WO2005029095A1 - バイオチップ - Google Patents

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WO2005029095A1
WO2005029095A1 PCT/JP2004/013656 JP2004013656W WO2005029095A1 WO 2005029095 A1 WO2005029095 A1 WO 2005029095A1 JP 2004013656 W JP2004013656 W JP 2004013656W WO 2005029095 A1 WO2005029095 A1 WO 2005029095A1
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group
substrate
biochip
substance
active ester
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PCT/JP2004/013656
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French (fr)
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Kazuhiko Ishihara
Sohei Hunaoka
Kanehisa Yokoyama
Original Assignee
Sumitomo Bakelite Co., Ltd.
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Publication date
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    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
    • C12Q1/6813—Hybridisation assays
    • C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
    • C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
    • C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
    • C12Q1/001—Enzyme electrodes
    • C12Q1/002—Electrode membranes
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    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N37/00—Details not covered by any other group of this subclass

Definitions

  • the present invention relates to a biochip used for detecting or analyzing a physiologically active substance in a sample.
  • Proteomics involves the qualitative and quantitative measurement of gene activity by detecting and quantifying expression at the protein level, rather than at the gene level. Also includes studies of non-gene-encoded events such as post-translational modifications of proteins and protein-protein interactions.
  • a protein chip is a generic term for proteins or molecules that capture the protein immobilized on the surface of a chip (a minute substrate).
  • Non-Patent Document 1 In signal detection of a protein chip, non-specific adsorption of a substance to be detected to a protein chip substrate causes a reduction in a signal-to-noise ratio, thereby lowering detection accuracy (for example, see Non-Patent Document 1). ).
  • DNA microarrays allow the study of expression patterns throughout the genome, even in complex biological systems, resulting in an explosive increase in genetic information.
  • the background of the microarray substrate causes a reduction in the SZN ratio, and reduces the detection accuracy (for example, Non-Patent Document 1).
  • the SZN ratio is obtained by dividing the amount of signal (signal) obtained from the labeled sample sample cap by the amount of signal (noise) generated in the labeled sample sample force and the site other than the obtained signal substance. The value, the SZN ratio is high, and the detection sensitivity is high.
  • the material used as the microarray substrate is often made of glass or plastic, but since the surface of these materials is usually chemically inert, it is necessary to immobilize biologically active substances. Requires surface modification. Glass and plastic Since it is difficult to directly introduce various functional groups into an active surface, it is common to first introduce an amino group and then introduce a functional group via the amino group.
  • Examples of a method for introducing an amino group to the substrate surface include treatment with aminoalkylsilane, plasma treatment in a nitrogen atmosphere, and coating of an amino group-containing polymer substance.
  • aminoalkylsilanes are commonly used.
  • aminoalkylsilanes having a primary amino group such as aminopropyltrimethoxysilane, aminopropyltriethoxysilane, and aminopropylmethyldimethoxysilane.
  • Patent Document 2 Patent Document 3, Patent Document 4
  • N- (6-maleimide propyloxy) succinimide or the like which is a crosslinking agent having a maleimide group at one end and an active ester at one end
  • Patent Document 5 N-hydroxysuccinimide active ester
  • Ethyleneglycol-0,0-bis (succinimidylsuccinate) having active esters at both ends is used.
  • microfluidics a technique using microchannels called microfluidics
  • a technique using microchannels called microfluidics
  • there is an immunoassay that causes an antigen-antibody reaction in a microchannel Patent Document 6
  • Patent Document 7 a technique using a microchannel has been studied.
  • Patent Document 1 JP 2001-116750 A
  • Non-patent Document 1 "DNA Microarray Practical Manual”, edited by Yoshihide Hayashizaki and Koji Okazaki, Yodosha, 2000, p.57
  • Patent Document 2 JP 2002-176991 A
  • Patent Document 3 JP-A-2002-181817
  • Patent Document 4 Japanese Patent Publication No. 2002-532699
  • Patent Document 5 JP-A-11-187900
  • Patent Document 6 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2001-004628
  • Patent Document 7 Japanese Patent Application Laid-Open No. 2004-053417
  • the present invention has been made in view of the above circumstances, and provides a biochip excellent in detection sensitivity, in which nonspecific adsorption or binding of a substance to be detected, which is not coated with an adsorption inhibitor, is suppressed. I do.
  • a biochip substrate characterized in that the substrate has a polymer material containing a first unit having a phosphorylcholine group and a second unit having an active ester group on the surface of the substrate. Is done.
  • the biochip substrate of the present invention has a phosphorylcholine group, nonspecific adsorption of a physiologically active substance on the substrate can be suppressed.
  • a capturing substance for capturing a physiologically active substance can be stably introduced into a polymer substance. Therefore, nonspecific adsorption or binding of the substance to be detected without coating with the adsorption inhibitor can be suppressed, and the detection sensitivity can be improved.
  • the biochip substrate of the present invention can be, for example, a substrate used for a biochip in which a capturing substance for capturing a physiologically active substance is immobilized on the surface of the substrate.
  • the polymer substance includes a third unit having a butyl methacrylate group, and the phosphorylcholine group and the active ester of the phosphorylcholine group contained in the polymer substance are included.
  • Group and the butyl methacrylate group It may be 3 mol% or more and 40 mol% or less.
  • the polymer substance includes a third unit having a butyl methacrylate group, and the phosphorylcholine group and the active ester group of the phosphorylcholine group contained in the polymer substance are included.
  • proportion force 20 molar 0/0 over 40 I be less than mol 0/0 to the total of the butyl methacrylate streams rate groups and! /,.
  • the polymer substance includes a third unit having a butyl methacrylate group, and the phosphorylcholine group and the phosphorylcholine group of the active ester group contained in the polymer substance are included.
  • the ratio to the total of the ester group and the butyl methacrylate group may be 1 mol% or more and 25 mol% or less.
  • the polymer substance includes a third unit having a butyl methacrylate group, and the phosphorylcholine group and the active ester of the active ester group contained in the polymer substance are included. total I be less than the proportion force 15 mole% to 25 mole 0/0 relative to the said the group butyl meth Tari rate group! /,.
  • a biochip substrate comprising a polymer material containing the following components (a) and (b) on the surface of the substrate.
  • the biochip substrate of the present invention has a polymer substance containing the above-mentioned components (a) and (b), it is possible to more reliably suppress nonspecific adsorption of a physiologically active substance on the substrate.
  • the first unit of the component (a) and the first unit of the component (b) may have the same structure or different structures. Further, the component (a) and the component (b) may be mixed.
  • the ratio of the phosphorylcholine group contained in the polymer substance to the total of the phosphorylcholine group, the active ester group, and the butyl methacrylate group is 3 mol% or more. It may be 40 mol% or less. Further, in the biochip substrate of the present invention, the phosphorylcholine group contained in the polymer substance may be a total of the phosphorylcholine group, the active ester group, and the butyl methacrylate group. May be 20 mol% or more and less than 40 mol%.
  • the ratio of the phosphorylcholine group is determined by the sum of the phosphorylcholine groups contained in the component (a) and the component (b). Point.
  • the ratio of the active ester group contained in the polymer substance to the total of the phosphorylcholine group, the active ester group, and the butyl methacrylate group is 1 mol. % To 25 mol%.
  • the ratio of the active ester group contained in the polymer substance to the total of the phosphorylcholine group, the active ester group, and the butyl methacrylate group is 15 mol% or more and less than 25 mol%.
  • a second layer containing a high molecular weight substance having a first unit containing a phosphorylcholine group and a second unit containing an active ester group;
  • a biochip substrate is provided, wherein the substrate, the first layer, and the second layer are laminated in this order.
  • the substrate, the first layer, and the second layer are laminated in this order, the surface of the biochip substrate does not need to be coated with an anti-adsorption agent, so that the detection target substance can be removed. Specific adsorption or binding can be suppressed, and detection sensitivity can be improved. Further, peeling of the layer due to washing with a surfactant or the like can be suppressed.
  • the first layer or the second layer can be formed in a film shape.
  • the structure may be such that the amino group of the first layer reacts with the active ester group of the second layer to form a covalent bond, specifically, an amide bond.
  • the first layer may include the silane coupling agent having the amino group.
  • the silane coupling agent having an amino group may be present in the form of an organosiloxane such as a polyorganosiloxane.
  • the first unit containing a phosphorylcholine group is A configuration having a 2-methacryloyloxetyl phosphorylcholine group may be employed.
  • the polymer substance may have a third unit containing a butyl methacrylate group.
  • the high molecular substance can be a copolymer.
  • the polymer substance is a copolymer of the monomer having the phosphorylcholine group, the monomer having the active ester group, and the monomer having the butyl methacrylate group. It can be.
  • a first layer is formed on a substrate
  • a second layer is formed on the first layer
  • the first layer is formed from a compound having at least one group selected from an atalylate group, a metathalylate group, a butyl group, and an alkenyl group,
  • a substrate for a biochip wherein the second layer is formed from a copolymer of a polymer of a monomer having a phosphorylcholine group and a monomer having an active ester group. Is done.
  • a first layer provided on the substrate and also having an organosiloxane force
  • a second layer provided on the first layer and comprising a copolymer of a monomer having a phosphorylcholine group and a monomer having an active ester group;
  • the substrate has a layer in which a copolymer containing a phosphorylcholine group and an active ester group is also formed, the detection can be performed without coating an adsorption inhibitor on the surface of the biochip substrate. Nonspecific adsorption or binding of the target substance can be suppressed, and the detection sensitivity can be improved. Further, peeling of the layer due to washing with a surfactant or the like can be suppressed.
  • the first layer may be provided on a surface of the substrate, and the second layer may be provided on a surface of the first layer.
  • the organosiloxane may be a compound having a group containing a polymerizable double bond.
  • the group having a polymerizable double bond may constitute an alkenyl group.
  • at least a part of the group having a polymerizable double bond may constitute at least one group selected from an atalylate group, a metathallate group, a butyl group, and an alkenyl group.
  • at least one basic force selected from the group consisting of an acrylate group, a methacrylate group, a vinyl group, and an alkenyl group.
  • the first layer has a silane coupling agent having at least one group selected from an acrylate group, a methacrylate group, a vinyl group, and an alkyl group. May be formed. Further, the silane coupling agent may form an organosiloxane.
  • the monomer having a phosphorylcholine group may have a structure having a methacryl group or an acrylic group. Further, in the biochip substrate of the present invention, the monomer force 2-methacryloyloxyshethylphosphorylcholine having a phosphorylcholine group may be used!
  • the monomer having an active ester group may have a methacryl group or an acryl group.
  • the biochip substrate of the present invention may further include the above-mentioned active ester group having a tropophenyl group or an N-hydroxysuccinimide group.
  • the material of the substrate may be plastic.
  • the plastic may be a saturated cyclic polyolefin.
  • the material of the substrate may be glass.
  • a polymer substance having a first unit containing a phosphorylcholine group and a second unit containing a monovalent group represented by the following formula (1) is provided on the surface of the substrate.
  • a biochip substrate is provided.
  • A is a monovalent leaving group excluding a hydroxyl group.
  • a biochip substrate characterized in that the substrate has a polymer material containing the following components (a) and (b) on the surface of the substrate.
  • a first layer provided on the substrate and including a compound having an amino group
  • a biochip substrate is provided.
  • a first layer provided on the substrate formed from a compound having at least one group selected from an atalylate group, a metathalylate group, a vinyl group, and an alkenyl group; and a first layer provided on the first layer.
  • a second layer formed from a copolymer of a polymer of a monomer having a phosphorylcholine group and a monomer having a monovalent group represented by the above formula (1),
  • the leaving group A exists through the carbonyl group in the second unit, so that the biologically active substance is captured in the polymer substance. Trapping substance It can be more reliably introduced chemically.
  • the monovalent group represented by the formula (1) may be a group in which the force of the following formula (p) or formula (q) is also selected. ! / ,.
  • the leaving group A can be more reliably activated, and the reactivity can be further improved.
  • the formula (P) or the formula (q) below a configuration in which H is removed from N of a cyclic compound containing N and a configuration in which H is removed from the C force of a cyclic compound containing C are also included. You can also.
  • R 1 and R 2 are each independently a monovalent organic group, and may be linear, branched, or cyclic.
  • R 1 may be a divalent group forming a ring together with C.
  • R 2 may be together with N It may be a divalent group forming a ring.
  • a biochip substrate comprising a polymer substance having, on a surface of the substrate, a first unit containing a phosphorylcholine group and a second unit containing a carboxylic acid-derived group. Is done.
  • a biochip substrate characterized in that the substrate has a polymer material containing the following components (a) and (b).
  • a first layer provided on the substrate and including a compound having an amino group
  • a second layer provided on the first layer and including a polymer substance having a first unit containing a phosphorylcholine group and a second unit containing a carboxylic acid-derived group;
  • a first layer provided on the substrate formed from a compound having at least one group selected from an atalylate group, a metathalylate group, a vinyl group, and an alkenyl group; and a first layer provided on the first layer.
  • a second layer formed from a copolymer of a monomer having a phosphorylcholine group and a monomer having a carboxylic acid-inducing group;
  • a microarray for detecting a physiologically active substance using a fluorescent dye by immobilizing a capture substance for capturing a physiologically active substance on the surface of the substrate of the biochip substrate A substrate for microarray, comprising: the macromolecular substance comprising a first unit having a phosphorylcholine group and a second unit having an active ester group on a surface of the substrate.
  • the microarray substrate of the present invention can form a covalent bond by reacting a capturing substance with an active ester group while suppressing nonspecific adsorption of a physiologically active substance, thereby ensuring detection of a physiologically active substance. Can be performed.
  • a biochip characterized in that a capture substance for capturing a physiologically active substance is immobilized on the biochip substrate.
  • the capturing substance can have a physiological activity. Further, it can be a molecule having a physiologically active substance. This molecule can capture a bioactive substance by itself, or a plurality of molecules can capture a bioactive substance. Further, in the present invention, the capture substance is covalently bonded to the polymer substance! /, Can be configured.
  • a biochip comprising a substrate having on its surface a polymer substance having a first unit containing a phosphorylcholine group and a second unit containing an active ester group, A biochip is provided, wherein the active ester group reacts with a capturing substance that captures a physiologically active substance to form a covalent bond.
  • the trapping substance is chemically fixed to the polymer substance by the action of the active ester group, and the non-specific adsorption of the physiologically active substance on the substrate is caused by the phosphorylcholine group. Since it is suppressed by the action, the analysis of the physiologically active substance can be performed reliably.
  • the configuration in which the capture substance reacts to form a covalent bond includes a case where the capture substance reacts with a predetermined site having an active ester group to form a covalent bond.
  • the polymer substance may be formed in a layer on the surface of the substrate. Further, the surface of the substrate may be coated with the polymer substance. This makes it possible to more reliably suppress nonspecific adsorption.
  • the active ester group used for the immobilization can be more reliably introduced into the substrate surface.
  • a biochip comprising a polymer substance comprising, on a surface of a substrate, a first unit having a phosphorylcholine group and a plurality of second units having an active ester group,
  • Some of the active ester groups and a capturing substance that captures a physiologically active substance react to form a covalent bond
  • a biochip wherein the remaining active ester group and a hydrophilic polymer having a hydrophilic group react to form a covalent bond.
  • the polymer substance contains, for example, two or more active ester groups of one kind, and the remaining active ester groups other than the active ester groups that have formed a covalent bond with the supplementary substance. It reacts with the hydrophilic polymer to form a covalent bond. Therefore, the reaction between the physiologically active substance and the active ester group is suppressed, and the polymer substance is made hydrophilic. Therefore, the configuration is such that nonspecific adsorption of a physiologically active substance is further suppressed.
  • the hydrophilic polymer may have a configuration having an amino group.
  • the hydrophilic polymer can be more reliably reacted with the active ester to form an amide bond.
  • the hydrophilic polymer may include a polyalkylene oxide or a plurality of types of the polyalkylene oxide in its structure. Also before The hydrophilic polymer may include in the structure any one of polyethylene oxide, polypropylene oxide, a copolymer thereof, and a copolymer of at least one of these and another polyalkylene oxide. .
  • the material of the substrate may be plastic.
  • the plastic may be a saturated cyclic polyolefin.
  • the present invention comprising: a substrate; and a channel provided in the substrate,
  • a polymer substance including a first unit having a phosphorylcholine group and a second unit having an active ester group on the surface of the flow path;
  • a biochip wherein the active ester group reacts with a capturing substance that captures a physiologically active substance to form a covalent bond.
  • the channel is provided in the substrate, so that the capture substance force S is further sufficiently fixed.
  • the physiologically active substance can more reliably interact with the capturing substance.
  • the test solution can be caused to flow in the flow channel, and can be suitably used for detection or quantification of a physiologically active substance in the test solution captured by the capture substance. It can also be used to identify components contained in test solutions.
  • the flow path may be provided in a groove shape on the surface of the substrate.
  • the biochip has a plurality of the active ester groups, and the plurality of the active ester groups react with the capturing substance to form a covalent bond or are inactive. You may be misconductuled.
  • active ester group is inactive means that a part of the active ester group (leaving group) has been replaced by another group and has lost high reaction activity. Say.
  • the biochip of the present invention may have a protective member that covers the flow channel.
  • the protection member may be a plate-like member.
  • the configuration may be such that the substrate and the plate-shaped protection member are joined, and the flow path is formed on the joining surface.
  • the material of the substrate or the protective member may be plastic. Further, in the nanochip of the present invention, the material of the substrate is used for detecting light. On the other hand, it may be a transparent plastic. Further, in the present invention, at least one of the material of the substrate and the protection member may be plastic transparent to detection light.
  • the biochip of the present invention may have a configuration in which the physiologically active substance is further captured by the capture substance.
  • the first unit containing a phosphorylcholine group may have a 2 methacryloyloxetyl phosphorylcholine group.
  • the active ester group may have a nitrophenol group or an N-hydroxysuccinimide group.
  • the polymer substance may have a third unit including a butyl methacrylate group.
  • the polymer substance includes a copolymer of the monomer having the phosphorylcholine group, the monomer having the active ester group, and the monomer having the butyl methacrylate group. can do.
  • the material of the substrate may be glass.
  • the capture substance is one or more substances selected from the group consisting of nucleic acids, abs, proteins, enzymes, antibodies, oligopeptides, sugar chains, and glycoproteins. You may. Further, in the biochip of the present invention, the physiologically active substance is one or two or more substances whose nucleic acid, abtamer, protein, enzyme, antibody, oligopeptide, sugar chain, and glycoprotein are also selected. You can.
  • a capturing substance for capturing a physiologically active substance may be fixed to the surface of the substrate under neutral or alkaline conditions.
  • the neutral or alkaline condition can be a condition of pH 7.6 or more.
  • a biochip comprising a substrate having on its surface a polymer substance having a first unit containing a phosphorylcholine group and a second unit containing a monovalent group represented by the following formula (1): So,
  • a biochip in which a monovalent group represented by the following formula (1) reacts with a capturing substance that captures a physiologically active substance to form a covalent bond.
  • a monovalent group represented by the following formula (1) reacts with a capturing substance that captures a physiologically active substance to form a covalent bond.
  • A is a monovalent leaving group excluding a hydroxyl group.
  • a high-density composition comprising a first unit having a phosphorylcholine group and a plurality of second units having a monovalent group represented by the above formula (1) is provided on the surface of the substrate.
  • a biochip wherein the remaining monovalent group represented by the formula (1) and a hydrophilic polymer having a hydrophilic group react to form a covalent bond.
  • the present invention has a substrate, and a flow path provided in the substrate,
  • a polymer substance comprising a first unit having a phosphorylcholine group and a second unit having a monovalent group represented by the above formula (1),
  • a biochip wherein the active ester group reacts with a capturing substance that captures a physiologically active substance to form a covalent bond.
  • the monovalent group represented by the formula (1) may be a group selected from the following formulas (or formula (q)). ,.
  • R 1 and R 2 are each independently a monovalent organic group, and may be linear, branched, or cyclic.
  • R 1 may be a divalent group forming a ring together with C.
  • R 2 may be together with N It may be a divalent group forming a ring.
  • a biochip comprising a substrate having on its surface a polymeric substance having a first unit containing a phosphorylcholine group and a second unit containing a carboxylic acid-derived group, A biochip is provided in which a group reacts with a capturing substance that captures a physiologically active substance to form a covalent bond.
  • a biochip comprising, on a surface of a substrate, a polymer substance including a first unit having a phosphorylcholine group and a plurality of second units having a carboxylic acid-derived group,
  • a part of the carboxylic acid-derived group and a capturing substance that captures a physiologically active substance react to form a covalent bond;
  • a biochip wherein the remaining carboxylic acid-derived group reacts with a hydrophilic polymer having a hydrophilic group to form a covalent bond.
  • a polymer material including a first unit having a phosphorylcholine group and a second unit having a carboxylic acid-derived group on the surface of the flow channel;
  • a biochip is provided, wherein the active ester group reacts with a capturing substance that captures a physiologically active substance to form a covalent bond.
  • the microarray substrate has
  • a nucleic acid, an abdama, a protein, an enzyme, an antibody, an oligopeptide, a sugar chain, and a glycoprotein are provided.
  • the signal of the sample of the microarray can be accurately detected by reducing the autofluorescence of the microarray substrate and reducing the adsorption of the fluorescent substance.
  • a method for producing a substrate for a biochip is provided.
  • a substrate for a nanochip wherein the second layer is formed by copolymerizing the monomer having a phosphorylcholine group and the monomer having an active ester group on the first layer.
  • a method for using a biochip substrate comprising:
  • the non-specific adsorption or binding of the substance to be detected is controlled by controlling the pH of the solution of the physiologically active substance without coating the adsorption inhibitor. And a microchip with high detection sensitivity can be obtained.
  • the liquid may be a solution containing a physiologically active substance.
  • Conditions in 1) may be, for example, a P H7. 6.
  • the capture substance is selected from the group consisting of nucleic acids, proteins, proteins, enzymes, antibodies, oligopeptides, sugar chains, and glycoproteins. Two or more substances may be used.
  • the bioactive substance to be detected may be a nucleic acid, an abtamer, a protein, an enzyme, an antibody, an oligopeptide, a sugar chain, or a glycoprotein.
  • the group force may also be one or more selected substances.
  • the biochip substrate has a plurality of the active ester groups
  • the step of inactivating the remaining active ester groups can be performed using an alkali conjugate.
  • the step of inactivating the remaining active ester groups can be performed using a compound having a primary amino group.
  • the compound having a primary amino group may be aminoethanol or glycine.
  • the capture substance is one or more selected from the group consisting of nucleic acids, proteins, proteins, enzymes, antibodies, oligopeptides, sugar chains, and glycoproteins. It may be a substance. Further, in this configuration, the step of immobilizing the capture substance may include a step of bringing a solution containing the physiologically active substance and having a pH of 7.6 or less into contact with the surface of the substrate.
  • the biochip production method of the present invention which comprises the capturing substance.
  • Contacting the surface of the substrate with an acidic or neutral liquid comprising the pH of the acidic or neutral liquid.
  • the pH of the acidic or neutral liquid may be 7.6 or less.
  • a biochip produced by the method for producing a biochip.
  • FIG. 1 is a plan view showing a configuration of a biochip according to an embodiment.
  • the present embodiment relates to a biochip substrate in which a capturing substance for capturing a physiologically active substance is immobilized on a substrate (solid phase substrate).
  • This biochip substrate has a polymer material on the surface of the substrate.
  • the polymer substance has a first unit containing a phosphorylcholine group and a second unit containing a carboxylic acid-inducing group.
  • components of the biochip substrate will be described.
  • a polymer substance having a first unit containing a phosphorylcholine group and a second unit containing a carboxylic acid-derived group has a property of suppressing nonspecific adsorption of a bioactive substance and a property of fixing a bioactive substance. It is a polymer that has both.
  • the phosphorylcholine group contained in the first unit plays a role in suppressing non-specific adsorption of a physiologically active substance
  • the sulfonic acid-derived group contained in the second unit plays a role in chemically immobilizing the capture molecule.
  • the first unit is, for example, a (meth) atalyloyloxyalkylphosphorinolecholine group such as a 2-methacryloyloxyshethylphosphorylcholine group or a 6-methacryloyloxyhexylphosphorylcholine group;
  • Atalyloyloxyalkoxyalkyl phosphorolinolecholine groups such as 2-methacryloyloxyethoxyshethyl phosphorylcholine group and 10-methacryloyloxyethoxylinol phosphorylcholine group;
  • Alkylphosphorinolecholine groups such as acrylphosphorylcholine, butyrphosphorylcholine, hexenylphosphorylcholine, otaturphosphorylcholine, and decylphosphorylcholine;
  • the phosphorylcholine group S can be included in these groups.
  • the first unit has 2-methacryloyloxyshethyl phosphorylcholine, non-specific adsorption on the substrate surface can be more reliably suppressed.
  • the activated carboxylic acid derivatives include carboxylic acid anhydrides, such as acrylic acid, methacrylic acid, crotonic acid, maleic acid, and fumaric acid, such as acrylic acid, methacrylic acid, maleic acid, and fumaric acid, acid halides, active esters, and active esters.
  • An example of a dani amide converted into a dani amide is given.
  • the carboxylic acid-derived group is an activated group derived from such a compound, for example, an active ester group such as a p-ditrophenyl group ⁇ N-hydroxysuccinimide group;
  • Halogens such as C1 and F;
  • the carboxylic acid-derived group may be a group represented by the following formula (1). [0111] [Chemical Formula 5] One C—A
  • A is a leaving group excluding a hydroxyl group.
  • the monovalent group represented by the above formula (1) is selected, for example, from the following formula (p) or formula (q)
  • V can be the base of any deviation.
  • R 1 and R 2 are each independently a monovalent organic group, and may be any of linear, branched, and cyclic
  • R 1 may be a divalent group forming a ring together with C.
  • R 2 may form a ring together with N It may be a divalent group.
  • Examples of the group represented by the above formula (p) include groups represented by the following formulas (r), (s), and).
  • Examples of the group represented by the above formula (q) include groups represented by the following formulas (u) and (V).
  • the group represented by the above formula (1) is, for example, a group derived from an acid anhydride represented by the following formula (r) or formula (s);
  • the active ester group is preferably used because of its excellent reactivity under mild conditions.
  • the mild conditions include, for example, neutral or alkaline conditions, specifically pH 7.0 to 10.0, more specifically pH 7.6 to 9.0, and more specifically pH 8. Can be 0.
  • the definition of the "active ester group” as defined in this specification is not strictly defined, but as a conventional technical expression, the acidity of the ester group is added to the alcohol side of the ester group.
  • a group of esters that have an electron-withdrawing group and activate the nucleophilic reaction that is, an ester group having a high reaction activity, means various chemical synthesis such as polymer chemistry, peptide synthesis, and the like. Is commonly used in the field. Practically, phenol esters, thiophenol esters, N-hydroxyamine esters, esters of heterocyclic hydroxy conjugates, etc. are active esters having a much higher activity than alkyl esters and the like. Known as the base.
  • Active ester groups include, for example, p-trophenyl, N-hydroxysuccinimide, succinimide, phthalimide, and 5-norbornene-2,3-dicarboximide groups.
  • p two An oral phenyl group is preferably used.
  • the first unit containing a phosphorylcholine group is 2- It may have a methacryloyloxetyl phosphorylcholine group, and the active ester group may be a nitrophenyl group.
  • the polymer substance used in the present invention may contain other groups in addition to the phosphorylcholine group and the carboxylic acid-derived group. Further, the polymer substance can be a copolymer. Specifically, the polymer substance is preferably a copolymer containing a butyl methacrylate group. By doing so, the polymer substance can be appropriately hydrophobized, and the adsorptivity to the substrate surface can be more appropriately secured.
  • a polymer substance is prepared by combining a first monomer having a 2-methacryloyloxetylphosphorylcholine (MPC) group with p-trophenylcarpo-loxyshetyl methacrylate (N It can be a copolymer of a second monomer having a (PMA) group and a third monomer having a butyl methacrylate (BMA) group.
  • PMA 2-methacryloyloxetylphosphorylcholine
  • BMA butyl methacrylate
  • Poly (MPC-co-BMA-co-NPMA) (PMBN) which is a copolymer thereof, is schematically represented by the following general formula (2).
  • a, b, and c are each independently a positive integer.
  • the first and third monomers may be block-copolymerized, or these monomers may be randomly copolymerized!
  • the copolymer represented by the general formula (2) is more excellent in balance between a property of appropriately rendering a polymer substance hydrophobic, a property of suppressing nonspecific adsorption, and a property of immobilizing a capture substance. It is a configuration. Therefore, by using this, the surface of the substrate can be more reliably made of a polymer substance. While covering and suppressing non-specific adsorption on the substrate provided with the polymer substance, the trapping substance can be more reliably fixed by covalent bond and introduced onto the substrate.
  • the copolymer represented by the general formula (2) can be obtained by mixing each monomer of MPC, BMA, and NPMA, and by a known polymerization method such as radical polymerization.
  • a known polymerization method such as radical polymerization.
  • solution polymerization should be performed at a temperature of 30 ° C or more and 90 ° C or less in an inert gas atmosphere such as Ar. I can do it.
  • the solvent used in the solution polymerization is appropriately selected.
  • an anolycole such as methanol, ethanol and isoprononoe
  • an athenole such as etinoleatenole
  • an organic solvent such as chlorophonolem alone or a mixture of a plurality of solvents
  • radical polymerization initiator used in the radical polymerization reaction those commonly used can be used.
  • azo-based initiators such as azobisisobutymouth-tolyl (AIBN) and azobis valero-tolyl;
  • Oil-soluble organic peroxides such as lauroyl peroxide, benzoyl peroxide, t-butylperoxy neodecanoate and t-butyl peroxybivalate;
  • polymerization is performed for about 2 to 6 hours at 60 ° C in Ar using a mixed solvent of getyl ether and chloroform in a volume ratio of 8 to 2 and AIBN. Can be.
  • the material of the substrate used as the biochip substrate can be, for example, glass, plastic, metal or the like.
  • thermoplastic resins which are preferred by plastics, are more preferred from the viewpoint of easiness of surface treatment and mass productivity.
  • thermoplastic resin a resin that generates a small amount of fluorescence can be used.
  • a resin with a small amount of generated fluorescence / resin the background in the reaction for detecting a physiologically active substance can be reduced, and thus the detection sensitivity can be further improved.
  • thermoplastic resin having a small amount of fluorescent light include, for example, polyethylene and polypropylene. Linear polyolefin;
  • Etc. can be used.
  • saturated cyclic polyolefin is particularly excellent in heat resistance, chemical resistance, low fluorescence, transparency, and moldability, and thus is suitable for optical analysis and is preferably used as a material for a substrate.
  • the saturated cyclic polyolefin refers to a polymer having a cyclic olefin structure alone or a saturated polymer obtained by hydrogenating a copolymer of cyclic olefin and a-olefin.
  • the former include, for example, hydrogenation of norbornene-based monomers typified by norbornene, dicyclopentadiene, and tetracyclododecene, and polymers obtained by ring-opening polymerization of these alkyl-substituted products. It is a saturated polymer produced.
