dTTP, and at least one of dATP, dCTP, dGTP and dTTP is labeled (9)
  • a method for producing a DNA strand
  • RNA promoter obtained by removing the liquid phase after producing a carrier on which a single-stranded cDNA is immobilized by the method for producing a cDNA strand described in (7) is optionally included.
  • a method for producing a DNA strand comprising a step of bringing a solution containing DNA polymerase, DNA ligase and nucleotide monomer into contact with the surface of the cDNA immobilization carrier on a single strand c DNA immobilization carrier to form a double-stranded cDNA;
  • the nucleotide monomer includes dATP, dCTP, dGTP and dTTP, and dATP
  • RNA promoter obtained by removing a liquid phase after producing a carrier on which a double-stranded cDNA is immobilized by the method for producing a DNA strand according to (11) is optionally included.
  • a solution containing a RNA polymerase and a nucleotide monomer is brought into contact with the surface of the double-stranded cDNA immobilization carrier and the RNA strand is produced.
  • the groups derived from the phosphate ester contained in the first unit of the polymer substance include phosphorylcholine group, phosphorylethanolamine group, phosphorylserine group, phosphorylinositol group, phosphorylglycerol group, and phosphatidylphosphorylglycerol.
  • nucleotide-immobilized carrier according to any one of (15) to (18), wherein the form of the insoluble carrier includes a microtiter plate,
  • nucleotide-fixing carrier according to any one of (16) to (20) V, wherein the polynucleotide comprises a T7 RNA promoter or an SP6 RNA promoter,
  • polynucleotide-immobilized carrier according to any one of (15) to (21) V, comprising poly dT as a sequence complementary to the poly A-til of the polynucleotide force mRNA,
  • nucleotide-fixing carrier according to (23) or (24), wherein the polynucleotide comprises a T7 RNA promoter and an SP6 RNA promoter,
  • the polymer substance has a third unit containing a butyl metatalylate group (15) to (25) V, the nucleotide-immobilized carrier according to any one of the above,
  • the insoluble carrier includes a second polymer substance having a first unit containing a phosphorylcholine group and a third unit containing a butyl methacrylate group on the surface (15).
  • nucleotide-immobilized carrier according to any one of (15) to (27) V, wherein the insoluble carrier is a plastic material force
  • the DNA strand elongation reaction can be efficiently performed in the shape of RNA on a carrier, and cDNA that accurately reflects the expression status of mRNA can be generated and stably stored as cDNA. Furthermore, it is possible to provide a method for synthesizing cDNA that allows easy production of RNA strands and DNA strands based on stored cDNA.
  • the present invention relates to a first unit having a group derived from a phosphate ester constituting a hydrophilic part of a phospholipid and a second unit having a carboxylic acid derivative group in which an electron-withdrawing substituent is bonded to a carbonyl group.
  • the present invention provides a method for producing a cDNA strand, comprising the step of extending a polynucleotide for DNA extension to form a single-stranded cDNA.
  • a polynucleotide for DNA extension is immobilized on a surface of an insoluble carrier as a primer to form a polynucleotide-immobilized carrier.
  • the surface of the carrier used here has a first unit having a group derived from a phosphate ester constituting a hydrophilic part of a phospholipid represented by a phosphorylcholine group and a second unit having a carboxylic acid-derived group.
  • a macromolecular substance that contains units! / Speak There is now a macromolecular substance that contains units! / Speak.
  • a polymer substance containing a first unit having a group derived from a phosphate ester constituting a hydrophilic part of a phospholipid represented by a phosphorylcholine group and a second unit having a carboxylic acid derivative group is RNA It is a polymer that has both the property of suppressing nonspecific adsorption of strands and the property of fixing DNA strands.
  • the phosphate group that constitutes the hydrophilic part of phospholipids represented by the phosphorylcholine group contained in the first unit plays a role in suppressing nonspecific adsorption of the truncated RNA fragment, and is contained in the second unit.
  • the carboxylic acid-derived group serves to immobilize the primer. That is, the primer activates the coating layer. It is covalently bonded at the site of the functional ester group and immobilized on the surface of the carrier.
  • Examples of the group derived from the phosphate ester contained in the first unit include a phosphorylcholine group, a phosphorylethanolamine group, a phosphorylserine group, a phosphorylinositol group, a phosphoryldaricerol group, and a phosphatidylphosphorylglycerol group.
  • a phosphorylcholine group is preferred.
  • Examples of the phosphorylcholine group include (meth) ataryloxyalkylphosphorylcholine groups such as 2-methacryloyloxyphosphorylcholine group and 6-methacryloyloxyhexylphosphorylcholine group;
  • (Meth) acryloyloxyalkoxy phosphorylcholine groups such as 2-methacryloyloxyethoxyethyl phosphorylcholine group and 10-methacryloyloxyethoxynor phosphorylcholine group;
  • Alkenylphosphorylcholine groups such as allylphosphorylcholine group, butyrphosphorylcholine group, hexenylphosphorylcholine group, otatur phosphorylcholine group, and desacetylphosphorylcholine group;
  • 2-methacryloyloxychetylphosphorylcholine is preferred.
  • the first unit has 2-metatalyloxyxetyl phosphorylcholine, nonspecific adsorption of the cage RNA fragment on the surface of the carrier can be more reliably suppressed.
  • the force exemplified by the phosphorylcholine group represented by the following formula (a) as the basic skeleton is exemplified. It may be replaced with a phosphoric acid group such as a phosphorylserine group of the following formula (d), a phosphorylglycerol group of the following formula (e), or a phosphatidyl phosphorylglycerol group shown by the following formula (f) (the following !, But the same).
  • a phosphoric acid group such as a phosphorylserine group of the following formula (d), a phosphorylglycerol group of the following formula (e), or a phosphatidyl phosphorylglycerol group shown by the following formula (f) (the following !, But the same).
  • the carboxylic acid derivative is obtained by activating the carboxyl group of the carboxylic acid, and C
  • the carboxylic acid derivative is a compound in which a nucleophilic reaction is activated by bonding a group having higher electron withdrawing property than an alkoxyl group to a carbonyl group.
  • Carboxylic acid-derived groups are compounds having reactivity with amino groups, thiol groups, hydroxyl groups and the like.
  • a carboxyl group such as carboxylic acid, such as acrylic acid, methacrylic acid, crotonic acid, maleic acid, fumaric acid, is an acid anhydride, acid.
  • carboxylic acid such as acrylic acid, methacrylic acid, crotonic acid, maleic acid, fumaric acid
  • Examples include halides, active esters, and compounds converted to active amides.
  • Carboxylic acid-derived groups are activated groups derived from such compounds, for example, active ester groups such as p-trophenyl groups and N-hydroxysuccinimide groups;
  • Halogens such as Cl F
  • the carboxylic acid-derived group may be a group represented by the following formula (1).
  • A is a leaving group excluding a hydroxyl group.
  • the monovalent group represented by the above formula (1) can be, for example, V selected from the following formula (p) or formula (q), or any group.
  • R 1 and R 2 are each independently a monovalent organic group, linear, branched, and cyclic.
  • R 1 may be a divalent group that forms a ring together with C.
  • R 2 together with N It may be a divalent group forming a ring.
  • Examples of the group represented by the formula (p) include groups represented by the following formulas (r), (s), and (w). Further, as a group represented by the above formula (q), for example, represented by the following formula (u) Groups.
  • the group represented by the above formula (1) is, for example, a group derived from an acid anhydride represented by the following formula (r), formula (s) or the like;
  • an active ester group is preferably used because it is excellent in reactivity under mild conditions.
  • Mild conditions include, for example, neutral or alkaline conditions, specifically pH 7.0 or higher and 10.0 or lower, more specifically pH 7.6 or higher and 9.0 or lower, and more specifically pH 8. Can be 0.
  • the "active ester group” as defined in the present specification is not strictly defined according to the definition, but as a conventional technical expression, an alcohol of the ester group is defined.
  • a group of esters that have a high acidity and an electron-attracting group on the side to activate a nucleophilic reaction that is, an ester group having a high reaction activity, can be used for various chemical syntheses, such as polymers. Those commonly used in the fields of chemistry, peptide synthesis and the like.
  • the ester group has an electron-withdrawing group on the alcohol side of the ester group and is more active than the alkyl ester.
  • the active ester group has reactivity with groups such as amino group, thiol group and hydroxyl group. More specifically, phenol esters, thiophenol esters, N hydroxyamine esters, cyanomethyl esters, esters of heterocyclic hydroxy compounds, etc. have much higher activity than alkyl esters. Known as the active ester group.
  • the activated carboxylic acid derivative group in the polymer substance is an active ester group
  • the active ester group include p-trophenyl group, N-hydroxysuccinimide group, succinimide group, phthalimide group, 5-norbornene 2,3-dicarboximide group, and the like, for example, p-trophenyl group. It is preferably used.
  • the first unit containing a phosphorylcholine group is 2-methacryloyloxy.
  • the polymer substance used for the coating layer of the carrier of the present embodiment may contain other groups in addition to the phosphorylcholine group and the carboxylic acid derivative group.
  • the polymer substance can be a copolymer.
  • the polymer substance is preferably a copolymer containing a butyl methacrylate group.
  • the polymer substance is composed of a first monomer having a 2-methacryloyloxychetyl phosphorylcholine (MPC) group, and a p-trope-oxycarboxyl polyethylene glycol methacrylate (NPMA) group. And a second monomer having a butyl metallate (BMA) group.
  • MPC 2-methacryloyloxychetyl phosphorylcholine
  • NPMA p-trope-oxycarboxyl polyethylene glycol methacrylate
  • BMA butyl metallate
  • a, b, and c are each independently a positive integer.
  • the first to third monomers may be block copolymerized, or these monomers may be randomly copolymerized! /.
  • the copolymer represented by the general formula (2) has an appropriate hydrophobic property of the high molecular weight material, a property of suppressing non-specific adsorption of the cage RNA fragment, and a property of immobilizing the primer. This is an even better structure. For this reason, by using such a copolymer, the surface of the support is more reliably coated with the polymer substance, and nonspecific adsorption of the vertical RNA fragment onto the carrier coated with the polymer substance is performed. In addition, the primer can be more securely immobilized by covalent bonding and introduced onto the carrier while suppressing the above.
  • the copolymer represented by the general formula (2) can be obtained by mixing MPC, BMA, and NPMA monomers and using a known polymerization method such as radical polymerization.
  • a known polymerization method such as radical polymerization.
  • solution polymerization is performed in an inert gas atmosphere such as Ar under a temperature condition of 30 ° C to 90 ° C. I can do it.
  • the solvent used for the solution polymerization is appropriately selected.
  • methanol, ethanol ⁇ isoprono nore, etc., an alcoholate, ethinoleethenore, etc., organic solvents such as chlorohonole, alone or in combination Can be used.
  • it can be a mixed solvent in which the volume ratio of diethyl ether and black mouth form is 8 to 2.
  • radical polymerization initiator used in the radical polymerization reaction those usually used can be used.
  • azo-based initiators such as azobisisobutyor-tolyl (AIBN), azobis valero-tolyl;
  • Lauroyl peroxide Lauroyl peroxide, benzoyl peroxide, t-butylperoxyneodecanoate, tube Oil-soluble organic peracids such as tilperoxybivalate;
  • polymerization is carried out in Ar at 60 ° C for about 2 to 6 hours using a mixed solvent and AIBN in which the volume ratio of jetyl ether and black mouth form is 8 to 2. Can do.
  • the high molecular substance has a third unit including a butyl metatalylate group.
  • the first unit including a phosphorylcholine group and the second unit including a carboxylic acid derivative group are described.
  • a second polymer material having a first unit containing a phosphorylcholine group and a third unit containing a butylmetatalylate group. But, okay.
  • the first unit of the first polymer substance and the first unit of the second polymer substance may have the same structure or different structures. Further, when the first polymer substance includes a third unit containing a butyl metatalylate group, the third unit of the first polymer substance and the third unit of the second polymer substance are the same. It may be a structure or a different structure.
  • Such a second polymer substance is used as a polymer that suppresses non-specific adsorption of cage DNA fragments.
  • Such polymers for example phosphorylcholine group 30 molar 0/0, contains a proportion of butyl methacrylate Tali rate group 70 mole 0/0, MPC poly mer is shall (manufactured by NOF Corporation) Can be used.
  • the polymer substance when the polymer substance is composed of the first polymer substance and the second polymer substance, these polymer substances can be mixed to form a structure. Since each polymer substance polymer can be dissolved in, for example, an ethanol solution, a mixed polymer can be easily obtained by mixing each polymer solution.
  • the carrier including the coating layer having the polymer substance force as described above can be obtained by applying a liquid containing the polymer substance on the surface of the carrier processed into a predetermined shape and drying it. Further, the carrier may be immersed in a liquid containing a polymer substance and dried.
  • plastic material when used as the carrier, the flexibility to change the shape and size is ensured, and it can be provided at a lower cost than that of the glass carrier. Force is also preferred.
  • plastic materials include glass transitions of 100 ° C or higher. Those having a transition point are preferred, and in particular, from the viewpoint of ease of surface treatment and mass production, thermoplastic resin can be used.
  • thermoplastic resin one having a small amount of fluorescence generation can be used. By using a resin having a small amount of fluorescence, the background in the detection reaction of the DNA strand can be lowered, so that the detection sensitivity can be further improved.
  • thermoplastic resins with low fluorescence generation include linear polyolefins such as polyethylene and polypropylene;
  • Etc. can be used.
  • saturated cyclic polyolefin is particularly excellent in heat resistance, chemical resistance, low fluorescence, transparency and moldability, and is therefore suitable for optical analysis and is preferably used as a carrier material.
  • the saturated cyclic polyolefin refers to a saturated polymer obtained by hydrogenating a polymer having a cyclic olefin structure or a copolymer of cyclic olefin and a-olefin.
  • the former include hydrogenation of norbornene-based monomers represented by, for example, norbornene, dicyclopentagen, and tetracyclododecene, and polymers obtained by ring-opening polymerization of these alkyl-substituted products. It is a saturated polymer produced.
  • the latter copolymer is cyclic with ⁇ -olefins such as ethylene, propylene, isopropylene, 1-butene, 3-methyl 1-butene, 1-pentene, 3-methyl 1-pentene, 1-hexene and 1-octene. It is a saturated polymer produced by hydrogenating a random copolymer of olefin monomers.
  • the copolymer is most preferably a copolymer with ethylene. These resins may be used alone or in combination of two or more copolymers or mixtures.
  • a saturated cyclic polyolefin obtained by addition polymerization of a monomer having a cyclic olefin structure formed only by a saturated cyclic polyolefin obtained by ring-opening polymerization of a monomer having a cyclic olefin structure can also be used.
  • a carrier having a plastic material strength including a polymer substance as described above can be obtained by applying a liquid containing a polymer substance on the surface of a carrier processed into a predetermined shape and drying it. Further, the carrier may be immersed in a liquid containing a polymer substance and dried.
  • the material of the carrier is plastic, the shape of a microtiter plate represented by 96 holes or 384 holes, the shape of a substrate represented by a slide glass, the shape of a bead, or a sheet In order to include the reaction in the liquid phase, which can be easily processed into a shape or the like, the shape of a microtiter plate represented by 96 holes or 384 holes is preferable.
  • the polynucleotide for DNA extension immobilized on an insoluble carrier is used as a primer, and, as will be described later, at least one sequence complementary to the polyA-til of mRNA, and at least one RNA Those containing a promoter are preferably used.
  • the polynucleotide for DNA elongation is immobilized on the surface of the carrier.
  • a specific example of this immobilization method will be described below.
  • step (i) when the carrier is in the form of a substrate, the polynucleotide is dissolved or separated when the polynucleotide that anneals with the large RNA fragment is immobilized on the substrate.
  • the method of spotting scattered liquid is preferred.
  • the carrier shape is a microtiter plate
  • a liquid in which the polynucleotide is dissolved or dispersed in the well is dispensed.
  • a part of the active ester group contained in the polymer substance reacts with the polynucleotide to form a covalent bond between the polynucleotides.
  • the solution in which the polynucleotide is dissolved or dispersed can be, for example, neutral force alkaline, for example, pH 7.6 or higher.
  • the polynucleotide After the polynucleotide is immobilized, it may be washed with pure water or a buffer solution in order to remove the strong polynucleotide not immobilized on the surface of the carrier.
  • step (ii) after washing, a polynucleotide other than immobilized polynucleotide is used.
  • An inert ester treatment of the active ester on the surface of the plastic carrier is performed with an alkaline compound or a compound having a primary amino group.
  • alkaline compounds include sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, disodium hydrogen phosphate, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, sodium borate, hydroxide Lithium, potassium phosphate, or the like can be used.
  • Examples of the compound having a primary amino group include glycine, 9 aminoacazine, aminobutanol, 4-aminobutyric acid, aminocaprylic acid, aminoethanol, 5 amino 2,3 dihydro-1,4 pentanol, aminoethanethiol hydrochloride Salt, aminoethanethiolsulfate, 2- (2aminoethylamino) ethanol, dihydrogen phosphate 2-aminoethyl, hydrogensulfate aminoethyl, 4- (2-aminoethyl) morpholine, 5-aminofluorescein 6-aminohexanoic acid, aminohexylcellulose, p-aminohippuric acid, 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3-propanediol, 5-aminoisophthalic acid, aminomethane, aminophenol, 2-aminooctane, 2-aminooctane Acid, 1-amino-2-propanol,
  • the introduction of the amino group makes it possible to immobilize the polynucleotide on the surface of the carrier efficiently and firmly.
  • the amino group can be introduced at the end of the molecular chain or at the side chain of the primer. However, introduction of the amino group at the end of the molecular chain enables more efficient annealing with complementary vertical RNA fragments. It is preferable from the viewpoint of being able to.
  • the single-stranded cDNA immobilized carrier can be obtained by removing the liquid phase.
  • RNA fragment, nucleotide monomer, and reverse transcriptase or polymerase activity A solution containing an enzyme having a property is brought into contact with the surface of the insoluble carrier.
  • a DNA extension vertical RNA fragment, dATP, dCTP, dGTP, and dTTP to be used for the purpose of signaling a DNA extension polynucleotide immobilized on the surface of an insoluble carrier.
  • a sample comprising a nucleotide monomer comprising) and an enzyme having reverse transcriptase or polymerase activity is introduced.
  • reaction system of the introduced sample an extension reaction in which a reverse enzyme and Z or an enzyme having a polymerase activity is converted into a cocoon-shaped RNA is used, but the reverse transcriptase and Z used in the present invention are used.
  • enzymes with polymerase activity include Moroni mouse leukocyte virus (M— MLV) reverse transcriptase, Rous sarcoma virus (RSV) reverse transcriptase, avian myeloblastosis (AMV) reverse transcriptase, Rous unseated virus (RAV) ) Reverse transcriptase, osteomyeloblastosis associated virus (MAV) reverse transcriptase, human immunodeficiency virus (HIV) reverse transcriptase, retrovirus reverse transcriptase, retrotransposon reverse transcriptase, hepatitis B reverse transcriptase , Cauliflower mosaic reverse transcriptase, bacterial reverse transcriptase, Thermus the rmophilus (Tth) DNA polymerase, Thermus aquaticus (Taq) DNA polymerase, Therm otoga neopolitana (T ne DNA polymerase ⁇ C, Thermotoga maritime (Tma DNA polymerase, Thermococcus
  • an RNase inhibitor should be added for the purpose of suppressing the degradation of RNA in the form of a cage.
  • RNA fragment in the solution is formed into a cage shape and the polynucleotide for DNA extension immobilized on the carrier surface is extended to form a single-stranded cDNA. That is, by controlling the temperature of the reaction system described above, a DNA chain elongation reaction takes place, that is, a DNA fragment force complementary to the truncated RNA fragment is formed on the carrier, and the cDNA strand is in the form of a hybrid with the RNA strand. Can be obtained.
  • Reaction temperature and time are not particularly limited. Characteristics such as DNA polymerase and restriction enzyme, stability of vertical DNA or RNA. Depends on quality and absolute quantity. Good.
  • the cDNA production reaction is completed by washing with, for example, a 0.1 lwt% SDS solution.
  • the present invention uses the above-described single-stranded DNA-immobilized carrier to bring a solution containing a sense and antisense primer, a DNA polymerase, and a nucleotide monomer into contact with the carrier.
  • the PCR is carried out by a predetermined heat cycle, and the DNA strand is produced in the liquid phase by extending and amplifying the DNA strand in the form of a single-stranded DNA that is immobilized on a carrier.
  • a method for producing a DNA strand is provided.
  • the present invention provides a carboxylic acid-derived compound in which a first unit having a group derived from a phosphate ester constituting the hydrophilic part of a phospholipid and an electron-withdrawing substituent are bonded to a carbo group.
  • An insoluble carrier having a polymer substance containing a second unit having a group on the surface,
  • a method for producing a cDNA strand comprising
  • the insoluble carrier described in the first embodiment can be used.
  • the polynucleotide for DNA extension one containing a sequence complementary to the poly A-til of mRNA is used, and preferably it may further contain at least one RNA promoter.
  • the polynucleotide can be bound to the surface of the insoluble carrier in the same manner as in the first embodiment.
  • the polynucleotide immobilized on the carrier preferably includes at least one sequence complementary to the polyA tile of mRNA.
  • This polynucleotide-immobilized carrier is also useful in a variety of methods, including the production of sense or antisense cDNA.
  • This polynucleotide-immobilized carrier is also useful for the production of sense or antisense mRNA.
  • the polynucleotide immobilized on the carrier in the present invention preferably contains a sequence complementary to the polyA-til of mRNA, such as oligo dT. Further, it preferably contains an mRNA promoter sequence.
  • the present invention is formed by bonding the first unit having a group derived from a phosphate ester constituting the hydrophilic part of the phospholipid and the electron-withdrawing substituent force S-carbonyl group.
  • Nucleotide-immobilized DNA in which a polynucleotide containing at least one sequence complementary to the polyA-till of mRNA is immobilized on an insoluble carrier having a polymer substance containing a second unit having a carboxylic acid-derived group on the surface.
  • a carrier is provided.
  • the immobilized nucleotide further contains at least one RNA promoter, preferably at least two RNA promoters.
  • the polynucleotide is usually immobilized on an insoluble plate such as a microtiter plate, and the present invention provides such a microtiter plate.
  • the microtiter plate according to one preferred embodiment of the present invention has at least two wells, each of which has a different polynucleotide immobilized.
  • the polynucleotide-immobilized carrier of the present invention can be used for the production of sense or antisense single-stranded cDNA, and sense or antisense mRNA.
  • the single-stranded cDNA produced on the polynucleotide-immobilized carrier in the present invention is stable for a long period of time and is stably immobilized on the substrate surface, so that cDNA or mRNA is produced many times. This can be used repeatedly.
  • the polynucleotide comprising at least one sequence complementary to the polyA-til of mRNA is bound to an insoluble carrier and is a nucleotide-immobilized carrier.
  • these sequences are preferably 6 to: L00 nucleotides long.
  • the immobilized polynucleotide further comprises an RNA promoter and a Z or restriction enzyme recognition site.
  • its 5 'end is fixed to an insoluble carrier and its 3' end is complementary to the poly A-til of mRNA.
  • One embodiment of the present invention is a polynucleotide-immobilized carrier in which a polynucleotide is immobilized on an insoluble dish, preferably a microtiter plate.
  • the immobilized polynucleotide includes at least one sequence complementary to the poly A tile of mRNA, eg, poly dT.
  • RNA promoter In a further preferred embodiment, it has an RNA promoter.
  • Another embodiment of the present invention is a polynucleotide-immobilized carrier in which a polynucleotide is bound to an insoluble carrier containing at least one RNA promoter.
  • the most preferred embodiment is one that includes either the T7 or SP6 RNA promoter! /.
  • the single-stranded DNA of an insoluble carrier preferably an insoluble carrier and a single-stranded DNA-immobilized carrier comprising a single-stranded DNA bound thereto, is mRNA. At least a sequence complementary to the poly-A-til.
  • the single stranded DNA has an RNA promoter, more preferably the single stranded DNA contains at least two different RNA promoters. More preferably, these promoters are T7 or SP6 RNA promoters.
  • step (b) add the mRNA-containing sample solution having poly-A-tille to the carrier on which the polynucleotide for DNA strand elongation is immobilized, and reverse-transcribe to it.
  • a solution containing the enzyme and a solution containing nucleotide monomers containing dATP, dCTP, dGTP and dTTP (one of which may be labeled).