  • the latter copolymer is composed of ⁇ -olefins such as ethylene, propylene, isopropylene, 1-butene, 3-methyl-1-butene, 1-pentene, 3-methyl-1-pentene, 1-hexene and 1-otene, and cyclic olefins. It is a saturated polymer produced by hydrogenating a random copolymer of a series of monomers. Among the copolymers, copolymers with ethylene are most preferred. These resins may be used alone, or may be two or more copolymers or mixtures.
  • a saturated cyclic polyolefin obtained by addition polymerization of a monomer having a cyclic olefin structure which is not limited to a saturated cyclic polyolefin obtained by ring-opening polymerization of a monomer having a cyclic olefin structure.
  • the biochip substrate according to the present embodiment is obtained by applying a liquid containing a polymer substance to the surface of a substrate processed into a predetermined shape and drying the liquid.
  • the substrate may be immersed in a liquid containing a polymer substance and dried.
  • the shape of the substrate is not limited to a plate, and may be, for example, a film or a sheet.
  • the substrate can be a flexible plastic film.
  • the substrate may be composed of one member, or may be composed of a plurality of members.
  • the Noochip can have a configuration in which, for example, a capturing substance that captures a bioactive substance via a polymer substance is immobilized on the surface of a biochip substrate. In this case, it can be more suitably used for detecting a physiologically active substance.
  • the biochip may be used alone, or may be used in a state of being incorporated in another analyzer.
  • a configuration may be adopted in which the Noo chip also serves as a sample stage of the analyzer.
  • the capturing substance that captures a physiologically active substance can be a substance that specifically interacts with the physiologically active substance.
  • the specific interaction may be a physical interaction or a chemical interaction.
  • the capturing substance can have a physiological activity.
  • the biologically active capture substance include nucleic acids, abscesses, proteins, enzymes, antibodies, oligopeptides, sugar chains, and glycoproteins.
  • the physiologically active substance is, for example, a nucleic acid, an abdomen, a protein, an enzyme, an antibody, an oligopeptide, a sugar chain, or a glycoprotein. Can be.
  • the biochip of the present embodiment is obtained by immobilizing a capture substance on a biochip substrate.
  • the manufacturing process of the Noo chip is, for example,
  • the pH of the liquid in which the trapping substance is dissolved or dispersed can be, for example, a neutral acidic force.
  • washing with pure water or a buffer solution can be performed to remove the immobilized small bioactive substance.
  • alkaline conjugate examples include sodium hydroxide, potassium hydroxide, sodium carbonate, sodium hydrogen carbonate, disodium hydrogen phosphate, calcium hydroxide, magnesium hydroxide, sodium borate, and hydroxide. Lithium, potassium phosphate, or the like can be used.
  • Examples of the compound having a primary amino group include glycine, 9 aminoaquadine, aminobutanol, 4-aminobutyric acid, aminocaprylic acid, aminoethanol, 5-amino2,3-dihydro-1,4-pentanol, aminoethane Thiol hydrochloride, aminoethanethiol sulfate, 2- (2-aminoethylamino) ethanol, 2-aminoethyl dihydrogen phosphate, aminoethyl hydrogen sulfate, 4 (2-aminoethyl) morpholine, 5-aminofluorescein, 6-aminohexanoic acid, aminohexyl cellulose, p-aminohippuric acid, 2-amino-2-hydroxymethyl-1,3 propanediol, 5-aminoisophthalic acid, aminoaminomethane, aminophenol, 2-aminooctane, 2 -Aminooctanoic acid,
  • the capturing substance immobilized on the Noochip substrate preferably has an amino group in order to increase the reactivity with the active ester group. Since an amino group has excellent reactivity with an active ester group, the use of a capturing substance having an amino group enables the capturing substance to be efficiently and firmly fixed on the biochip substrate.
  • the amino group may be introduced at the terminal of the molecular chain or at the side chain, but is preferably introduced at the terminal of the molecular chain.
  • an amino acid is used to enhance the reactivity with an active ester group.
  • the amino acid group has an amino group in the molecular chain.
  • an amino group may be further introduced into the molecular chain terminal.
  • the terminal amino group can be reacted with the active ester group to form a covalent bond with the polymer substance more reliably.
  • the terminal amino group for immobilization, the hybridization with the DNA complementary strand and the mutual reaction with the protein can be performed more efficiently.
  • a biochip having a capture substance immobilized on a substrate is obtained.
  • This biochip can be used for detection, quantification, and the like of a physiologically active substance. It can also be used to identify biologically active substances contained in test solutions.
  • detection of a physiologically active substance using a biochip will be described.
  • the method for detecting a physiologically active substance using a Noo chip can be performed using, for example, a fluorescent substance. By doing so, the detection sensitivity can be improved.
  • the active ester group When the active ester group is used on a biochip without inactivating the active ester group, or when there is a possibility that the active ester group may remain on the substrate, the biological activity
  • the liquid in which the substance is dissolved or dispersed can also be made neutral or acidic. By doing so, non-specific reaction and adsorption between the polymer substance and the physiologically active substance can be suppressed more reliably.
  • P H of the liquid 8.0 or less preferably to 7.6 or less. Further, more specifically, for example, it can be PH 7.0.
  • the active ester group reacts with the amino group of the biologically active substance, and the biologically active substance to be detected is easily immobilized by covalent bonding to a portion other than the spotted capture molecule.
  • nonspecific adsorption or binding of a substance to be detected is suppressed without coating the surface of the biochip substrate with an adsorption inhibitor, and a capture molecule that captures a biologically active substance is provided. Can be reliably fixed by covalent bonding, so that detection sensitivity and detection accuracy can be improved.
  • the biochip of the present embodiment is used for, for example, parallel detection and analysis of a large number of proteins, nucleic acids, and the like in a biological sample. More specifically, it is used, for example, for measuring proteomics and gene activity at the intracellular protein level.
  • immobilization of the capture substance on the biochip substrate and detection of the physiologically active substance are performed under the following conditions.
  • the capture substance when the capture substance is immobilized on the biochip substrate, a method in which a liquid in which the capture substance is dissolved or dispersed can be spotted can be used. .
  • the immobilization reaction of the trapping substance is performed under neutral or alkaline conditions.
  • a liquid in which a capturing substance used for spotting is dissolved or dispersed is made neutral or alkaline.
  • the capture substance and the active ester group in the second unit of the polymer substance can be more reliably reacted to form a covalent bond.
  • these conditions for example, P H7. 0 or more, preferably to pH 7. 6 above. More specifically, the pH can be adjusted to 8.0. If the pH is too low, there is a concern that it becomes difficult to immobilize the trapping substance, which is difficult to react with the active ester group and the trapping substance.
  • the lower limit of the pH of the liquid containing the trapping substance can be set to, for example, pHIO or less, which is appropriately selected depending on the type of the trapping substance and the material of the polymer substance.
  • an acidic or neutral liquid containing the biologically active substance for example, a solution is added to the polymeric substance on the substrate.
  • the liquid containing the physiologically active substance can be neutral or acidic, specifically, under the pH conditions described in the first embodiment.
  • the configuration of the biochip substrate and the biochip is as follows.
  • the configuration described in the first embodiment can be used.
  • the configuration of the biochip of the present embodiment can be a configuration shown in the following (i) to (X).
  • the capture substance is at least one of nucleic acids, proteins, oligopeptides, sugar chains, and glycoproteins;
  • (X) A configuration in which the physiologically active substance is at least one of nucleic acids, proteins, oligopeptides, sugar chains, and glycoproteins.
  • the present embodiment when used for detection and analysis of proteins, nucleic acids, and the like, nonspecific adsorption or binding of the detection target substance without coating with an anti-adhesion agent is prevented.
  • a biochip that is suppressed and has high detection accuracy and high detection sensitivity can be obtained.
  • the capture substance is immobilized under the conditions described in the second embodiment using the biochip substrate described in the first embodiment.
  • the conditions for immobilizing the capture substance can be the conditions described in the second embodiment.
  • a liquid containing the biologically active substance to be detected is brought into contact with the polymer substance on the substrate, and the biologically active substance is captured by the capture substance.
  • the pH of the liquid containing the physiologically active substance is set to be lower than or equal to the pH of the liquid containing the capturing substance, preferably lower than the pH of the liquid containing the capturing substance.
  • immobilization of a capture substance on a biochip substrate and detection of a physiologically active substance can be performed by the following procedures (1) and (2).
  • the present embodiment by controlling the pH of the liquid containing the physiologically active substance, non-specific adsorption or binding of the detection target substance without coating with the anti-adsorption agent is suppressed, and the detection accuracy is improved. And a biochip with high detection sensitivity can be obtained. If a microarray substrate is used as a microchip substrate, a microarray having excellent detection sensitivity can be obtained.
  • the configurations described in the first embodiment or other embodiments can be used as the configurations of the biochip substrate and the biochip.
  • the biochip substrate according to the present embodiment includes a polymer having a first layer containing a compound having an amino group and a second unit containing a first unit having a phosphorylcholine group and a carboxylic acid derivative on the substrate surface.
  • the substrate, the first layer, and the second layer are stacked in this order.
  • the substrate for example, the material or the shape described in the first embodiment can be used.
  • a plastic substrate such as a saturated cyclic polyolefin or a glass substrate can be used.
  • the first layer contains a compound having an amino group.
  • the first layer functions as an adhesive layer that fixes the second layer on the substrate and suppresses peeling.
  • the first layer can include, for example, an aminosilane such as a silane coupling agent having an amino group.
  • the first layer can be more stably provided on the substrate surface, and the substrate surface can be more reliably covered with the first layer.
  • the silane coupling agent having an amino group may be present in the form of an organosiloxane or a polyorganosiloxane.
  • the thickness of the first layer can be, for example, 1 A (0.1 nm) or more. By doing so, the surface of the substrate can be surely covered, and peeling of the surface force of the substrate of the second layer can be suppressed more reliably.
  • the upper limit of the thickness of the first layer is not particularly limited, but may be, for example, 100 A (10 nm) or less.
  • the second layer has a function of coating the substrate to provide a surface state suitable for detection of a physiologically active substance and the like.
  • the polymer material constituting the second layer is a polymer having both the property of suppressing nonspecific adsorption of the physiologically active substance and the property of immobilizing the physiologically active substance.
  • Phosphorylcholine groups in polymer substances play a role in suppressing nonspecific adsorption of bioactive substances.
  • the carboxylic acid-derived group in the polymer substance has a role of reacting with the amino group of the compound in the first layer and a role of immobilizing the capturing substance.
  • the configuration described in the first embodiment can be applied.
  • the group containing a phosphorylcholine group and the carboxylic acid-derived group in the polymer substance can be, for example, the groups exemplified in the first embodiment.
  • a structure in which the first unit of the polymer substance has a 2-methacryloyloxetyl phosphorylcholine group can be employed.
  • the second unit of the polymer substance may have a p-nitrophenyl group.
  • the polymer substance may have a third unit containing a butylmetharylate group.
  • the activated carboxylic acid derivative is an active ester group will be described.
  • the thickness of the second layer can be, for example, 5 nm or more. By doing this, thus, the surface of the substrate provided with this layer can be reliably covered, and nonspecific adsorption of a physiologically active substance or the like can be further suppressed. Although there is no particular upper limit on the thickness of the second layer,
  • An intervening layer may or may not exist between the substrate and the first layer and between the first layer and the second layer.
  • the first layer is provided in contact with the substrate, and the second layer is provided in contact with the first layer, and the biochip is manufactured in a laminated form in which substantially no intervening layer is present.
  • the separation of the polymer substance from the substrate in the use process can be more reliably suppressed.
  • the amino group in the first layer may react with a part of the active ester groups in the second layer to form a covalent bond, specifically, an amide bond. it can.
  • the second layer can be more securely fixed on the substrate, and the separation can be suppressed.
  • a biochip can be obtained by chemically immobilizing a capture substance for capturing a physiologically active substance on a biochip substrate using the remaining active ester groups.
  • the method for manufacturing a biochip substrate of the present embodiment can include a step of providing a first layer on a substrate and a step of providing a second layer on the first layer.
  • the manufacturing process of the biochip substrate includes, for example, the following processes (1) and (2). Can be included.
  • step (1) a first layer is formed on the substrate.
  • the first layer containing a compound having an amino group is introduced into the substrate surface using a method such as aminoalkylsilane treatment, plasma treatment in a nitrogen atmosphere, or coating of a polymer material containing an amino group.
  • a method such as aminoalkylsilane treatment, plasma treatment in a nitrogen atmosphere, or coating of a polymer material containing an amino group.
  • the aminoalkylsilane treatment is preferably used in terms of simplicity and uniformity.
  • the aminoalkylsilane treatment can be performed, for example, by immersing the substrate in an aminoalkylsilane (coupling agent) solution and heat treatment.
  • concentration of the aminoalkylsilane solution is For example, it can be 0.1% by weight or more and 10% by weight or less, preferably 0.1% by weight or more and 5% by weight or less, more preferably 1% by weight or more and 5% by weight or less.
  • the concentration of the aminoalkylsilane is 10% by weight or less, preferably 5% by weight or less, and more preferably 1% by weight or less, the aminoalkylsilane conjugate can be uniformly dispersed on the substrate. . For this reason, variation in the thickness of the first layer can be suppressed.
  • step (2) will be described.
  • the second layer is formed on the first layer.
  • a phosphorylcholine group When forming a second layer containing a polymer substance having a first unit containing a phosphorylcholine group and a second unit containing an active ester group on the first layer, for example, a phosphorylcholine group
  • a method in which the substrate is immersed in a solution of a polymer substance having a polymer and an active ester group can be used.
  • the concentration of the polymer having a phosphorylcholine group and an active ester group can be, for example, from 0.05% by weight to 5.0% by weight, and preferably from 0.1% by weight to 1.0% by weight. .
  • the concentration of the polymer substance By setting the concentration of the polymer substance to 0.05% by weight or more, preferably 0.1% by weight or more, the second layer covering the first layer can be surely provided. Further, by setting the concentration of the polymer substance to 5.0% by weight or less, preferably 1.0% by weight or less, the second layer is uniformly formed on the first layer, and the second layer is formed. Variation in film thickness can be suppressed.
  • non-specific adsorption or binding of a substance to be detected without coating with an adsorption inhibitor is suppressed, and the film is not peeled off even by washing with a surfactant.
  • a substrate for a biochip with high sensitivity can be obtained.
  • the biochip can be obtained by immobilizing various capture substances using the biochip substrate of the present embodiment.
  • bioactive substances can be detected using a biochip.
  • the substances described in the first embodiment can be used as the capturing substance and the physiologically active substance.
  • the configurations of the biochip substrate and the biochip are the same as those of the first embodiment or those described above. The configuration described in the embodiment can be used.
  • the present embodiment relates to a biochip using the biochip substrate described in the above embodiment.
  • the biochip of the present embodiment is a biochip substrate having a polymer substance having a phosphorylcholine group and a plurality of carboxylic acid-derived groups on the surface of the substrate.
  • the capturing substance to be captured reacts to form a covalent bond, and the remaining carboxylic acid-derived group and the hydrophilic polymer having a hydrophilic group react to form a covalent bond. is there.
  • the biochip substrate described in another embodiment of the present specification can be used as the nanochip substrate.
  • the polymer substance of the Noochip substrate may have a p-type as an active ester group in which the first unit contains a 2-methacryloyloxetyl phosphorylcholine group and the second unit is an embodiment of an activated carboxylic acid-derived group.
  • a configuration having a trophenol group can be employed.
  • a polymer substance represented by the general formula (2) may be used.
  • the biochip of the present embodiment is configured such that, among a plurality of active ester groups contained in the polymer substance of the biochip substrate, some of the active ester groups react with the capturing substance, and After the step of immobilizing the capture substance for forming a covalent bond and the step of immobilizing the capture substance, a step of reacting the remaining active ester groups with the hydrophilic polymer to form a covalent bond with the hydrophilic polymer can be included.
  • the immobilization of the capture substance on the Noochip substrate can be performed by the method described in the above embodiment, for example, by the method described in the second embodiment.
  • a method in which a liquid in which a physiologically active substance is dissolved or dispersed is spotted.
  • the pH of the liquid in which the capture substance is dissolved or dispersed can be neutral or alkaline. , Preferably 7.6 or more. After the spotting, it can be washed with pure water or a buffer solution to remove immobilized entrapped substances.
  • the capture substance is immobilized and washed, the capture substance is left on the substrate surface other than the spotted substance, that is, on the substrate! /
  • the active ester group is converted into a hydrophilic polymer.
  • introduction of the hydrophilic polymer into the polymer substance will be described.
  • the polymer substance is converted into a hydrophilic polymer by reacting an active ester group on the surface of the substrate other than the immobilized physiologically active substance with a hydrophilic polymer.
  • the hydrophilic polymer is a polymer having a hydrophilic group, and can include, for example, a polyalkylene oxide or a plurality of types of polyalkylene oxides in its structure.
  • a polyalkylene oxide for example, a structure of polyethylene glycol, polypropylene glycol, a copolymer thereof, or a copolymer of at least one of these and another polyalkylene oxide can be included in the structure.
  • the terminal of the hydrophilic polymer is aminated to enhance the reactivity with the active ester group.
  • Specific examples of the hydrophilic polymer having an amino group introduced at its terminal include Jeffamine M series manufactured by San Techno Chemical Co., Ltd. (XTJ-505, XTJ-6506, XTJ-507, M-2070, XTJ-234) Equal strength.
  • the hydrophilic polymer For the introduction of the hydrophilic polymer into the active ester group, a method of immersing the substrate on which the physiologically active substance is immobilized in a liquid such as a solution of the hydrophilic polymer is preferable.
  • concentration of the hydrophilic polymer in the liquid containing the hydrophilic polymer can be, for example, 0.1% by weight or more.
  • the hydrophilic polymer can be reliably introduced into the polymer substance.
  • the concentration of the hydrophilic polymer can be, for example, 100% by weight or less.
  • the biochip according to the present embodiment has a configuration in which the active ester group remaining due to the introduction of the hydrophilic polymer is eliminated, and therefore, the non-specific detection target substance without coating with the adsorption inhibitor is not required. By suppressing adsorption or binding, the detection sensitivity can be more reliably improved. [0203] In this embodiment, as the configurations of the biochip substrate and the biochip, the configurations described in the first embodiment or the other embodiments described above can be used.
  • the carboxylic acid-derived group contained in the second unit of the polymer substance is an active ester group
  • the active ester group may be an N-hydroxysuccinimide group
  • a biochip in which a capture substance having a physiological activity such as a primary antibody is immobilized on a biochip substrate may be immobilized.
  • a reaction-based immobilization method is used.
  • p-nitrophenyl ester is relatively high and has excellent reactivity on the pH side. For this reason, depending on the type of the capturing substance having a physiological activity, there was a concern that a sufficient signal intensity could not be obtained due to denaturation or decomposition of the capturing substance due to high pH.
  • the trapping substance can be immobilized at a lower pH, for example, pH 7.4 or more and 9.0 or less. For this reason, even in the case of a capture substance having low stability at a high pH, it is possible to stably immobilize the polymer substance while maintaining physiological activity.
  • the basic configuration of the biochip substrate of the present embodiment is similar to that of the biochip substrate according to the first embodiment except that the second unit in the polymer substance has an N-hydroxysuccinimide group. It can be the same as the substrate.
  • the first unit containing a phosphorylcholine group is 2 A methacryloyloxetyl phosphorylcholine group, wherein the active ester group is an N-hydroxysuccinimide group.
  • the target to be detected without coating the substrate with the anti-adsorption agent Since nonspecific adsorption or binding of a substance can be suppressed, the signal intensity can be improved.
  • the ratio of the phosphorylcholine group to the first unit in the polymer substance or the ratio of the activated carboxylic acid-derived group contained in the second unit of the polymer substance is determined.
  • the following can also be used.
  • the activated carboxylic acid-derived group is an active ester group
  • the polymer substance on the substrate may have the following component (a).
  • the ratio of the phosphorylcholine group contained in the polymer substance to the total of the phosphorylcholine group, the active ester group, and the butyl methacrylate group is, for example, 3 mol% or more, preferably 25% or more. Can be. If the proportion of the phosphorylcholine group is too small, non-specific adsorption of a physiologically active substance will occur when used as a chip, and there is a concern that the knocking ground may increase.
  • the ratio of the phosphorylcholine group contained in the polymer substance on the substrate to the total of the phosphorylcholine group, the active ester group, and the butyl methacrylate group is, for example, 40 mol% or less, preferably less than 40 mol%. , More preferably 35 mol% or less, and still more preferably less than 35 mol%. If the proportion of the phosphorylcholine group is too large, the water solubility of the mixed polymer becomes high, and there is a concern that the surface layer may be peeled off.
  • the ratio of the active ester group contained in the polymer substance to the total of the phosphorylcholine group and the active ester group can be, for example, 1 mol% or more and 25 mol% or less. If the proportion of the active ester group is too small, the amount of the immobilized physiologically active substance is reduced and sufficient. There is a concern that a signal cannot be obtained. If the proportion of the active ester groups is too large, the amount of the active ester groups present on the outermost surface is saturated, and there is a concern that the signal intensity is not improved.
  • the ratio of the active ester group contained in the polymer substance to the total of the phosphorylcholine group and the active ester group can be, for example, 15 mol% or more and less than 25 mol%.
  • the ratio of the active ester group contained in the polymer substance to the total of the phosphorylcholine group and the active ester group is 1 mol% or more. More preferably, it is 8% or less. By setting the content to 1 mol% or more and 8% or less, the detection sensitivity can be further improved.
  • the polymer substance has the following constitution composed of the above-mentioned component (a) and the following component (b).
  • the first unit of (a) and the first unit of (b) may have the same structure or different structures.
  • the third unit of (a) and the third unit of (b) may have the same structure or may have different structures. It may be a structure.
  • the component (b) is used as a polymer that suppresses nonspecific adsorption of a physiologically active substance.
  • Such polymers for example phosphorylcholine group 30 mole 0/0, and butyl methacrylate over preparative groups are in a ratio of 70 mole 0/0, using MPC polymer (manufactured by NOF Corporation) is shall be able to.
  • the polymer substance is composed of the components (a) and (b)
  • a configuration in which the components (a) and (b) are mixed can be adopted. Since the polymers of the components (a) and (b) can be dissolved in, for example, an ethanol solution, a mixed polymer can be easily obtained by mixing the respective polymer solutions.
  • the ratio of the phosphorylcholine group contained in the mixed polymer also having the component powers (a) and (b) to the total of the phosphorylcholine group, the active ester group, and the butyl methacrylate group is, for example, it can be at least 3 mol%, preferably at least 25 mol%. If the proportion of the phosphorylcholine group in the mixed polymer is too small, nonspecific adsorption of a physiologically active substance will occur, and the background may be increased.
  • the ratio of the phosphorylcholine group contained in the mixed polymer (a) or (b) to the total of the phosphorylcholine group, the active ester group, and the butyl methacrylate group is, for example, 40 mol%. Below, preferably less than 40 mol%, more preferably 35 mol% or less, even more preferably less than 35 mol%. Also in the mixed polymer, if the proportion of the phosphorylcholine group is too large, the water solubility of the mixed polymer becomes high, and there is a concern that the surface layer may be peeled off.
  • the ratio of the active ester group contained in the mixed polymer composed of the components (a) and (b) to the total of the phosphorylcholine group, the active ester group, and the butyl methacrylate group is, for example, It can be 1 mol% or more and 25 mol% or less. Also in the case of a mixed polymer, if the ratio of the active ester group is too small, there is a concern that the immobilization amount of the physiologically active substance is reduced and a sufficient signal cannot be obtained. If the proportion of the active ester group is too large, the amount of the active ester group present on the outermost surface is saturated, and there is a concern that the signal intensity is not improved.
  • the ratio of the active ester group contained in the mixed polymer (a) and (b) to the total of the phosphorylcholine group and the active ester group is, for example, from 15 mol% to 25 mol%. Can be less than.
  • the ratio to the total is 1 mol% or more and 8% or less.
  • the active ester group for example, a p-ditrophenyl group, an N-hydroxysuccinimide group, or the like can be used.
  • the capture substance is immobilized on the biochip substrate.
  • a method of spotting a liquid in which a physiologically active substance is dissolved or dispersed can be used.
  • the pH of the liquid in which the trapping substance is dissolved or dispersed can be 7.6 or more. After the spotting, it can be washed with pure water or a buffer solution to remove immobilized substances. After the washing, a portion other than the portion on which the physiologically active substance is spotted is subjected to hydrophilic polymer driving.
  • nonspecific adsorption or binding of a substance to be detected without coating with an adsorption inhibitor is suppressed, and a biochip with high detection accuracy or detection sensitivity can be obtained.
  • the present embodiment relates to a microarray substrate having the nanochip substrate described in the above embodiment.
  • This microarray substrate has a polymer substance having a first unit containing a phosphorylcholine group and a second unit containing an active ester group on the substrate surface.
  • the components, materials, and manufacturing method of the microarray substrate described in the above embodiments can be used.
  • the microarray substrate of the present embodiment has a configuration in which autofluorescence is reduced and adsorption of a fluorescent dye is reduced. Therefore, the information signal of the specimen can be detected with higher sensitivity as fluorescence.
  • This microarray substrate is preferably used as a microarray substrate for immobilizing a capturing substance for capturing a physiologically active substance on the surface of the substrate and detecting the physiologically active substance using a fluorescent dye.
  • a microarray suitably used as a microarray for detecting a biologically active substance using a fluorescent dye is obtained.
  • a microarray can be obtained by immobilizing at least one capture substance of nucleic acids, abs, proteins, enzymes, antibodies, oligopeptides, sugar chains, and glycoproteins on a microarray substrate.
  • a microarray is not limited to a DNA microarray, but refers to a device in which a predetermined physiologically active capture substance is integrated (chip-tilted) on a substrate.
  • the configuration of the microarray substrate and the microarray includes the microchip substrate and the microchip substrate according to the first embodiment or the other embodiments described above.
  • a microchip configuration can be applied.
  • the configuration of the biochip of the present embodiment can be as shown in the following (i) to (vi).
  • the present embodiment relates to another configuration of a microchip substrate in which a polymer substance having a first unit having a phosphorylcholine group and a second unit having a carboxylic acid-derived group is provided on the substrate.
  • the microchip substrate of this embodiment includes a substrate, a first layer provided on the substrate and containing an organosiloxane, a monomer having a phosphorylcholine group provided on the first layer, and a carboxyl group. And a second layer containing a copolymer with a monomer having an acid-derived group.
  • a layer is provided in which a substrate, a first layer, and a second layer are stacked in this order.
  • the carboxylic acid-derived group is an active ester group will be described as an example.
  • the organosiloxane constituting the first layer can be a compound having a group having a polymerizable double bond.
  • the group having a polymerizable double bond may constitute an alkenyl group (olefin group). Further, at least a part of the group having a polymerizable double bond may constitute an acrylate group, a metathallate group, or a butyl group.
  • the first layer can have a compound having at least one group selected from an atalylate group, a metathalylate group, a vinyl group, and another alkenyl group.
  • the substrate described in the above embodiment can be used.
  • the second layer to be overlaid is formed by radical polymerization, photopolymerization, or radical polymerization of a monomer.
  • This layer reacts with the monomer in the second layer when formed by polymerization such as ionic polymerization, and fixes the second layer on the substrate by covalent bonding.
  • the thickness of the first layer can be, for example, 1 A (0.1 nm) or more. By doing so, the surface of the substrate can be surely covered, and peeling of the surface force of the substrate of the second layer can be suppressed more reliably.
  • the upper limit of the thickness of the first layer is not particularly limited, but may be, for example, 100 A (10 nm) or less.
  • the second layer has a function of coating the substrate to provide a surface state suitable for detection of a physiologically active substance or the like.
  • the second layer has both the property of suppressing nonspecific adsorption of a physiologically active substance and the property of immobilizing a trapping substance.
  • the phosphorylcholine group in the copolymer in the second layer plays a role in suppressing non-specific adsorption of the physiologically active substance, and the active ester group in the copolymer plays a role in fixing the physiologically active substance. Fulfill.
  • the thickness of the second layer can be, for example, 5 nm or more. By doing so, the surface of the substrate on which the first layer is provided can be reliably covered, and non-specific adsorption of a physiologically active substance or the like can be suppressed more reliably.
  • the upper limit of the thickness of the second layer is not particularly limited, but may be, for example, 100 nm or less.
  • An intervening layer may or may not exist between the substrate and the first layer and between the first layer and the second layer.
  • the first layer is provided in contact with the substrate, and the second layer is provided in contact with the first layer, and the biochip is manufactured in a laminated form in which substantially no intervening layer is present.
  • the separation of the polymer substance from the substrate in the use process can be more reliably suppressed.
  • the organosiloxane in the first layer has a group having a polymerizable double bond, and the group having a polymerizable double bond reacts with the copolymer to form a covalent bond. Configuration.
  • the first layer is formed only of a compound having at least one group selected from an atalylate group, a metathallate group, a butyl group, and another alkenyl group.
  • the layer may also be formed with a copolymer alone.
  • a structure in which the first layer is provided on the surface of the substrate and the second layer is provided on the surface of the first layer may be employed.
  • the substrate for the second layer is formed by forming a first layer on the substrate surface and then copolymerizing a monomer having a phosphorylcholine group and a monomer having an active ester group on the first layer. It is obtained by forming
  • a silane coupling agent having a polymerizable double bond can be used as the organosiloxane used for forming the first layer on the substrate surface.
  • the silane coupling agent may be present on the substrate in the form of an organosiloxane.
  • the organosiloxane is preferably a silane coupling agent having at least one group selected from an atalylate group, a metathalylate group, a butyl group, and other olefin groups.
  • silane coupling agents (3 acryloxypropyl) trimethoxysilane, methacryloxypropyl trimethoxysilane, N- (3-acryloxy-2-hydroxypropyl) -3-amino Propyltriethoxysilane, N- (3-methacryloxy-2-hydroxypropyl) -13-aminopropyltriethoxysilane, methacryloxypropyltriethoxysilane, methacryloxymethyltriethoxysilane, methacryloxymethyltri Methoxysilane, (3-acryloxypropyl) methyldimethoxysilane, methacryloxypropylmethyldiethoxysilane, methacryloxypropylmethyldimethoxysilane, methacryloxypropyldimethylethoxysilane, methacryloxypropyldimethylmethoxysilane , Allyltrimethoxysilane, 3- (N-styrylmethyl-2-amino
  • the formation of the first layer with the silane coupling agent can be performed, for example, by immersing the silane coupling agent solution in the substrate and performing heat treatment.
  • the concentration of the silane coupling agent solution can be 0.1% by weight or more, preferably 1% by weight or more. By doing so, the first layer can be formed more reliably.
  • the concentration of the silane coupling agent solution can be, for example, 10% by weight or less, preferably 5% by weight. By doing so, the first layer can be formed more stably on the substrate.
  • a second layer containing a polymer of a monomer having a phosphorylcholine group and a polymer of a monomer having an active ester group into the upper part of the first layer, for example,
  • the substrate on which the first layer is formed is immersed in a solution of a monomer having a rucholine group and a monomer having an active ester group, and each monomer can be polymerized.
  • the polymerization is performed by radical polymerization, radical ion polymerization, photopolymerization, or the like.
  • a polymerization initiator may be added to a solution of a monomer having a phosphorylcholine group and a monomer having an active ester group.
  • Examples of the monomer having a phosphorylcholine group include 2-methacryloyloxyshethyl phosphorylcholine, 2-methacryloyloxyethoxyl phosphorylcholine, 6-methacryloyloxyhexyl phosphorylcholine, and 10-methacryloyloxyethoxynonyl phosphoryl.
  • 2-Methacryloyloxetyl phosphorylcholine is preferred, including ricolin, arinolephosphorinolecholine, butenylphosphorylcholine, hexenylphosphorylcholine, otaturphosphorylcholine, decylphosphorylcholine and the like.
  • the monomer having an active ester group is, for example, an active ester group described in the first embodiment as an active ester group, more specifically, a p-ditrophenyl group or an N-hydroxysuccinimide group And the like. Further, those having a methacryl group or an acryl group are preferable. In particular, p-toro-fluorocarboxyl metathalylate is preferred.
  • the substrate for a nanochip obtained as described above can be used for the detection and analysis of proteins, nucleic acids, and the like. It is excellent in detection accuracy and detection sensitivity that suppresses specific adsorption or binding and prevents film peeling due to surfactant.
  • various capture substances can be immobilized on the obtained biochip substrate, and a Noochip capable of detecting a physiologically active substance can be obtained.
  • the capture substance and the physiologically active substance can be, for example, the substances described in the above embodiments. Further, in the present embodiment, as the configurations of the biochip substrate and the biochip, the configurations described in the first embodiment or the other embodiments described above can be used.
  • the present embodiment relates to a biochip using the biochip substrate described in the above embodiment.
  • the present embodiment relates to a biochip that analyzes proteins, nucleic acids, and the like in a biological sample using a microchannel.
  • the biochip of the present embodiment has a substrate and a channel provided in the substrate.
  • the flow path may be provided in a groove shape on the surface of the substrate, for example.
  • This biochip has, on the surface of the flow channel, a polymer substance having a first unit containing a phosphorylcholine group and a second unit containing an active ester group.
  • the active ester group reacts with a capturing substance that captures a physiologically active substance to form a covalent bond.
  • the biochip may have a protective member that covers the flow channel.
  • a protective member that covers the flow channel.
  • the shape of the protective member is not particularly limited, but may be, for example, a plate, a sheet, or a film.
  • the biochip of the present embodiment will be described in more detail by taking a configuration having a plate-shaped substrate and a plate-shaped protection member as an example.
  • FIG. 1 is a plan view showing the configuration of the biochip according to the present embodiment.
  • the Noo chip shown in FIG. 1 includes a substrate 103 in which two plate-like members, a flow path substrate and a lid substrate, are joined, a groove 102 provided on a joint surface of the substrate 103, and two ends provided in both ends of the groove 102. , And a through-hole 101 communicating with the groove 102.
  • three grooves 102 are provided in parallel with each other on the surface of the flow path substrate constituting the substrate 103.
  • the groove 102 functions as a fine channel through which a liquid can flow. Also, the through hole 101 is It functions as a part for introducing a liquid such as a test liquid into 2. Further, since the through hole 101 is connected to the outside air, it also functions as an air guide hole for flowing the liquid in the groove 102.
  • the substrate 103 has a polymer material having a first unit containing a phosphorylcholine group and a second unit containing a carboxylic acid-derived group on a part or the whole of the surface of the groove 102, that is, the surface of the microchannel. .
  • a capturing substance for capturing a physiologically active substance is fixed to the polymer substance on the substrate 103.
  • the carboxylic acid-derived group reacts with the scavenger to form a covalent bond.
  • a capture substance having a physiological activity such as DNA or protein is immobilized on the substrate.
  • the polymer substance has a plurality of carboxylic acid-derived groups, and the plurality of carboxylic acid-derived groups are reacted with a trapping substance to form a covalent bond, or are inactivated.
  • the carboxylic acid-derived group is inactivated! / Means that a part of the carboxylic acid-derived group (leaving group) is replaced by another group and the activity is lost.
  • the polymer substance can be the substance described in the above embodiments.
  • the carboxylic acid-derived group contained in the second unit of the polymer substance can be, for example, the group described in the first embodiment.
  • a carboxylic acid derived group can be an active ester group.
  • the active ester group can be properly used depending on the capturing substance to be immobilized.
  • the active ester group is, for example, the group described in the first embodiment, and more specifically, the p-ditrophenyl group or N 2 — Can be a hydroxysuccinimide group.
  • the polymer substance may be formed in a layer on the surface of the groove 102. By doing so, non-specific adsorption to the surface of the groove 102 can be more reliably suppressed.
  • the thickness of the layer made of a polymer substance is not particularly limited, but may be, for example, 5 nm or more.
  • a film-like polymer substance may be provided on the surface of the groove 102. In this case, the surface of the groove 102 can be more stably covered with the polymer material film. Further, the polymer substance may be provided on the entire surface of the groove 102. By doing so, non-specific adsorption to the surface of the groove 102 can be more reliably suppressed.
  • the material of the substrate 103 can be, for example, the material of the substrate used in the above embodiments. Specifically, the ability to use glass, plastic, metal, etc. From the viewpoint of easiness of surface treatment and mass productivity, thermoplastic resin, which is preferred by plastic, is more preferred.
  • At least one of the flow path substrate and the lid substrate constituting the substrate 103 can be made of resin transparent to detection light.
  • the material of the transparent resin is appropriately selected according to the wavelength of the detection light used for the detection reaction of the physiologically active substance, and examples thereof include saturated cyclic polyolefin, PMMA, polystyrene, and polycarbonate.
  • the biochip shown in Fig. 1 can be configured to be used for detecting or quantifying a physiologically active substance in a test solution captured by a capture substance by flowing a test solution in a flow channel. It is also possible to specify the components contained in the test solution.
  • the diameter of the through hole 101 is appropriately designed according to the thickness of the lid substrate, the width of the flow path, and the like.
  • the groove 102 serving as a flow channel can have the following configuration. A certain flow rate is required to perform the detection reaction of the physiologically active substance efficiently in the flow path of the biochip in which the capture substance is immobilized on the substrate for the nanochip. Also, what contributes to the reaction is the channel surface portion where the trapping substance is immobilized. From these facts, it is preferable that the cross-sectional area of the flow channel is small in order to efficiently react with a small amount of the sample solution.
  • the width and depth of the cross section perpendicular to the direction in which the flow path extends can be, for example, 20 m or more, and preferably 50 / z m or more. By doing so, the flow of the sample liquid to the flow channel can be sufficiently ensured. Further, it is possible to adopt a configuration in which the flow of the sample liquid is easily controlled. Further, the width and depth of the channel can be, for example, 500 ⁇ m or less, preferably 200 ⁇ m or less. This makes it possible to sufficiently secure recognition even when capturing a physiologically active substance such as a hybridization with a fluorescence scanner.
  • the length of the channel can be appropriately designed according to the type of the substance to be detected and the amount of the test solution.
  • a channel substrate having a fine channel engraved thereon and a lid substrate serving as a lid are prepared.
  • the flow path substrate and the lid substrate correspond to the above-described substrate and protective member, respectively.
  • the flow path substrate is provided with the above-described groove 102 and a through-hole 101 which communicates with the groove 102 and penetrates the flow path substrate.
  • the joining surface of both substrates that is, the surface on the side where the flow path is formed, is coated with a polymer substance having a phosphorylcholine group and an active ester group.
  • the coating of the polymer substance can be performed by, for example, a method of attaching the polymer substance to the substrate at the time of manufacturing the microchip substrate in the above embodiment.
  • a liquid in which a trapping substance is dissolved or dispersed is dropped at a predetermined position in the flow path of the flow path substrate or in or near the flow path forming portion of the lid substrate, and the liquid is left for a certain period of time.
  • a method of dropping a liquid containing a capturing substance onto a polymer substance include spotting with a bottle spotter and spots of an ink jet system.
  • the pH of the liquid containing the capturing substance can be, for example, 2 or more and 11 or less. If the pH of the liquid containing the trapping substance is too high or too low, it will be on the strong acid side or strong alkali side, and the denaturation of the bioactive substance may occur. For example, in the case of an S protein having a trapping substance, the pH of the liquid containing the trapping substance can be around neutral.
  • the active ester groups are inactivated.
  • the inactivation treatment can be performed, for example, under the conditions described in the first embodiment.
  • the inactivation siding can be performed using an alkalization conjugate or a compound having a primary amino group.
  • the flow channel substrate and the lid substrate are bonded to form a flow channel through which a liquid can flow.
  • the two substrates can be bonded together by applying an adhesive or by heat welding.
  • a thermoplastic resin can be used as a material for the substrate. By using a thermoplastic resin, heat welding at a relatively low temperature is possible.
  • the capturing substance is immobilized on the polymer substance having a phosphorylcholine group and an active ester group, the heat resistance of the physiologically active substance can be improved after immobilization. Therefore, if a thermoplastic resin is used, the activity of the immobilized trapped substance can be maintained even when heat welding is performed.
  • the capturing substance and the physiologically active substance include the substances described in the above embodiments. Also, in this embodiment, an amino group may be introduced into the capturing substance according to the structure of the capturing substance.
  • the configurations described in the first embodiment or the other embodiments described above can be used as the configurations of the biochip substrate and the biochip.
  • a liquid sending means such as a micropump or a microsyringe.
  • the protein to be detected is captured by the antibody.
  • a certain amount of the washing solution is sent to perform washing.
  • a predetermined amount of a secondary antibody in which an antibody against the protein to be analyzed is labeled with a fluorescent substance or the like is supplied and washed. If a protein to be analyzed is present in the sample solution, it can be recognized as a fluorescent spot by a fluorescent scanner.
  • non-specific adsorption of a component in a test solution without coating with an adsorption inhibitor in this case, a component containing a physiologically active substance to be detected, on a flow path is to be suppressed.
  • the efficiency of specific interaction between the capture substance and the physiologically active substance can be further improved.
  • Saturated cyclic polyolefin resin (hydrogenated carbohydrate (MFR: Melt flow index) of 5-methyl-2 norbornene ring-opened polymer: 21 g / 10 min, hydrogenation rate: virtually 100%, heat distortion temperature 123 ° C )) was processed into a slide glass shape (dimensions: 76 mm X 26 mm X lmm) to produce a substrate.
  • MFR hydrogenated carbohydrate
  • a sandwich method was performed on the substrate. Specifically, first, anti-mouse IgG2a as a primary antibody prepared at the dilution ratio shown in Table 1 was spotted on the substrate using an automatic spotter, and then allowed to stand at room temperature at 4 ° C. for 24 hours. Thereafter, the active ester was deactivated by immersion in a 0.1N aqueous sodium hydroxide solution.
  • the substrate After subjecting the surface of the substrate to a hydrophilization treatment in the same manner as in Experimental Example A1, the substrate was immersed in a 2% by weight aqueous solution of an amino group-containing alkylsilane, and then subjected to a heat treatment to introduce amino groups into the surface. This was immersed in a 1% by weight aqueous solution of dartartaldehyde to react the amino group on the surface with glutaraldehyde to introduce an aldehyde group.
  • a sandwich method was performed on the substrate.
  • anti-mouse IgG2a as a primary antibody prepared at the dilution ratio shown in Table 1 was spotted on the substrate by an automatic spotter, and then allowed to stand at room temperature at 4 ° C. for 24 hours. Thereafter, the substrate was immersed in 9.6 g / l of a PBS (phosphate buffered saline) buffer solution in which 5% by weight of skim milk was suspended to prevent nonspecific adsorption, and allowed to stand at room temperature for 2 hours.
  • PBS phosphate buffered saline
  • a microarray scanner “ScanArray” manufactured by Technologies was used. The measurement conditions were as follows: laser output 90%, PMT sensitivity 60%, excitation wavelength 649 nm, measurement wavelength 670 nm, and resolution 50 ⁇ m.
  • Saturated cyclic polyolefin resin (5-hydrogen-2-norbornene ring-opened polymer hydrogenated carohydrate (MFR: 21 g / 10 min, hydrogenation rate: virtually 100%, thermal deformation temperature 123 ° C))
  • the substrate was fabricated by processing into a shape (dimensions: 76 mm X 26 mm X lmm).
  • the substrate is immersed in a 0.5% by weight ethanol solution of 2-methacryloyloxyshethylphosphorylcholine-butyl methacrylate-p-nitrophenylcarbo-loxyshethyl methacrylate copolymer to form a phosphorylcholine group on the substrate surface.
  • a microarray scanner “ScanArray” manufactured by Technologies was used. The measurement conditions were as follows: laser output 90%, PMT sensitivity 60%, excitation wavelength 649 nm, measurement wavelength 670 nm, and resolution 50 ⁇ m.
  • Table 2 Dilution ratio 10 20 30 40 Spot signal intensity 63,021 59,142 30,053 15,244 Experimental example B1 Background value 802 853 750 700
  • Saturated cyclic polyolefin resin (5-hydrogen-2-norbornene ring-opened polymer hydrogenated carohydrate (MFR: 21 g / 10 min, hydrogenation rate: virtually 100%, thermal deformation temperature 123 ° C))
  • the substrate was fabricated by processing into a shape (dimensions: 76 mm X 26 mm X lmm).
  • the substrate is immersed in a 0.5% by weight ethanol solution of 2-methacryloyloxyshethylphosphorylcholine-butyl methacrylate-p-nitrophenylcarbo-loxyshethyl methacrylate copolymer to form a phosphorylcholine group on the substrate surface.
  • a polymer having an active ester group was introduced.
  • a microarray scanner “ScanArray” manufactured by Technologies was used. The measurement conditions were as follows: laser output 90%, PMT sensitivity 60%, excitation wavelength 649 nm, measurement wavelength 670 nm, and resolution 50 ⁇ m.
  • Saturated cyclic polyolefin resin (5-hydrogen-2-norbornene ring-opened polymer hydrogenated carohydrate (MFR: 21 g / 10 min, hydrogenation rate: virtually 100%, thermal deformation temperature 123 ° C))
  • the substrate was fabricated by processing into a shape (dimensions: 76 mm X 26 mm X lmm).
  • the first layer was formed by immersing the substrate in a 1% by weight aqueous solution of KBM903 (manufactured by Shin-Etsu-Danigaku Co., Ltd., aminosilane).
  • this substrate was immersed in a 0.5% by weight ethanol solution of 2-metharyloyloxetyl phosphorylcholine butyl methacrylate-p-trophenyl-carbo-loxyshetyl methacrylate copolymer.
  • a second layer having a polymer substance having a phosphorylcholine group and an active ester group was formed on the substrate surface.
  • Saturated cyclic polyolefin resin (5-hydrogen-2-norbornene ring-opened polymer hydrogenated carohydrate (MFR: 21 g / 10 min, hydrogenation rate: virtually 100%, thermal deformation temperature 123 ° C))
  • the substrate was fabricated by processing into a shape (dimensions: 76 mm X 26 mm X lmm).
  • the substrate is immersed in a 0.5% by weight ethanol solution of 2-methacryloyloxetyl phosphorylcholine-butyl methacrylate-p-ditrophenyl carboxy-l-oxetyl methacrylate copolymer.
  • a layer having a polymer material having a phosphorylcholine group and an active ester group was formed on the substrate surface.
  • a sandwich method was performed on each of the obtained substrates.
  • an anti-mouse IgG2a as a primary antibody prepared at the dilution ratio shown in Table 4 was spotted on the substrate by an automatic spotter, and then allowed to stand at room temperature at 4 ° C for 24 hours. Thereafter, the active ester was deactivated by immersing in a 0.1 N aqueous sodium hydroxide solution. Then, it was immersed in a 1.0% by weight aqueous sodium dodecyl sulfate solution for 1 hour.
  • a microarray scanner “ScanArray” manufactured by Technologies was used. The measurement conditions were as follows: laser output 90%, PMT sensitivity 50%, excitation wavelength 649 nm, measurement wavelength 670 nm, and resolution 50 ⁇ m.
  • Example D1 As shown in Table 4, in Example D1, the force at which a high spot signal value and a low background value were observed In Example D2, the layer was peeled off, and a low spot signal value was exhibited. The background value also increased due to non-specific adsorption on the substrate due to layer peeling.
  • Saturated cyclic polyolefin resin (5-hydrogen-2-norbornene ring-opened polymer hydrogenated carohydrate (MFR: 21 g / 10 min, hydrogenation rate: virtually 100%, thermal deformation temperature 123 ° C))
  • the shape (dimensions: 76mm X 26mm X lmm) was worked.
  • the substrate By immersing the substrate in a 0.5% by weight ethanol solution of 2-methacryloyloxyshethyl phosphorylcholine-butyl methacrylate-p-nitrophenylcarbonyloxyethyl methacrylate copolymer, the substrate surface becomes active with phosphorylcholine groups.
  • a polymer substance having an ester group was introduced.
  • a sandwich method was performed on the substrate.
  • the primary antibody and anti-mouse IgG2a prepared at the dilution ratios shown in Table 5 were spotted on the substrate by an automatic spotter, and then allowed to stand at room temperature of 4 ° C for 24 hours. Thereafter, the active ester group was converted into a hydrophilic polymer by immersing it in a 40% by weight aqueous solution of -506 (manufactured by San Techno Chemical Co., Ltd., terminally aminated ethylene glycol propylene glycol copolymer) as a hydrophilic polymer.
  • -506 manufactured by San Techno Chemical Co., Ltd., terminally aminated ethylene glycol propylene glycol copolymer
  • Experimental example E1 had a lower knock ground value than experimental example E2 at any dilution ratio. The result was a large S / N ratio.
  • Experimental Example F1 Example F3 produced the biochip substrate and the Noochip described in the sixth embodiment, and performed antibody detection.
  • Saturated cyclic polyolefin resin (5-hydrogen-2-norbornene ring-opened polymer hydrogenated carohydrate (MFR: 21 g / 10 min, hydrogenation rate: virtually 100%, thermal deformation temperature 123 ° C))
  • the substrate was fabricated by processing into a shape (dimensions: 76 mm X 26 mm X lmm).
  • the substrate was immersed in a 2% by weight aqueous solution of an amino group-containing alkylsilane, and then subjected to a heat treatment to introduce amino groups into the surface.
  • This was immersed in a 1% by weight aqueous solution of dartartaldehyde, whereby the amino groups on the surface and dartaldehyde were reacted to introduce aldehyde groups.
  • the experimental example F1 resulted in a higher spot signal value, a lower knock ground value and a higher S / N ratio than the experimental examples F2 and F3 at any dilution ratio.
  • Experimental Example G1 Example G9 produced the biochip substrate and the Noochip described in the seventh embodiment, and performed antibody detection.
  • the polymer substance having a phosphorylcholine group and an active ester group consisting of the proportions in Table 7 was used as a saturated cyclic polyolefin resin (hydrogenated product of a ring-opened polymer of 5-methyl-2-norbornene (MFR: 21 g / 10 min, hydrogenation rate: Substantially 100%, and the heat deformation temperature was 123 ° C)).
  • the solution was adjusted to 0.5% by weight on an ethanol substrate.
  • a sandwich method was performed on the substrate. Specifically, first, the primary antibody and anti-mouse IgG2a prepared at the dilution ratio shown in Table 9 were spotted on the substrate using an automatic spotter, and then allowed to stand at room temperature at 4 ° C. for 24 hours. Thereafter, the active ester groups were treated by immersion in an aqueous solution of 0.1N sodium hydroxide.
  • Saturated cyclic polyolefin resin (5-hydrogen-2-norbornene ring-opened polymer hydrogenated carohydrate (MFR: 21 g / 10 min, hydrogenation rate: virtually 100%, thermal deformation temperature 123 ° C))
  • the substrate was fabricated by processing into a shape (dimensions: 76 mm X 26 mm X lmm).
  • the substrate is immersed in a 0.5% by weight ethanol solution of 2-methacryloyloxyshethylphosphorylcholine-butyl methacrylate-p-nitrophenylcarbo-loxyshethyl methacrylate copolymer to form a phosphorylcholine group on the substrate surface.
  • a polymer having an active ester group was introduced.
  • Experimental Example A substrate similar to that used in H1 was immersed in a 2% by volume ethanol solution of 3-aminopropyl-trimethoxysilane, washed with pure water, and heat-treated to induce amino groups. Entered.
  • the substrate into which the amino group was introduced was immersed in a 1% by volume aqueous solution of dartalaldehyde, and then washed with pure water to introduce the aldehyde group.
  • DNA solution 1 The following solutions were prepared as DNA solution 1 and DNA solution 2.
  • DNA solution 1 24 bp oligo DNA (TAGAAGCAT TTGCGGTGGACGATG (SEQ ID NO: 1) (manufactured by Sigma Dienosis) having an amino group at the 5 'end is dissolved in a predetermined buffer to a concentration of 0.1 gZ1. did.
  • DNA solution 2 5; 24, 24 bp oligo DNA (CATCGTCC ACCGCAAATGCTTCTA (SEQ ID NO: 2) (manufactured by Sigma Dienosis Co.) with a Cy3 label at the end 3X SSC to a concentration of 0.002 ⁇ & / ⁇ 1 (standard saline citrate), was dissolved in a solution of 0.2 weight 0/0 SDS (sodium dodecyl sulfate).
  • DNA solution 1 was dispensed into a 96-well plate and spotted on a substrate using a micro-pin type microarray spotter. After the completion of the spot, the sample was allowed to stand in an oven at 80 ° C.
  • a blocking treatment was performed by immersing the active ester group in an inactive 0.1N sodium hydroxide solution for 5 minutes to inactivate the active ester group.
  • the DNA solution 2 is spread on this substrate, covered with a cover glass, and left in a humid container at 65 ° C for 3 hours to hybridize the immobilized oligo DNA with the Cy3-labeled oligo DNA.
  • the substrate was washed in 2 ⁇ SSC, 0.5% by weight SDS, and then washed with pure water to prepare a substrate after DNA hybridization.
  • Experimental Example HI and Experimental Example H2 were measured for the amount of autofluorescence using a fluorescent scanner for microarray “ScanArray” (manufactured by Packard BioChip Technologies). The measurement conditions were: laser output 90%, PMT sensitivity 70%, excitation wavelength 550nm, measurement wavelength 570nm. Table 10 shows the results of numerically deducing the fluorescence amount of the substrate from the scan image obtained using the ScanArray using the analysis software “QuantArray” attached to the scanner.
  • spot fluorescence was detected using a microarray scanner "ScanArray LiteJ (manufactured by Packard Biochip Technology)".
  • the laser output was 90%
  • the PMT sensitivity was 45%
  • the excitation wavelength was 550 nm
  • the measurement wavelength was 570 nm.
  • Table 10 shows the results of quantifying the fluorescence amount of the spot using the analysis software “QuantArray” attached to the scanner. Show.
  • Saturated cyclic polyolefin resin (hydrogenated carbohydrate of 5-methyl-2-norbornene ring-opened polymer (MFR: 21 g / 10 min, hydrogenation rate: substantially 100%, heat distortion temperature 123 ° C))
  • the substrate was processed into a glass shape (dimensions: 76 mm X 26 mm X lmm).
  • the first layer was formed by immersing the substrate in a 1% by weight (3 acryloxypropyl) trimethoxysilane ethanol / water mixed solution.
  • the substrate was treated with 2-methacryloxyshethyl phosphorylcholine (0.1 mol / L), p-ditrophenylcarbo-loxoshetyl methacrylate (0.1 mol / L), and azobisisobutyrate as a radical initiator.
  • 2-methacryloxyshethyl phosphorylcholine 0.1 mol / L
  • p-ditrophenylcarbo-loxoshetyl methacrylate 0.1 mol / L
  • azobisisobutyrate as a radical initiator.
  • -A second layer having a phosphorylcholine group and an active ester group was formed on the substrate surface by immersing the substrate in an ethanol solution of tolyl (0. Olmol ZL) and heating at 65 ° C for 4 hours.
  • a substrate was fabricated by processing the saturated cyclic polyolefin resin into a slide glass shape (dimensions: 76 mm X 26 mm X lmm).
  • the substrate was formed a first layer by immersion in ethanol Z water mixed solution of 1 wt 0/0 Bulle triethoxysilane.
  • the substrate was further treated with 2-methacryloxyshethylphosphorylcholine (0.1 ImolZL), p-ditrophenol-carpo-loxoshetinol methatalylate (0.1 ImolZL), and the photoinitiator 1 [4 (2-hydroxyl Ethoxy) -phenyl] -2-Hydroxy-2-methyl-1 Propane Ion (0. Olmol / L) in ethanol solution and irradiated with 250nm-400nm ultraviolet light for 2 hours, phosphorylcholine group on the substrate surface And a second layer having an active ester group.
  • 2-methacryloxyshethylphosphorylcholine
  • a second layer having phosphorylcholine groups and active ester groups on the substrate surface was formed in the same manner as in Experimental Example 13 except that allyltriethoxysilane was used to form the first layer.
  • a substrate was fabricated by processing the saturated cyclic polyolefin resin into a slide glass shape (dimensions: 76 mm X 26 mm X lmm).
  • Substrate is co-polymerized with 2-methacryloyloxetyl phosphorylcholine butyl methacrylate-p-ditrophenylcarbonyloxetyl methacrylate
  • a layer having a polymer substance having a phosphorylcholine group and an active ester group was formed on the substrate surface.
  • a sandwich method was performed on the substrate. Specifically, first, an anti-mouse IgG2a as a primary antibody prepared at the dilution ratio shown in Table 11 was spotted on the substrate by an automatic spotter, and the plate was allowed to stand at room temperature at 4 ° C. for 24 hours. Thereafter, the active ester groups were deactivated by immersion in a 0.1N aqueous sodium hydroxide solution. Then, it was immersed in a 1.0% by weight aqueous sodium dodecyl sulfate solution for 1 hour.
  • EXPERIMENTAL EXAMPLE II A microarray scanner “ScanArray” manufactured by Packard BioChip Technologies was used to measure the amount of fluorescence in Experimental Example 15 of Experiment. The measurement conditions were laser output 90%, PMT sensitivity 60%, excitation wavelength 649nm, measurement wavelength 670nm, and resolution 50m.
  • the biochip substrate and the biochip described in the tenth embodiment were prepared, and DNA hybridization and antibody detection were performed.
  • DNA solutions 1 and 2 were prepared as DNA solutions 1 and 2, an antibody solution, an antigen solution, and a blocking solution 13.
  • DNA solution 1 A 24 bp oligo DNA having an amino group at the 5 'end (TAGAAGCAT TTGCGGTGGACGATG (SEQ ID NO: 1) (Sigma dienosis)) was buffered to a concentration of 0.1 gZ1 with a predetermined concentration. It was prepared by dissolving in a liquid.
  • DNA solution 2 oligo DNA having a chain length of 24 bp having a Cy3 label at the 5 'end (CATCGTCC ACCGCAAATGCTTCTA (SEQ ID NO: 2) (manufactured by Sigma Dienosis Co., Ltd.) was added to 3 X SSC to a concentration of 0.002 ⁇ g / 1, It was dissolved in a solution of 0.2 weight 0 / OSDS.
  • Antibody solution An anti-mouse IgG2a antibody (derived from egret) was prepared by dissolving in PBS at a concentration of 0.1 mgZml.
  • Antigen solution Dissolve mouse IgG2a antibody at a concentration of 1 ⁇ g Zml in FBS, and add 100 ml of FBS containing the above-mentioned mouse IgG2a antibody in 1 ml of buffer, 100 ml of a solution obtained by dissolving NH3 conjugated Cy3 in ultrapure water at a concentration of 1 mg Zml, 1 ml of potassium chloride, and 2 hours at 25 ° C Unreacted NHS-modified Cy3 was removed by a gel filtration column, and a solution containing Cy3-labeled mouse IgG2a and FBS-derived protein in PBS was prepared.
  • Blocking solution 1 A 0.1N sodium hydroxide solution was prepared.
  • Blocking solution 2 prepared by dissolving sodium borohydride in PBS at a concentration of 0.5% by weight.
  • Blocking solution 3 BSA was prepared by dissolving it in PBS at a concentration of 1% by weight.
  • a polystyrene resin substrate having a groove having a width of 150 m and a depth of 100 m and a through hole having a diameter of lmm provided at the end of the groove was formed by injection molding. Further, a flat substrate of polystyrene resin having the same size as this substrate was formed.
  • Both the grooved surface of the grooved substrate and one surface of the flat substrate were treated with 2-methacryloyloxyethylphosphifolylcholine-butyl methacrylate-p-ditrophenylcarbonylcarbonyloxymethacrylate.
  • a polymer substance having a phosphorylcholine group and an active ester group was introduced by applying and drying a 0.5% by weight ethanol solution of the polymer.
  • DNA solution 1 was spotted on the bottom of the groove, and after spotting, allowed to stand overnight while maintaining the humidity. Thereafter, the resin-coated surface of the flat substrate was aligned with the grooved surface of the substrate having the grooves, and the substrates were bonded together by ultrasonic welding to produce a substrate through which fluid could flow. Inject the pore-blocking solution 1 provided at the end of the groove, fill the inside of the flow channel, and leave it for 10 minutes to inactivate the active ester groups in the flow channel, and use DNA hybridization. It was subjected to evaluation.
  • a substrate having a width of 150 m and a depth of 100 m and a through-hole having a diameter of lmm at the end of the groove was formed on a polystyrene resin substrate by injection molding. Further, a flat substrate having the same size as this substrate was formed.
  • the grooved surface of the grooved substrate and one surface of the flat substrate were treated with 2-methacryloyloxyl tylfosifolylcholine-butyl methacrylate-p-ditrophenylcarbonylcarbonyloxylate.
  • a polymer substance having a phosphorylcholine group and an active ester group was introduced by applying and drying a 0.5% by weight ethanol solution of a lumetarylate copolymer.
  • the antibody solution was spotted on the bottom of the groove using a microarray spot pin having a diameter of 100 m, and the spotted spot was allowed to stand overnight while maintaining the humidity. Thereafter, the resin-coated surface of the flat substrate was aligned with the groove side, and the substrates were bonded to each other by ultrasonic welding to produce a substrate through which fluid could flow. Inject the pore capping solution 1 provided at the end of the groove, fill the inside of the flow channel, leave it for 10 minutes, inactivate the active ester group in the flow channel, and evaluate by antigen-antibody reaction. Was served.
  • a substrate having a width of 150 ⁇ m, a depth of 100 ⁇ m, a through-hole having a diameter of lmm at the end of the groove, and a flat substrate of the same size as this substrate were formed by injection molding on a polystyrene resin substrate. After hydrophilizing the surfaces of both substrates, they were immersed in a 2% by weight solution of aminoalkylsilane, and then heat-treated to introduce amino groups to the surfaces of both substrates. This was immersed in a 1% by weight aqueous solution of dartalaldehyde, whereby the amino group on the substrate surface was reacted with the darthalaldehyde to introduce an aldehyde group.
  • DNA solution 1 was spotted on the bottom of the groove using a microarray spot pin with a diameter of 100 ⁇ m, and left overnight while keeping the humidity after spotting. Thereafter, the resin-coated surface of the flat substrate was aligned with the groove side, and the substrates were bonded together by ultrasonic welding to produce a substrate through which fluid could flow. Inject the pore-blocking solution 2 provided at the end of the groove, fill the inside of the flow channel, leave it for 10 minutes to inactivate the aldehyde group in the flow channel, and evaluate it by DNA hybridization. Provided.