  • step (c) the hybridization between the poly A-til part of the mRNA and a sequence complementary to the poly A-til of the polynucleotide for DNA extension immobilized on the carrier is carried out.
  • step (d) the polynucleotide for DNA elongation is elongated using mRNA as a saddle shape to obtain a cDNA strand complementary to the mRNA.
  • steps (c) and (d) are the same
  • the steps (c) and (d) may comprise an incubation at a predetermined temperature, for example 37 ° C.
  • a single-stranded cDNA-immobilized carrier obtained by binding a polynucleotide, preferably a polynucleotide having at least one RNA promoter, to an insoluble carrier.
  • This polynucleotide preferably has at least one sequence complementary to the polyA-til of mRNA and forms a nucleotide-fixing carrier.
  • a poly A-til mRNA-containing solution such as cell lysate is added, and mRNA polyadyllate (poly A-til) is hybridized to the immobilized polynucleotide sequence. More preferably, the carrier and the solution are incubated. .
  • An antisense cDNA complementary to the annealed mRNA is produced.
  • a single-stranded cDNA-immobilized carrier additionally comprising an RNA promoter obtained by producing a carrier on which single-stranded cDNA is immobilized in this way and then removing the liquid phase.
  • a solution containing DNA polymerase, DNA ligase, and nucleotide monomer can be brought into contact with the surface of a single-stranded cDNA-immobilized carrier to form a double-stranded cDNA.
  • nucleotide monomers included in a solution to be contacted with a single-stranded cDNA immobilization support include dATP, dCTP, dGTP, and dTTP.
  • dATP dATP
  • dCTP dCTP
  • dGTP dGTP
  • dTTP dTTP
  • RNA strand can be produced by bringing a solution containing RNA polymerase and a nucleotide monomer into contact with the surface of a double-stranded cDNA-immobilized carrier, and the present invention includes such a production step.
  • a method for producing an RNA strand is provided. In this method for producing RNA strands, nucleotide monomers included in the solution brought into contact with the double-stranded cDNA-immobilized carrier include ATP, CTP, GTP and UTP.
  • antisense mRNA is produced.
  • an initial solution phase and a solid phase are formed by incubating a carrier and a sample solution, and then the reaction is started in the following steps.
  • the present invention can be obtained by producing a carrier on which a single-stranded cDNA is immobilized by the method for producing a cDNA strand as described above, and then removing the liquid phase.
  • a solution containing DNA polymerase, DNA ligase, and nucleotide monomer is brought into contact with the surface of the cDNA-immobilized carrier, and the RNA promoter power is also increased.
  • a method for producing an RNA strand characterized by producing an antisense mRNA.
  • the present invention also provides a method for producing sense single-stranded cDNA, wherein double-stranded cDNA is prepared by the following method, and then the second reaction mixture and the solid phase are heated. At this time, a second liquid phase containing the sense single-stranded cDNA is obtained.
  • the present invention provides a method for producing sense cDNA using the double-stranded cDNA-immobilized carrier as described above. After the sense and antisense cDNAs form a double-stranded cDNA in the liquid phase, the double-stranded cDNA is denatured, resulting in a sense cDNA in the liquid phase.
  • One feature of the embodiment of the present invention is a method for producing sense single-stranded cDNA.
  • This method involves the production of a double-stranded cDNA-immobilized carrier in the liquid phase, where one strand of a double-stranded cDNA strand is immobilized on an insoluble carrier and one of the double-stranded cDNA strands.
  • This strand contains at least one sequence complementary to the polyA till of mRNA.
  • the double-stranded cDNA-immobilized carrier is denatured to obtain sense cDNA in the liquid phase.
  • sense mRNA means mRNA equivalent to genetic information
  • antisense mRNA means a polynucleotide complementary to sense mRNA.
  • the sense single-stranded cDNA contains genetic information equivalent to that of the sense mRNA.
  • the uracil of the mRNA is replaced by thymine and the nucleotide is a deoxyribonucleotide, not a ribonucleotide.
  • a 96-well microtiter was obtained by injection molding using a hydrogenated product of a 5-methyl-2-norbornene ring-opening polymer (MFR: 21 gZlO content, hydrogenation rate: substantially 100%, heat distortion temperature: 123 ° C). Plates were molded.
  • PNBM each group, the molar 0/0 25 : 74: 1 to 0.5 coated on a weight 0/0 ethanol solution
  • PNBM plate each group, the molar 0/0 25 : 74: 1 to 0.5 coated on a weight 0/0 ethanol solution
  • PNBM plate each group, the molar 0/0 25 : 74: 1 to 0.5 coated on a weight 0/0 ethanol solution
  • An Icrotiter plate was formed. After oxygen plasma was applied to the molded 96-well titer plate, amino groups were introduced with aminosilane, aldehyde groups were then introduced into amino groups with dartal aldehyde, and aldehyde group introduced 96-well microtiter plates were prepared. Hereinafter, it is referred to as an aldehyde plate.
  • Oligo T (T15, ⁇ 20, ⁇ 30) modified at the end with an amino group was dissolved in 0.25 ⁇ carbonate buffer ( ⁇ 9.0) to prepare 10 / ⁇ ⁇ ⁇ ⁇ oligo 13 ⁇ 4 solution .
  • the ETFE sheet was removed from each well and washed. After washing, each well blocking was performed.
  • 400 ⁇ l of ImolZl NaOH solution was poured into each well as a blocking solution for each well and left at room temperature for 5 minutes.
  • the blocking solution was removed and washing was performed with pure water.
  • a solution of 0.6 g sodium borohydride and 50 ml ethanol in 180 ml phosphate buffer was used as a blocking solution, and 400 1 min was poured into each well and left at room temperature for 5 min. Then, the blocking solution was removed and washing was performed with pure water.
  • Each plate was dried and subjected to cDNA synthesis from the following total RNA.
  • RNAs Inhibitor (Super), ImM Cy3 labeled dUTP, 20 mM dATP, 20 mM dGTP, 20 mM dCTP, DEPC treated water
  • TE buffer (10 mM Tris / HCl (pH 8.5), ImMEDTA) was dispensed to float and remove the ETFE sheet. Washed twice with TE buffer, washed with pure water and dried.
  • Fluorescence images of the bottom surfaces of each well were taken with a fluorescence microscope, and the amount of fluorescence was numerically determined by image processing, and the conditions of cDNA synthesis were compared. That is, if fluorescence is observed, it indicates that cDNA has been synthesized, and if the fluorescence intensity is high, cDNA is efficiently synthesized.