  • a substrate having a width of 150 ⁇ m, a depth of 100 ⁇ m, a through-hole having a diameter of lmm at the end of the groove, and a flat substrate of the same size as this substrate were formed by injection molding on a polystyrene resin substrate. After hydrophilizing the surfaces of both substrates, they were immersed in a 2% by weight solution of aminoalkylsilane, and then heat-treated to introduce amino groups to the surfaces of both substrates. This was immersed in a 1% by weight aqueous solution of dartalaldehyde, whereby the amino group on the substrate surface was reacted with the darthalaldehyde to introduce an aldehyde group.
  • the antibody solution was placed on the bottom of the groove using a microarray spot pin with a diameter of 100 m. They were spotted and left overnight while keeping humidity after spotting. Thereafter, the resin-coated surface of the flat substrate was aligned with the groove side, and the substrates were bonded to each other by ultrasonic welding to produce a substrate through which fluid could flow. After sending the blocking solution 2 at the end of the groove at a speed of 21Z for 10 minutes, send the blocking solution 3 at a speed of 21Z for 10 minutes, and finally send PBS. The solution was subjected to evaluation by antigen-antibody reaction.
  • a substrate having a width of 150 ⁇ m and a depth of 100 ⁇ m and a through-hole having a diameter of lmm at the end of the groove and a flat substrate having the same size as the substrate were formed by injection molding on a polystyrene resin substrate. After hydrophilizing the surfaces of both substrates, they were immersed in a 2% by weight solution of aminoalkylsilane, and then heat-treated to introduce amino groups to the surfaces of both substrates. This was immersed in a 1% by weight aqueous solution of dartalaldehyde, whereby the amino group on the substrate surface was reacted with the darthalaldehyde to introduce an aldehyde group.
  • the antibody solution was spotted on the bottom of the groove, and allowed to stand overnight while keeping the humidity after spotting. Then, the resin-coated surface of the flat substrate was aligned with the groove side, and the substrates were bonded to each other by ultrasonic welding to produce a substrate through which fluid could flow.
  • the pore blocking solution 2 provided at the end of the groove was fed for 10 minutes at a speed of 21Z, and finally PBS was fed for evaluation by antigen-antibody reaction.
  • a substrate having a width of 150 ⁇ m, a depth of 100 ⁇ m, a through-hole having a diameter of lmm at the end of the groove, and a flat substrate of the same size as this substrate were formed by injection molding on a polystyrene resin substrate.
  • the surfaces of both substrates were subjected to a hydrophilic treatment.
  • the antibody solution was spotted on the bottom surface of the groove using a microarray spot pin having a diameter of 100 m, and the spotted spot was left overnight while keeping the humidity. Thereafter, the resin-coated surface of the flat substrate was aligned with the groove side, and the substrates were bonded to each other by ultrasonic welding to produce a substrate through which fluid could flow.
  • the pore blocking solution 3 provided at the end of the groove was fed for 10 minutes at a speed of 21Z, and finally PBS was fed for evaluation by antigen-antibody reaction.
  • the experimental example in which the material of the substrate was plastic was shown. Even when the material of the substrate was glass, the polymer having a phosphorylcholine group and an active ester group on the substrate surface was also used. By using a substance, the detection sensitivity could be improved.
  • a biochip substrate for immobilizing a physiologically active substance on the surface of a solid-phase substrate A biochip substrate comprising a polymer material having a phosphorylcholine group and an active ester group on the substrate surface.
  • a method for using a biochip substrate having a polymer substance comprising: (1) a step of immobilizing a capture molecule that is a molecule that captures a physiologically active substance at ⁇ 7.6 or more; and (2) detecting A method for using a substrate for a biochip, comprising a step of bringing a solution containing a physiologically active substance having a pH of 7.6 or less into contact with the surface of a substrate and causing the capture molecule to capture the physiologically active substance.
  • the physiologically active substance to be detected is at least one of a nucleic acid, a protein, an oligopeptide, a sugar chain, and a glycoprotein. How to use the substrate.
  • a biochip substrate for immobilizing a physiologically active substance on the surface of a solid-phase substrate comprising a layer A containing a compound having an amino group on the surface of the substrate and a layer A having a phosphorylcholine group and an active ester group.
  • a substrate for a biochip wherein a layer B containing a molecular substance is laminated in the order of a substrate, a layer A, and a layer B.
  • Layer A contains aminosilane.
  • the bioactive substance is immobilized by reacting with the active ester group on the biochip substrate having a polymer substance having a phosphorylcholine group and an active ester group on the substrate surface, and the bioactive substance is immobilized.
  • a biochip characterized in that a polymer having a hydrophilic group is introduced into an active ester group on the surface of a substrate other than the above.
  • (5-5) Active ester group strength A biochip according to (5-1), wherein (5-1) is a (5-4) V, which is a -trophenyl ester group.
  • the solid substrate is made of plastic. (5-1) One (5-6) V H.
  • a biochip comprising: a step of immobilizing a physiologically active substance; and a step of introducing a polymer having a hydrophilic group into an active ester group on the surface of the substrate other than the surface on which the physiologically active substance is immobilized. Manufacturing method.
  • a biochip substrate for immobilizing a physiologically active substance on the surface of a solid substrate comprising a high molecular weight substance having a phosphorylcholine group and an N-hydroxysuccinimide ester on the substrate surface.
  • Substrate for biochip comprising a high molecular weight substance having a phosphorylcholine group and an N-hydroxysuccinimide ester on the substrate surface.
  • the physiologically active substance is at least one of a nucleic acid, an abtamer, a protein, an oligopeptide, a sugar chain, and a glycoprotein, according to any one of (6-7)-(6-10). Biochip manufacturing method.
  • (6-12) A biochip manufactured by the biochip manufacturing method according to any one of (6-7) and (6-11).
  • (7-1) A biomaterial characterized by having a polymer having a phosphorylcholine group and an active ester group, or a mixed polymer of the polymer and a polymer having a phosphorylcholine group and a butyl methacrylate group on the surface of the substrate. Chips.
  • polymeric material or proportion of phosphorylcholine groups contained in the mixed polymer is less than 2 0 mole 0/0 over 40 mole 0/0 (7-1), wherein the biochip.
  • Active ester group strength A biochip according to (7-1) -1 (7-4) V, which is a ⁇ ⁇ -trophyl ester group or an N-hydroxysuccinimide ester.
  • a solid-state substrate is made of glass.
  • the method for producing a biochip according to any one of (7-1) to (7-9), wherein the polymer substance having a phosphorylcholine group and an active ester group on a substrate surface is provided. Minute Immobilizing a physiologically active substance on a biochip substrate having a mixed polymer of a bioactive substance and a polymer also having a phosphorylcholine group and a butyl methacrylate group, and a method other than immobilizing the physiologically active substance. Introducing a polymer having a hydrophilic group into an active ester group on the surface of a substrate.
  • the phosphorylcholine group is a 2-methacryloyloxetyl phosphorylcholine group (8-2)
  • (8-8) (8-1) At least one of the nucleic acids, aptamers, proteins, oligopeptides, sugar chains, and glycoproteins on the microarray substrate according to any one of (8-7).
  • a biochip substrate for immobilizing a physiologically active substance on the surface of a solid-phase substrate wherein a layer A is formed on the surface of the solid-phase substrate, and a layer is further formed on the layer A.
  • B is formed, the layer A is formed from a compound A having at least one group selected from a phthalate group, a metathalylate group, a butyl group, and an olefin group, and the layer B is formed of a monomer having a phosphorylcholine group.
  • (9-11) The method for producing a biochip substrate according to any one of (9 10), wherein the surface of the solid substrate is selected from an atalylate group, a metathalylate group, a bur group, and an olefin group.
  • a layer B is formed by copolymerizing a monomer having a phosphorylcholine group and a monomer having an active ester group on the layer A.
  • a method for producing a biochip substrate comprising: (9-12) (9-1) -1 (9-10) A biochip obtained by immobilizing a physiologically active substance on the biochip substrate described in any one of the above.
  • a biochip comprising: a high molecular substance, wherein the carboxylic acid-derived group reacts with a capturing substance that captures a physiologically active substance to form a covalent bond.
  • A is a monovalent leaving group excluding a hydroxyl group.
  • the compound represented by the formula (1) A biochip characterized in that the monovalent group is a group selected from the following formula (P) or formula (q). [0402] [Formula 10]
  • R 1 and R 2 are each independently a monovalent organic group, and may be linear, branched, or cyclic.
  • R 1 may be a divalent group forming a ring together with C.
  • R 2 may be together with N It may be a divalent group forming a ring.
  • the capture substance is a nucleic acid, an abtamer, a protein, an enzyme, an antibody, an oligopeptide, a sugar chain, or A biochip characterized in that it is one or two or more substances that can be selected for both glycoprotein power and group power.
  • the physiologically active substance is a nucleic acid, an abtamer, a protein, an enzyme, an antibody, an oligopeptide, a sugar chain, and A biochip characterized in that it is one or two or more substances whose glycoprotein power and group power are selected.
  • the biochip of the present invention has low non-specific adsorption of a physiologically active substance such as a protein, thereby suppressing loss of a physiologically active substance as a target in a sample, and efficiently performing a specific reaction such as an antigen antibody reaction. Due to the interaction, highly sensitive detection of a bioactive substance is possible in a short time. In addition, since the configuration is such that the auto-fluorescence of the substrate is reduced and the adsorption of the fluorescent dye is reduced, the SZN ratio can be increased and the signal of the sample can be accurately detected.

Abstract

　吸着防止剤をコーティングすることなく、検出対象物質の非特異的な吸着または結合が抑制され、検出感度に優れたバイオチップを提供する。バイオチップ用基板の基板表面にホスホリルコリン基および活性エステル基を含む高分子物質を有する構成とする。

Description

明 細 書
バイオチップ
技術分野
[0001] 本発明は、試料中の生理活性物質の検出または分析に用いられるバイオチップに 関する。
背景技術
[0002] 遺伝子活性の評価や疾患プロセス、薬物効果の生物学的プロセスを含む生物学 的プロセスを解読するための試みは、伝統的に、ゲノミタスに焦点が当てられてきた 力 プロテオミクスは、細胞の生物学的機能についてより詳細な情報を提供する。プ 口テオミクスは、遺伝子レベルというよりもむしろ、タンパク質レベルでの発現を検出し そして定量することによる、遺伝子活性の定性的かつ定量的な測定を含む。また、タ ンパク質の翻訳後修飾、タンパク質間の相互作用など遺伝子にコードされない事象 の研究を含む。
[0003] 膨大なゲノム情報の入手が可能となった今日、プロテオミクス研究はますます迅速 高効率（ノヽイスループット）化が求められている。この目的の分子アレイとして DNAチ ップが実用化されてきた。一方、生体機能において最も複雑で多様性の高いタンパ ク質の検出に関しては、プロテインチップが提唱され、最近研究が進められている。 プロテインチップとは、タンパク質、またはそれを捕捉する分子をチップ (微小な基板) 表面に固定ィ匕したものを総称する。
[0004] し力し、現状のプロテインチップは一般に DNAチップの延長線上に位置付けられ て開発がなされている為、ガラス基板上にタンパク質、またはそれを捕捉する分子を チップ表面に固定ィ匕する検討がなされている（例えば、特許文献 1参照)。
[0005] プロテインチップのシグナル検出において、プロテインチップ基板への検出対象物 質の非特異的な吸着は信号対雑音比を低下させる原因となり、検出精度を低下させ る (たとえば、非特許文献 1参照)。
[0006] このため、通常のサンドイッチ法では、一次抗体を固定ィ匕した後に二次抗体の非特 異的吸着を防止するため、吸着防止剤のコーティングが行われている力 これらの非 特異的吸着防止能は十分でない。また一次抗体を固定化した後に吸着防止剤をコ 一ティングするため固定ィ匕したタンパク質の上にコーティングされてしま 、、二次抗体 と反応できないという問題があった。このため、一次抗体の固定化後、吸着防止剤を コーティングすることなぐ生理活性物質の非特異的吸着量の少な 、バイオチップが 求められている。非特異的吸着の原因としては種々あるが基材とタンパクとの疎水性 相互作用、水素結合などが考えられている。そのため、バイオチップ基板の表面は 親水性であり、かつ水素結合基を持たな 、ことが求められて 、る。
[0007] また、プロテインチップ基板への検出対象物質の非特異的吸着を除去するために 界面活性剤による洗浄過程が多数組み込まれて ヽるが、界面活性剤によりコ一ティ ング膜がはがれてしまうという問題もあり、界面活性剤による洗浄でもコーティング膜 が剥がれな 、プロテインチップが求められて 、る。
[0008] また、マイクロアレイ状のチップを用いて試料検体の情報を得る技術は、生物学、 医学において欠くことのできない技術になりつつある。たとえば、 DNAマイクロアレイ では、複雑な生物系においてもゲノム全体の発現パターンの研究が可能となり、遺伝 子情報量の爆発的な増カロがもたらされて 、る。
[0009] マイクロアレイのシグナル検出において、マイクロアレイ用基板のバックグランドは S ZN比を低下させる原因となり、検出精度を低下させる（たとえば、非特許文献 1など )。 SZN比とは、ラベルイ匕された試料検体カゝら得られたシグナル量 (シグナル)をラベ ル化された試料検体力 得られたシグナル物質以外の部位力 発生したシグナル量 (ノイズ)で除した値のことを 、、 SZN比が高 、と検出感度が高くなる。
[0010] マイクロアレイ上の物質を検出する手段として蛍光物質を用いる場合、マイクロアレ ィ基板の自己蛍光量力バックグランドとなり、基板の自己蛍光が高いと、 SZN比が低 下する問題がある。また、蛍光物質の基板への付着によりバックグランドにムラが生じ た場合、その基板カゝら得られたデータの再現性または信頼性に支障をきたす原因と なりうる。
[0011] マイクロアレイ用基板として用いられる素材は、ガラスもしくはプラスチック製であるこ とが多いが、通常これらの材料表面は化学的に不活性であることから、生理活性物 質を固定ィ匕するためには表面修飾を施す必要がある。ガラスやプラスチックなどの不 活性な表面に様々な官能基を直接導入することは困難であるため、まずアミノ基を導 入しておき、そのアミノ基を介して官能基を導入する方法が一般的である。
[0012] 基板表面へのァミノ基の導入方法として、アミノアルキルシランによる処理、窒素雰 囲気下でのプラズマ処理、アミノ基含有高分子物質のコーティングなどが挙げられる
1S 処理の簡便性、均一性、再現性の観点から、アミノアルキルシランによる処理が 多用されている。一般的に用いられているアミノアルキルシランとしては、ァミノプロピ ルトリメトキシシラン、ァミノプロピルトリエトキシシラン、ァミノプロピルメチルジメトキシ シランなどの 1級アミノ基を有するアミノアルキルシランが挙げられる。
[0013] アミノ基を介して官能基を導入する方法として、たとえば、 2官能性アルデヒドを有 するダルタルアルデヒドで処理することにより、基板にアルデヒド基を導入することが 知られている (特許文献 2、特許文献 3、特許文献 4)。マレイミド基を導入する場合は 、一端にマレイミド基、一端に活性エステルを有する架橋剤である N— (6—マレイミド 力プロイロキシ)スクシンイミドなどで処理することができる（特許文献 5)。また、同様に N—ヒドロキシスクシンイミド活性エステルを導入する場合には、両端に活性エステル 有する Ethyleneglycol— 0,0— bis (succinimidylsuccinate)などを用いる。
[0014] ところが、基板に上記のような表面処理を施した場合、基板の自己蛍光量が増大し 、この基板の自己蛍光の上昇が SZN比の低下の原因となっていた。また、蛍光物質 の基板への付着が起こることによりバックグランドが高くなり、 SZN比の低下の原因と なる問題もあった。そのため、表面処理により自己蛍光量が増大せず、かつ蛍光物 質の付着のな 、マイクロアレイ用基板が求められて 、た。
[0015] また、マイクロアレイ研究の一方で、反応の高効率化および微少サンプル化を目指 し、マイクロフルイデイクスと呼ばれる、微細流路を用いる技術が開発されている。たと えば、微細流路内で抗原抗体反応を起こさせる免疫分析などが挙げられる (特許文 献 6)。 DNA分析にぉ 、てもマイクロ流路を用いた手法が検討されて 、る（特許文献 7)。
[0016] ところが、微細流路を用いた生理的活性物の従来の分析にぉ 、ては、流路へ生理 活性物質が付着してしまい、検出感度の低下をまねくことがあった。このため、流路 への生理活性物質の付着を防止する技術が求められている。また、 DNAのハイブリ ダイゼーシヨンや抗原抗体反応等にお ヽては、より短時間かつ少量で反応が起こる 系が切望されている。
特許文献 1：特開 2001— 116750号公報
非特許文献 1 :「DNAマイクロアレイ実戦マニュアル」、林崎良英、岡崎康司編、羊土 社、 2000年、 p.57
特許文献 2 :特開 2002-176991号公報
特許文献 3：特開 2002-181817号公報
特許文献 4：特表 2002-532699号公報
特許文献 5：特開平 11—187900号公報
特許文献 6：特開 2001— 004628号公報
特許文献 7：特開 2004-053417号公報
[0017] 発明の開示
[0018] 本発明は上記事情に鑑みてなされたものであり、吸着防止剤をコーティングするこ となぐ検出対象物質の非特異的な吸着または結合が抑制され、検出感度に優れた バイオチップを提供する。
[0019] 本発明によれば、基板の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と活性エス テル基を有する第二単位とを含む高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ 用基板が提供される。
[0020] 本発明のバイオチップ用基板は、ホスホリルコリン基を有するため、基板上への生 理活性物質の非特異的吸着を抑制することができる。また、活性エステル基を有する ため、生理活性物質を捕捉する捕捉物質を高分子物質中に安定的に導入すること ができる。このため、吸着防止剤をコーティングすることなぐ検出対象物質の非特異 的な吸着または結合を抑制し、検出感度を向上させることができる。本発明のバイオ チップ用基板は、たとえば基板の表面に生理活性物質を捕捉する捕捉物質が固定 化されるバイオチップに用いる基板とすることができる。
[0021] 本発明のバイオチップ用基板において、前記高分子物質がブチルメタタリレート基 を有する第三単位を含み、前記高分子物質に含まれる前記ホスホリルコリン基の、前 記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタタリレート基との合計に 対する割合力 3モル％以上 40モル％以下であってもよい。また、本発明のバイオチ ップ用基板において、前記高分子物質がブチルメタタリレート基を有する第三単位を 含み、前記高分子物質に含まれる前記ホスホリルコリン基の、前記ホスホリルコリン基 と前記活性エステル基と前記ブチルメタタリレート基との合計に対する割合力 20モ ル0 /0以上 40モル0 /0未満であってもよ!/、。
[0022] 本発明のバイオチップ用基板において、前記高分子物質がブチルメタタリレート基 を有する第三単位を含み、前記高分子物質に含まれる前記活性エステル基の、前 記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタタリレート基との合計に 対する割合力 1モル％以上 25モル％以下であってもよい。また、本発明のバイオチ ップ用基板において、前記高分子物質がブチルメタタリレート基を有する第三単位を 含み、前記高分子物質に含まれる前記活性エステル基の、前記ホスホリルコリン基と 前記活性エステル基と前記ブチルメタタリレート基との合計に対する割合力 15モル %以上 25モル0 /0未満であってもよ!/、。
[0023] 本発明によれば、基板の表面に、下記 (a)、（b)成分を含む高分子物質を有するこ とを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
(a)ホスホリルコリン基を有する第一単位と活性エステル基を有する第二単位とを含 む高分子
(b)ホスホリルコリン基を有する第一単位とブチルメタタリレート基を有する第三単位 とを含む高分子
[0024] 本発明のバイオチップ用基板は、上記 (a)、（b)成分を含む高分子物質を有するた め、基板上への生理活性物質の非特異的吸着をさらに確実に抑制することができる 。なお、（a)成分の第一単位と (b)成分の第一単位とは同一構造であってもよいし、 異なる構造であってもよい。また、（a)成分と (b)成分とが混合されていてもよい。
[0025] 本発明のバイオチップ用基板において、前記高分子物質に含まれるホスホリルコリ ン基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタタリレート基と の合計に対する割合力 3モル％以上 40モル％以下であってもよい。また、本発明 のバイオチップ用基板において、前記高分子物質に含まれるホスホリルコリン基の、 前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタタリレート基との合計 に対する割合力 20モル％以上 40モル％未満であってもよい。なお、本明細書にお いて、高分子物質が上記 (a)、（b)成分を含む構成では、ホスホリルコリン基の割合 は、 (a)成分と (b)成分に含まれるホスホリルコリン基の合計を指す。
[0026] 本発明のバイオチップ用基板において、前記高分子物質に含まれる前記活性エス テル基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタタリレート 基との合計に対する割合が、 1モル％以上 25モル％以下であってもよい。また、本発 明のバイオチップ用基板にお！ヽて、前記高分子物質に含まれる前記活性エステル基 の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブチルメタタリレート基との合 計に対する割合が、 15モル％以上 25モル％未満であってもよ 、。
[0027] 本発明によれば、基板の表面に、
アミノ基を有する化合物を含む第一の層と、
ホスホリルコリン基を含む第一単位と活性エステル基を含む第二単位とを有する高 分子物質を含む第二の層と、
が、
前記基板、前記第一の層、および前記第二の層の順で積層されていることを特徴 とするバイオチップ用基板が提供される。
[0028] 本発明においては、基板、第一の層および第二の層がこの順で積層されているた め、バイオチップ用基板の表面に吸着防止剤をコーティングすることなぐ検出対象 物質の非特異的な吸着または結合を抑制し、検出感度を向上させることができる。ま た、界面活性剤等による洗浄による層の剥離を抑制することができる。なお、第一の 層または第二の層は、膜状に形成することができる。
[0029] 本発明のバイオチップ用基板において、
前記第一の層の前記アミノ基と、前記第二の層の前記活性エステル基とが反応し て共有結合、具体的にはアミド結合が形成された構成とすることができる。
[0030] 本発明のバイオチップ用基板において、前記第一の層が前記アミノ基を有するシラ ンカップリング剤を含んでもよい。アミノ基を有するシランカップリング剤は、ポリオル ガノシロキサン等のオルガノシロキサンの形態で存在して 、てもよ 、。
[0031] 本発明のバイオチップ用基板において、ホスホリルコリン基を含む前記第一単位が 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン基を有する構成とすることができる。
[0032] 本発明のバイオチップ用基板において、前記高分子物質は、ブチルメタタリレート 基を含む第三単位を有する構成とすることができる。また、本発明において、前記高 分子物質は共重合体とすることができる。この構成において、前記高分子物質は、前 記ホスホリルコリン基を有する単量体と、前記活性エステル基を有する単量体と、前 記ブチルメタタリレート基を有する単量体と、の共重合体とすることができる。
[0033] 本発明によれば、基板上に第一の層が形成され、
さらに第一の層上に第二の層が形成され、
前記第一の層は、アタリレート基、メタタリレート基、ビュル基、およびアルケニル基 から選ばれる少なくとも一つの基を有する化合物から形成され、
前記第二の層は、ホスホリルコリン基を有する単量体の重合体と、活性エステル基 を有する単量体と、の共重合体から形成されて 、ることを特徴とするバイオチップ用 基板が提供される。
[0034] また、本発明によれば、基板と、
前記基板上に設けられ、オルガノシロキサン力もなる第一の層と、
第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を有する単量体と、活性エステル基を有 する単量体との共重合体からなる第二の層と、
を有することを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
[0035] この構成によれば、基板上にホスホリルコリン基と活性エステル基とを含む共重合 体力も形成された層を有するため、バイオチップ用基板の表面に吸着防止剤をコー ティングすることなぐ検出対象物質の非特異的な吸着または結合を抑制し、検出感 度を向上させることができる。また、かつ界面活性剤等による洗浄による層の剥離を 抑制することができる。この構成において、前記基板の表面に前記第一の層が設け られ、前記第一の層の表面に前記第二の層が設けられた構成とすることができる。
[0036] また、前記オルガノシロキサンは、重合性二重結合を含む基を有する化合物とする ことができる。重合性二重結合を有する基がアルケニル基を構成していてもよい。ま た、重合性二重結合を有する基の少なくとも一部がアタリレート基、メタタリレート基、 ビュル基、およびアルケニル基力 選ばれる少なくとも 1つの基を構成していてもよい [0037] 本発明のバイオチップ用基板において、前記化合物の、アタリレート基、メタクリレ ート基、ビニル基、およびァルケ-ル基力 選ばれる少なくとも 1つの基力 前記第二 の層の前記共重合体と共有結合を形成して!/ヽてもよ ヽ。
[0038] 本発明のバイオチップ用基板において、前記第一の層が、アタリレート基、メタクリレ ート基、ビニル基、およびァルケ-ル基力 選ばれる少なくとも 1つの基を有するシラ ンカップリング剤により形成されていてもよい。また、シランカップリング剤は、オルガノ シロキサンを形成して 、てもよ 、。
[0039] 本発明のバイオチップ用基板において、ホスホリルコリン基を有する前記単量体が 、メタクリル基またはアクリル基を有する構成とすることができる。また、本発明のバイ ォチップ用基板において、ホスホリルコリン基を有する前記単量体力 2—メタクリロイ ルォキシェチルホスホリルコリンであってもよ!/、。
[0040] 本発明のバイオチップ用基板において、活性エステル基を有する前記単量体が、 メタクリル基またはアクリル基を有する構成とすることができる。また、本発明のバイオ チップ用基板にぉ 、て、前記活性エステル基力 ¾一二トロフエニル基または N—ヒドロ キシスクシンイミド基を含むことができる。
[0041] 本発明のバイオチップ用基板において、前記基板の材料がプラスチックであっても よい。また、本発明のバイオチップ用基板において、前記プラスチックが飽和環状ポ リオレフインであってもよい。また、本発明のバイオチップ用基板において、前記基板 の材料がガラスであってもよ 、。
[0042] 本発明によれば、基板の表面に、ホスホリルコリン基を含む第一単位と下記式（1) に示される一価の基を含む第二単位とを有する高分子物質を有することを特徴とす るバイオチップ用基板が提供される。 [0043] [化 1] 一 C— A
II ( 1 )
〇
[0044] (ただし、上記式（1)において、 Aは水酸基を除く一価の脱離基である。 )
[0045] また、本発明によれば、基板の表面に、下記 (a)、 （b)成分を含む高分子物質を有 することを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
(a)ホスホリルコリン基を有する第一単位と上記式（1)で示される一価の基を有する 第二単位とを含む高分子
(b)ホスホリルコリン基を有する第一単位とブチルメタタリレート基を有する第三単位 とを含む高分子
[0046] また、本発明によれば、
基板と、
前記基板上に設けられ、アミノ基を有する化合物を含む第一の層と、
前記第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を有する第一単位と上記式（1)で 示される一価の基を有する第二単位とを含む高分子物質を含む第二の層と、 を有することを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
[0047] また、本発明によれば、基板と、
前記基板上に設けられ、アタリレート基、メタタリレート基、ビニル基、およびァルケ -ル基から選ばれる少なくとも 1つの基を有する化合物から形成された第一の層と、 前記第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を有する単量体の重合体と、上記 式（1)で示される一価の基を有する単量体と、の共重合体から形成された第二の層 と、
を有することを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
[0048] こうした構成によれば、上記式（1)に示したように、第二単位にカルボ二ル基を介し て脱離基 Aが存在するため、高分子物質中に生理活性物質を捕捉する捕捉物質を さらに確実に化学的に導入することができる。
[0049] 本発明のバイオチップ用基板において、前記式（1)に示される一価の基が、下記 式 (p)または式 (q)力も選択される 、ずれかの基であってもよ!/、。こうすることにより、 脱離基 Aをさらに確実に活性化し、反応性をさらに向上させることができる。なお、下 記式 (P)または式 (q)は、それぞれ、 Nを含む環状化合物の Nから Hが抜けた構成や Cを含む環状ィ匕合物の C力も Hが抜けた構成とすることもできる。
[0050] [化 2] 一 C 一 O— CR1
II (P)
o
- C - O - NR2
II (q)
O
[0051] (ただし、上記式 (p)および式 (q)にお 、て、 R1および R2は、それぞれ独立して、一価 の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記 式 (p)において、 R1は Cとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式 (q)において、 R2は Nとともに環を形成する二価の基であってもよい。 )
[0052] 本発明によれば、基板の表面に、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸 誘導基を含む第二単位とを有する高分子物質を有することを特徴とするバイオチッ プ用基板が提供される。
[0053] また、本発明によれば、基板の表面に、下記 (a)、 （b)成分を含む高分子物質を有 することを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
(a)ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを 含む高分子
(b)ホスホリルコリン基を有する第一単位とブチルメタタリレート基を有する第三単位 とを含む高分子
[0054] また、本発明によれば、基板と、
前記基板上に設けられ、アミノ基を有する化合物を含む第一の層と、
前記第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導 基を含む第二単位とを有する高分子物質を含む第二の層と、
を有することを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
[0055] また、本発明によれば、基板と、
前記基板上に設けられ、アタリレート基、メタタリレート基、ビニル基、およびァルケ -ル基から選ばれる少なくとも 1つの基を有する化合物から形成された第一の層と、 前記第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を有する単量体と、カルボン酸誘 導基を有する単量体と、の共重合体から形成された第二の層と、
を有することを特徴とするバイオチップ用基板が提供される。
[0056] 本発明によれば、前記バイオチップ用基板の前記基板の表面に生理活性物質を 捕捉する捕捉物質を固定ィ匕し、蛍光色素を用いて前記生理活性物質を検出するた めのマイクロアレイ用基板であって、前記基板の表面に、ホスホリルコリン基を有する 第一単位と活性エステル基を有する第二単位とを含む前記高分子物質を有すること を特徴とするマイクロアレイ用基板が提供される。本発明のマイクロアレイ用基板は、 生理活性物質の非特異的吸着を抑制しつつ、捕捉物質と活性エステル基とを反応さ せて共有結合を形成させることができるため、生理活性物質の検出を確実に行うこと ができる。
[0057] 本発明によれば、前記バイオチップ用基板に、生理活性物質を捕捉する捕捉物質 が固定化されたことを特徴とするバイオチップが提供される。なお、捕捉物質は生理 活性を有することができる。また、生理活性物質を有する分子とすることができる。こ の分子は単独で生理活性物質を捕捉することもできるし、複数の分子で生理活性物 質を捕捉することもできる。また、本発明において、捕捉物質が高分子物質に共有結 合して！/、る構成とすることができる。
[0058] 本発明によれば、ホスホリルコリン基を含む第一単位と活性エステル基を含む第二 単位とを有する高分子物質を表面に有する基板を含むバイオチップであって、 前記活性エステル基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合 を形成していることを特徴とするバイオチップが提供される。
[0059] 本発明によれば、活性エステル基の作用により捕捉物質が高分子物質に化学的に 固定ィ匕されているとともに、基板上への生理活性物質の非特異的吸着がホスホリル コリン基の作用により抑制されるので、生理活性物質の分析を確実に行うことができ る。なお、捕捉物質とが反応して、共有結合を形成している構成として、捕捉物質と 活性エステル基のある所定の部位とが反応して共有結合して 、る場合も含まれる。ま た、本発明において、前記基板の表面に前記高分子物質が層状に形成されていて もよい。また、前記基板の表面を前記高分子物質が被覆していてもよい。こうすれば 、さらに確実に非特異的吸着を抑制することができる。また、固定ィ匕に用いる活性ェ ステル基を基板表面にさらに確実に導入できる。
[0060] 本発明によれば、基板の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と、活性エス テル基を有する第二単位を複数と、を含む高分子物質を有するバイオチップであつ て、
一部の前記活性エステル基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して共有 結合を形成しており、
残りの前記活性エステル基と親水基を有する親水性ポリマーとが反応して共有結 合を形成していることを特徴とするバイオチップが提供される。
[0061] 本発明においては、高分子物質中に、たとえば一種類の活性エステル基が 2個以 上含まれ、補足物質と共有結合を形成した活性エステル基以外の、残りの活性エス テル基と親水性ポリマーとが反応して共有結合を形成している。このため、生理活性 物質と活性エステル基との反応が抑制され、また、高分子物質が親水化されている。 よって、生理活性物質の非特異的吸着がより一層抑制された構成となっている。
[0062] 本発明のバイオチップにおいて、前記親水性ポリマーがアミノ基を有する構成とす ることができる。こうすれば、親水性ポリマーを活性エステルとさらに確実に反応させ て、アミド結合を形成させることができる。
[0063] 本発明のバイオチップにおいて、前記親水性ポリマーは、ポリアルキレンォキシドま たは複数種類の前記ポリアルキレンォキシドを構造中に含むことができる。また、前 記親水性ポリマーが、ポリエチレンォキシド、ポリプロピレンォキシド、これらの共重合 体、およびこれらの少なくとも一つと他のポリアルキレンォキシドとの共重合体のいず れかを構造中に含むことができる。
[0064] 本発明のバイオチップにお ヽて、前記基板の材料がプラスチックであってもよ ヽ。ま た、本発明のバイオチップにおいて、前記プラスチックが飽和環状ポリオレフインであ つてもよい。
[0065] 本発明によれば、基板と、前記基板に設けられた流路と、を有し、
前記流路の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と活性エステル基を有す る第二単位とを含む高分子物質を有し、
前記活性エステル基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合 を形成していることを特徴とするバイオチップが提供される。
[0066] 本発明のバイオチップにおいては、基板に流路が設けられているため、捕捉物質 力 Sさらに充分に固定化された構成となっている。また、生理活性物質をさらに確実に 捕捉物質と相互作用させることができる構成となっている。このため、流路中に試験 液を流動させて、捕捉物質に捕捉された試験液中の生理活性物質の検出または定 量に好適に用いることができる。また、試験液中に含まれる成分の特定に用いること もできる。なお、この構成において、流路が基板の表面に溝状に設けられていてもよ い。
[0067] 本発明のバイオチップにお 、て、複数の前記活性エステル基を有し、前記複数の 活性エステル基は、前記捕捉物質と反応して共有結合を形成しているか、または不 活ィ匕されていてもよい。なお、活性エステル基が不活性ィ匕されているとは、活性エス テル基を構成する一部の基 (脱離基)が他の基に置換されて、高い反応活性を喪失 していることをいう。
[0068] 本発明のバイオチップにお 、て、前記流路を覆う保護部材を有して 、てもよ 、。ま た、保護部材が板状部材であってもよい。このとき、基板と板状の保護部材とが接合 され、接合面に流路が形成された構成とすることもできる。
[0069] 本発明のバイオチップにお ヽて、前記基板または保護部材の材料がプラスチックで あってもよい。また、本発明のノィォチップにおいて、前記基板の材料が、検出光に 対して透明なプラスチックであってもよい。また、本発明において、前記基板と前記保 護部材の少なくとも一方の材料が、検出光に対して透明なプラスチックであってもよ い。
[0070] 本発明のバイオチップにおいて、さらに前記捕捉物質に前記生理活性物質が捕捉 された構成とすることができる。
[0071] 本発明のバイオチップにおいて、ホスホリルコリン基を含む前記第一単位が 2 メタ クリロイルォキシェチルホスホリルコリン基を有することができる。
[0072] 本発明のバイオチップにおいて、前記活性エステル基力 ¾ ニトロフエ-ル基または N-ヒドロキシスクシンイミド基を有することができる。
[0073] 本発明のバイオチップにおいて、前記高分子物質は、ブチルメタタリレート基を含 む第三単位を有することができる。この構成において、前記高分子物質は、前記ホス ホリルコリン基を有する単量体と、前記活性エステル基を有する単量体と、前記プチ ルメタタリレート基を有する単量体と、の共重合体とすることができる。
[0074] 本発明のバイオチップにおいて、前記基板の材料がガラスであってもよい。
[0075] 本発明のバイオチップにおいて、前記捕捉物質は、核酸、アブタマ一、タンパク質 、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、および糖タンパク質力 なる群力 選択される 一または二以上の物質であってもよい。また、本発明のバイオチップにおいて、前記 生理活性物質は、核酸、アブタマ一、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖 、および糖タンパク質力もなる群力も選択される一または二以上の物質であってもよ い。
[0076] 本発明のバイオチップにおいて、生理活性物質を捕捉する捕捉物質が、中性また はアルカリ性の条件で前記基板の表面に固定ィ匕されてなる構成とすることができる。 前記中性またはアルカリ性の条件は、 pH7. 6以上の条件とすることができる。
[0077] 本発明によれば、ホスホリルコリン基を含む第一単位と下記式（1)に示される一価 の基を含む第二単位とを有する高分子物質を表面に有する基板を含むバイオチップ であって、
前記下記式 (1)に示される一価の基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応 して、共有結合を形成して ヽることを特徴とするバイオチップが提供される。 [0078] [化 3] 一 C— A
II ( 1 )
〇
[0079] (ただし、上記式（1)において、 Aは水酸基を除く一価の脱離基である。 )
[0080] また、本発明によれば、基板の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と、上 記式（1)で示される一価の基を有する第二単位を複数と、を含む高分子物質を有す るバイオチップであって、
一部の前記式（1)で示される一価の基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反 応して共有結合を形成しており、
残りの前記式（1)で示される一価の基と親水基を有する親水性ポリマーとが反応し て共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップが提供される。
[0081] また、本発明によれば、基板と、前記基板に設けられた流路と、を有し、
前記流路の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と上記式（1)に示される 一価の基を有する第二単位とを含む高分子物質を有し、
前記活性エステル基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合 を形成していることを特徴とするバイオチップが提供される。
[0082] 本発明のバイオチップにおいて、前記式（1)に示される一価の基が、下記式 ( ま たは式 (q)力 選択される 、ずれかの基であってもよ!/、。
[0083] [化 4] 一 C一 O— CR1
Figure imgf000018_0001
- C - O - NR2
II (q)
O
[0084] (ただし、上記式 (p)および式 (q)にお 、て、 R1および R2は、それぞれ独立して、一価 の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記 式 (p)において、 R1は Cとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式 (q)において、 R2は Nとともに環を形成する二価の基であってもよい。 )
[0085] 本発明によれば、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第 二単位とを有する高分子物質を表面に有する基板を含むバイオチップであって、前 記カルボン酸誘導基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合を 形成していることを特徴とするバイオチップが提供される。
[0086] また、本発明によれば、基板の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカル ボン酸誘導基を有する第二単位を複数とを含む高分子物質を有するバイオチップで あって、
一部の前記カルボン酸誘導基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して共 有結合を形成しており、
残りの前記カルボン酸誘導基と親水基を有する親水性ポリマーとが反応して共有 結合を形成していることを特徴とするバイオチップが提供される。
[0087] また、本発明によれば、基板と、前記基板に設けられた流路と、を有し、
前記流路の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有 する第二単位とを含む高分子物質を有し、 前記活性エステル基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合 を形成していることを特徴とするバイオチップが提供される。
[0088] 本発明によれば、前記マイクロアレイ用基板に、
核酸、アブタマ一、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、および糖タンパ ク質力 なる群力 選択される一または二以上の前記捕捉物質が固定化されたことを 特徴とするマイクロアレイが提供される。
[0089] 本発明によれば、マイクロアレイ用基板の自己蛍光を低減し、かつ蛍光物質の吸着 を低減することにより、マイクロアレイの検体のシグナルを精密に検出することができ る。
[0090] 本発明によれば、前記バイオチップ用基板の製造方法であって、
(1)前記基板の前記表面とアミノ基を有する前記化合物との接触工程、および
(2)前記アミノ基を有する化合物と前記高分子物質との接触工程、
を含むことを特徴とするバイオチップ用基板の製造方法が提供される。
[0091] また、本発明によれば、前記バイオチップ用基板の製造方法であって、
前記基板上に、前記第一の層を形成した後、
前記第一の層上で、ホスホリルコリン基を有する前記単量体と活性エステル基を有 する前記単量体とを共重合することにより前記第二の層を形成することを特徴とする ノィォチップ用基板の製造方法が提供される。
[0092] 本発明によれば、前記バイオチップ用基板の使用方法であって、
(1)生理活性物質を捕捉する捕捉物質を中性またはアルカリ性の条件で前記基板 上に固定ィ匕するステップ、および
(2)前記マイクロチップ用基板の表面に、検出される生理活性物質を含む前記条件 以下の pHの液体を接触させて、前記捕捉物質に前記生理活性物質を捕捉させるス テツプ、
を含むことを特徴とするバイオチップ用基板の使用方法が提供される。
[0093] 本発明のバイオチップ用基板の使用方法によれば、吸着防止剤をコーティングす ることなぐ生理活性物質の溶液の pHを制御することにより、検出対象物質の非特異 的な吸着または結合を抑制し、検出感度の高いマイクロチップを得ることができる。こ の構成において、液体は、生理活性物質を含む溶液とすることができる。また、上記（
1)における条件は、たとえば PH7. 6とすることができる。
[0094] 本発明のバイオチップ用基板の使用方法において、前記捕捉物質は、核酸、アブ タマ一、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、および糖タンパク質力もなる 群力も選択される一または二以上の物質であってもよい。
[0095] また、本発明のバイオチップ用基板の使用方法において、検出される前記生理活 性物質は、核酸、アブタマ一、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、糖タン ノ ク質力もなる群力も選択される一または二以上の物質であってもよい。
[0096] 本発明によれば、前記バイオチップ用基板を用いたノィォチップの製造方法であ つて、
前記バイオチップ用基板は、複数の前記活性エステル基を有し、
一部の前記活性エステル基と前記捕捉物質とを反応させて、前記捕捉物質を固定 化する工程と、
捕捉物質を固定ィ匕する工程の後、残りの前記活性エステル基を不活性ィ匕する工程 と、
を有することを特徴とするバイオチップの製造方法が提供される。
[0097] 本発明のバイオチップの製造方法において、残りの活性エステル基を不活性化す る前記工程を、アルカリィ匕合物を用いて行うことができる。
[0098] また、本発明のバイオチップの製造方法にぉ 、て、残りの活性エステル基を不活性 化する前記工程を、 1級のアミノ基を有する化合物を用いて行うことができる。また、 本発明のバイオチップの製造方法において、 1級のアミノ基を有する前記化合物が、 アミノエタノールまたはグリシンであってもよ 、。
[0099] 本発明のバイオチップの製造方法において、前記捕捉物質が、核酸、アブタマ一、 タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、および糖タンパク質力もなる群から 選択される一または二以上の物質であってもよい。また、この構成において、捕捉物 質を固定ィ匕する前記工程は、前記生理活性物質を含む pH7. 6以下の溶液を前記 基板の前記表面に接触させる工程を含んでもょ ヽ。
[0100] 本発明によれば、本発明のバイオチップの製造方法であって、前記捕捉物質を含 む酸性または中性の液体を前記基板の前記表面に接触させる工程を含むことを特 徴とするバイオチップの製造方法が提供される。本発明において、酸性または中性 の前記液体の pHが 7. 6以下あってもよい。
[0101] 本発明によれば、前記バイオチップの製造方法であって、
前記バイオチップ用基板の一部の前記活性エステル基と前記捕捉物質とを反応さ せて、共有結合を形成させて、前記捕捉物質を固定化する工程と、
捕捉物質を固定ィ匕する前記工程の後、残りの前記活性エステル基と前記親水性ポ リマーとを反応させて、共有結合させる工程と、
を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法が提供される。
[0102] 本発明によれば、前記バイオチップの製造方法により製造されたことを特徴とする バイオチップが提供される。
図面の簡単な説明
[0103] 上述した目的、およびその他の目的、特徴および利点は、以下に述べる好適な実 施の形態、およびそれに付随する以下の図面によってさらに明らかになる。
[0104] [図 1]実施の形態に係るバイオチップの構成を示す平面図である。
発明を実施するための最良の形態
[0105] (第 1の実施形態）
本実施形態は、基板（固相基板)上に生理活性物質を捕捉する捕捉物質が固定化 されバイオチップ用基板に関する。このバイオチップ用基板は、基板の表面に高分 子物質を有する。高分子物質は、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘 導基を含む第二単位とを有する。以下、バイオチップ用基板の構成部材について説 明する。
[0106] (高分子物質）
ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する 高分子物質は、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質と生理活性物質を固 定ィ匕する性質とを併せ持つポリマーである。第一単位に含まれるホスホリルコリン基 は生理活性物質の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、第二単位に含まれる力 ルボン酸誘導基は捕捉分子を化学的に固定化する役割を果たす。 [0107] 第一の単位は、たとえば、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン基、 6—メタ クリロイルォキシへキシルホスホリルコリン基等の（メタ）アタリロイルォキシアルキルホ スホリノレコリン基；
2—メタクリロイルォキシエトキシェチルホスホリルコリン基および 10—メタクリロイルォキ シエトキシノ -ルホスホリルコリン基等の（メタ）アタリロイルォキシアルコキシアルキル ホスホリノレコリン基；
ァリルホスホリルコリン基、ブテュルホスホリルコリン基、へキセニルホスホリルコリン基 、オタテュルホスホリルコリン基、およびデセ-ルホスホリルコリン基等のアルケ -ルホ スホリノレコリン基；
等の基を有し、ホスホリルコリン基力 Sこれらの基中に含まれて 、る構成とすることがで きる。
[0108] また、これらの基のうち、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンが好ましい。
第一単位が 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンを有する構成とすることに より、基板表面における非特異的吸着をより一層確実に抑制することができる。
[0109] 活性ィ匕されたカルボン酸誘導体は、カルボン酸のカルボキシル基が活性ィ匕された ものであり、 c = oを介して脱離基を有するカルボン酸である。活性ィ匕されたカルボン 酸誘導体としては、たとえば、カルボン酸であるアクリル酸、メタクリル酸、クロトン酸、 マレイン酸、フマル酸などのカルボキシル基力 酸無水物、酸ハロゲン化物、活性ェ ステル、活性ィ匕アミドに変換されたィ匕合物が挙げられる。カルボン酸誘導基は、こうし た化合物に由来する活性ィ匕された基であり、たとえば、 p—二トロフエ二ル基ゃ N—ヒド ロキシスクシンイミド基等の活性エステル基；
— C1、 一 F等のハロゲン；
等の基を有することができる。
[0110] また、カルボン酸誘導基は、下記式（1)に示される基とすることができる。 [0111] [化 5] 一 C— A
II ( 1 )
〇
(ただし、上記式（1)において、 Aは水酸基を除く脱離基である。 )
[0112] 上記式（1)に示される一価の基は、たとえば下記式 (p)または式 (q)から選択される
V、ずれかの基とすることができる。
[0113] [化 6] 一 C 一 O— CR1
II (P)
o
- C - O - NR2
II (q)
O
[0114] (ただし、上記式 (p)および式 (q)において、 R1および R2は、それぞれ独立して、一価 の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記 式 (p)において、 R1は Cとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式 (q)において、 R2は Nとともに環を形成する二価の基であってもよい。 )
[0115] 上記式 (p)に示される基として、たとえば下記式 (r)、（s)、および ）に示される基 が挙げられる。また、上記式 (q)に示される基として、たとえば下記式 (u)、（V)に示さ れる基が挙げられる。
[0116] 上記式（1)に示される基は、たとえば下記式 (r)、式 (s)等に示される酸無水物由来 の基；
下記式 (t)に示される酸ハロゲンィ匕物由来の基； 下記式 (U)、式 (W)に示される活性エステル由来の基;または
下記式 (V)に示される活性ィ匕アミド由来の基とすることができる。
[化 7]
Figure imgf000024_0001
Figure imgf000024_0002
[0117] カルボン酸誘導基のうち、活性エステル基は、穏やかな条件における反応性に優 れるため、好ましく用いられる。穏やかな条件としては、たとえば中性またはアルカリ 性の条件、具体的には pH7. 0以上 10. 0以下、さらに具体的には pH7. 6以上 9. 0 以下、さらにまた具体的には pH8. 0とすることができる。
[0118] なお、本明細書において規定するところの「活性エステル基」は、その定義につい て厳密な規定はなされていないが、慣用の技術表現としては、エステル基のアルコー ル側に酸性度の高 、電子求引性基を有して求核反応を活性ィ匕するエステル群、す なわち反応活性の高いエステル基を意味するものとして、各種の化学合成、たとえば 高分子化学、ペプチド合成等の分野で慣用されているものである。実際的には、フエ ノールエステル類、チォフエノールエステル類、 N—ヒドロキシァミンエステル類、複素 環ヒドロキシィ匕合物のエステル類等がアルキルエステル等に比べてはるかに高い活 性を有する活性エステル基として知られて 、る。
[0119] 本実施形態および以下の実施形態では、高分子物質中の活性ィ匕カルボン酸誘導 体基が活性エステル基である場合を例に、説明する。活性エステル基としては、たと えば p—-トロフエ-ル基、 N—ヒドロキシスクシンイミド基、コハク酸イミド基、フタル酸ィ ミド基、 5—ノルボルネン -2,3-ジカルボキシイミド基等が挙げられる力 たとえば p—二ト 口フ ニル基が好ましく用いられる。
[0120] 基板の表面に捕捉物質が固定化されるノィォチップ用基板の場合、第一単位と第 二単位のさらに具体的な構成の組み合わせとして、たとえば、ホスホリルコリン基を含 む第一単位が 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン基を有し、活性エステル 基力 ¾ ニトロフエニル基である構成とすることができる。
[0121] また、本発明に使用する高分子物質は、ホスホリルコリン基およびカルボン酸誘導 基以外に他の基を含んでもよい。また、高分子物質は共重合体とすることができる。 具体的には、高分子物質がブチルメタタリレート基を含む共重合体であることが好ま しい。こうすることにより、高分子物質を適度に疎水化し、基板表面への吸着性をさら に好適に確保することができる。
[0122] 具体的には、高分子物質を、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン（MPC) 基を有する第一単量体と、 p—-トロフエ-ルカルポ-ルォキシェチルメタタリレート（N PMA)基を有する第二単量体と、ブチルメタリレート（BMA)基を有する第三単量体 との共重合体とすることができる。これらの共重合体である poly (MPC-co-BMA-c o-NPMA) (PMBN)は、模式的に下記一般式（2)で示される。
[0123] [化 8]
Figure imgf000025_0001
—ニトロフエニルカルボニル
2—メタクリロイルォキシェチル ブチルメタクリレート
ォキシェ于ルメタクリレ一ト ホスホリルコリン （MPC) (B A)
(N PMA)
[0124] ただし、上記一般式（2)にお 、て、 a、 b、および cは、それぞれ独立して、正の整数 である。また、上記一般式 (2)において、第一一第三単量体がブロック共重合してい てもよ 、し、これらの単量体がランダムに共重合して 、てもよ!/、。
[0125] 上記一般式 (2)で示される共重合体は、高分子物質の適度な疎水化と、非特異吸 着を抑制する性質と、捕捉物質固定化する性質とのバランスにより一層優れた構成 である。このため、これを用いることにより、基板表面をより一層確実に高分子物質で 被覆するとともに、高分子物質が設けられた基板上への非特異的吸着を抑制しつつ 、捕捉物質をさらに確実に共有結合により固定ィ匕して基板上に導入することができる