  • Table 1 shows the fluorescence intensity of the wells with each oligo T immobilized on the PNBM plate and aldehyde plate.
  • the fluorescence intensity value of each well was obtained by subtracting the fluorescence intensity value of the well where Oligo T was not immobilized, and was used as the fluorescence intensity by cDNA synthesis.
  • a method for producing a cDNA strand comprising

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Abstract

　リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、ＤＮＡ伸長用のポリヌクレオチドを固定化する工程、ＲＮＡ断片、ヌクレオチドモノマー、及び逆転者酵素又はポリメラーゼ活性を有する酵素を含む溶液を不溶性担体表面に接触させる工程、溶液中のＲＮＡ断片を鋳型にしてＤＮＡ伸長用のポリヌクレオチドを伸長させて１本鎖のｃＤＮＡを形成する工程を含むｃＤＮＡ鎖の製造方法。

Description

cDNAおよび RNA鎖の製造方法およびヌクレオチド固定化担体 技術分野
[0001] 本発明は、遺伝子の保存や分析に有用なポリヌクレオチド固定化担体、そのポリヌ クレオチド固定ィ匕担体を用いる cDNAの製造方法、並びに cDNAを铸型とした DN A鎖及び RNA鎖の製造方法に関する。
背景技術
[0002] 大部分の生物は、遺伝情報が DNAの形で保存されている。この DNAはメッセンジ ヤー RNA(mRNA)に転写され、次いで、この mRNAはタンパク質に翻訳される。真 核細胞においては、ゲノム DNAが成熟 mRNAにプロセシングされるときに、通常、 いくつかの遺伝情報の欠落が起こる。この欠落はイントロン Zェキソン、すなわち、 R プライシングもしくはタンパク質のプロセシングによって起こる。したがって、タン パク質構造の遺伝的基礎的解析は、ゲノム DNAよりも mRNAを使って研究するほう が有禾 ljである。
しかし、 mRNAは非常に不安定であり、種々の RNA分解酵素により、容易に分解 を受ける。そこで、従来 mRNAをもとに合成した DNA鎖（cDNA)が研究の材料に 使われている。 cDNAはターゲットの mRNAを铸型として、 1本鎖 DNAを生産できる 逆転写酵素を用いつくられる。
ポリペプチドをコードする配列を含む mRNA (すなわち、センス mRNA)の転写に 関与するベクターのプロモーターの利用に加えて、相補的 cDNA鎖力 転写された アンチセンス mRNAをつくることもできる。アンチセンス mRNAは、タンパク質の生物 学的機能や、その作用が未だ知られて 、な 、mRNAを理解する有用な道具である。 アンチセンス RNA分子はターゲット mRNAと共にァニールさせ、翻訳を阻害すること によって、特異的タンパク質の生産をブロックする。それため、この型の翻訳阻害は 種々の病状に関連するいろいろな遺伝子産物の研究に重要であろうと思われる。
1本鎖 cDNAは、 DNAポリメラーゼの触媒作用による 2本鎖 cDN Aの合成の基礎と して使用されるほ力 ポリメラーゼ'チェイン'リアクション（以下、 PCRという。）の铸型 として使用できる。この方法で、反対向きの複数のヌクレオチド 'プライマーと熱安定 性 DNAポリメラーゼを用いて、特異的な遺伝子配列を迅速に増幅できる。ァユーリン グと DNA合成のサイクルを繰り返すことにより、ターゲット遺伝子のコピーが速やかに つくられる。こうして、センス 1本鎖 cDNAは、それに対応する 2本鎖 cDN Aのセグメン トを特異的に増幅させるため使われる。
液相法では、生じた 2本鎖 cDNAは分子の方向を決定するマーカーが含まれてい ない。したがって、新しくつくられた 2本鎖 cDNAクローンは、その 50%に転写方向の 誤りがあると思われ、そのままではクローニング'ベクターへ挿入できない。それゆえ、 ベクターへ正しい方向で挿入し、 mRN Aを迅速にクローユングする方法力 望まれ ている。
1本鎖 cDNAあるいは 2本鎖 cDNAは、固相を用いることによってもつくられる（非 特許文献 1)。固相法では、通常、多孔性ビーズに固定されたポリデォキシチミジル酸 (ポリ dT)が mRNAのポリアデュル酸（ポリ A)ティルと相補し結合する。次いで、アン チセンス 1本鎖 cDNA力 結合された mRNA力 逆転写酵素によってつくられる。铸 型の RNAが消化分解されたのち、第 2の cDNA鎖が DNAポリメラーゼによって合成 される。生じた 2本鎖 cDNAは、ビーズに固定化されたアンチセンス鎖をもっている。 しかし固相法においては、 2本鎖 cDNA産物は不溶性担体力 切り離すことができ ない。この問題を避けるためには、 2本鎖 cDNA産物を加熱し、担体に固定された 2 本鎖 cDNAから 1本鎖 cDNAを遊離させ、この 1本鎖 cDNAを用いて、 2本鎖 cDNA が PCRで合成される。しかし、これは反応にもう一つのステップが加わることを意味し 、 PCR反応ごとに適当なー揃 、のプライマーが必要となる。
それゆえ、単離された mRNAから、結合型ではない 2本鎖 cDNAクローンを創る単 純な方法が要求されて 、る。
また、 cDNAクローンから mRNAを合成できる種々の方法も知られており、その一つ は液相法である（非特許文献 2)。この方法においては、 RNAプロモーターをもつベ クタ一に 2本鎖 cDNAが挿入される。ベクターは次いで、制限酵素で消化されて直鎖 状となり、 RNAポリメラーゼの作用で mRNAが合成される。合成された mRNAは、 铸型 DNAを除去するため DNaseで処理される。必要ならばこのとき、新たに合成さ れた RNAの末端に、ターミナル 'トランスフェラーゼ及び dATPを用いてポリアデニル 酸ティルが付加される。
mRNAの固相合成法もまた、よく知られている。その一つは、非特許文献 3に書か れている。この方法では、 DNA配列が制限酵素によってバタテリオファージ 'ラムダ のゲノムカゝら消化されて、粘着末端をもつランダム DNA断片が生じる。これを T4DN Aポリメラーゼを用い、ピオチンィ匕 dUTPによって粘着末端を満たし平滑ィ匕する。 T4DNAポリメラーゼによる DNA合成のあ!、だ、ピオチン化 dUTPがハイブリダィズ するように、むき出しの dAヌクレオチドをもつ粘着末端が残るように、制限酵素が選 ばれる。ランダム配列が次に、アビジンをもつアクリルアミド担体に固定ィ匕される。 mR NAが天然のラムダ'プロモーター配列をもつ配列から、 T7RNAポリメラーゼ又は S P6RNAポリメラーゼを用いて、合成される。この系は、バタテリオファージ 'ラムダに おける転写の速度論的解析の研究のため設計されたものである。
mRNAの液相及び固相合成法はいずれも、欠点を有している。液相合成法は、 R NAプロモーター含有のベクターの使用が必要な上、挿入の後、ベクターは、直鎖状 の配列に変換されなければならない。固相合成法は、いつも完全な遺伝情報を提供 するとは限らない。なぜなら、この情報は固定ィ匕されたゲノム DNAの情報であって m RNAの情報ではないからである。それゆえ、改良された mRNAの合成方法が望ま れている。
非特許文献 4には、固相担体にァミノ結合を介して共有結合されたオリゴヌクレオチ ドは、 PCRの実験に便利に使用できると記載されている。しかし、ここで記載されてい るテクニックは、 cDNAや RNAの生産を特異的に提供するものではない。そのうえ、 担体に共有結合されたオリゴヌクレオチドを除くメカニズムについては何ら提供されて いない。
特許文献 1には、固体担体上にオリゴヌクレオチドを固定し、 RNAを铸型にして固体 表面上で cDNAを生成させる方法が開示されている。また、特許文献 2には、担体上 に RNAを固定し、逆転写酵素で cDNAを製造する方法が開示されている。
しかしながら、固相表面と液相間での酵素を用いた、核酸鎖の伸長反応は起こりに くぐ生成させた cDNA力 铸型となる mRNAの発現状況を正確に反映したものか疑 問が残る。
[0004] 非特許文献 1 : 1. Raineriet al.、 NucleicAcids Research, 19:4010, 1991
非特許文献 2 : S. Shichijo et al, J. Neurosci. Res., 30:316—320, 1991
非特許文献 3 : Hironori Terada (寺田博之）「固定ィ匕 DNAによる転写の動的解析」（Bi ophysics (生物物理）、 31:49- 52、 1991
非特許文献 4 : Stamm et al., Nucleic Acids Res., 19:1350, 1991
特許文献 1：特許公表平 8— 500722
特許文献 2：特許公表 2003 - 519482
発明の開示
[0005] 本発明の目的は、不溶性担体にぉ 、て mRNAを铸型に DNA鎖の伸長反応が効 率よく行え、かつ铸型 mRNAの発現状況を正確に反映した cDNAを製造する方法、 及び製造した cDNAをもとに RNA鎖および DNA鎖の製造が容易に行える方法を提 供することである。
[0006] 本発明は、
(1)リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位 と電子求引性の置換基力 Sカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第 二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、（l) DNA伸長用のポリ ヌクレオチドを固定ィ匕させてポリヌクレオチド固定ィ匕担体を形成する工程、 (2)RNA 断片、ヌクレオチドモノマー、及び逆転写酵素又はポリメラーゼ活性を有する酵素を 含む溶液を前記不溶性担体表面に接触させる工程、 (3)溶液中の前記 RNA断片を 铸型にして担体表面に固定ィ匕されている前記 DNA伸長用のポリヌクレオチドを伸長 させて 1本鎖の cDNAを形成する工程、を含むことを特徴とする cDNA鎖の製造方 法、
(2)リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位 と電子求引性の置換基力 Sカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第 二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、
(a)少なくとも一つの、 mRNAのポリ Aティルに相補的な配列を含む DNA伸長用ポ リヌクレオチドを、前記不溶性担体に結合させる工程、 (b)前記 DNA伸長用ヌクレオチドが固定ィ匕された担体に、ポリ Aティルをもつ mRN A含有試料溶液、逆転写酵素を含む溶液およびヌクレオチドモノマーを含む溶液を 加える工程、
(c)前記 mRNAのポリ Aティルと、ポリ Aティルに相補的な配列をハイブリダィズさせ る工程、
(d)前記 mRNAを铸型として、 DNA伸長用ポリヌクレオチドを伸長させ、 mRNAに 相補的なアンチセンス cDNAを製造する工程、
を含む cDNA鎖の製造方法、
(3)工程 (c)、（d)を、同じ液相中で行う（2)記載の cDNA鎖の製造方法、
(4)工程 (c)、 (d)が、所定の温度でのインキュベートを含んで 、る (2)又は（3)記載 の cDNA鎖の製造方法、
(5)前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホス ホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシト ール基、ホスホリルグリセロール基、及びホスファチジルホスホリルグリセロール基から 選ばれる少なくとも 1つの基である（ 1)〜 (4) 、ずれか記載の cDNA鎖の製造方法、
(6)前記ヌクレオチドモノマーを含む溶液が dATP、 dCTP、 dGTP及び dTTPを含 む（1)〜（5) 、ずれか記載の cDNA鎖の製造方法、
(7)前記 DNA伸長用ポリヌクレオチド力 少なくとも一つの RNAプロモーターを更に 含む（1)〜（6) V、ずれか記載の cDNA鎖の製造方法、
(8) (1)〜（7)いずれか記載の cDNA鎖の製造方法により 1本鎖 cDNAが固定ィ匕さ れた担体を製造した後、液相を除去して得られる 1本鎖 cDNA固定化担体、
(9) (8)記載の 1本鎖 cDNA固定ィ匕担体を使用して、前記担体上にセンス及びアン チセンスプライマー、 DNAポリメラーゼ、及びヌクレオチドモノマーを含む溶液を接 触させ、所定のヒートサイクルにより PCRを行い、担体に固定ィ匕されている 1本鎖 cD NAを铸型にして DNA鎖を伸長増幅することをことにより液相中に DNA鎖を製造す ることを特徴とする DNA鎖の製造方法、
(10)前記ヌクレオチドモノマーが dATP、 dCTP、 dGTP及び dTTPを含み、 dATP 、 dCTP、 dGTP,及び dTTPの内、少なくとも一つが標識されたものである（9)記載 の DNA鎖の製造方法、
(11) (7)記載の cDNA鎖の製造方法により 1本鎖 cDNAが固定ィ匕された担体を製 造した後、液相を除去して得られる RNAプロモーターを付カ卩的に含んでいる 1本鎖 c DNA固定化担体に、 DNAポリメラーゼ、 DNAリガーゼ及びヌクレオチドモノマーを 含む溶液を前記 cDNA固定ィ匕担体表面に接触させ、 2本鎖の cDNAを形成させる 工程を含む DNA鎖の製造方法、
(12)前記ヌクレオチドモノマーが dATP、 dCTP、 dGTP及び dTTPを含み、 dATP
、 dCTP、 dGTP,及び dTTPの内、少なくとも一つが標識されたものである（11)の D NA鎖の製造方法、
(13) (11)記載の DNA鎖の製造方法により 2本鎖 cDNAが固定ィ匕された担体を製 造した後、液相を除去して得られる RNAプロモーターを付カ卩的に含んで ヽる 2本鎖 の cDNA固定化担体に、 RNAポリメラーゼおよびヌクレオチドモノマーを含む溶液を 前記 2本鎖 cDNA固定ィ匕担体表面に接触させ、 RNA鎖を製造する工程を含む、セ ンス RN A鎖の製造方法、