[0126] なお、上記一般式（2)で示される共重合体は、 MPC、 BMA、および NPMAの各 単量体を混合し、ラジカル重合等の公知の重合方法により得ることができる。上記一 般式 (2)で示される共重合体をラジカル重合により作製する場合、たとえば、 Ar等の 不活性ガス雰囲気にて、 30°C以上 90°C以下の温度条件で溶液重合を行うことがで きる。
[0127] 溶液重合に使用される溶媒は適宜選択されるが、たとえば、メタノール、エタノール ゝイソプロノ ノーノレ等のァノレコーノレや、ジェチノレエーテノレ等のエーテノレ、クロロホノレム 等の有機溶媒を単独でまたは複数混合して用いることができる。具体的には、ジェチ ルエーテルとクロ口ホルムを体積比で 8対 2とした混合溶媒とすることができる。
[0128] また、ラジカル重合反応に使用されるラジカル重合開始剤としては、通常使用され るものを用いることができる。たとえば、ァゾビスイソブチ口-トリル (AIBN)、ァゾビス バレロ-トリル等のァゾ系開始剤；
過酸化ラウロイル、過酸化べンゾィル、 t ブチルペルォキシネオデカノエート、 tーブ チルペルォキシビバレート等の油溶性の有機過酸ィ匕物；
などが用いられる。
[0129] さらに具体的には、ジェチルエーテルとクロ口ホルムを体積比で 8対 2とした混合溶 媒および AIBNを用い、 Ar中、 60°Cにて 2— 6時間程度重合を行うことができる。
[0130] (基板の素材）
本実施形態において、バイオチップ用基板として使用される基板の素材は、たとえ ばガラス、プラスチック、金属その他とすることができる。このうち、表面処理の容易性 および量産性の観点から、プラスチックが好ましぐ熱可塑性榭脂がより好ましい。
[0131] 熱可塑性榭脂としては、蛍光発生量の少ないものを用いることができる。蛍光発生 量の少な!/ヽ榭脂を用いること〖こより、生理活性物質の検出反応におけるバックグラン ドを低下させることができるため、検出感度をさらに向上させることができる。蛍光発 生量の少ない熱可塑性榭脂としては、たとえば、ポリエチレン、ポリプロピレン等の直 鎖状ポリオレフイン；
環状ポリオレフイン；
含フッ素樹脂；
等を用いることができる。上記樹脂の中でも、飽和環状ポリオレフインは、耐熱性、耐 薬品性、低蛍光性、透明性および成形性に特に優れるため、光学的な分析に好適 であり、基板の材料として好ましく用いられる。
[0132] ここで、飽和環状ポリオレフインとは、環状ォレフィン構造を有する重合体単独また は環状ォレフィンと aーォレフインとの共重合体を水素添加した飽和重合体を指す。 前者の例としては、たとえばノルボルネン、ジシクロペンタジェン、テトラシクロドデセ ンに代表されるノルボルネン系モノマー、及び、これらのアルキル置換体を開環重合 して得られる重合体を水素添加して製造される飽和重合体である。後者の共重合体 はエチレンやプロピレン、イソプロピレン、 1ーブテン、 3—メチルー 1ーブテン、 1 ペンテ ン、 3—メチルー 1 ペンテン、 1一へキセン、 1 オタテン等の α—才レフインと環状ォレ フィン系モノマーのランダム共重合体を水素添加することにより製造される飽和重合 体である。共重合体では、エチレンとの共重合体が最も好ましい。これらの榭脂は単 独で用いてもよく、 2種類またはそれ以上の共重合体あるいは混合物であってもよ ヽ 。また、環状ォレフィン構造を有する単量体が開環重合して得られる飽和環状ポリオ レフインだけでなぐ環状ォレフィン構造を有する単量体の付加重合により得られる飽 和環状ポリオレフインを用いることもできる。
[0133] 本実施形態に係るバイオチップ用基板は、所定の形状に加工された基板の表面に 高分子物質を含む液体を塗布し、乾燥すること〖こより得られる。また、高分子物質を 含む液体中に基板を浸漬し、乾燥してもよい。
[0134] なお、本実施形態および以下の実施形態において、基板の形状は板状には限ら れず、たとえばフィルム状やシート状であってもよい。具体的には、基板を可とう性の プラスチックフィルムとすることもできる。また、基板は、一つの部材から構成されてい てもよいし、複数の部材カも構成されていてもよい。
[0135] 得られたバイオチップ用基板を用いてバイオチップを作製することができる。以下、 バイオチップ用基板を用いたバイオチップにつ!/、て説明する。 [0136] ノィォチップは、たとえば、バイオチップ用基板の表面に、高分子物質を介して生 理活性物質を捕捉する捕捉物質が固定化された構成とすることができる。こうすれば 、生理活性物質の検出にさらに好適に用いることができる。
[0137] なお、本実施形態および以降の実施形態にお!、て、バイオチップは、単独で用い られてもよいし、他の分析装置中に組み込まれた状態で用いられてもよい。たとえば 、ノィォチップが分析装置の試料台を兼ねる構成とすることもできる。
[0138] 本実施形態および以下の実施形態にお!ヽて、生理活性物質を捕捉する捕捉物質 は、生理活性物質に特異的に相互作用する物質とすることができる。特異的な相互 作用は物理的な相互作用であっても化学的な相互作用であってもよい。また、捕捉 物質は生理活性を有することができる。生理活性を有する捕捉物質としては、たとえ ば、核酸、アブタマ一、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、または糖タン ノ ク質とすることができる。
[0139] また、本実施形態および以下の実施形態にお!、て、生理活性物質は、たとえば、 核酸、アブタマ一、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、または糖タンパク 質とすることができる。
[0140] 次に、バイオチップの製造方法を説明する。本実施形態のバイオチップは、バイオ チップ用基板に捕捉物質を固定ィ匕することにより得られる。
[0141] (生理活性物質を捕捉する捕捉物質の固定化）
ノィォチップの製造工程は、たとえば、
(i)バイオチップ用基板上の高分子物質に含まれる複数の活性エステル基のうち、少 なくとも一部の活性エステル基と捕捉物質とを反応させて共有結合を形成させること により、バイオチップ用基板の捕捉物質を固定ィ匕する工程、
(ii)捕捉物質を固定ィ匕した以外の基板表面の活性エステル基を不活性ィ匕する工程 、すなわち残りの活性エステル基を不活性ィ匕する工程、
を有することができる。以下、それぞれの工程について説明する。
[0142] 上記 (i)にお 、て、生理活性物質を捕捉する捕捉物質をバイオチップ用基板上に 固定ィ匕する際には、捕捉物質を溶解または分散した液体を点着する方法が好まし 、 。高分子物質に含まれる活性エステル基の一部が捕捉物質と反応して、捕捉物質と 共有結合が形成される。
[0143] 捕捉物質を溶解または分散した液体の pHは、たとえば酸性力も中性とすることが できる。
[0144] また、点着後、固定化されなカゝつた生理活性物質を除去するため、純水や緩衝液 で洗浄することができる。
[0145] また、上記 (ii)に示したように、洗浄後は生理活性物質を固定ィ匕した以外の基板表 面の活性エステルの不活性ィ匕処理をアルカリィ匕合物、あるいは一級アミノ基を有する 化合物で行う。
[0146] アルカリィ匕合物としては、水酸化ナトリウム、水酸ィ匕カリウム、炭酸ナトリウム、炭酸水 素ナトリウム、リン酸水素ニナトリウム、水酸ィ匕カルシウム、水酸化マグネシウム、ホウ 酸ナトリウム、水酸化リチウム、リン酸カリウムなどを用いることができる。
[0147] 一級アミノ基を有する化合物としては、グリシン、 9 アミノアクアジン、アミノブタノ一 ル、 4ーァミノ酪酸、アミノカプリル酸、アミノエタノール、 5—ァミノ 2, 3—ジヒドロー 1, 4 ペンタノール、アミノエタンチオール塩酸塩、アミノエタンチオール硫酸、 2—（2—アミ ノエチルァミノ）エタノール、リン酸二水素 2 アミノエチル、硫酸水素アミノエチル、 4 (2—アミノエチル）モルホリン、 5-ァミノフルォレセイン、 6—ァミノへキサン酸、ァミノへ キシルセルロース、 p—ァミノ馬尿酸、 2—アミノー 2—ヒドロキシメチルー 1, 3 プロパンジ オール、 5-ァミノイソフタル酸、ァミノメタン、ァミノフエノール、 2—ァミノオクタン、 2-ァ ミノオクタン酸、 1ーァミノ 2 プロパノール、 3 アミノー 1 プロパノール、 3—ァミノプロべ ン、 3—ァミノプロピオ-トリル、アミノビリジン、 11 アミノウンデカン酸、ァミノサリチル 酸、ァミノキノリン、 4ーァミノフタ口-トリル、 3—ァミノフタルイミド、 P-ァミノプロピオフエ ノン、ァミノフエ-ル酢酸、ァミノナフタレンなどを用いることができる。これらのうち、ァ ミノエタノール、グリシンを用いることが好ましい。
[0148] ノィォチップ用基板に固定ィ匕する捕捉物質は、活性エステル基との反応性を高め るため、アミノ基を有することが好ましい。アミノ基は活性エステル基との反応性に優 れるため、アミノ基を有する捕捉物質を用いることにより、効率よくかつ強固にバイオ チップ基板上に捕捉物質を固定ィ匕することができる。ァミノ基の導入位置は分子鎖末 端あるいは側鎖であってもよ 、が、分子鎖末端に導入されて 、ることが好ま 、。 [0149] たとえば、本実施形態および以下の実施形態に記載のバイオチップ用基板上に固 定化する捕捉物質として核酸、アブタマ一を用いる場合、活性エステル基との反応性 を高めるために、アミノ基を導入することが好ましい。 DNAやアブタマ一等の核酸鎖 の場合、分子鎖中にアミノ基を有しているが、さら〖こ、分子鎖末端にアミノ基を導入し てもよい。こうすること〖こより、末端のアミノ基を活性エステル基と反応させて、高分子 物質とさらに確実に共有結合を形成させることができる。また、末端のアミノ基を固定 ィ匕に用いることにより、 DNA相補鎖とのハイブリダィゼーシヨンやタンパクとの相互の 反応をより一層効率よく行うことができる。
[0150] また、捕捉物質として、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク 質を用いる場合にも、必要に応じてアミノ基を導入することが好ま 、。
[0151] 以上により、基板上に捕捉物質が固定ィ匕されたバイオチップが得られる。このバイ ォチップは、生理活性物質の検出、定量等に用いることができる。また、試験液中に 含まれる生理活性物質の特定にも利用可能である。以下、バイオチップを用いた生 理活性物質の検出につ!、て説明する。
[0152] (生理活性物質の検出）
ノィォチップを用いた生理活性物質の検出方法に特に制限はな 、が、たとえば蛍 光物質を用いて行うことができる。こうすることにより、検出感度を向上させることがで きる。
[0153] また、バイオチップ上に活性エステル基を不活性ィ匕しな 、で用いる場合や、活性ェ ステル基が基板上に残存している可能性が有る場合には、検出対象の生理活性物 質を溶解または分散した液体が中性力も酸性とすることができる。こうすることにより、 高分子物質と生理活性物質との非特異的な反応や吸着をより一層確実に抑制する ことができる。
[0154] このような条件として、具体的には、液体の PHは 8. 0以下、好ましくは 7. 6以下と することができる。また、さらに具体的には、たとえば PH7. 0とすることができる。 pH が高すぎると、活性エステル基と生理活性物質のアミノ基とが反応を起こし、捕捉分 子を点着した以外の部分に、検出する生理活性物質が共有結合により固定化されや すくなる。 [0155] 本実施形態によれば、バイオチップ用基板の表面に吸着防止剤をコーティングす ることなく検出対象物質の非特異的な吸着または結合を抑制するとともに、生理活性 物質を捕捉する捕捉分子を共有結合により確実に固定ィ匕することができるため、検 出感度や検出精度を向上させることができる。
[0156] 本実施形態のバイオチップは、たとえば生体試料中の多数のタンパク質、核酸等 の並列検出および分析に用いられる。より詳細には、たとえばプロテオミクスや遺伝 子活性の細胞内タンパク質レベルでの測定等に用いられる。
[0157] なお、本実施形態で用いた各部材は、以下の実施形態においても用いることがで きる。
[0158] 以下の実施形態においては、第 1の実施形態と異なる部分を中心に説明する。
[0159] (第 2の実施形態）
本実施形態では、第 1の実施形態において、バイオチップ用基板への捕捉物質の 固定ィ匕および生理活性物質の検出を、以下の条件で行う。
[0160] (捕捉物質の固定化）
本実施形態においても、第 1の実施形態の場合と同様に、捕捉物質をバイオチップ 基板上に固定化する際に、捕捉物質を溶解または分散させた液体を点着する方法 を用いることができる。
[0161] また、本実施形態においては、捕捉物質の固定ィ匕反応を中性またはアルカリ性の 条件で行う。たとえば、点着に用いる捕捉物質を溶解または分散した液体を中性また はアルカリ性とする。こうすること〖こより、捕捉物質と高分子物質の第二単位中の活性 エステル基とをさらに確実に反応させ、共有結合を形成させることができる。こうした 条件として、たとえば PH7. 0以上、好ましくは pH7. 6以上とすることができる。さらに 具体的には、 pHを 8. 0とすることができる。 pHが低すぎる条件では、活性エステル 基と捕捉物質とが反応を起こしにくぐ捕捉物質を固定ィ匕することが困難となる懸念 がある。
[0162] また、捕捉物質を含む液体の pHの下限は、捕捉物質の種類や高分子物質の材料 に応じて適宜選択される力 たとえば pHIO以下とすることができる。
[0163] なお、本実施形態においても、点着後、固定化されな力 た生理活性物質を除去 するため、純水や緩衝液で洗浄することが好ま Uヽ。
[0164] また、本実施形態においては、捕捉物質の固定化後、生理活性物質を捕捉させる 際に、生理活性物質を含む酸性または中性の液体、たとえば溶液を基板上の高分 子物質に接触させることもできる。生理活性物質を含む液体は、中性または酸性、具 体的には第 1の実施形態にて前述した pH条件とすることができる。こうすることにより 、生理活性物質の非特異的吸着を抑制しつつ、捕捉物質にさらに安定的に相互作 用させることができる。
[0165] なお、本実施形態にぉ 、て、バイオチップ用基板およびバイオチップの構成として
、第 1の実施形態に記載の構成を用いることができる。
[0166] たとえば、本実施形態のバイオチップの構成は、下記 (i)から (X)に示す構成とする ことができる。
(i)ホスホリルコリン基および活性エステル基を有する高分子層を表面に有する基板 に、該活性エステル基を介して、生理活性物質を捕捉する分子が基板表面に固定 化される構成、
(ii)ホスホリルコリン基が 2—メタタリロイルォキシェチルホスホリルコリン基中に含まれ る構成、
(iii)活性エステル基力 ¾ ニトロフ -ル基である構成、
(iv)高分子物質がブチルメタタリレート基を含む共重合体である構成、
(V)基板がプラスチック製である構成、
(vi)プラスチックが飽和環状ポリオレフインある構成、
(vii)基板がガラス製である構成。
(viii)捕捉物質が核酸、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質の内、少なく とも一つである構成、
(ix)バイオチップにさらに生理活性物質が捕捉された構成、
(X)生理活性物質が核酸、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質の内、少 なくとも一つである構成。
[0167] 本実施形態によれば、タンパク質、核酸等の検出および分析に用いられる際に、吸 着防止剤をコーティングすることなぐ検出対象物質の非特異的な吸着または結合が 抑制され、検出精度や検出感度が高いバイオチップが得られる。
[0168] (第 3の実施形態）
本実施形態においては、第 1の実施形態に記載のバイオチップ用基板を用 、て、 第 2の実施形態に記載の条件で捕捉物質の固定化を行う。捕捉物質の固定化の条 件は、第 2の実施形態に記載の条件とすることができる。
[0169] また、本実施形態では、捕捉物質の固定化後、基板上の高分子物質に、検出対象 の生理活性物質を含む液体を接触させ、捕捉物質に生理活性物質を捕捉させる。こ のとき、生理活性物質を含む液体の pHを、捕捉物質を含む液体の pH以下の pH、 好ましくは捕捉物質を含む液体の pHより低 、pHとする。
[0170] このようにすれば、生理活性物質と活性エステル基との反応をさらに確実に抑制す ることがでさる。
[0171] 具体的には、バイオチップ用基板への捕捉物質の固定ィ匕および生理活性物質の 検出を、下記（1) (2)の手順で行うことができる。
(1) ρΗ7. 6以上で捕捉物質を固定するステップ、および
(2)検出する生理活性物質を含む pH7. 6以下の溶液を基板表面に接触させ、捕捉 物質に生理活性物質を捕捉させるステップ。
[0172] 本実施形態によれば、生理活性物質を含む液体の pHを制御することにより、吸着 防止剤をコーティングすることなぐ検出対象物質の非特異的な吸着または結合を抑 制し、検出精度や検出感度の高いバイオチップを得ることができる。また、マイクロチ ップ用基板としてマイクロアレイ用基板を用いれば、検出感度に優れたマイクロアレイ が得られる。
[0173] なお、本実施形態にぉ 、て、バイオチップ用基板およびバイオチップの構成として 、第 1の実施形態または他の実施形態に記載の構成を用いることができる。
[0174] (第 4の実施形態）
本実施形態のバイオチップ用基板は、基板表面に、アミノ基を有する化合物を含む 第一の層と、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導体とを含む第二単 位とを有する高分子物質を含む第二の層と、を有する。基板、第一の層および第二 の層がこの順に積層されている。 [0175] 基板としては、たとえば第 1の実施形態に記載の材料または形状のものを用いるこ とができる。たとえば、飽和環状ポリオレフイン等のプラスチック製の基板やガラス製 の基板とすることができる。
[0176] 第一の層は、アミノ基を有する化合物を含む。第一の層は、第二の層を基板上に固 定化し、その剥離を抑制する接着層として機能する。第一の層は、たとえば、アミノ基 を有するシランカップリング剤等のアミノシランを含むことができる。こうすれば、基板 表面に第一の層をさらに安定的に設け、基板表面を第一の層でさらに確実に被覆す ることができる。なお、アミノ基を有するシランカップリング剤は、オルガノシロキサンや ポリオルガノシロキサン等の形態で存在して 、てもよ 、。
[0177] 第一の層の厚さは、たとえば 1 A (0. lnm)以上とすることができる。こうすることによ り、基板表面を確実に被覆し、第二の層の基板表面力 の剥離をさらに確実に抑制 することができる。また、第一の層の厚さの上限に特に制限はないが、たとえば 100 A (10nm)以下とすることができる。
[0178] 第二の層は、基板上を被覆して生理活性物質の検出等に適した表面状態を提供 する機能を有する。第二の層を構成する高分子物質は、生理活性物質の非特異的 吸着を抑制する性質と生理活性物質を固定ィ匕する性質とを併せ持つポリマーである 。高分子物質中のホスホリルコリン基は生理活性物質の非特異的吸着を抑制する役 割を果たす。また、高分子物質中のカルボン酸誘導基は、第一の層中の化合物のァ ミノ基と反応する役割および捕捉物質を固定化する役割を果たす。
[0179] 高分子物質として、たとえば第 1の実施形態に記載の構成を適用することができる。
また、高分子物質中のホスホリルコリン基を含む基およびカルボン酸誘導基は、たと えば第 1の実施形態に例示した基とすることができる。たとえば、高分子物質の第一 単位が 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン基を有する構成とすることができ る。また、高分子物質の第二単位が p—二トロフエ二ル基を有する構成とすることがで きる。さらに、第 1の実施形態と同様に、本実施形態においても、高分子物質がプチ ルメタタリレート基を含む第三単位を有していてもよい。以下、活性化されたカルボン 酸誘導体が活性エステル基である場合を例に説明する。
[0180] 第二の層の厚さは、たとえば 5nm以上とすることができる。こうすることにより、第一 の層の設けられた基板表面を確実に被覆し、生理活性物質等の非特異的吸着をさ らに確実に抑制することができる。また、第二の層の厚さの上限に特に制限はないが
、たとえば lOOnm以下とすることができる。
[0181] なお、基板と第一の層との間および第一の層と第二の層との間には、介在層が存 在していてもしていなくてもよい。第一の層が基板に接して設けられ、第二の層が第 一の層に接して設けられた構成とし、実質的に介在層が存在しない積層形態とする ことにより、バイオチップの製造過程または使用過程における基板からの高分子物質 の剥離より一層確実に抑制することができる。
[0182] また、第一の層のアミノ基と、第二の層中の一部の活性エステル基とが反応して共 有結合、具体的にはアミド結合が形成された構成とすることができる。こうすることによ り、基板上に第二の層をより一層確実に固定し、その剥離を抑制することができる。ま た、残りの活性エステル基を用いて、生理活性物質を捕捉する捕捉物質をバイオチ ップ用基板上に化学的に固定ィ匕し、バイオチップを得ることができる。
[0183] 次に、本実施形態に係るバイオチップ用基板の製造方法を説明する。本実施形態 のバイオチップ用基板の製造方法は、基板上に第一の層を設ける工程と、第一の層 上に第二の層を設ける工程とを含むことができる。基板に接して第一の層が設けられ 、第一の層に接して第二の層が設けられる構成の場合、バイオチップ用基板の製造 工程は、たとえば下記（1)および（2)の工程を含むことができる。
(1)基板の表面とアミノ基を有する化合物との接触工程、および
(2)アミノ基を有する化合物と高分子物質との接触工程。
[0184] まず、上記（1)の工程について説明する。（1)の工程により、基板上に第一の層が 形成される。
[0185] 基板表面へのアミノ基を有する化合物を含む第一の層の導入には、アミノアルキル シラン処理、窒素雰囲気下でのプラズマ処理、アミノ基含有高分子物質のコーティン グなどの方法を用いることができる。このうち、アミノアルキルシラン処理は、簡便性お よび均一性の観点力 好ましく用いられる。
[0186] アミノアルキルシラン処理は、たとえばアミノアルキルシラン (カップリング剤）溶液へ の基板の浸漬および熱処理によることができる。アミノアルキルシラン溶液の濃度は、 たとえば、 0. 1重量％以上 10重量％以下、好ましくは、 0. 1重量％以上 5重量％以 下、さらに好ましくは 1重量％以上 5重量％以下とすることができる。アミノアルキルシ ラン濃度を 0. 1重量％以上、好ましくは 1重量％以上とすることにより、基板の表面に より一層確実にアミノ基を有する化合物を層状に形成することができる。また、アミノア ルキルシラン濃度を 10重量％以下、好ましくは 5重量％以下、さらに好ましくは 1重量 %以下とすることにより、アミノアルキルシランィ匕合物を基板状に一様に分散させるこ とができる。このため、第一の層の膜厚のばらつきを抑制することができる。
[0187] 次に、上記（2)の工程について説明する。（2)の工程により、第一の層上に第二の 層が形成される。
[0188] 第一の層の上部に、ホスホリルコリン基を含む第一単位と活性エステル基を含む第 二単位とを有する高分子物質を含む第二の層を形成する際には、たとえばホスホリ ルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質の溶液に基板を浸漬する方法を 用いることができる。ホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質の濃 度はたとえば 0. 05重量％以上 5. 0重量％以下、好ましくは 0. 1重量％以上 1. 0重 量％以下とすることができる。
[0189] 高分子物質の濃度を 0. 05重量％以上、好ましくは 0. 1重量％以上とすることによ り、第一の層を被覆する第二の層を確実に設けることができる。また、高分子物質の 濃度を 5. 0重量％以下、好ましくは 1. 0重量％以下とすることにより、第一の層上に 一様に第二の層を形成し、第二の層の膜厚のばらつきを抑制することができる。
[0190] 本実施形態によれば、吸着防止剤をコーティングすることなぐ検出対象物質の非 特異的な吸着または結合を抑制し、かつ界面活性剤による洗浄によっても膜剥がれ しな 、検出精度または検出感度の高 、バイオチップ用基板が得られる。
[0191] 本実施形態のバイオチップ用基板を使用して各種の捕捉物質を固定ィ匕し、バイオ チップを得ることができる。また、バイオチップを用いて生理活性物質の検出等を行う ことができる。
[0192] なお、本実施形態においても、捕捉物質および生理活性物質としては、たとえば第 1の実施形態に記載の物質を用いることができる。また、本実施形態において、バイ ォチップ用基板およびバイオチップの構成として、第 1の実施形態または前述した他 の実施形態に記載の構成を用いることができる。
[0193] (第 5の実施形態）
本実施形態では、以上の実施形態に記載の記載のバイオチップ用基板を用いた バイオチップに関する。本実施形態のバイオチップは、基板の表面にホスホリルコリ ン基と複数のカルボン酸誘導基とを有する高分子物質を有するバイオチップ用基板 の、一部の前記カルボン酸誘導基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して 共有結合を形成しており、残りの前記カルボン酸誘導基と親水性基を有する親水性 ポリマーとが反応して共有結合を形成して!/、る構成である。共有結合による高分子物 質への親水性ポリマーの導入により、バイオチップ表面の高分子物質へのタンパク 質の非特異的吸着をさらに低減できる。
[0194] ノィォチップ用基板としては、本明細書の他の実施形態に記載のバイオチップ用 基板のいずれかの構成を用いることができる。以下、第 1の実施形態に記載のバイオ チップ用基板を用いる場合を例に説明する。ノィォチップ用基板の高分子物質は、 たとえば、第一単位が 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン基を含み、第二 単位が活性ィ匕カルボン酸誘導基の一態様である活性エステル基として p—-トロフエ -ル基を有する構成とすることができる。また、上記一般式 (2)に示した高分子物質 を用いてもよい。
[0195] また、本実施形態のバイオチップは、バイオチップ用基板の高分子物質中に含ま れる複数の活性エステル基のうち、一部の活性エステル基を捕捉物質と反応させて 、捕捉物質と共有結合を形成させる捕捉物質の固定化工程と、捕捉物質の固定ィ匕 工程の後、残りの活性エステル基を親水性ポリマーと反応させて、親水性ポリマーと 共有結合させる工程を含むことができる。
[0196] (捕捉物質の固定化）
ノィォチップ基板への捕捉物質の固定ィ匕は、以上の実施形態に記載の方法により 、たとえば第 2の実施形態に記載の方法により、行うことができる。具体的には、本実 施形態においても、上述した実施形態と同様に、捕捉物質をバイオチップ基板上に 固定ィ匕する際には、生理活性物質を溶解または分散した液体を点着する方法を用 いることができる。捕捉物質を溶解または分散した液体の pHは、中性またはアルカリ 性、好ましくは 7.6以上とすることができる。また、点着後、固定化されな力つた捕捉物 質を除去するため、純水や緩衝液で洗浄することができる。
[0197] 本実施形態では、捕捉物質の固定化後および洗浄後、さらに、捕捉物質を点着し た以外の基板表面部分、つまり基板上に残存して！/ヽる活性エステル基を親水性ポリ マー化する。以下、高分子物質への親水性ポリマーの導入について説明する。
[0198] (親水性基を有するポリマーの導入）
本発明では、さらに生理活性物質を固定ィ匕した以外の基板表面の活性エステル基 とを親水性ポリマーとを反応させて、高分子物質を親水性ポリマー化する。
[0199] 親水性ポリマーは、親水基を有するポリマーであり、たとえばポリアルキレンォキシド または複数種類のポリアルキレンォキシドを構造中に含むことができる。ポリアルキレ ンォキシドとして、たとえば、ポリエチレングリコール、ポリプロピレングリコール、これら の共重合体、およびこれらの少なくとも一つと他のポリアルキレンォキシドとの共重合 体の 、ずれかを構造中に含むことができる。
[0200] また、親水性ポリマーは、活性エステル基との反応性を高めるために末端がァミノ 化されて!/ヽることが好まし ヽ。末端にァミノ基が導入された親水性ポリマーとしては、 具体的にはサン テクノケミカル株式会社製のジェファーミン Mシリーズ (XTJ— 505、 XTJ— 6506、 XTJ— 507、 M— 2070、 XTJ— 234)等力挙げられる。
[0201] 活性エステル基への親水性ポリマーの導入には、親水性ポリマーの溶液等の液体 に生理活性物質が固定化された基板を浸漬する方法が好ましい。親水性ポリマーを 含む液体中の親水性ポリマーの濃度は、たとえば 0. 1重量％以上とすることができる
。こうすることにより、高分子物質に確実に親水性ポリマーを導入することができる。ま た、親水性ポリマーの濃度は、たとえば 100重量％以下とすることができる。溶液の 粘度が高いポリマーを使用する場合は希釈して使用することが好ましい。こうすること により、高分子物質に安定的に親水性ポリマーを導入することができる。
[0202] 本実施形態に係るバイオチップは、親水性ポリマーの導入により残存する活性エス テル基が脱離した構成であるため、吸着防止剤をコーティングすることなぐ検出対 象物質の非特異的な吸着または結合を抑制し、検出感度をより一層確実に向上させ ることがでさる。 [0203] なお、本実施形態にぉ 、て、バイオチップ用基板およびバイオチップの構成として 、第 1の実施形態または前述した他の実施形態に記載の構成を用いることができる。
[0204] (第 6の実施形態）
第 1の実施形態に記載のバイオチップ用基板および以上の他の実施形態に記載 のバイオチップ用基板において、高分子物質の第二単位に含まれるカルボン酸誘導 基を活性エステル基とする場合、活性エステル基が N—ヒドロキシスクシンイミド基であ つてもよい。
[0205] たとえば、バイオチップ用基板に一次抗体等の生理活性を有する捕捉物質が固定 ィ匕されたバイオチップとして、捕捉物質の固定ィ匕法においては、物理的吸着による固 定化法、化学反応による固定ィ匕法などが用いられる。
[0206] 化学的固定ィ匕法においては、活性エステルを用いて生理活性物質のァミノ基と反 応させることにより固定ィ匕する方法が知られている。しかしながら活性エステル基はそ のエステルの種類によりアミノ基との反応性が大きく変化する。
[0207] 例えば p—二トロフエ-ルエステルなどは比較的高 、pH側での反応性に優れる。こ のため、生理活性を有する捕捉物質の種類によっては、高い pHによる捕捉物質の 変性、分解などが原因となり充分なシグナル強度が得られな 、懸念があった。
[0208] このような場合、活性エステル基を N—ヒドロキシスクシンイミド基とすることにより、よ り低い pH、たとえば pH7. 4以上 9. 0以下にて捕捉物質を固定ィ匕することができる。 このため、高 pHにおける安定性の低い捕捉物質の場合においても、生理活性を保 持した状態で高分子物質に安定的に固定ィ匕することができる。
[0209] なお、本実施形態のバイオチップ用基板の基本構成は、高分子物質中の第二単 位が N—ヒドロキシスクシンイミド基を有することを除くほか、第 1の実施形態に記載の ノィォチップ用基板と同様とすることができる。
[0210] たとえば、基板の表面に高分子物質を有するバイオチップ用基板において、第一 単位と第二単位のさらに具体的な構成の組み合わせとして、たとえば、ホスホリルコリ ン基を含む第一単位が 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン基を有し、活性 エステル基が N—ヒドロキシスクシンイミド基である構成とすることができる。
[0211] 本実施形態によれば、基板上に吸着防止剤をコーティングすることなぐ検出対象 物質の非特異的な吸着または結合を抑制することができるので、シグナル強度を向 上させることができる。
[0212] なお、本実施形態にぉ 、て、バイオチップ用基板およびバイオチップの構成として 、第 1の実施形態または前述した他の実施形態に記載の構成を用いることができる。
[0213] (第 7の実施形態）
以上の実施形態に記載のバイオチップ用基板において、高分子物質中の第一単 位にホスホリルコリン基の割合、または高分子物質の第二単位に含まれる活性ィ匕カ ルボン酸誘導基の割合を、以下のよう〖こすることもできる。以下、活性化カルボン酸 誘導基が活性エステル基である場合を例に説明する。
[0214] 本実施形態において、バイオチップ用基板およびバイオチップの構成部材としては 、第 1の実施形態または前述した他の実施形態に記載のものを用いることができる。
[0215] 本実施形態において、基板上の高分子物質が、下記 (a)成分からなる構成とするこ とがでさる。
(a)ホスホリルコリン基を含む第一単位と活性エステル基を有する第二単位とを必須 成分とし、ブチルメタタリレート基を有する第三単位を任意成分とする高分子
[0216] この場合、高分子物質中に含まれるホスホリルコリン基の、ホスホリルコリン基と活性 エステル基とブチルメタタリレート基との合計に対する割合を、たとえば 3モル％以上 、好ましくは 25%以上とすることができる。ホスホリルコリン基の割合が小さすぎると、 チップとして用いたときに、生理活性物質の非特異的吸着を起こすようになり、ノ ック グランドが高くなる懸念がある。
[0217] また、基板上の高分子物質に含まれるホスホリルコリン基の、ホスホリルコリン基と活 性エステル基とブチルメタタリレート基との合計に対する割合を、たとえば 40モル％ 以下、好ましくは 40モル％未満、さらに好ましくは 35モル％以下、さらにまた好ましく は 35モル％未満とすることができる。ホスホリルコリン基の割合が大きすぎると、混合 ポリマーの水溶性が高くなるため表面層が剥離してしまう懸念がある。
[0218] また、高分子物質に含まれる活性エステル基の、ホスホリルコリン基と活性エステル 基との合計に対する割合を、たとえば 1モル％以上 25モル％以下とすることができる 。活性エステル基の割合が小さすぎると、生理活性物質の固定化量が低下し充分な シグナルが得られない懸念がある。また、活性エステル基の割合が大きすぎると、最 表面に存在する活性エステル基量が飽和してしま 、シグナル強度が向上しな 、懸念 がある。
[0219] さらに具体的には、高分子物質に含まれる活性エステル基の、ホスホリルコリン基と 活性エステル基との合計に対する割合を、たとえば 15モル％以上 25モル％未満と することができる。また、生理活性物質の検出反応におけるノ ックグランドをより一層 確実に低下させる観点では、高分子物質に含まれる活性エステル基の、ホスホリルコ リン基と活性エステル基との合計に対する割合を、 1モル％以上 8%以下とすることが さらに好ましい。 1モル％以上 8%以下とすることにより、検出感度をさらに向上させる ことができる。
[0220] また、高分子物質が上記 (a)成分および下記 (b)成分からなる以下の構成とするこ とちでさる。
(b)ホスホリルコリン基を含む第一単位とブチルメタタリレート基を含む第三単位とを 有する高分子
[0221] なお、上記 (a)の第一単位と上記 (b)の第一単位とは同一構造であってもよいし、 異なる構造であってもよい。また、上記 (a)がブチルメタタリレート基を含む第三単位 を含むとき、（a)の第三単位と上記 (b)の第三単位とは同一構造であってもよいし、異 なる構造であってもよい。
[0222] (b)成分は、生理活性物質の非特異的吸着を抑制するポリマーとして用いられる。
このようなポリマーとしては、たとえばホスホリルコリン基が 30モル0 /0、ブチルメタクリレ ート基が 70モル0 /0の割合で含まれて 、るものである MPCポリマー（日本油脂社製） を用いることができる。
[0223] なお、高分子物質が上記 (a)、 (b)成分からなる場合、 (a)、 (b)成分が混合されて いる構成とすることができる。上記 (a)成分および (b)成分のポリマーは、たとえばェ タノール溶液に溶解できるため、それぞれのポリマー溶液を混合することにより容易 に混合ポリマーを得ることができる。
[0224] 上記（a)、 (b)成分力もなる混合ポリマーに含まれるホスホリルコリン基の、ホスホリ ルコリン基と活性エステル基とブチルメタタリレート基との合計に対する割合は、たとえ ば 3モル％以上、好ましくは 25モル％以上とすることができる。混合ポリマーにおいて も、ホスホリルコリン基の割合が小さすぎると、生理活性物質の非特異的吸着を起こ すようになり、バックグランドが高くなる懸念がある。