(14)前記ヌクレオチドモノマーが ATP、 CTP、 GTP、 UTPを含み、 ATP、 CTP、 G TP、 UTPの内、少なくとも 1つが標識されたものである（13)記載のセンス RNA鎖の 製造方法、
(15)リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単 位と電子吸引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する 第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、 mRNAのポリ Aティル に相補的な配列を少なくとも一つ含むポリヌクレオチドが固定ィ匕されたヌクレオチド固 定化担体、
(16)前記固定ィ匕されたヌクレオチドは、さらに RNAプロモーターを少なくとも一つ含 む（ 15)記載のヌクレオチド固定化担体、
(17)前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホ スホリルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシ トール基、ホスホリルグリセロール基、及びホスファチジルホスホリルグリセロール基か ら選ばれる少なくとも 1つの基である（ 15)記載のヌクレオチド固定ィ匕担体、 (18)前記ポリヌクレオチド力 6〜： LOO塩基のヌクレオチドを含む（ 15)から（ 17)のい ずれか記載のヌクレオチド固定ィヒ担体、
(19)前記不溶性担体の形態がマイクロタイタープレートを含む（ 15)から（ 18)いず れか記載のヌクレオチド固定ィ匕担体、
(20)前記マイクロタイタープレートが少なくとも二つのゥエルを有し、前記ゥエル各々 は相異なる固定ィ匕ポリヌクレオチドを含む（19)記載のヌクレオチド固定ィ匕担体、
(21)前記ポリヌクレオチドが、 T7RNAプロモーター又は SP6RNAプロモーターを 含む（16)から（20) V、ずれか記載のヌクレオチド固定ィヒ担体、
(22)前記ポリヌクレオチド力 mRNAのポリ Aティルに相補的な配列としてポリ dTを 含む（15)から（21) V、ずれか記載のヌクレオチド固定ィ匕担体、
(23)前記ポリヌクレオチド力 少なくとも二つの RNAプロモーターを含む（15)から（ 22) V、ずれか記載のヌクレオチド固定ィ匕担体、
(24)前記ポリヌクレオチド力 少なくとも二つの相異なる RNAプロモーターを含む（2 3)記載のヌクレオチド固定ィ匕担体、
(25)前記ポリヌクレオチドが、 T7RNAプロモーター及び SP6RNAプロモーターを 含む（23)又は（24)記載のヌクレオチド固定ィヒ担体、
(26)前記高分子物質がブチルメタタリレート基を含む第三単位を有するものである（ 15)から（25) V、ずれか記載のヌクレオチド固定ィ匕担体、
(27)前記不溶性担体は、前記高分子物質に加えて、ホスホリルコリン基を含む第一 単位と、ブチルメタタリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を表面 に含む（15)から（26) V、ずれか記載のヌクレオチド固定ィ匕担体、
(28)前記不溶性担体が、プラスチック材料力 なる（15)から（27) V、ずれか記載の ヌクレオチド固定ィ匕担体、
(29)前記プラスチック材料力 100°C以上のガラス転移点を有するものである（28) 記載のヌクレオチド固定ィ匕担体、
(30)前記プラスチック材料力 飽和環状ポリオフィン榭脂である（28)記載の固定ィ匕 担体、
である。 [0007] 本発明によれば、担体上で RNAを铸型に DNA鎖の伸長反応が効率よく行え、 m RNAの発現状況を正確に反映した cDNAを生成し、 cDNAとして安定した保存が 可能になり、さらに保存された cDNAをもとに RNA鎖および DNA鎖の製造が容易に 行える、 cDNAの合成方法を提供することができる。
発明を実施するための最良の形態
[0008] 以下、本発明の実施形態について詳細に説明する。
(第 1の実施形態）
本発明は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する 第一単位と電子求引性の置換基がカルボニル基に結合してなるカルボン酸誘導基 を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、 (1) DNA伸 長用のポリヌクレオチドを固定ィ匕させてポリヌクレオチド固定ィ匕担体を形成する工程、 (2)RNA断片、ヌクレオチドモノマー、及び逆転写酵素又はポリメラーゼ活性を有す る酵素を含む溶液を前記不溶性担体表面に接触させる工程、 (3)溶液中の前記 RN A断片を铸型にして担体表面に固定ィ匕されている前記 DNA伸長用のポリヌクレオチ ドを伸長させて 1本鎖の cDNAを形成する工程、を含むことを特徴とする cDNA鎖の 製造方法を提供する。
[0009] まず、（1)不溶性担体の表面にプライマーとして DNA伸長用のポリヌクレオチドを 固定化させてポリヌクレオチド固定ィ匕担体を形成する。
[0010] ここで使用される担体の表面には、ホスホリルコリン基に代表されるリン脂質の親水 部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位とカルボン酸誘導基 を有する第二単位とを含む高分子物質が存在するようになって！/ヽる。
[0011] ホスホリルコリン基に代表されるリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘 導される基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子 物質は、 RNA鎖の非特異的吸着を抑制する性質と DNA鎖を固定ィ匕する性質とを併 せ持つポリマーである。特に、第一単位に含まれるホスホリルコリン基に代表されるリ ン脂質の親水部を構成するリン酸エステル基は铸型 RNA断片の非特異的吸着を抑 制する役割を果たし、第二単位に含まれるカルボン酸誘導基はプライマーをィ匕学的 に固定ィ匕する役割を果たす。すなわち、プライマーは、前記このコーティング層の活 性エステル基の部位で共有結合して、当該担体の表面に固定ィ匕される。
[0012] 第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリルコリン基、ホスホ リルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール基、ホスホリルダリ セロール基、ホスファチジルホスホリルグリセロール基が挙げられ、特にホスホリルコリ ン基が好適であり。ホスホリルコリン基として、たとえば、 2—メタクリロイルォキシェチ ルホスホリルコリン基、 6—メタクリロイルォキシへキシルホスホリルコリン基等の（メタ） アタリロイルォキシアルキルホスホリルコリン基；
2—メタクリロイルォキシエトキシェチルホスホリルコリン基および 10—メタクリロイルォ キシエトキシノ-ルホスホリルコリン基等の（メタ）アタリロイルォキシアルコキシアルキ ルホスホリルコリン基；
ァリルホスホリルコリン基、ブテュルホスホリルコリン基、へキセニルホスホリルコリン基 、オタテュルホスホリルコリン基、およびデセ-ルホスホリルコリン基等のアルケ -ルホ スホリノレコリン基；
等の基が挙げられる。
[0013] また、これらのホスホリルコリン基のうち、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコ リンが好まし 、。第一単位が 2 -メタタリロイルォキシェチルホスホリルコリンを有する 構成とすることにより、担体表面における铸型 RNA断片の非特異的吸着をより一層 確実に抑制することができる。
[0014] なお、ここでは基本骨格として下記式 (a)に示すホスホリルコリン基である例を挙げ た力 このホスホリルコリンを下記式（b)のホスホリルエタノールアミン基、下記式（c) のホスホリルイノシトール基、下記式（d)のホスホリルセリン基、下記式（e)のホスホリ ルグリセロール基、下記式（f)に示したホスファチジルホスホリルグリセロール基など のリン酸基に置き換えてもよ 、（以下につ!、ても同様)。
[0015] (化 1) 0
o〇= p I
Figure imgf000011_0001
o )
o
O
Figure imgf000011_0002
[0016] カルボン酸誘導体は、カルボン酸のカルボキシル基が活性化されたものであり、 C
=0を介して脱離基を有するカルボン酸である。カルボン酸誘導体は、具体的には、 アルコキシル基よりも電子求引性の高い基がカルボニル基に結合して求核反応が活 性ィ匕された化合物である。カルボン酸誘導基は、アミノ基、チオール基、水酸基等に 対する反応性を有する化合物である。
[0017] 活性ィ匕されたカルボン酸誘導体として、さらに具体的には、カルボン酸であるアタリ ル酸、メタクリル酸、クロトン酸、マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基が、酸無 水物、酸ハロゲン化物、活性エステル、活性ィ匕アミドに変換されたィ匕合物が挙げられ る。カルボン酸誘導基は、こうしたィ匕合物に由来する活性ィ匕された基であり、たとえば 、 p -トロフエ-ル基ゃ N -ヒドロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；
Cl F等のハロゲン；
等の基を有することができる。
[0018] また、カルボン酸誘導基は、下記式（1)に示される基とすることができる。
[0019] (化 2) — A
( 1 )
[0020] (ただし、上記式（1)において、 Aは水酸基を除く脱離基である。 )
上記式（1)に示される一価の基は、たとえば下記式 (p)または式 (q)から選択される V、ずれかの基とすることができる。
[0021] (化 3) 一 C - 0 — CR1
II (P)
o
一 C一 O — NR2
II (q)
O
[0022] (ただし、上記式 (p)および式 (q)にお 、て、 R1および R2は、それぞれ独立して、一価 の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記 式 (p)において、 R1は Cとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式 (q)において、 R2は Nとともに環を形成する二価の基であってもよい。 )
[0023] 上記式 (p)に示される基として、たとえば下記式 (r)、（s)、および (w)に示される基 が挙げられる。また、上記式 (q)に示される基として、たとえば下記式 (u)に示される 基が挙げられる。
[0024] 上記式（1)に示される基は、たとえば下記式 (r)、式 (s)等に示される酸無水物由来 の基；
下記式 (t)に示される酸ハロゲンィ匕物由来の基；
下記式 (u)、式 (w)に示される活性エステル由来の基;または
下記式 (V)に示される活性ィ匕アミド由来の基とすることができる。
[0025] (化 4)
Figure imgf000013_0001
Figure imgf000013_0002
[0026] カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優 れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ 性の条件、具体的には pH7. 0以上 10. 0以下、さらに具体的には pH7. 6以上 9. 0 以下、さらにまた具体的には pH8. 0とすることができる。
[0027] また、本明細書にぉ 、て規定するところの「活性エステル基」は、その定義にっ 、て 厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコー ル側に酸性度の高 、電子求引性基を有して求核反応を活性ィ匕するエステル群、す なわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば 高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。なお、ペプチド合 成の分野においては、泉屋信夫、加藤哲夫、青柳東彦、脇道典著、「ペプチド合成 の基礎と実験」、 1985年発行、丸善、に記載されているように、活性エステル法はァ ミノ酸またはペプチドの C末端を活性ィ匕する方法の一つとして用いられて 、る。 [0028] 実際的には、エステル基のアルコール側に、電子求引性の基を有し、アルキルエス テルよりも活性ィ匕されたエステル基である。活性エステル基は、アミノ基、チオール基 、水酸基等の基に対する反応性を有する。さらに具体的には、フ ノールエステル類 、チォフエノールエステル類、 N ヒドロキシァミンエステル類、シァノメチルエステル 、複素環ヒドロキシ化合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに 高 ヽ活性を有する活性エステル基として知られて ヽる。
[0029] ここでは、高分子物質中の活性化カルボン酸誘導体基が活性エステル基である場 合を例に、説明する。活性エステル基としては、たとえば p -トロフエニル基、 N ヒ ドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸イミド基、 5 ノルボルネン 2, 3 ージカルボキシイミド基等が挙げられる力 たとえば p -トロフエニル基が好ましく用 いられる。
[0030] 表面にプライマーが固定化される担体の場合、第一単位と第二単位のさらに具体 的な構成の組み合わせとして、たとえば、ホスホリルコリン基を含む第一単位が 2—メ タクリロイルォキシェチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル基力 ¾— -トロフエ
-ル基である構成とすることができる。
[0031] また、本実施形態の担体のコーティング層に使用される高分子物質は、ホスホリル コリン基およびカルボン酸誘導基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は 共重合体とすることができる。具体的には、高分子物質がブチルメタタリレート基を含 む共重合体であることが好ましい。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し 、この高分子物質の担体表面への吸着性をさらに好適に確保することができる。
[0032] 具体的には、高分子物質を、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン（MPC )基を有する第一単量体と、 p -トロフエ-ルォキシカルボ-ルポリエチレングリコー ルメタタリレート (NPMA)基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（BMA)基を 有する第三単量体との共重合体とすることができる。これらの共重合体である poly ( MPC - co - BMA - co - NPMA) (PMBN)は、模式的に下記一般式（2)で示さ れる。
[0033] (化 5)
Figure imgf000015_0001
ρ_ニトロフ: Lニルォキシカルボニル
2—メタクリロイルォキシェ于ル /?—ブ于ルメタクリレート
ポリエチレングリコールメタクリレート ホスホリルコリン （M PC) (BMA)
(Ν ΡΜΑ)
[0034] ただし、上記一般式（2)にお 、て、 a、 b、および cは、それぞれ独立して、正の整数 である。また、上記一般式 (2)において、第一〜第三単量体がブロック共重合してい てもよ 、し、これらの単量体がランダムに共重合して 、てもよ!/、。
[0035] 上記一般式 (2)で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、铸型 RN A断片の非特異吸着を抑制する性質と、プライマーを固定ィヒする性質とのバランスと に、より一層優れた構成である。このため、このような共重合体を用いることにより、担 体表面をより一層確実に高分子物質で被覆するとともに、高分子物質がコーティング された担体上への铸型 RNA断片の非特異的吸着を抑制しつつ、プライマーをさらに 確実に共有結合により固定ィ匕して担体上に導入することができる。
[0036] なお、上記一般式（2)で示される共重合体は、 MPC、 BMA、および NPMAの各 単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一 般式 (2)で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、 Ar等の 不活性ガス雰囲気にて、 30°C以上 90°C以下の温度条件で溶液重合を行うことがで きる。
[0037] 溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール ゝイソプロノ ノーノレ等のァノレコーノレや、ジェチノレエーテノレ等のエーテノレ、クロロホノレム 等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジェチ ルエーテルとクロ口ホルムを体積比で 8対 2とした混合溶媒とすることができる。
[0038] また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用され るものを用いることができる。たとえば、ァゾビスイソブチ口-トリル (AIBN)、ァゾビス バレロ-トリル等のァゾ系開始剤；
過酸化ラウロイル、過酸化べンゾィル、 t ブチルペルォキシネオデカノエート、 tーブ チルペルォキシビバレート等の油溶性の有機過酸ィ匕物；
などが用いられる。
[0039] さらに具体的には、ジェチルエーテルとクロ口ホルムを体積比で 8対 2とした混合溶 媒および AIBNを用い、 Ar中、 60°Cにて 2〜6時間程度重合を行うことができる。
[0040] なお、本実施形態では、高分子物質がブチルメタタリレート基を含む第三単位を有 する例を説明したが、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む 第二単位とを有する高分子物質を第一の高分子物質とし、これに加えて、ホスホリル コリン基を含む第一単位とブチルメタタリレート基を含む第三単位とを有する第二の 高分子物質を含んで 、てもよ 、。
[0041] なお、上記第一の高分子物質の第一単位と上記第二の高分子物質の第一単位と は同一構造であってもよいし、異なる構造であってもよい。また、上記第一の高分子 物質がブチルメタタリレート基を含む第三単位を含むとき、この第一の高分子物質の 第三単位と上記第二の高分子物質の第三単位とは同一構造であってもよいし、異な る構造であってもよい。
[0042] このような第二の高分子物質は、铸型 DNA断片の非特異的吸着を抑制するポリマ 一として用いられる。このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が 30モ ル0 /0、ブチルメタタリレート基が 70モル0 /0の割合で含まれて 、るものである MPCポリ マー（日本油脂社製)を用いることができる。
[0043] なお、高分子物質が上記第一の高分子物質、第二の高分子物質からなる場合、こ れらの高分子物質が混合されて 、る構成とすることができる。各々の高分子物質のポ リマーは、たとえばエタノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混 合することにより容易に混合ポリマーを得ることができる。
[0044] 以上のような高分子物質力 なるコーティング層を表面に含む担体は、所定の形状 に加工された担体の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより得 られる。また、高分子物質を含む液体中に担体を浸潰し、乾燥してもよい。
[0045] また、担体として、プラスチック材料を用いた場合には、形状やサイズの変更に対す る柔軟性が確保される上に、ガラス担体のものに比べて安価で提供することができる という観点力も好ましい。このようなプラスチック材料としては、 100°C以上のガラス転 移点を有するものが好ましぐ特に表面処理の容易性および量産性の観点から、熱 可塑性榭脂を用いることができる。
[0046] 熱可塑性榭脂としては、蛍光発生量の少な 、ものを用いることができる。蛍光発生 量の少ない榭脂を用いることにより、 DNA鎖の検出反応におけるバックグランドを低 下させることができるため、検出感度をさらに向上させることができる。蛍光発生量の 少ない熱可塑性榭脂としては、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直鎖状ポ リ才レフイン；
環状ポリオレフイン；
含フッ素樹脂；
等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフインは、耐熱性、耐 薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適 であり、担体の材料として好ましく用いられる。
[0047] ここで、飽和環状ポリオレフインとは、環状ォレフィン構造を有する重合体単独また は環状ォレフィンと aーォレフインとの共重合体を水素添加した飽和重合体を指す。 前者の例としては、たとえばノルボルネン、ジシクロペンタジェン、テトラシクロドデセ ンに代表されるノルボルネン系モノマー、及び、これらのアルキル置換体を開環重合 して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。後者の共重合体 はエチレンやプロピレン、イソプロピレン、 1—ブテン、 3—メチル 1—ブテン、 1—ぺ ンテン、 3—メチル 1—ペンテン、 1—へキセン、 1—オタテン等の α ォレフィンと 環状ォレフィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される 飽和重合体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。これらの 榭脂は単独で用いてもよぐ 2種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であ つてもよい。また、環状ォレフィン構造を有する単量体が開環重合して得られる飽和 環状ポリオレフインだけでなぐ環状ォレフィン構造を有する単量体の付加重合により 得られる飽和環状ポリオレフインを用いることもできる。
[0048] 以上のような高分子物質を表面に含むプラスチック材料力 なる担体は、所定の形 状に加工された担体の表面に高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥することにより 得られる。また、高分子物質を含む液体中に担体を浸潰し、乾燥してもよい。 [0049] なお、担体の材料をプラスチックとした場合、 96穴や 384穴に代表されるマイクロタ イタ一プレートの形状、スライドグラスに代表される基板状のもの、またビーズ状のも の、あるいはシート状のもの等への加工が容易である力 液相での反応を含むにあ たっては、 96穴や 384穴に代表されるマイクロタイタープレートの形状のものが好適 である。
[0050] ここで、不溶性担体に固定ィ匕する DNA伸長用ポリヌクレオチドは、プライマーとして 用いられ、後述するように、 mRNAのポリ Aティルに相補的な配列を少なくとも一つ、 および少なくとも一つの RNAプロモーターを含んでいるものが好適に使用される。
[0051] 次に、担体の表面へ DNA伸長用ポリヌクレオチドを固定ィ匕する。以下、この固定化 方法の一具体例について説明する。
(i)担体上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少なくとも一部 の活性エステル基とポリヌクレオチドとを反応させて共有結合を形成させることにより、 担体表面でポリヌクレオチドを固定ィ匕し、続、て (ϋ)ポリヌクレオチドを固定ィ匕した以 外の担体表面の活性エステル基を不活性ィ匕する、すなわち残りの活性エステル基を 不活性ィ匕することにより、ポリヌクレオチドを担体の表面に固定することができる。以下 、それぞれの工程について説明する。
[0052] 上記工程 (i)にお ヽて、担体形状が、基板状の場合は、铸型 RNA断片とァニール するポリヌクレオチドを基板上に固定ィ匕する際には、ポリヌクレオチドを溶解または分 散した液体を点着する方法が好ま 、。
担体形状が、マイクロタイタープレートの場合は、ゥエル中にポリヌクレオチドを溶解 または分散した液体を分注する。
高分子物質に含まれる活性エステル基の一部がポリヌクレオチドと反応して、ポリヌ クレオチドの間で共有結合が形成される。
[0053] このポリヌクレオチドを溶解または分散した液体は、例えば中性力 アルカリ性、例 えば pHが 7. 6以上とすることができる。
[0054] また、ポリヌクレオチドの固定ィ匕後、担体表面に固定ィ匕されな力つたポリヌクレオチ ドを除去するため、純水や緩衝液で洗浄してもよい。
[0055] また、上記工程 (ii)に示したように、洗浄後はポリヌクレオチドを固定ィ匕した以外の プラスチック担体表面の活性エステルの不活性ィ匕処理をアルカリィ匕合物、あるいは 一級アミノ基を有する化合物で行う。
[0056] アルカリィ匕合物としては、水酸化ナトリウム、水酸ィ匕カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水 素ナトリウム、リン酸水素ニナトリウム、水酸ィ匕カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ 酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。
[0057] 一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、 9 アミノアクアジン、アミノブタノ一 ル、 4ーァミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、 5 ァミノ 2, 3 ジヒドロー 1, 4 ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、 2—（2 アミノエチルァミノ）エタノール、リン酸二水素 2—アミノエチル、硫酸水素アミノエチ ル、 4— (2—アミノエチル）モルホリン、 5—ァミノフルォレセイン、 6—ァミノへキサン 酸、ァミノへキシルセルロース、 p アミノ馬尿酸、 2—アミノー 2—ヒドロキシメチル一 1 , 3 プロパンジオール、 5 ァミノイソフタル酸、ァミノメタン、ァミノフエノール、 2 ァ ミノオクタン、 2 ァミノオクタン酸、 1ーァミノ 2 プロパノール、 3 アミノー 1 プロパ ノール、 3 ァミノプロペン、 3 ァミノプロピオ-トリル、アミノビリジン、 11—アミノウン デカン酸、ァミノサリチル酸、ァミノキノリン、 4—ァミノフタ口-トリル、 3—ァミノフタルイ ミド、 p ァミノプロピオフエノン、ァミノフエ-ル酢酸、ァミノナフタレンなどを用いること ができる。これらのうち、アミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
[0058] また、担体に固定ィ匕するポリヌクレオチドには、活性エステル基との反応性を高める ため、アミノ基を導入しておくことが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に 優れるため、ァミノ基が導入されたことにより、効率よくかつ強固に担体の表面上にポ リヌクレオチドを固定ィ匕することができる。ァミノ基の導入位置はプライマーの分子鎖 末端あるいは側鎖であってもよいが、分子鎖末端に導入されていることが、相補的な 铸型 RNA断片とのアニーリングをより一層効率よく行うことができるという観点からは 、好ましい。
[0059] 以上により、担体の表面上にポリヌクレオチドが固定ィ匕されたアレイが得られる。こ のように 1本鎖 cDNAが固定ィ匕された後、液相を除去することにより 1本鎖 cDNA固 定化担体が得られる。
[0060] 次に、（2) RNA断片、ヌクレオチドモノマー、及び逆転写酵素又はポリメラーゼ活 性を有する酵素を含む溶液を前記不溶性担体表面に接触させる。
すなわち、不溶性担体の表面に固定ィ匕された DNA伸長用ポリヌクレオチドにァ- ールさせるための DNA伸長用の铸型 RNA断片、 dATP、 dCTP、 dGTPおよび dT TP (これらのうち一つが標識されて 、てもよ 、）を含むヌクレオチドモノマーおよび逆 転写酵素又はポリメラーゼ活性を有する酵素を含むサンプルが導入される。