[0225] また、上記（a)、 (b)成分力 なる混合ポリマーに含まれるホスホリルコリン基の、ホ スホリルコリン基と活性エステル基とブチルメタタリレート基との合計に対する割合は、 たとえば、 40モル％以下、好ましくは 40モル％未満、さらに好ましくは 35モル％以下 、さらにまた好ましくは 35モル％未満とすることができる。混合ポリマーにおいても、ホ スホリルコリン基の割合が大きすぎると、混合ポリマーの水溶性が高くなるため表面層 が剥離してしまう懸念がある。
[0226] また、上記 (a)、 (b)成分カゝらなる混合ポリマーに含まれる活性エステル基の、ホスホ リルコリン基と活性エステル基とブチルメタタリレート基との合計に対する割合を、たと えば 1モル％以上 25モル％以下することができる。混合ポリマーの場合にも、活性ェ ステル基の割合が小さすぎると、生理活性物質の固定ィ匕量が低下し十分なシグナル が得られない懸念がある。また、活性エステル基の割合が大きすぎると、最表面に存 在する活性エステル基量が飽和してしま 、シグナル強度が向上しな 、懸念がある。
[0227] さらに具体的には、（a)、 （b)成分力もなる混合ポリマーに含まれる活性エステル基 の、ホスホリルコリン基と活性エステル基との合計に対する割合を、たとえば 15モル %以上 25モル％未満とすることができる。また、生理活性物質の検出反応における ノ ックグランドをより一層確実に低下させる観点では、（a)、 （b)成分力もなる混合ポリ マーに含まれる活性エステル基の、ホスホリルコリン基と活性エステル基との合計に対 する割合を、 1モル％以上 8%以下とすることがさらに好ましい。 1モル％以上 8%以 下とすることにより、検出感度をさらに向上させることができる。
[0228] なお、本実施形態にぉ 、ても、活性エステル基としては、たとえば p—二トロフエニル 基、 N-ヒドロキシスクシンイミド基等を用いることができる。
[0229] 本実施形態のバイオチップ用基板に捕捉物質を用いると、検出感度に優れたバイ ォチップを得ることができる。バイオチップ用基板を用いたバイオチップの作製には、 以上の実施形態に記載の方法を用いることができる。
[0230] たとえば、本実施形態においても、捕捉物質をバイオチップ基板上に固定化する 際には、生理活性物質を溶解または分散した液体を点着する方法を用いることがで きる。また、捕捉物質を溶解または分散した液体の pHは 7. 6以上とすることができる 。また、点着後、固定化されな力 た物質を除去するため、純水や緩衝液で洗浄す ることができる。また、洗浄後は生理活性物質を点着した以外の部分を親水性ポリマ ーィ匕してちょい。
[0231] 本実施形態によれば、吸着防止剤をコーティングすることなぐ検出対象物質の非 特異的な吸着または結合が抑制され、検出精度または検出感度の高いバイオチップ を得ることができる。
[0232] (第 8の実施形態）
本実施形態は、以上の実施形態に記載のノィォチップ用基板を有するマイクロア レイ用基板に関する。このマイクロアレイ用基板は、基板表面にホスホリルコリン基を 含む第一単位と活性エステル基を含む第二単位とを有する高分子物質を有する。
[0233] 本実施形態にぉ ヽて、マイクロアレイ用基板の構成部材、材料、および製造方法と しては、以上の実施形態に記載のものを用いることができる。
[0234] 本実施形態のマイクロアレイ用基板は、自己蛍光を低減化、蛍光色素の吸着を低 減した構成である。このため、検体の情報シグナルを蛍光としてさらに高感度で検出 することができる。このマイクロアレイ用基板は、基板の表面に生理活性物質を捕捉 する捕捉物質を固定化し、蛍光色素を用いて生理活性物質を検出するためのマイク ロアレイ用基板として好適に用いられる。
[0235] また、本実施形態のマイクロアレイ用基板を用いると、たとえば蛍光色素を用いて生 理活性物質を検出するマイクロアレイに好適に用いられるマイクロアレイが得られる。 たとえば、マイクロアレイ用基板に、核酸、アブタマ一、タンパク質、酵素、抗体、オリ ゴペプチド、糖鎖、および糖タンパク質のうち、少なくとも一つの捕捉物質を固定ィ匕す ることにより、マイクロアレイが得られる。なお、本明細書において、マイクロアレイは、 DNAマイクロアレイには限られず、基板上に生理活性を有する所定の捕捉物質を集 積化した (チップィ匕した)素子のことを 、う。
[0236] なお、本実施形態において、マイクロアレイ用基板およびマイクロアレイの構成に、 第 1の実施形態または前述した他の実施形態に記載のマイクロチップ用基板および マイクロチップの構成を適用することができる。
[0237] たとえば、本実施形態のバイオチップの構成は、下記 (i)から (vi)に示す構成とす ることがでさる。
(i)ホスホリルコリン基が 2—メタタリロイルォキシェチルホスホリルコリン基であるマイク ロアレイ用基板、
(ii)活性エステル基力 ¾ -トロフエ-ル基または N—ヒドロキシスクシンイミド基である マイクロアレイ用基板、
(iii)高分子物質がブチルメタタリレート基を含む共重合体であるマイクロアレイ用基 板。
(iv)基板がプラスチック製であるマイクロアレイ用基板、
(V)プラスチックが飽和環状ポリオレフインであるマイクロアレイ用基板、
(vi)基板がガラス製であるマイクロアレイ用基板。
[0238] (第 9の実施形態）
本実施形態は、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二 単位とを有する高分子物質が基板上に設けられたマイクロチップ用基板の別の構成 に関する。本実施形態のマイクロチップ用基板は、基板と、基板上に設けられ、オル ガノシロキサンを含む第一の層と、第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を有す る単量体とカルボン酸誘導基を有する単量体との共重合体を含む第二の層と、を有 する。基板、第一の層および第二の層がこの順に積層された層が設けられている。 以下、カルボン酸誘導基が活性エステル基である場合を例に説明する。
[0239] この構成にぉ 、て、第一の層を構成するオルガノシロキサンは、重合性二重結合を 有する基を有する化合物とすることができる。重合性二重結合を有する基がアルケニ ル基 (ォレフイン基)を構成していてもよい。また、重合性二重結合を有する基の少な くとも一部がアタリレート基、メタタリレート基、またはビュル基を構成していてもよい。 第一の層は、アタリレート基、メタタリレート基、ビニル基、または他のアルケニル基か ら選ばれる少なくとも 1つの基を有する化合物を有することができる。
[0240] 基板の構成としては、以上の実施形態に記載の基板を用いることができる。
[0241] 第一の層は、重層される第二の層が単量体のラジカル重合、光重合、またはラジカ ルイオン重合等の重合により形成される際に、第二の層中の単量体と反応し、共有 結合により第二の層を基板上に固定ィ匕する層である。
[0242] 第一の層の厚さは、たとえば 1 A (0. lnm)以上とすることができる。こうすることによ り、基板表面を確実に被覆し、第二の層の基板表面力 の剥離をさらに確実に抑制 することができる。また、第一の層の厚さの上限に特に制限はないが、たとえば 100 A (10nm)以下とすることができる。
[0243] 第二の層は、基板上を被覆して生理活性物質の検出等に適した表面状態を提供 する機能を有する。第二の層は、生理活性物質の非特異的吸着を抑制する性質と 捕捉物質を固定ィ匕する性質とを併せ持つ。第二の層中の共重合体中のホスホリルコ リン基は生理活性物質の非特異的吸着を抑制する役割を果たし、共重合体中の活 性エステル基は生理活性物質を固定ィ匕する役割を果たす。
[0244] 第二の層の厚さは、たとえば 5nm以上とすることができる。こうすることにより、第一 の層の設けられた基板表面を確実に被覆し、生理活性物質等の非特異的吸着をさ らに確実に抑制することができる。また、第二の層の厚さの上限に特に制限はないが 、たとえば lOOnm以下とすることができる。
[0245] なお、基板と第一の層との間および第一の層と第二の層との間には、介在層が存 在していてもしていなくてもよい。第一の層が基板に接して設けられ、第二の層が第 一の層に接して設けられた構成とし、実質的に介在層が存在しない積層形態とする ことにより、バイオチップの製造過程または使用過程における基板からの高分子物質 の剥離より一層確実に抑制することができる。また、このとき、第一の層中のオルガノ シロキサンが重合性二重結合を有する基を有し、重合性二重結合を有する基と前記 共重合体とが反応して、共有結合が形成された構成とすることができる。
[0246] また、本実施形態において、第一の層が、アタリレート基、メタタリレート基、ビュル 基、または他のアルケニル基力 選ばれる少なくとも 1つの基を有する化合物のみか ら形成され、第二の層が共重合体のみ力も形成されていてもよい。また、基板の表面 に第一の層が設けられ、第一の層の表面に第二の層が設けられた構成としてもよい
[0247] 次に、本実施形態のバイオチップ用基板の製造方法を説明する。このバイオチップ 用基板は、基板表面に、第一の層を形成した後、第一の層上でホスホリルコリン基を 有する単量体と活性エステル基を有する単量体とを共重合することにより第二の層を 形成することにより得られる。
[0248] 基板表面の第一の層の形成に使用するオルガノシロキサンとしては、重合性二重 結合を有するシランカップリング剤を用いることができる。なお、シランカップリング剤 は、基板上にオルガノシロキサンの状態で存在していてもよい。また、オルガノシロキ サンは、アタリレート基、メタタリレート基、ビュル基、またはその他のォレフィン基から 選ばれる少なくとも 1つの基を有するシランカップリング剤であることが好ま 、。
[0249] これらのシランカップリング剤としては、（3 アクリルォキシプロピル）トリメトキシシラ ン、メタクリルォキシプロピルトリメトキシシラン、 N-(3-アクリルォキシ 2—ヒドロキシプ 口ピル)— 3—ァミノプロピルトリエトキシシラン、 N- (3-メタクリルォキシ 2—ヒドロキシプロ ピル)一 3—ァミノプロピルトリエトキシシラン、メタクリルォキシプロピルトリエトキシシラン 、メタクリルォキシメチルトリエトキシシラン、メタクリルォキシメチルトリメトキシシラン、 ( 3—アクリルォキシプロピル)メチルジメトキシシラン、メタクリルォキシプロピルメチルジ エトキシシラン、メタクリルォキシプロピルメチルジメトキシシラン、メタクリルォキシプロ ピルジメチルエトキシシラン、メタクリルォキシプロピルジメチルメトキシシラン、ァリルト リメトキシシラン、 3- (N—スチリルメチルー 2—アミノエチルァミノ） プロピルトリメトキシ シラン、ビュルトリァセトキシシラン、ビュルトリエトキシシラン、ビュルトリイソプロペン ォキシシラン、ビニルトリイソプロポキシシラン、ビニルトリメトキシシラン、ビニルトリス（ 2—メトキシェトキシ）シラン、ビュルトリス (メチルェチルケトキシィミノ）シラン、ァリルォ キシゥンデシルトリメトキシシラン、ァリルトリエトキシシラン、ノルボルネ-ルトリエトキシ シラン、 3—ブテュルトリエトキシシラン、 2— (クロロメチル）ァリルトリメトキシシラン、（2— (3—シクロへキセ -ル）ェチル）トリエトキシシラン、（2— (3—シクロへキセ -ル）ェチル )トリメトキシシラン、（3—シクロペンタジェ-ルプロピル）トリエトキシシラン、ドコセ-ル トリエトキシシラン、 7—オタテュルトリメトキシシラン、スチリルェチルトリメトキシシラン、 ビニルトリー t ブトキシシラン、ビニルトリス、（メトキシプロボキシ）シラン、ビニルメチル ジエトキシシラン、ビニルメチルジメトキシシラン、 1, 3—ジビニルテトラァメチルジシラ ザン、ビュルジメチルエトキシシラン、トリビュルメトキシシラン、ビス（トリエトキシシリル )エチレン、ビス（トリメトキシシリルメチル）エチレン、トリエトキシシリル修飾ポリ 1, 2- ブタンジェンなどが挙げられる。
[0250] シランカップリング剤による第一の層の形成は、たとえばシランカップリング剤溶液 を基板に浸漬し熱処理することにより行うことができる。シランカップリング剤溶液の濃 度は、 0. 1重量％以上、好ましくは 1重量％以上とすることができる。こうすることによ り、第一の層をさらに確実に形成することができる。また、シランカップリング剤溶液の 濃度は、たとえば 10重量％以下、好ましくは 5重量％とすることができる。こうすること により、第一の層を基板上により一層安定的に形成することができる。
[0251] 第一の層の上部に、ホスホリルコリン基を有する単量体の重合体、および活性エス テル基を有する単量体の重合体を含む第二の層を導入するには、たとえば、ホスホリ ルコリン基を有する単量体、および活性エステル基を有する単量体の溶液に第一の 層が形成された基板を浸漬し、各単量体を重合することができる。重合は、ラジカル 重合、ラジカルイオン重合、光重合などで行われる。ホスホリルコリン基を有する単量 体、および活性エステル基を有する単量体の溶液には重合開始剤を添加しておくこ とがでさる。
[0252] ホスホリルコリン基を有する単量体としては、たとえば 2—メタクリロイルォキシェチル ホスホリルコリン、 2—メタクリロイルォキシエトキシェチルホスホリルコリン、 6—メタクリロ ィルォキシへキシルホスホリルコリン、 10—メタクリロイルォキシエトキシノニルホスホリ ルコリン、ァリノレホスホリノレコリン、ブテニルホスホリルコリン、へキセニルホスホリルコリ ン、オタテュルホスホリルコリン、デセ-ルホスホリルコリン等を挙げられる力 2—メタク リロイルォキシェチルホスホリルコリンが好まし 、。
[0253] 活性エステル基を有する単量体は、活性エステル基としてたとえば第 1の実施形態 に記載の活性エステル基、さらに具体的には、 p—二トロフエ-ル基、 N—ヒドロキシス クシンイミド基等を有する単量体が好ましぐさらにメタクリル基またはアクリル基を有 するものが好まし 、。特に p—-トロフエ-ルカルポ-ルォキシェチルメタタリレートが 好ましい。
[0254] 以上により得られるノィォチップ用基板は、タンパク質、核酸等の検出および分析 に用いられる際に、吸着防止剤をコーティングすることなぐ検出対象物質の非特異 的な吸着または結合を抑制し、かつ界面活性剤による膜剥がれすることがなぐ検出 精度や検出感度に優れる。また、得られたバイオチップ用基板に各種の捕捉物質を 固定化し、生理活性物質の検出等が可能なノィォチップを得ることができる。
[0255] なお、本実施形態において、捕捉物質および生理活性物質は、たとえば以上の実 施形態に記載の物質とすることができる。また、本実施形態において、バイオチップ 用基板およびバイオチップの構成として、第 1の実施形態または前述した他の実施 形態に記載の構成を用いることができる。
[0256] (第 10の実施形態）
本実施形態は、以上の実施形態に記載のバイオチップ用基板を用いたバイオチッ プに関する。また、本実施形態は、生体試料中のタンパク質、核酸等の分析を、微細 流路を用いて行うバイオチップに関する。
[0257] 本実施形態のバイオチップは、基板および基板に設けられた流路を有する。流路 は、たとえば基板の表面に溝状に設けられていてもよい。このバイオチップは、流路 の表面に、ホスホリルコリン基を含む第一単位と活性エステル基を含む第二単位とを 有する高分子物質を有する。また、活性エステル基と生理活性物質を捕捉する捕捉 物質とが反応して、共有結合を形成している。
[0258] また、バイオチップが、流路を覆う保護部材を有してもよい。こうすれば、流路の内 容物の乾燥ゃ流路外への漏出を抑制することができる。このため、バイオチップを用 いた分析をさらに安定的に行うことができる。保護部材の形状に特に制限はないが、 たとえば板状、シート状、またはフィルム状とすることができる。以下、板状の基板と板 状の保護部材を有する構成を例に、本実施形態のバイオチップにつ 、てさらに詳細 に説明する。
[0259] 図 1は、本実施形態に係るバイオチップの構成を示す平面図である。図 1に示した ノィォチップは、流路基板および蓋基板の二つの板状部材が接合されてなる基板 1 03と、基板 103の接合面に設けられた溝 102と、溝 102の両端に設けられ、溝 102 に連通する貫通孔 101とを有する。図 1では、基板 103を構成する流路基板の表面 に 3つの溝 102が互いに平行に設けられて!/、る。
[0260] 溝 102は、液体を流通可能な微細流路として機能する。また、貫通孔 101は、溝 10 2中への試験液等の液体の導入部として機能する。また、貫通孔 101は外気に接続 しているため、溝 102中の液体を流動させる導気孔としても機能する。
[0261] 基板 103は、溝 102の表面すなわち微細流路表面の一部または全体に、ホスホリ ルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する高分子物 質を有する。基板 103上の高分子物質に、生理活性物質を捕捉する捕捉物質が固 定化されている。カルボン酸誘導基と捕捉物質とが反応して、共有結合を形成してい る。これにより、たとえば、 DNAやタンパク質などの生理活性を有する捕捉物質が基 板上に固定ィ匕されている。
[0262] 高分子物質は、複数のカルボン酸誘導基を有し、複数のカルボン酸誘導基は、捕 捉物質と反応して共有結合を形成している力、または不活ィ匕されている。ここで、力 ルボン酸誘導基が不活性化されて!/、るとは、カルボン酸誘導基を構成する一部の基 (脱離基)が他の基に置換されて、活性を喪失していることをいう。
[0263] 高分子物質は、以上の実施形態に記載の物質とすることができる。高分子物質の 第二単位に含まれるカルボン酸誘導基は、たとえば第 1の実施形態に記載の基とす ることができる。たとえば、カルボン酸誘導基を活性エステル基とすることができる。以 下、カルボン酸誘導基が活性エステル基である場合を例に説明する。また、活性エス テル基は、固定ィ匕の対象となる捕捉物質によって使い分けることができるが、たとえ ば、第 1の実施形態に記載の基、さらに具体的には、 p—二トロフエニル基または N—ヒ ドロキシサクシンイミド基とすることができる。
[0264] 高分子物質は、溝 102の表面に層状に形成されていてもよい。こうすれば、溝 102 の表面への非特異的吸着をさらに確実に抑制することができる。高分子物質からなる 層の厚さに特に制限はないが、たとえば 5nm以上とすることができる。また、溝 102の 表面に膜状の高分子物質が設けられていてもよい。こうすれば、溝 102の表面をさら に安定的に高分子物質の膜で被覆することができる。また、高分子物質は、溝 102 の表面全面に設けられていてもよい。こうすれば、溝 102の表面への非特異的吸着 をより一層確実に抑制することができる。
[0265] 基板 103の素材は、たとえば、以上の実施形態で用いられる基板の素材とすること ができる。具体的には、ガラス、プラスチック、金属その他を用いることができる力 表 面処理の容易性および量産性から、プラスチックが好ましぐ熱可塑性榭脂がより好 ましい。
[0266] また、基板 103を構成する流路基板および蓋基板のうち、少なくとも片方を検出光 に対して透明な榭脂とすることができる。透明な榭脂の材料は、生理活性物質の検 出反応に用いられる検出光の波長に応じて適宜選択されるが、たとえば、飽和環状 ポリオレフイン、 PMMA、ポリスチレン、ポリカーボネイトなどが挙げられる。流路基板 および蓋基板のうちの少なくとも一方を透明とすることにより、送液の状態を容易に確 認することができる。また、流路基板および蓋基板のうちの少なくとも一方について適 当な着色を施すこともできる。こうすることにより、光学的に流路内の反応を観察する 際に、感度を上げる作用も期待できる。
[0267] 図 1に示したバイオチップは、流路中に試験液を流動させて、捕捉物質に捕捉され た試験液中の生理活性物質の検出または定量に用いられる構成とすることができる 。また、試験液中に含まれる成分の特定も可能である。
[0268] 貫通孔 101の径は、蓋基板の厚さや流路の幅等に応じて適宜設計される。また、 流路となる溝 102については、以下の構成とすることができる。ノィォチップ用基板 に捕捉物質が固定化されたバイオチップの流路中で生理活性物質の検出反応を効 率よく行うためには、ある程度の流速が必要である。また、反応に寄与するのは捕捉 物質が固定ィ匕されている流路表面部分である。これらのことから、少ない量のサンプ ル液で効率よく反応させるには、流路の断面積が小さい方が好ましい。
[0269] 流路の延在方向に垂直な断面の幅および深さは、たとえば 20 m以上、好ましく は 50 /z m以上とすることができる。こうすることにより、流路へのサンプル液の流通を 充分に確保することができる。また、サンプル液の流通を制御しやすい構成とすること ができる。また、流路の幅および深さは、たとえば 500 μ m以下、好ましくは 200 μ m 以下とすることができる。こうすることにより、ハイブリダィゼーシヨンなどの生理活性物 の捕捉の状況を蛍光スキャナーなどで行う場合にも、認識のしゃすさを充分に確保 することができる。また、流路の長さは検出物質の種類や試験液の量などに応じて適 宜設計することができる。
[0270] 次に、図 1に示したバイオチップの製造方法について説明する。 まず、微細流路が彫刻された流路基板と蓋となる蓋基板を準備する。流路基板と蓋 基板は、それぞれ、上述した基板および保護部材に対応する。流路基板には、前述 した溝 102および溝 102に連通し流路基板を貫通する貫通孔 101を設けておく。
[0271] 次に、両基板の接合面、すなわち流路を形成する側の面を、ホスホリルコリン基お よび活性エステル基を有する高分子物質でコートする。高分子物質のコートは、たと えば以上の実施形態において、マイクロチップ用基板の作製時に基板上に高分子 物質を付着させる方法により行うことができる。
[0272] そして、流路基板の流路内または蓋基板の流路形成部内もしくはその近傍の所定 の位置に、捕捉物質を溶解または分散させた液体を滴下してある一定時間放置し、 捕捉物質を固定化する。捕捉物質を含む液体を高分子物質上に滴下する方法とし て、たとえば、ビンスポッターによる点着や、インクジェット方式のスポットが挙げられる 。また、捕捉物質を含む液体の pHは、たとえば 2以上 11以下とすることができる。捕 捉物質を含む液体の pHが大きすぎたり小さすぎたりする場合、強酸側または強アル カリ側となるため、生理活性物質の変性が起こる可能性がある。たとえば、捕捉物質 力 Sタンパク質である場合、捕捉物質を含む液体の pHを中性付近とすることができる。
[0273] 捕捉物質の固定の後、洗浄を行い、固定化されなカゝつた余剰の捕捉物質を除去す る。洗浄の後、活性エステル基を不活性化する。不活化処理は、たとえば第 1の実施 形態に記載の条件で行うことができる。具体的には、アルカリィ匕合物、あるいは一級 アミノ基を有する化合物を用いて不活性ィ匕を行うことができる。
[0274] 不活性ィヒの後、流路基板と蓋基板を貼り合わせ、液体が流通できる流路を形成す る。二枚の基板の貼り合わせは、接着剤の塗布による接着や熱溶着により行うことが できる。また、生理活性を有する捕捉物質は一般的に熱に弱いため、熱に弱い捕捉 物質が固定化されて ヽる場合、基板の材料として熱可塑性の榭脂を用いることがで きる。熱可塑性の榭脂を用いることにより、比較的低温での熱溶着が可能である。
[0275] 本実施形態では、ホスホリルコリン基および活性エステル基を有する高分子物質に 捕捉物質を固定ィ匕するため、固定化後、生理活性物質の耐熱性を向上させることが できる。このため、熱可塑性榭脂を用いれば、熱溶着を行っても、固定ィ匕した捕捉物 質の活性を保持することができる。 [0276] なお、捕捉物質および生理活性物質としては、以上の実施形態に記載の物質が挙 げられる。また、本実施形態においても、捕捉物質の構造に応じて、捕捉物質にアミ ノ基を導入してもよい。また、本実施形態において、バイオチップ用基板およびバイ ォチップの構成として、第 1の実施形態または前述した他の実施形態に記載の構成 を用いることができる。
[0277] 次に、本実施形態のバイオチップの使用方法を、捕捉物質として一次抗体がチッ プ上に固定化されている場合を例に説明する。
[0278] ノィォチップを使用する際には、まず、マイクロポンプやマイクロシリンジ等の送液 手段を用いて、一定量のサンプル液を送液する。この工程で抗体に検出目的のタン パクが捕捉される。サンプル液の送液の後、洗浄液を一定量送液し洗浄を行う。
[0279] 次に、分析目的のタンパク質に対する抗体に蛍光物質等の標識を施した二次抗体 を一定量送液し、洗浄を行う。サンプル液中に分析目的のタンパクが存在すれば、 蛍光スキャナ一により蛍光スポットとして認識できる。
[0280] 以上により、抗原抗体反応の効率が高ぐ少ない送液量で充分なタンパクを捕捉す ることができる。また、ブロッキングを施さずともタンパクの吸着が起こらず、少ない洗 浄液の送液量での洗浄が可能で、検出時のノックグランドを充分に低下させることが できる。
[0281] 本実施形態によれば、吸着防止剤をコーティングすることなぐ試験液中の成分、こ こでは検出対象の生理活性物質を含む成分の流路上への非特異的吸着を抑制す ることができる。このため、検出感度を上げることができる。また、検出部を流路状とす ることにより、捕捉物質と生理活性物質との特異的な相互作用の効率をより向上させ ることがでさる。
[0282] 以上、本発明を実施形態に基づいて説明した。この実施形態はあくまで例示であり 、種々の変形例が可能なこと、またそうした変形例も本発明の範囲にあることは当業 者に理解されるところである。
[0283] (実験例）
(実験例 Al、実験例 A2)
実験例 A1および実験例 A2では、第 1の実施形態に記載のバイオチップ用基板お よびバイオチップを作製し、抗体の検出を行った。
[0284] (実験例 A1)
飽和環状ポリオレフイン榭脂（5—メチルー 2ノルボルネンの開環重合体の水素添カロ 物（MFR (Melt flow index)： 21g/10分、水素添加率：実質的に 100%、熱変形温度 123°C) )をスライドガラス形状（寸法： 76mm X 26mm X lmm)に加工して基板を作 製した。基板を 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンーブチルメタクリレートー p -トロフエ-ルカルポ-ルォキシェチルメタタリレート共重合体の 0. 5重量0 /0ェタノ ール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを 有する高分子物質を導入した。
[0285] 次に、該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッタ 一により、表 1に示した希釈倍率で調製された一次抗体である抗マウス IgG2aをスポッ ト後、室温 4°Cの環境下に 24時間静置した。その後、 0. 1規定の水酸ィ匕ナトリウム水 溶液に浸漬することにより活性エステルを失活させた。
[0286] その後、抗原であるマウス IgG2aと抗原抗体反応を実施後、二次抗体であるビォチ ン標識抗マウス IgG2aと抗原抗体反応を実施した。最後に Cy5標識されたストレブトァ ビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行った。結果を表 1に示す。
[0287] (実験例 A2)
実験例 A1と同様の基板の表面に親水化処理を施したのち、アミノ基含有アルキル シランの 2重量％水溶液中に浸漬後、熱処理を施して表面にアミノ基を導入した。こ れを 1重量％ダルタルアルデヒド水溶液中に浸漬することにより、表面のァミノ基とグ ルタルアルデヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。
[0288] 次に該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッター により表 1に示した希釈倍率で調製された一次抗体である抗マウス IgG2aをスポット後 、室温 4°Cの環境下に 24時間静置した。その後、非特異吸着防止の為に 5重量％ス キムミルクを懸濁させた 9. 6g/リットルの PBS (phosphate buffered saline)緩衝溶液 に該基板を浸し室温で 2時間静置した。その後、抗原であるマウス IgG2aと抗原抗体 反応を実施後、二次抗体であるピオチン標識抗マウス IgG2aと抗原抗体反応を実施 した。最後に Cy5標識されたストレプトアビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量 測定を行った。結果を表 1に示す.
[0289] 実験例 A1および実験例 A2における蛍光量の測定には、 Packard BioChip
Technologies社製マイクロアレイスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レー ザ一出力 90%、 PMT感度 60%、励起波長 649nm、測定波長 670nm、解像度 50 μ mであった。
[0290] 実験例 A1は、 、ずれの希釈倍率にお!、ても、実験例 A2よりもスポットシグナル値 が強ぐバックグランド値が低ぐ S/N比が大きい結果になった。
[0291] [表 1]
Figure imgf000054_0001
Figure imgf000054_0002
[0292] (実験例 Bl、実験例 B2)
実験例 B1および実験例 B2では、第 2の実施形態に記載のバイオチップ用基板お よびバイオチップを作製し、抗体の検出を行った。
[0293] (実験例 B1)
飽和環状ポリオレフイン榭脂（5—メチルー 2ノルボルネンの開環重合体の水素添カロ 物（MFR: 21g/10分、水素添加率:実質的に 100%、熱変形温度 123°C) )をスライ ドガラス形状 (寸法： 76mm X 26mm X lmm)に加工して基板を作製した。基板を 2 ーメタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンーブチルメタクリレートー p—二トロフエニル カルボ-ルォキシェチルメタタリレート共重合体の 0. 5重量％エタノール溶液に浸漬 することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物 質を導入した。
[0294] 次に、該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッタ 一により表 2に示した希釈倍率で pHが 8. 0に調製された一次抗体である抗マウス IgG2aをスポット後、室温 4°Cの環境下に 24時間静置した。その後、 pH7. 0に調製さ れた、抗原であるマウス IgG2aの溶液を基板表面に塗布し、抗原抗体反応を実施後、 二次抗体であるピオチン標識抗マウス IgG2aと抗原抗体反応を実施した。最後に Cy5 標識されたストレプトアビジンと反応させ、各スポットにつ 、て蛍光量測定を行った。 結果を表 2に示す。
[0295] (実験例 B2)
pHが 7. 0に調製された一次抗体である抗マウス IgG2aと pHが 8. 0に調製された抗 原であるマウス IgG2aの溶液を用いた以外はすべて実験例 B 1と同様の操作を行った
[0296] 実験例 B1および実験例 B2における蛍光量の測定には、 Packard BioChip
Technologies社製マイクロアレイスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レー ザ一出力 90%、 PMT感度 60%、励起波長 649nm、測定波長 670nm、解像度 50 μ mであった。
[0297] 実験例 B1は、 V、ずれの希釈倍率にぉ 、ても、実験例 B2よりもスポットシグナル値 が強ぐバックグランド値が低ぐ S/N比が大きい結果になった。
[0298] [表 2] 表 2 希釈倍率 10 20 30 40 スポットシグナル強度 63,021 59,142 30,053 15,244 実験例 B1 バックグランド値 802 853 750 700
S/N比 78.6 147.9 40.1 21.8 スポットシグナル強度 53,002 51 ,210 16,334 10,502 実験例 B2パックグランド値 9020 8800 9530 8140
S/N比 5.88 5.82 1.71 1.29 [0299] (実験例 CI、実験例 C2)
実験例 CIおよび実験例 C2では、第 3の実施形態に記載のバイオチップ用基板お よびバイオチップを作製し、抗体の検出を行った。
[0300] (実験例 C1)
飽和環状ポリオレフイン榭脂（5—メチルー 2ノルボルネンの開環重合体の水素添カロ 物（MFR: 21g/10分、水素添加率:実質的に 100%、熱変形温度 123°C) )をスライ ドガラス形状 (寸法： 76mm X 26mm X lmm)に加工して基板を作製した。基板を 2 ーメタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンーブチルメタクリレートー p—二トロフエニル カルボ-ルォキシェチルメタタリレート共重合体の 0. 5重量％エタノール溶液に浸漬 することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物 質を導入した。
[0301] 次に該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッター により表 3に示した希釈倍率で pHが 8.0に調製された一次抗体である抗マウス IgG2a をスポット後、室温 4°Cの環境下に 24時間静置した。その後、 pH7.0に調製した抗原 であるマウス IgG2aの溶液を基板表面に塗布し、抗原抗体反応を実施後、二次抗体 であるピオチン標識抗マウス IgG2aと抗原抗体反応を実施した。最後に Cy5標識され たストレプトアビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行った。結果を表 3 に示す。
[0302] (実験例 C2)
pHが 7. 0に調製された一次抗体である抗マウス IgG2aと pHが 8. 0に調製された抗 原であるマウス IgG2aの溶液を用いた以外はすべて実験例 C1と同様の操作を行った
[0303] 実験例 C1および実験例 C2における蛍光量の測定には、 Packard BioChip
Technologies社製マイクロアレイスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レー ザ一出力 90%、 PMT感度 60%、励起波長 649nm、測定波長 670nm、解像度 50 μ mであった。
[0304] 表 3より、実験例 C1は、いずれの希釈倍率においても、実験例 C2よりもスポットシグ ナル値が強ぐノ ックグランド値が低ぐ S/N比が大きい結果になった。 [0305] [表 3] 表 3
Figure imgf000057_0001
[0306] (実験例 Dl、実験例 D2)
実験例 D1および実験例 D2では、第 4の実施形態に記載のバイオチップ用基板お よびバイオチップを作製し、抗体の検出を行った。
[0307] (実験例 D1)
飽和環状ポリオレフイン榭脂（5—メチルー 2ノルボルネンの開環重合体の水素添カロ 物（MFR: 21g/10分、水素添加率:実質的に 100%、熱変形温度 123°C) )をスライ ドガラス形状 (寸法： 76mm X 26mm X lmm)に加工して基板を作製した。基板を、 1重量％の KBM903 (信越ィ匕学社製、アミノシラン)水溶液に浸漬することにより第一 の層を形成した。さらにこの基板を 2—メタタリロイルォキシェチルホスホリルコリンーブ チルメタクリレートー p—-トロフエ-ルカルボ-ルォキシェチルメタタリレート共重合体 の 0. 5重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と 活性エステル基とを有する高分子物質を有する第二の層を形成した。
[0308] (実験例 D2)
飽和環状ポリオレフイン榭脂（5—メチルー 2ノルボルネンの開環重合体の水素添カロ 物（MFR: 21g/10分、水素添加率:実質的に 100%、熱変形温度 123°C) )をスライ ドガラス形状 (寸法： 76mm X 26mm X lmm)に加工して基板を作製した。基板を 2 ーメタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンーブチルメタクリレートー p—二トロフエニル カルボ-ルォキシェチルメタタリレート共重合体の 0. 5重量％エタノール溶液に浸漬 することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物 質を有する層を形成した。
[0309] (評価実験）
次に、得られたそれぞれの基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基 板に自動スポッターにより表 4に示した希釈倍率で調製された一次抗体である抗マウ ス IgG2aをスポット後、室温 4°Cの環境下に 24時間静置した。その後、 0. 1規定の水 酸化ナトリウム水溶液に浸漬することにより活性エステルを失活させた。その後 1. 0 重量％ドデシル硫酸ナトリウム水溶液に 1時間浸漬した。