[0061] この導入されたサンプルの反応系としては、逆転者酵素および Zまたはポリメラー ゼ活性をもつ酵素による RNAを铸型にした伸長反応を行うが、本発明で使用される 逆転写酵素および Zまたはポリメラーゼ活性を有する酵素は、モロニ一マウス白血球 ウィルス (M— MLV)逆転写酵素、ラウス肉腫ウィルス (RSV)逆転写酵素、トリ骨髄 芽球症 (AMV)逆転写酵素、ラウスアンシ ーテッドウィルス (RAV)逆転写酵素、骨 髄芽球症アンシエーテッドウィルス (MAV)逆転写酵素、ヒト免疫不全ウィルス (HIV) 逆転写酵素、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、 B型肝炎 逆転写酵素、カリフラワーモザイク逆転写酵素、バクテリア逆転写酵素、 Thermus the rmophilus(Tth)DNAポリメラーゼ、 Thermus aquaticus(Taq)DNAポリメラーゼ、 Therm otoga neopolitana(Tneノ DNAポリメフ ~~セ、 Thermotoga maritime(Tmaノ DNAポリメフ ーゼ、 Thermococcus litoralis(Tli、例えば VENT (登録商標）ブランド) DNAポリメラー ゼ、 Pyrococcus furiosus(Pfu)DNAポリメラーゼ、 Pyrococus species GBD (例えば、 DE EPVENT™ブランド) DNAポリメラーゼ、 Pyrococcus woosii(Pwo)DNAポリメラーゼ、 B acnlus sterothermophilus(Bst)DNAポリメフ ~~ゼ、 bulfolobus acidocaldarius(¾ac DN Aポリ フーセ、 Thermoplasma acidophilum(Tac)DNAポリメフーゼ、 Thermus flavus(T fl/Tub)DNAポリメラーゼ、 Thermus rubber(Tru)DNAポリメラーゼ、 Thermus brockia nus (例えば、 DYNAZYME (登録商標）ブランド) DNAポリメラーゼ、 Methanobacterium thermoautotrohicum(Mth)DNAポリメラーゼ DNA、その変異体、変形体、派生体を 含むがこれに限定されるものではな！/、。
さらに、铸型となる RNAの分解を抑える目的で、 RNaseインヒビターを添カ卩したほう がよい。
[0062] 続いて、（3)溶液中の前記 RNA断片を铸型にして担体表面に固定ィ匕されている前 記 DNA伸長用のポリヌクレオチドを伸長させて 1本鎖の cDNAを形成する。 すなわち、前述の反応系の温度を制御することにより、 DNA鎖の伸長反応が起こ る、すなわち铸型 RNA断片に相補的な DNA断片力 担体上に形成され、 RNA鎖と ハイプリした形態の cDNA鎖が得られるようになる。
[0063] 反応温度並びに時間は特に限定されるものでなぐ DNAポリメラーゼ、制限酵素な どの特性、铸型 DNAまたは RNAの安定性 '品質 ·絶対量に依存し、適宜、反応条 件を設定すればよい。
[0064] 伸長反応後は例えば 0. lwt%の SDS溶液を用いて洗浄して、 cDNAの生成反応 を終了する。
[0065] 以上のように、本発明は、前述した 1本鎖 DNA固定ィ匕担体を使用して、前記担体 上にセンス及びアンチセンスプライマー、 DNAポリメラーゼ、及びヌクレオチドモノマ 一を含む溶液を接触させ、所定のヒートサイクルにより PCRを行い、担体に固定化さ れて ヽる 1本鎖 DNAを铸型にして DNA鎖を伸長増幅することをことにより液相中に DNA鎖を製造することを特徴とする DNA鎖の製造方法を提供する。
[0066] (第 2の実施形態）
また、本発明は、リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有 する第一単位と電子求引性の置換基がカルボ-ル基に結合してなるカルボン酸誘 導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、
(a)少なくとも一つの、 mRNAのポリ Aティルに相補的な配列を含む DNA伸長用ポ リヌクレオチドを、前記不溶性担体に結合させる工程、
(b)前記 DNA伸長用ヌクレオチドが固定ィ匕された担体に、ポリ Aティルをもつ mRN A含有試料溶液、逆転写酵素を含む溶液、およびヌクレオチドモノマーを含む溶液 を加える工程、
(c)前記 mRNAのポリ Aティルと、ポリ Aティルに相補的な配列をハイブリダィズさせ る工程、
(d)前記 mRNAを铸型として、 DNA伸長用ポリヌクレオチドを伸長させ、 mRNAに 相補的なアンチセンス cDNAを製造する工程、
を含む cDNA鎖の製造方法を提供する。
[0067] 工程 (a)において、不溶性担体は第 1の実施形態で説明したものが使用可能であ る。 DNA伸長用ポリヌクレオチドとしては、 mRNAのポリ Aティルに相補的な配列を 含むものが使用され、好ましくはさらに少なくとも一つの RNAプロモーターを含んで いてもよい。また、ポリヌクレオチドを不溶性担体の表面への結合は、第 1の実施形態 と同様に行うことができる。
[0068] 本発明で担体に固定ィ匕されるポリヌクレオチドは、少なくとも、 mRNAのポリ Aティ ルに相補的なひとつの配列を含むことが好まし 、。このポリヌクレオチド固定ィ匕担体 は、またセンスもしくはアンチセンス cDNAの製造を含む、いろいろな方法に有用で ある。このポリヌクレオチド固定化担体は、また、センスもしくはアンチセンス mRNAの 製造にも有用である。
[0069] 本発明で担体に固定化されるポリヌクレオチドは、 mRNAのポリ Aティルに相補的 な配列、例えばオリゴ dT、を含むことが好ましい。更に、 mRNAのプロモーター配列 を含むことが好ましい。
別の観点から、本発明は、このようにリン脂質の親水部を構成するリン酸エステルよ り誘導される基を有する第一単位と電子吸引性の置換基力 Sカルボニル基に結合して なるカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶 性担体に、 mRNAのポリ Aティルに相補的な配列を少なくとも一つ含むポリヌクレオ チドが固定化されたヌクレオチド固定ィ匕担体を提供する。また、この固定化されたヌク レオチドは、さらに RNAプロモーターを少なくとも一つ、好ましくは少なくとも二つ含 むものである。
また、ポリヌクレオチドは、通常、マイクロタイタープレートのような不溶'性皿に固定さ れ、本発明はこのようなマイクロタイタープレートを提供する。
本発明の一つの好ましい形態におけるマイクロタイタープレートは、少なくとも、二 つのゥエルをもち、各々には異なるポリヌクレオチドが固定される。本発明のポリヌクレ ォチド固定化担体は、センスもしくはアンチセンス 1本鎖 cDNA、及びセンスもしくは アンチセンス mRNAの製造に使用できる。更に、本発明におけるポリヌクレオチド固 定ィ匕担体上で製造された 1本鎖 cDNAは長期に安定であって、かつ安定的に基板 表面に固定されており cDN A又は mRNAの製造に何度もこれを繰り返して使用でき る。 [0070] 本発明の好まし 、実施態様にぉ 、て、 mRNAのポリ Aティルに相補的な配列を少 なくとも一つ含むポリヌクレオチドは、不溶性担体に結合されていて、ヌクレオチド固 定化担体を構成する。これらの配列は、好ましくは 6〜： L00ヌクレオチド長さである。よ り好ましい実施態様では、固定ィ匕ポリヌクレオチドは、更に RNAプロモーター、及び Z又は制限酵素認識サイトを含む。好ましくは、その 5'末端は不溶性担体に固定さ れ、その 3'末端は mRNAのポリ Aティルに相補する。
[0071] 本発明のひとつの実施態様は、不溶性皿、好ましくはマイクロタイタープレートにポ リヌクレオチドを固定ィ匕させた、ポリヌクレオチド固定ィ匕担体である。固定ィ匕されたポリ ヌクレオチドは、少なくとも、 mRNAのポリ Aティルに相補的なひとつの配列、例えば 、ポリ dTを含む。
更に好ましい実施態様では、 RNAプロモーターをもっている。本発明のもうひとつ の実施態様は、少なくともひとつの RNAプロモーターを含む不溶性担体に、好ましく はポリヌクレオチドを結合させた、ポリヌクレオチド固定ィ匕担体である。最も好ましい実 施態様は、 T7もしくは SP6RNAプロモーターの!/、ずれかを含むものである。
[0072] 本発明の更に別の実施態様では、不溶性担体、好ましくは不溶性担体と、それに 結合された 1本鎖 DNAから成る 1本鎖 DNA固定化担体の、その 1本鎖 DNAは、 m RNAのポリ Aティルに相補する配列を少なくとも含んで 、る。本発明の好ま 、実施 態様においては、 1本鎖 DNAは、 RNAプロモーターをもっており、更に好ましくは、 1本鎖 DNAは少なくとも二つの異なる RNAプロモーターを含んでいる。もっと好まし くは、これらのプロモーターは、 T7もしくは SP6RNAプロモーターである。
[0073] 続!、て、工程 (b)にお!/、て、ポリ Aティルを有する mRNA含有試料溶液を、 DNA 鎖伸長用ポリヌクレオチドを固定ィ匕した担体に添加し、そこに逆転写酵素を含む溶液 、および dATP、 dCTP、 dGTPおよび dTTP (これらのうち一つが標識されていても ょ 、）を含むヌクレオチドモノマーを含む溶液をカ卩える。
[0074] 工程（c)にお!/、て、 mRNAのポリ Aティルの部分と、当該担体に固定化された DN A伸長用ポリヌクレオチドのポリ Aティルに相補的な配列との間でハイブリダィズさせ る。また、工程 (d)において、 mRNAを铸型として、 DNA伸長用ポリヌクレオチドを伸 長させて、当該 mRNAに相補的な cDNA鎖を得る。なお、工程 (c)、（d)を、同じ液 相中で行うことができ、また工程 (c)、 （d)が、所定の温度、例えば 37°Cでのインキュ ベートを含んでいてもよい。
[0075] すなわち、第 2の実施形態によれば、ポリヌクレオチド、好ましくは、少なくとも一つ の RNAプロモーターをもつポリヌクレオチドを不溶性担体に結合させて得られる、 1 本鎖 cDNA固定ィ匕担体の製造方法である。このポリヌクレオチドは、好ましくは mRN Aのポリ Aティルに相補する配列を少なくとも一つもっており、ヌクレオチド固定ィ匕担 体を形成する。そこへ、細胞溶解液のようなポリ Aティルの mRNA含有溶液を加え、 mRNAのポリアデュル酸ティル（ポリ Aティル）を固定化ポリヌクレオチド配列にハイ ブリダィズさせ、更に好ましくは、担体と溶液をインキュベートする。ァニール処理され た mRNAに相補的なアンチセンス cDNAがつくられる。
[0076] また、このように 1本鎖 cDNAが固定ィ匕された担体を製造した後、液相を除去して 得られる RNAプロモーターを付カ卩的に含んでいる 1本鎖 cDNA固定化担体に、 DN Aポリメラーゼ、 DNAリガーゼ及びヌクレオチドモノマーを含む溶液を 1本鎖 cDNA 固定ィ匕担体の表面に接触させ、 2本鎖の cDNAを形成させることができ、本発明はこ のような DNA鎖の製造方法を提供する。この DNA鎖の製造方法において、 1本鎖 c DNA固相化担体に接触させる溶液に含めるヌクレオチドモノマーとしては、 dATP、 dCTP、 dGTP及び dTTPが挙げられる。また、得られる 2本鎖 cDNAにラベルを導 入する場合には、これらヌクレオチドモノマーのうち、少なくとも一つが標識されたもの を用いる。
[0077] また、このように 2本鎖 cDNAが固定ィ匕された担体を製造した後、液相を除去して 得られる RNAプロモーターを付カ卩的に含んでいる 2本鎖の cDNA固定化担体に、 R NAポリメラーゼおよびヌクレオチドモノマーを含む溶液を 2本鎖 cDNA固定化担体 の表面に接触させることにより、 RNA鎖を製造することができ、本発明は、このような 製造工程を含む、センス RNA鎖の製造方法を提供する。この RNA鎖の製造方法に お!、て、 2本鎖 cDNA固相化担体に接触させる溶液に含めるヌクレオチドモノマーと しては、 ATP、 CTP、 GTP及び UTPが挙げられる。また、得られるセンス RNA鎖に ラベルを導入する場合には、これらヌクレオチドモノマーのうち、少なくとも一つが標 識されたものを用いる。 [0078] プロモーターが転写を始めるような試薬を含むサンプル液をカ卩えると、アンチセンス mRNAが生産される。アンチセンス mRNAの好ましい生産方法では、担体とサンプ ル液をインキュベートすることによって、最初の液相と固相をつくり、次いで以下のス テツプで反応を始める。
(1)固相に、 RNAポリメラーゼ、 ATP、 CTP、 GTP及び UTPと共に、好ましくは、ラ ベルされた NTP類の一つを含む反応混合物、好ましくは前記ヌクレオチドモノマー が ATP、 CTP、 GTP及び UTPを含み、 ATP、 CTP、 GTP、及び UTPの内、少なく とも一つが標識された混合物を加える。
(2)液相と反応混合物をインキュベートし、次いで、固相と反応混合物を加熱し、アン チセンス mRNAを含む液相をつくる。
そののち、液相を取得し、 DNaseで処理することにより、反応をつづけることが望ま しい。
[0079] 以上のように、別の観点から、本発明は、前述したように cDNA鎖の製造方法により 1本鎖 cDNAが固定ィ匕された担体を製造した後、液相を除去して得られる RNAプロ モーターを付カ卩的に含んでいる 1本鎖 cDNA固定化担体に、 DNAポリメラーゼ、 D NAリガーゼ、及びヌクレオチドモノマーを含む溶液を前記 cDNA固定化担体表面 に接触させ、前記 RNAプロモーター力もアンチセンス mRNAを製造することを特徴 とする RNA鎖の製造方法を提供する。
[0080] また、本発明は、下記のような方法で 2本鎖 cDNAをつくり、次いで第 2の反応混合 物と固相を加熱する、センス 1本鎖 cDNAの製造方法を提供する。このとき、センス 1 本鎖 cDNAを含む第 2の液相が得られる。
( 1 )ポリヌクレオチド固定化担体にポリ Aティルをもつ mRNA含有サンプル液をカロえ る；
(2)サンプル液と担体をインキュベートし、第 1の液相と固相をつくる；
(3)逆転写酵素、ヌクレオチドモノマー（dATP、 dCTP、 dGTP及び dTTPと共に、ラ ベルされたヌクレオチド (dNTP) )を含む第 1の反応混合物を、固相に加える；
(4) RNase、 DNAポリメラーゼ、 DNAリガーゼ、 dATP、 dCTP、 dGTP及び dTTP 含有の第 2の反応混合物を固相に加え； (5)第 2の反応混合物と固相をインキュベートする。
[0081] さらに別の観点から、本発明は、上記したような 2本鎖 cDNA固定ィ匕担体を用いる、 センス cDNAの製造方法を提供する。センス cDNAとアンチセンス cDNAが液相で 2本鎖 cDNAを形成したのちに、その 2本鎖 cDNAは変性され、液相中にセンスの c DNAが得られる。
[0082] 本発明の実施態様の特徴一つは、センス 1本鎖 cDNAの製造方法である。この方 法は、液相での 2本鎖 cDNA固定ィ匕担体の生産を含むもので、そこでは、 2本鎖 cD NA鎖の一方の鎖が不溶性担体に固定され、 2本鎖 cDNA鎖の一方の鎖は、 mRN Aのポリ Aティルに相補的な配列を少なくとも一つ含んでいる。その後、 2本鎖 cDNA 固定ィ匕担体を変性し、液相中にセンスの cDNAを得る。
[0083] 本願発明にお 、て、センス mRNAとは遺伝情報と同等な mRNAを意味し、一方、 アンチセンス mRNAとはセンス mRNAに相補的なポリヌクレオチドを意味する。セン ス 1本鎖 cDNAは、センス mRNAの遺伝情報と同等な遺伝情報を含んでいる。ただ し、その cDNAにおいては、 mRNAのゥラシルはチミンに置き代わり、ヌクレオチドは デォキシリボヌクレオチドであってリボヌクレオチドではない。
実施例
[0084] (PNBMコート 96穴マイクロタイタープレートの作製）
5—メチルー 2ノルボルネンの開環重合体の水素添カ卩物（MFR: 21gZlO分、水素 添加率:実質的に 100%、熱変形温度： 123°C)を用い、射出成形により 96ウェルマ イクロタイタ一プレートを成形した。各ゥエルを 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリ ルコリンーブチルメタクリレートー p—二トロフエニルォキシカルボ二ルポリエチレングリ コールメタタリレート共重合体（PNBM :各基は、モル0 /0で 25 : 74 : 1)の 0. 5重量0 /0 エタノール溶液でコートし、この成形物底面に PNBMをコートし、本発明の実施形態 である PNBMコート 96穴マイクロタイタープレートロタイタ一プレートを作製した。以 下 PNBMプレートと称す。
[0085] (アルデヒド基導入 96穴マイクロタイタープレートの作製）
5—メチルー 2ノルボルネンの開環重合体の水素添カ卩物（MFR: 21gZlO分、水素 添加率:実質的に 100%、熱変形温度： 123°C)を用い、射出成形により 96ウェルマ イクロタイタ一プレートを成形した。成形した 96ウェルタイタ一プレートに酸素プラズマ を施した後、アミノシランによりアミノ基を導入の後、ダルタルアルデヒドにより、ァミノ 基にアルデヒド基を導入し、アルデヒド基導入 96穴マイクロタイタープレートを作製し た。以下、アルデヒドプレートと称す。
[0086] (オリゴ Tの固定）
5，末端がァミノ基で修飾された下記配列のオリゴ T(T15、 Τ20、 Τ30)を 0. 25Μ 炭酸バッファ (ρΗ9. 0)を用いて溶解し、 10 /ζ Μのオリゴ 1¾液を調製した。各オリゴ Τ溶液を上記 ΡΝΒΜプレートおよびアルデヒドプレートの各ゥエルに 10 μ 1分注し、 直径 5mmに打ち抜!/、た ETFEシートでゥエル底面を覆 、、プレートを 80°Cで 1時間 放置した。 ETFEのシートを各ゥエルから取り除き、洗浄を行った。洗浄の後、各ゥェ ルブロッキングをおこなった。 PNBMプレートについては、各ゥエルにブロッキング溶 液として、 ImolZlの NaOH溶液を各ゥヱルに 400 μ 1分注し、 5分間室温で放置した 。その後、ブロッキング液を除き、純水により洗浄をおこなった。アルデヒドプレートに ついては、 180mlのリン酸緩衝液に 0. 6gの水素化ホウ素ナトリウムと 50mlのェタノ ールを溶解させた溶液をブロッキング溶液とし、各ゥエルに 400 1分注し室温で 5分 間放置し、ブロッキング液を除き、純水により洗浄をおこなった。
各々のプレートを乾燥させ、次のトータル RNAから cDN Aの合成実験に供した。
[0087] オリゴ T 配列
T15 TTTTTTTTTTTTTTT (配列番号 1；)
T20 ττττττττττττττττττττ (配列番号 2)
Τ30 ττττττττττττττττττττττττττττττ (配列番号 3)
[0088] (トータル mRNAから cDNA鎖の合成）
ヒト肝由来トータル RNATatal RNA (ヒト正常組織由来 Liver:コスモバイオ CB-0610 09) 1 μ gを含む DEPC処理水溶液 100 μ 1を 65°Cで 5分間保温後、氷上で急冷する。 反応液として、 Reverse
Transcriptase M- MLV (Rnase H -)、 5XReverse Transcriptase M- MLV Buffer、 RNAs e Inhibitor(Super), ImM Cy3標識 dUTP、 20mM dATP、 20mM dGTP、 20mM dCTP、 DEPC treated waterをカ卩えて調製しものを、ヒト肝由来トータル RNA (Tatal RNA)溶 液にカロえた。この溶液を各ゥエルに 5 1を分注し、上から直径 5mmの ETFE製シート で覆い、 42°Cで 1時間インキュベートした。インキュベート後、 TE buffer(10mMTris/H Cl(pH8.5), ImMEDTA)を 200 μ 1分注し、 ETFEシートを浮かせ、除去した。 TE bufferにて 2回洗浄し、純水にて洗浄し乾燥した。
各ゥエルの底面の蛍光像を蛍光顕微鏡により撮り、画像処理にて蛍光量を数値ィ匕 し、 cDNAの合成の状況を比較した。即ち、蛍光が観察されれば、 cDNAが合成さ れていることを示し、その蛍光強度が高ければ効率良ぐ cDNAの合成が出来ている ことになる。
PNBMプレートとアルデヒドプレートでの各オリゴ Tを固定したゥエルでの蛍光強度 を表 1に示す。なお、各ゥエルの蛍光強度値は、オリゴ Tを固定していないゥエルの蛍 光強度値を差し引いたものを cDNA合成による蛍光強度とした。
[0089] (表 1)
蛍光値
Figure imgf000028_0001
[0090] 本発明の実施形態の一つとなる PNBMプレートで cDNA鎖伸長が検出された一 方で、アルデヒド基板では cDNA鎖伸長は検出されて ヽな 、。
[0091] 以下、本発明の具体的な態様を挙げる。
リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と 電子求引性の置換基力 Sカルボ-ル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第 二単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、
(a)少なくとも一つの、 mRNAのポリ Aティルに相補的な配列を含む DNA伸長用ポ リヌクレオチドを、前記不溶性担体に結合させる工程、 (b)前記 DNA伸長用ヌクレオチドが固定ィ匕された担体に、ポリ Aティルをもつ mRN A含有試料溶液を加える工程、
(c)前記ポリ Aティルをもつ mRNA含有試料溶液に逆転写酵素を含む溶液を加える 工程、
(d)前記ポリ Aティルをもつ mRNA含有試料溶液にヌクレオチドモノマーを含む溶液 加える工程、
(e)前記 mRNAのポリ Aティルと、ポリ Aティルに相補的な配列をノヽイブリダィズさせ る工程、
(f)前記 mRNAを铸型として、 DNA伸長用ポリヌクレオチドを伸長させ、 mRNAに 相補的なアンチセンス cDNAを製造する工程、
を含む cDNA鎖の製造方法。

Claims

請求の範囲
[1] リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電 子求引性の置換基力カルボ-ル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二 単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、（l) DNA伸長用のポリヌク レオチドを固定化させてポリヌクレオチド固定ィ匕担体を形成する工程、（2)RNA断片 、ヌクレオチドモノマー、及び逆転写酵素又はポリメラーゼ活性を有する酵素を含む 溶液を前記不溶性担体表面に接触させる工程、 (3)溶液中の前記 RNA断片を铸型 にして担体表面に固定ィ匕されている前記 DNA伸長用のポリヌクレオチドを伸長させ て 1本鎖の cDNAを形成する工程、を含むことを特徴とする cDNA鎖の製造方法。
[2] リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電 子求引性の置換基力カルボ-ル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二 単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、
(a)少なくとも一つの、 mRNAのポリ Aティルに相補的な配列を含む DNA伸長用ポ リヌクレオチドを、前記不溶性担体に結合させる工程、
(b)前記 DNA伸長用ヌクレオチドが固定ィ匕された担体に、ポリ Aティルをもつ mRN A含有試料溶液、逆転写酵素を含む溶液およびヌクレオチドモノマーを含む溶液を 加える工程、
(c)前記 mRNAのポリ Aティルと、ポリ Aティルに相補的な配列をハイブリダィズさせ る工程、
(d)前記 mRNAを铸型として、 DNA伸長用ポリヌクレオチドを伸長させ、 mRNAに 相補的なアンチセンス cDNAを製造する工程、
を含む cDNA鎖の製造方法。
[3] 工程 (c)、 (d)を、同じ液相中で行う請求項 2記載の cDNA鎖の製造方法。
[4] 工程 (c)、 (d)が、所定の温度でのインキュベートを含んで 、る請求項 2又は 3記載の cDNA鎖の製造方法。
[5] 前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリ ルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール 基、ホスホリルグリセロール基、及びホスファチジルホスホリルグリセロール基から選ば れる少なくとも 1つの基である請求項 1〜4いずれか記載の cDNA鎖の製造方法。
[6] 前記ヌクレオチドモノマーを含む溶液が dATP、 dCTP、 dGTP及び dTTPを含む請 求項 1〜5いずれか記載の cDNA鎖の製造方法。
[7] 前記 DNA伸長用ポリヌクレオチドが、少なくとも一つの RNAプロモーターを更に含 む請求項 1〜6 、ずれか記載の cDNA鎖の製造方法。
[8] 請求項 1〜7いずれか記載の cDNA鎖の製造方法により 1本鎖 cDNAが固定ィ匕され た担体を製造した後、液相を除去して得られる 1本鎖 cDNA固定化担体。
[9] 請求項 8記載の 1本鎖 cDNA固定ィ匕担体を使用して、前記担体上にセンス及びアン チセンスプライマー、 DNAポリメラーゼ、及びヌクレオチドモノマーを含む溶液を接 触させ、所定のヒートサイクルにより PCRを行い、担体に固定ィ匕されている 1本鎖 cD
NAを铸型にして DNA鎖を伸長増幅することをことにより液相中に DNA鎖を製造す ることを特徴とする DNA鎖の製造方法。
[10] 前記ヌクレオチドモノマーが dATP、 dCTP、 dGTP及び dTTPを含み、 dATP、 dCT
P、 dGTP,及び dTTPの内、少なくとも一つが標識されたものである請求項 9記載の
DNA鎖の製造方法。
[11] 請求項 7記載の cDNA鎖の製造方法により 1本鎖 cDNAが固定ィ匕された担体を製造 した後、液相を除去して得られる RNAプロモーターを付カ卩的に含んでいる 1本鎖 cD NA固定化担体に、 DNAポリメラーゼ、 DNAリガーゼ及びヌクレオチドモノマーを含 む溶液を前記 cDNA固定ィ匕担体表面に接触させ、 2本鎖の cDNAを形成させる DN A鎖の製造方法。
[12] 前記ヌクレオチドモノマーが dATP、 dCTP、 dGTP及び dTTPを含み、 dATP、 dCT P、 dGTP,及び dTTPの内、少なくとも一つが標識されたものである請求項 11記載 の DNA鎖の製造方法。
[13] 請求項 11記載の DNA鎖の製造方法により 2本鎖 cDNAが固定ィ匕された担体を製 造した後、液相を除去して得られる RNAプロモーターを付カ卩的に含んで ヽる 2本鎖 の cDNA固定化担体に、 RNAポリメラーゼおよびヌクレオチドモノマーを含む溶液を 前記 2本鎖 cDNA固定ィ匕担体表面に接触させ、 RNA鎖を製造する工程を含む、セ ンス RN A鎖の製造方法。
[14] 前記ヌクレオチドモノマーが ATP、 CTP、 GTP及び UTPを含み、 ATP、 CTP、 GT P、 UTPの内、少なくとも 1つが標識されたものである請求項 13記載のセンス RNA鎖 の製造方法。
[15] リン脂質の親水部を構成するリン酸エステルより誘導される基を有する第一単位と電 子吸引性の置換基力 Sカルボ-ル基に結合してなるカルボン酸誘導基を有する第二 単位とを含む高分子物質を表面に有する不溶性担体に、 mRNAのポリ Aティルに相 補的な配列を少なくとも一つ含むポリヌクレオチドが固定ィ匕されたヌクレオチド固定ィ匕 担体。
[16] 前記固定ィ匕されたヌクレオチドは、さらに RNAプロモーターを少なくとも一つ含む請 求項 15に記載のヌクレオチド固定ィ匕担体。
[17] 前記高分子物質の第一単位に含まれるリン酸エステルより誘導される基は、ホスホリ ルコリン基、ホスホリルエタノールアミン基、ホスホリルセリン基、ホスホリルイノシトール 基、ホスホリルグリセロール基、及びホスファチジルホスホリルグリセロール基から選ば れる少なくとも 1つの基である請求項 15記載のヌクレオチド固定ィ匕担体。
[18] 前記ポリヌクレオチド力 6〜100塩基のヌクレオチドを含む請求項 15から 16のいず れか記載のヌクレオド固定ィ匕担体。
[19] 前記不溶性担体の形態がマイクロタイタープレートを含む請求項 15〜18いずれか 記載のヌクレオチド固定ィ匕担体。
[20] 前記マイクロタイタープレートが少なくとも二つのゥエルを有し、前記ゥエル各々は相 異なる固定ィ匕ポリヌクレオチドを含む請求項 19記載のヌクレオチド固定ィ匕担体。
[21] 前記ポリヌクレオチドが、 T7RNAプロモーター又は SP6RNAプロモーターを含む請 求項 16〜 201/、ずれ力、記載のヌクレオチド固定化担体。
[22] 前記ポリヌクレオチド力 mRNAのポリ Aティルに相補的な配列としてポリ dTを含む 請求項 15〜 2 、ずれ力、記載のヌクレオチド固定化担体。
[23] 前記ポリヌクレオチド力 少なくとも二つの RNAプロモーターを含む請求項 15〜22
V、ずれか記載のヌクレオチド固定ィ匕担体。
[24] 前記ポリヌクレオチド力 少なくとも二つの相異なる RNAプロモーターを含む請求項
23記載のヌクレオチド固定ィ匕担体。
[25] 前記ポリヌクレオチドが、 T7RNAプロモーター及び SP6RNAプロモーターを含む請 求項 23又は 24記載のヌクレオチド固定ィ匕担体。
[26] 前記高分子物質がブチルメタタリレート基を含む第三単位を有するものである請求項
15〜25いずれか記載のヌクレオチド固定化担体。
[27] 前記不溶性担体は、前記高分子物質に加えて、ホスホリルコリン基を含む第一単位 と、ブチルメタタリレート基を含む第三単位とを有する第二の高分子物質を表面に含 む請求項 15〜26いずれか記載のヌクレオチド固定ィ匕担体。
[28] 前記不溶性担体が、プラスチック材料力もなる請求項 15〜27いずれか記載のヌクレ ォチド固定化担体。
[29] 前記プラスチック材料力 100°C以上のガラス転移点を有するものである請求項 28 記載のヌクレオチド固定ィ匕担体。
[30] 前記プラスチック材料力 飽和環状ポリオフィン榭脂である請求項 28記載の固定ィ匕 担体。
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