[0310] その後、抗原であるマウス IgG2aと抗原抗体反応を実施後、二次抗体であるビォチ ン標識抗マウス IgG2aと抗原抗体反応を実施した。最後に Cy5標識されたストレブトァ ビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行った。結果を表 4に示す。
[0311] 実験例 D1および実験例 D2における蛍光量の測定には、 Packard BioChip
Technologies社製マイクロアレイスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レー ザ一出力 90%、 PMT感度 50%、励起波長 649nm、測定波長 670nm、解像度 50 μ mであった。
[0312] 表 4に示したように、実験例 D1では、高いスポットシグナル値、低いバックグランド 値が観測された力 実験例 D2では、層が剥がれてしまい、低いスポットシグナル値を 示した。また層剥がれにより基板に非特異的吸着を起こしたためバックグランド値も高 くなつた。
[0313] [表 4] 表 4 希釈倍率 10 20 30 40 スポットシグナル強度 60,021 52,1 10 30,203 13,015 実験例 D1
パックグランド値 902 821 730 710 スポットシグナル強度 2002 3,200 3,334 1 ,842 実験例 D2
パックグランド値 1052 1309 1920 1050 [0314] (実験例 El、実験例 E2)
実験例 Elおよび実験例 E2では、第 5の実施形態に記載のバイオチップ用基板お よびバイオチップを作製し、抗体の検出を行った。
[0315] (実験例 E1)
飽和環状ポリオレフイン榭脂（5—メチルー 2ノルボルネンの開環重合体の水素添カロ 物（MFR: 21g/10分、水素添加率:実質的に 100%、熱変形温度 123°C) )をスライ ドガラス形状（寸法： 76mm X 26mm X lmm)にカロ工した。基板を 2—メタクリロイルォ キシェチルホスホリルコリンーブチルメタクリレートー p—二トロフエニルカルボニルォキシ ェチルメタタリレート共重合体の 0. 5重量％エタノール溶液に浸漬することにより基板 表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。
[0316] 次に該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッター により表 5に示した希釈倍率で調製された一次抗体、抗マウス IgG2aをスポット後、室 温 4°Cの環境下に 24時間静置した。その後、親水性ポリマーとして、 ー506 (サン テクノケミカル株式会社製、末端アミノ化エチレングリコール プロピレングリコール 共重合体)の 40重量％水溶液に浸漬することにより活性エステル基を親水性ポリマ 一化した。
[0317] (実験例 E2)
XTJ— 506の 40重量％水溶液の代わりに 0. 1規定の水酸ィ匕ナトリウム水溶液を用 いたこと以外は実験例 E1と同様の操作を行った。
[0318] (評価実験）
実験例 E1および実験例 E2のバイチップのそれぞれにつ 、て、さらに抗原であるマ ウス IgG2aと抗原抗体反応を実施後、二次抗体であるピオチン標識抗マウス IgG2aと 抗原抗体反応を実施した。最後に Cy5標識されたストレプトアビジンと反応させ、各ス ポットにつ ヽて蛍光量測定を行った。結果を表 5に示す。
[0319] 蛍光量の測定には、 Packard BioChip Technologies社製マイクロアレイスキャナー「 ScanArray」を用いた。測定条件は、レーザー出力 90%、 PMT感度 60%、励起波長 649nm、測定波長 670nm、解像度 50 mであった。
[0320] 実験例 E1は、いずれの希釈倍率においても、実験例 E2よりもノ ックグランド値が低 ぐ S/N比が大きい結果になった。
[0321] [表 5] 表 5
Figure imgf000060_0001
[0322] (実験例 F1—実験例 F3)
実験例 F1—実験例 F3では、第 6の実施形態に記載のバイオチップ用基板および ノィォチップを作製し、抗体の検出を行った。
[0323] (実験例 F1)
飽和環状ポリオレフイン榭脂（5—メチルー 2ノルボルネンの開環重合体の水素添カロ 物（MFR: 21g/10分、水素添加率:実質的に 100%、熱変形温度 123°C) )をスライ ドガラス形状 (寸法： 76mm X 26mm X lmm)に加工して基板を作製した。基板を 2 ーメタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンーブチルメタクリレートー N—ヒドロキシスク シンイミドカルボ-ルォキシェチルメタタリレート共重合体の 0. 5重量0 /0エタノール溶 液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する 高分子物質を導入した。
[0324] 次に、該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッタ 一により表 6に示した希釈倍率で調製された一次抗体である抗マウス IgG2aをスポット 後、室温 4°Cの環境下に 24時間静置した。その後、 0. 1規定の炭酸水素ナトリウム 水溶液に浸漬することにより活性エステルを失活させた。
[0325] その後、抗原であるマウス IgG2aと抗原抗体反応を実施後、二次抗体であるビォチ ン標識抗マウス IgG2aと抗原抗体反応を実施した。最後に Cy5標識されたストレブトァ ビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行った。結果を表 6に示す。
[0326] (実験例 F2)
2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンーブチルメタクリレートー p—二トロフエ二 ルカルボォキシェチルメタタリレート共重合体の 0. 5重量％エタノール溶液を用いた 以外は実験例 F1と同様に操作した。
[0327] (実験例 F3)
実験例 F 1と同様にして基板の表面に親水化処理を施したのち、アミノ基含有アル キルシランの 2重量％水溶液中に浸漬後、熱処理を施して表面にアミノ基を導入した 。これを 1重量％ダルタルアルデヒド水溶液中に浸漬することにより、表面のァミノ基と ダルタルアルデヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。
[0328] 次に該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッター により表 6に示した希釈倍率で調製された一次抗体である抗マウス IgG2aをスポット後 、室温 4°Cの環境下に 24時間静置した。その後、非特異吸着防止の為に 5重量％ス キムミルクを懸濁させた 9. 6gZリットルの PBS緩衝溶液に該基板を浸し室温で 2時 間静置した。その後、抗原であるマウス IgG2aと抗原抗体反応を実施後、二次抗体で あるピオチン標識抗マウス IgG2aと抗原抗体反応を実施した。最後に Cy5標識された ストレプトアビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行った。結果を表 6 に示す。
[0329] 実験例 F1— F3における蛍光量の測定には、 Packard BioChip Technologies社製 マイクロアレイスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レーザー出力 90%、 P MT感度 50%、励起波長 649nm、測定波長 670nm、解像度 50 mであった。
[0330] 実験例 F1は、いずれの希釈倍率においても、実験例 F2および実験例 F3よりもス ポットシグナル値が強ぐノ ックグランド値が低ぐ S/N比が大きい結果になった。
[0331] [表 6] 表 6
Figure imgf000062_0001
[0332] (実験例 G1—実験例 G9)
実験例 G1—実験例 G9では、第 7の実施形態に記載のバイオチップ用基板および ノィォチップを作製し、抗体の検出を行った。
[0333] (実験例 G1— G7、実験例 G10、実験例 Gi l)単独ポリマー
表 7の割合よりなるホスホリルコリン基および活性エステル基を有する高分子物質を 飽和環状ポリオレフイン榭脂（5—メチルー 2ノルボルネンの開環重合体の水素添加物 (MFR: 21g/10分、水素添加率:実質的に 100%、熱変形温度 123°C) )のスライド 基板に導入した。溶液はエタノール基板で 0. 5重量％とした。
[0334] [表 7] 表 7 単独ポリマー
ホスホリルコリン基（モル ブチルメタクリレー卜基（モル％) p 二卜ロフ ニルエステル基（モル％) 実験例 G1 25 57 18 実験例 G2 35 41 24 実験例 G3 15 67 18 実験例 G4 25 70 5 実験例 G5 45 38 17 実験例 G6 30 40 30 実験例 G7 45 20 35 実翻 G10 25 74 1 実験例 G11 25 72 3 [0335] (実験例 G8、実験例 G9、実験例 G12— G14)
実験例 G6または実験例 G7で用いたポリマーの 0. 5重量％エタノール溶液を、そ れぞれ MPCポリマー（ホスホリルコリン基 30モル0 /0、ブチルメタタリレート基 70モル0 /0 )の 0. 5重量％エタノール溶液と混合することにより各基の割合を調整した。配合割 合と最終組成を表8に示す。
[0336] [表 8]
表 8 ブレンドポリマー
Figure imgf000063_0001
[0337] (評価実験）
次に、該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッタ 一により表 9に示した希釈倍率で調製された一次抗体、抗マウス IgG2aをスポット後、 室温 4°Cの環境下に 24時間静置した。その後、 0. 1Nの水酸ィ匕ナトリウムの水溶液 に浸漬することにより活性エステル基を処理した。
[0338] 実験例 G1— G14のバイチップについて、さらに抗原であるマウス IgG2aと抗原抗体 反応を実施後、二次抗体であるピオチン標識抗マウス IgG2aと抗原抗体反応を実施 した。最後に Cy5標識されたストレプトアビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量 測定を行った。結果を表 9に示す。
[0339] 蛍光量の測定には、 Packard BioChip Technologies社製マイクロアレイスキャナー「 ScanArray」を用いた。測定条件は、レーザー出力 90%、 PMT感度 45%、励起波長 649nm、測定波長 670nm、解像度 50 mであった。
[0340] 表 9より、実験例 G4、実験例 G10— G14は、ノ ックグランド値が特に低ぐ S/N比が 大きい結果になった。
[0341] [表 9] 表 9
Figure imgf000064_0001
[0342] (実験例 HI、実験例 H2)
実験例 H 1および実験例 H2では、第 8の実施形態に記載のバイオチップ用基板お よびバイオチップを作製し、 DN Aのハイブリダィゼゼーシヨンを行った。
[0343] (実験例 HI)
飽和環状ポリオレフイン榭脂（5—メチルー 2ノルボルネンの開環重合体の水素添カロ 物（MFR: 21g/10分、水素添加率:実質的に 100%、熱変形温度 123°C) )をスライ ドガラス形状 (寸法： 76mm X 26mm X lmm)に加工して基板を作製した。基板を 2 ーメタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンーブチルメタクリレートー p—二トロフエニル カルボ-ルォキシェチルメタタリレート共重合体の 0. 5重量％エタノール溶液に浸漬 することにより、基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物 質を導入した。
[0344] (実験例 H2)
実験例 H 1に使用したのと同様の基板を 2体積％の 3—ァミノプロピルートリメトキシシ ランのエタノール溶液に浸漬した後、純水洗浄し、熱処理することによりアミノ基を導 入した。アミノ基を導入した基板を 1体積％のダルタルアルデヒド水溶液に浸漬した 後、純水洗浄することでアルデヒド基を導入した。
[0345] (DNA溶液の調製）
DNA溶液 1および DN A溶液 2として、以下の溶液を調製した。
DNA溶液 1： 5 '末端にアミノ基を有した鎖長 24bpのオリゴ DNA (TAGAAGCAT TTGCGGTGGACGATG (配列番号 1) (シグマジエノシス社製）を 0. 1 gZ 1の 濃度になるように所定の緩衝液で溶解した。
DNA溶液 2； 5，末端に Cy3標識を有した鎖長 24bpのオリゴ DNA (CATCGTCC ACCGCAAATGCTTCTA (配列番号 2) (シグマジエノシス社製）を 0. 002 μ &/ μ 1の濃度になるように 3 X SSC (standard saline citrate) , 0. 2重量0 /0SDS (ドデシル 硫酸ナトリウム）の溶液に溶解した。
[0346] (スポットおよびハイブリダィゼーシヨン）
実験例 HIでは、 DNA溶液 1を 96穴プレートに分注し、マイクロピン式のマイクロア レイスポッターを用いて基板上にスポットした。スポット終了後、 80°Cのオーブン中に 静置した。
[0347] その後、 0. 1Nの水酸ィ匕ナトリウム溶液に 5分間浸漬することによって、活性エステ ル基を不活性ィ匕することにより、ブロッキング処理を行った。次に、この基板上に、 D NA溶液 2を展開し、カバーグラスで覆い、 65°Cの多湿容器内で 3時間放置すること で、固定化されたオリゴ DNAと Cy3標識オリゴ DNAとのハイブリダィゼーシヨンを行 つた。その後、 2 X SSC、 0. 5重量％SDS中で洗浄し、次に純水洗浄することにより DNAノヽイブリダィゼーシヨン後の基板を作製した。
[0348] 実験例 H2では、実験例 HIと同様にして、 DNA溶液 1を 96穴プレートに分注し、 マイクロピン式のマイクロアレイスポッターを用いて基板上にスポットした。スポット終 了後、 80°Cのオーブン中に静置した。
[0349] その後、 0. 5重量％水素化ホウ素ナトリウム PBS溶液に 5分間浸漬することによつ て、余分なアルデヒド基をブロッキングした。この基板上に、 DNA溶液 2を展開し、力 バーグラスで覆い、 65°Cの多湿容器内で 3時間放置することで、固定ィ匕されたオリゴ DNAと Cy3標識オリゴ DNAとのハイブリダィゼーシヨンを行った。その後、 2 X SSC 、 0. 5重量。/ oSDS中で洗浄し、次に純水洗浄することにより DNAノヽイブリダィゼー シヨン後の基板を作製した。
[0350] (評価実験）
実験例 HIおよび実験例 H2における自己蛍光量の測定には、マイクロアレイ用蛍 光スキャナー「ScanArray」（Packard BioChip Technologies社製）を用いた。測定条件 は、レーザー出力 90%、 PMT感度 70%、励起波長 550nm、測定波長 570nmであ つた。 ScanArrayを用いて得られたスキャンイメージから、スキャナーに付属の解析 用ソフトウェア「QuantArray」を用 V、て基板の蛍光量を数値ィ匕した結果を表 10に示 す。
[0351] DNAノヽイブリダィゼーシヨン後の蛍光カウント値、バックグランド値の測定にはマイ クロアレイスキャナー「ScanArray LiteJ (パッカードバイオチップテクノロジ一社製） を用いてスポットの蛍光を検出した。測定条件は、レーザー出力 90%、 PMT感度 45 %、励起波長 550nm、測定波長 570nmであった。スキャナーに付属の解析用ソフト ウェア「QuantArray」を用いてスポットの蛍光量を数値化した結果を表 10に示す。
[0352] 実験例 HIでは、実験例 H2と比較して、自己蛍光が低 、結果となった。また、 DN Aノヽイブリダィゼーシヨン後の蛍光カウント値にっ 、ても実験例 HIが優れて 、た。こ の結果は、本発明の効果を支持するものであった。
[0353] [表 10] 表 1 0
Figure imgf000066_0001
[0354] (実験例 II一実験例 15)
実験例 II一実験例 15では、第 9の実施形態に記載のバイオチップ用基板およびバ ィォチップを作製し、抗体の検出を行った。
[0355] (実験例 II)
飽和環状ポリオレフイン榭脂（5—メチルー 2ノルボルネンの開環重合体の水素添カロ 物（MFR: 21g/10分、水素添加率:実質的に 100%、熱変形温度 123°C) )をスライ ドガラス形状 (寸法： 76mm X 26mm X lmm)に加工して基板を作製した。基板を、 1重量％の（3 アクリルォキシプロピル）トリメトキシシランのエタノール/水混合溶液 に浸漬することにより第一の層を形成した。さらにこの基板を 2—メタクリルォキシェチ ルホスホリルコリン（0. lmol/L)、 p—二トロフエ-ルカルポ-ルォキシェチルメタタリ レート（0. lmol/L)、ラジカル開始剤であるァゾビスイソブチ口-トリル（0. Olmol ZL)のエタノール溶液に浸漬し 65°Cにて 4時間加熱することにより基板表面にホス ホリルコリン基と活性エステル基とを有する第二の層を形成した。
[0356] (実験例 12)
第一の層の形成に（3—アクリルォキシプロピル）トリメトキシシランの代わり〖こメタタリ ルォキシプロピルトリメトキシシランを用いた以外は実験例 IIと同様に操作して基板 表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する第二の層を形成した。
[0357] (実験例 13)
飽和環状ポリオレフイン榭脂をスライドガラス形状（寸法： 76mm X 26mm X lmm) に加工して基板を作製した。基板を、 1重量0 /0のビュルトリエトキシシランのエタノー ル Z水混合溶液に浸漬することにより第一の層を形成した。さらにこの基板を 2—メタ クリルォキシェチルホスホリルコリン（0. ImolZL)、 p—二トロフエ-ルカルポ-ルォキ シェチノレメタタリレート（0. ImolZL)、光開始剤である 1 [4 (2—ヒドロキシエトキシ )—フエ-ル]— 2—ヒドロキシ— 2—メチルー 1 プロパン 1 オン（0. Olmol/L)のエタ ノール溶液に浸漬し 250nm— 400nmの紫外線を 2時間照射することにより基板表面 にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する第二の層を形成した。
[0358] (実験例 14)
第一の層の形成にァリルトリエトキシシランを用いた以外はすべて実験例 13と同様 に操作して基板表面にホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する第二の層を形 成した。
[0359] (実験例 15)
飽和環状ポリオレフイン榭脂をスライドガラス形状（寸法： 76mm X 26mm X lmm) に加工して基板を作製した。基板を 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン ブチルメタクリレートー p—二トロフエニルカルボニルォキシェチルメタタリレート共重合 体の 0. 5重量％エタノール溶液に浸漬することにより、基板表面にホスホリルコリン基 と活性エステル基とを有する高分子物質を有する層を形成した。
[0360] (評価実験）
次に該基板上でサンドイッチ法を実施した。詳細はまず、該基板に自動スポッター により表 11に示した希釈倍率で調製された一次抗体である抗マウス IgG2aをスポット 後、室温 4°Cの環境下に 24時間静置した。その後、 0. 1規定の水酸ィ匕ナトリウム水 溶液に浸漬することにより活性エステル基を失活させた。その後 1. 0重量％ドデシル 硫酸ナトリウム水溶液に 1時間浸漬した。
[0361] その後、抗原であるマウス IgG2aと抗原抗体反応を実施後、二次抗体であるビォチ ン標識抗マウス IgG2aと抗原抗体反応を実施した。最後に Cy5標識されたストレブトァ ビジンと反応させ、各スポットについて蛍光量測定を行った。結果を表 11に示す。
[0362] 実験例 II一実験例 15における蛍光量の測定には、 Packard BioChip Technologies 社製マイクロアレイスキャナー「ScanArray」を用いた。測定条件は、レーザー出力 90 %、 PMT感度 60%、励起波長 649nm、測定波長 670nm、解像度 50 mであった
[0363] 実験例 II一実験例 14では、高 、スポットシグナル値、低 、バックグランド値が観測さ れたが、実験例 15では、層が剥がれてしまい、低いスポットシグナル値を示した。また 層剥がれにより基板に非特異的吸着を起こしたためバックグランド値も高くなつた。
[0364] [表 11]
表 1 1
Figure imgf000069_0001
[0365] (実験 ί歹 ΐ一 J6)
本実験例では、第 10の実施形態に記載のバイオチップ用基板およびバイオチップ を作製し、 DNAのハイブリダィゼーシヨンおよび抗体の検出を行った。
[0366] (溶液類の調製）
本実験例において、 DNA溶液 1、 2、抗体溶液、抗原溶液、およびブロッキング溶 液 1一 3として、以下の溶液を調製した。
[0367] DNA溶液 1： 5 '末端にアミノ基を有した鎖長 24bpのオリゴ DNA(TAGAAGCAT TTGCGGTGGACGATG (配列番号 1) (シグマジエノシス社製）を 0. 1 gZ 1の 濃度になるように所定の緩衝液に溶解し調製した。
DNA溶液 2 : 5 '末端に Cy3標識を有した鎖長 24bpのオリゴ DNA(CATCGTCC ACCGCAAATGCTTCTA (配列番号 2) (シグマジエノシス社製）を 0. 002 μ g/ 1の濃度になるように 3 X SSC、 0. 2重量0 /oSDSの溶液に溶解した。
[0368] 抗体溶液:抗マウス IgG2a抗体 (ゥサギ由来）を PBS中に 0. lmgZmlの濃度の濃 度で溶解し調製した。
抗原溶液: FBS中にマウス IgG2a抗体を 1 μ gZml濃度で溶解し、 pH9. 5の炭酸 バッファー lml中に、上記マウス IgG2a抗体を含む FBSを 100 1をカ卩え、さらに lmg Zml濃度で NHS化 Cy3を超純水に溶解させた溶液を 1添カ卩し、 25°Cで 2時間 放置し、ゲルろ過カラムにより未反応の NHS化 Cy3を除き、 PBS中に Cy3標識され たマウス IgG2aおよび FBS由来タンパク質を含む溶液を調製した。
[0369] ブロッキング溶液 1 : 0. 1Nの水酸ィ匕ナトリウム溶液を調製した。
ブロッキング溶液 2：水素化ホウ素ナトリウムを 0. 5重量％の濃度で PBS中に溶解し 調製した。
ブロッキング溶液 3： BSAを 1重量％濃度で PBS中に溶解させ調製した。
[0370] (実験 ί歹 ΐ)
射出成形により、幅 150 m深さ 100 mの溝と、溝の末端に設けられた直径 lm mの貫通孔と、を有するポリスチレン榭脂基板を成形した。また、この基板と同じ大き さのポリスチレン榭脂の平板基板を成形した。
[0371] 溝を形成させた基板の溝を有する面と平板基板の片面とを 2—メタクリロイルォキシ ェチルホシホリルコリンーブチルメタクリレートー p—二トロフエニルカルボニルォキシェ チルメタタリレート共重合体の 0. 5重量％エタノール溶液を塗布乾燥することにより、 ホスホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。
[0372] 直径 100 μ mのマイクロアレイ用スポットピンを用いて、 DNA溶液 1を溝の底面部 に点着し、点着後湿度を保ちながら一晩放置した。その後、平面基板の榭脂コート 面と溝を有する基板の溝が形成された面を合わせ、超音波溶着により基板同士を貼 り合わせ、流体が流通できる基板を作製した。溝の末端に設けられた孔力 ブロッキ ング溶液 1を注入し、流路内に満たした後、 10分間放置し、流路内の活性エステル 基を不活化し、 DNAノヽイブリダィゼーシヨンによる評価に供した。
[0373] (実験 ί歹 2)
射出成形により、ポリスチレン榭脂基板に、幅 150 m深さ 100 mの溝および溝 の末端に直径 lmmの貫通孔を有する基板を成形した。また、この基板と同じ大きさ の平板基板を成形した。
[0374] 溝を形成させた基板の溝を有する面と平板基板の片面を 2—メタクリロイルォキシェ チルホシホリルコリンーブチルメタクリレートー p—二トロフエニルカルボ二ルォキシェチ ルメタタリレート共重合体の 0. 5重量％エタノール溶液を塗布乾燥することにより、ホ スホリルコリン基と活性エステル基とを有する高分子物質を導入した。
[0375] 直径 100 mのマイクロアレイ用スポットピンを用いて、抗体溶液を溝の底面部に 点着し、点着後湿度を保ちながら一晩放置した。その後、平面基板の榭脂コート面と 溝側を合わせ、超音波溶着により基板同士を貼り合わせ、流体が流通できる基板を 作製した。溝の末端に設けられた孔カゝらブロッキング溶液 1を注入し、流路内に満た した後、 10分間放置し、流路内の活性エステル基を不活ィ匕し、抗原抗体反応による 評価に供した。
[0376] (実験 ί歹 3)
射出成形によりポリスチレン榭脂基板に幅 150 μ m深さ 100 μ mの溝および溝の末 端に直径 lmmの貫通孔を有する基板およびこの基板と同じ大きさの平板基板を成 形した。両基板の表面に親水化処理を施した後、アミノアルキルシラン 2重量％溶液 中に浸漬した後、熱処理を施し両基板の表面にアミノ基を導入した。これを 1重量％ ダルタルアルデヒド水溶液に浸漬することにより、基板表面のァミノ基とダルタルアル デヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。直径 100 μ mのマイクロアレイ用スポット ピンを用いて、 DNA溶液 1を溝の底面部に点着し、点着後湿度を保ちながら一晩放 置した。その後、平面基板の榭脂コート面と溝側を合わせ、超音波溶着により基板同 士を貼り合わせ、流体が流通できる基板を作製した。溝の末端に設けられた孔力 ブ ロッキング溶液 2を注入し、流路内に満たした後、 10分間放置し流路内のアルデヒド 基を不活化し、 DNAノヽイブリダィゼーシヨンによる評価に供した。
[0377] (実験 ί歹 4)
射出成形によりポリスチレン榭脂基板に幅 150 μ m深さ 100 μ mの溝および溝の末 端に直径 lmmの貫通孔を有する基板およびこの基板と同じ大きさの平板基板を成 形した。両基板の表面に親水化処理を施した後、アミノアルキルシラン 2重量％溶液 中に浸漬した後、熱処理を施し両基板の表面にアミノ基を導入した。これを 1重量％ ダルタルアルデヒド水溶液に浸漬することにより、基板表面のァミノ基とダルタルアル デヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。
[0378] 直径 100 mのマイクロアレイ用スポットピンを用いて、抗体溶液を溝の底面部に 点着し、点着後湿度を保ちながら一晩放置した。その後、平面基板の榭脂コート面と 溝側を合わせ、超音波溶着により基板同士を貼り合わせ、流体が流通できる基板を 作製した。溝の末端に設けられた孔カゝらブロッキング溶液 2を 2 1Z分のスピードで 1 0分間送液した後、ブロッキング溶液 3を 2 1Z分のスピードで 10分間送液し、最後 に PBSを送液し、抗原抗体反応による評価に供した。
[0379] (実験 ί歹 5)
射出成形によりポリスチレン榭脂基板に幅 150 μ m深さ 100 μ mの溝および溝の末 端に直径 lmmの貫通孔を有する基板およびこの基板と同じ大きさの平板基板を成 形した。両基板の表面に親水化処理を施した後、アミノアルキルシラン 2重量％溶液 中に浸漬した後、熱処理を施し両基板の表面にアミノ基を導入した。これを 1重量％ ダルタルアルデヒド水溶液に浸漬することにより、基板表面のァミノ基とダルタルアル デヒドを反応させ、アルデヒド基を導入した。
[0380] 直径 100 mのマイクロアレイ用スポットピンを用いて、抗体溶液を溝の底面部に 点着し、点着後湿度を保ちながら一晩放置した。その後、平面基板の榭脂コート面と 溝側を合わせ、超音波溶着により基板同士を貼り合わせ、流体が流通できる基板を 作製した。溝の末端に設けられた孔カゝらブロッキング溶液 2を 2 1Z分のスピードで 1 0分間送液し、最後に PBSを送液し、抗原抗体反応による評価に供した。
[0381] (実験 ί歹 6)
射出成形によりポリスチレン榭脂基板に幅 150 μ m深さ 100 μ mの溝および溝の末 端に直径 lmmの貫通孔を有する基板およびこの基板と同じ大きさの平板基板を成 形した。両基板の表面に親水化処理を施した。
[0382] 直径 100 mのマイクロアレイ用スポットピンを用いて、抗体溶液を溝の底面部に 点着し、点着後湿度を保ちながら一晩放置した。その後、平面基板の榭脂コート面と 溝側を合わせ、超音波溶着により基板同士を貼り合わせ、流体が流通できる基板を 作製した。溝の末端に設けられた孔カゝらブロッキング溶液 3を 2 1Z分のスピードで 1 0分間送液し、最後に PBSを送液し、抗原抗体反応による評価に供した。
[0383] (DNAノヽイブリダィゼーシヨンによる評価実験）
実験 f歹 ΐおよび実験 f歹 3を用いて評価を行った。注入孔カゝら DNA溶液 2を 2 1Z 分のスピードで 1分間、 3分間、 5分間、および 10分間送液した後、 PBS (—)を 5 1 Z分のスピードで 10分間送液し洗浄を行い、超純水を送液した後、流路中の DNA スポット部およびスポット部以外の蛍光（Cy3)をマイクロアレイ用スキャナー「ScanAr ray Lite] (パッカードバイオチップテクノロジ一社製)を用いて測定した。測定条件 は、レーザー出力 90%、 PMT感度 45%、励起波長 550nm、測定波長 570nmであ つた。スキャナーに付属の解析用ソフトウェア「QuantArray」を用いてスポットの蛍光 量を数値化した結果を表 12および表 13に示す。
[0384] (抗原抗体反応による評価実験）
実験 ί¾[2、実験 ί¾[4、実験 ί¾[5および実験 ί¾[6を用いて評価を行った。注入孔か ら抗原溶液を 2 1Z分のスピードで 1分間、 3分間、 5分間、および 10分間送液した 後、 PBS (—)を 5 μ 1Z分のスピードで 10分間送液し洗浄を行い、超純水を送液した 後、流路中の DNAスポット部およびスポット部以外の蛍光（Cy3)をマイクロアレイ用 スキャナーで測定した。結果を表 14および表 15に示す。
[0385] なお、以上の実験例においては、基板の材料をプラスチックとした実験例を示した 力 基板の材料をガラスとした場合にも、基板表面にホスホリルコリン基および活性ェ ステル基を有する高分子物質を用いることにより、検出感度の向上が可能であつた。
[0386] [表 12]
表 1 2
Figure imgf000073_0001
[0387] [表 13] 表 13
Figure imgf000074_0001
[0388] [表 14] 表" 14
Figure imgf000074_0002
[0389] [表 15] 表 15
Figure imgf000074_0003
以下、本発明の実施態様を列挙する。
(1—1)固相基板の表面の生理活性物質を固定ィ匕するバイオチップ用基板であって 、基板表面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質を有するこ とを特徴とするバイオチップ用基板。
(1-2)ホスホリルコリン基が 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンである（1— 1)記載のバイオチップ用基板。
(1—3)活性エステル基が p—二トロフエ-ルエステル基である（1—1)又は（1—2)記載 のバイオチップ用基板。
(1-4)前記高分子物質がブチルメタタリレート基を含む共重合体である（1—1)一 (1 3) Vヽずれか記載のバイオチップ用基板。
(1-5)固相基板がプラスチック製であることを特徴とする（1—1)一 (1-4) V、ずれか記 載のバイオチップ用基板。
(1-6)プラスチックが飽和環状ポリオレフインである（1 5)記載のバイオチップ用基 板。
(1-7)固相基板がガラス製である（1—1)一 (1-4) V、ずれか記載のバイオチップ用 基板。
(1—8) (1—1)—（1—7)いずれか記載のノィォチップ用基板に生理活性物質を固定 化する工程、及び生理活性物質を固定化した以外の基板表面の活性エステル基を 不活性化する工程を有することを特徴とするバイオチップの製造方法。
( 1-9)活性エステル基の不活性化をアルカリ化合物を用 、て行う（ 1-8)記載のバイ ォチップの製造方法。
(1-10)活性エステル基の不活性ィ匕を 1級のアミノ基を有する化合物を用 、て行う（ 1 8)記載のバイオチップの製造方法。
(1-11) 1級のアミノ基を有する化合物がアミノエタノール、又はグリシンである（1—10 )記載のバイオチップの製造方法。
(1—12)生理活性物質が核酸、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質の内 、少なくとも一つである（1 8)—（1 11)いずれかに記載のバイオチップの製造方法
(1-13) (1-8) - ( 1-12) V、ずれか記載のバイオチップの製造方法により製造され たバイオチップ。 [0391] (2-1)ホスホコリン基及び活性エステル基を有する高分子層を表面に有する基板に 、該活性エステル基を介して、生理活性物質を捕捉する分子が基板表面に固定化さ れているバイオチップ。
(2-2)ホスホリルコリン基が 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン基である（2 1)記載のバイオチップ。
(2-3)活性エステル基が p—二トロフエ-ルエステル基である（2— 1)又は（2— 2)記載 のバイオチップ。
(2-4)前記高分子物質がブチルメタタリレート基を含む共重合体である（2 - 1)一 (2 3) V、ずれか記載のバイオチップ。
(2-5)固相基板がプラスチック製である（2— 1)一 (2-4) V、ずれか記載のバイオチッ プ。
(2-6)プラスチックが飽和環状ポリオレフインである（2— 5)記載のバイオチップ。 (2-7)固相基板がガラス製である（2— 1)一 (2-4) V、ずれか記載のバイオチップ。 (2— 8)生理活性物質を捕捉する分子が核酸、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖 タンパク質の内、少なくとも一つである（2— 1)一（2— 7)いずれか記載のバイオチップ
(2— 9)生理活性物質を捕捉する分子の固定化が、 pH7. 6以上で行なわれる、 (2- 1)一 (2-8) V、ずれか記載のバイオチップ。
(2-10) (2-1)一 (2-9) V、ずれか記載のノィォチップに更に生理活性物質が捕捉 されたバイオチップ。
(2-11)生理活性物質が核酸、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質の内 、少なくとも一つである（2— 10)記載のバイオチップ。
(2-12) (2— 10)又は（2— 11)のバイオチップの製造方法であって、生理活性物質を 含む pH7. 6以下の溶液を基板表面に接触させる工程を含むことを特徴とするバイ ォチップの製造方法。
[0392] (3-1)基板の表面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する
高分子物質を有するバイオチップ用基板の使用方法であって、 (1) ρΗ7. 6以上で 生理活性物質を捕捉する分子である捕捉分子を固定する工程、及び (2)検出する 生理活性物質を含む pH7. 6以下の溶液を基板表面に接触させ、該捕捉分子に生 理活性物質を捕捉させる工程、を含むことを特徴とするバイオチップ用基板の使用 方法。
(3-2)ホスホリルコリン基が 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン基である（3 1)記載のバイオチップ用基板の使用方法。
(3-3)活性エステル基が p—二トロフエ-ルエステル基である（3— 1)又は（3— 2)記載 のバイオチップ用基板の使用方法。
(3-4)前記高分子物質がブチルメタタリレート基を含む共重合体である（3 - 1)一 (3 3) V、ずれか記載のバイオチップ用基板の使用方法。
(3-5)捕捉分子が核酸、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質の内、少な くとも一つである（3— 1)一（3— 4)いずれか記載のバイオチップ用基板の使用方法。 (3— 6)検出する生理活性物質が核酸、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパ ク質の内、少なくとも一つである（3— 1)一（3— 5)いずれか記載のバイオチップ用基 板の使用方法。
(4-1)固相基板の表面に生理活性物質を固定ィ匕するバイオチップ用基板であって 、基板表面にアミノ基を有する化合物を含む層 Aとホスホリルコリン基及び活性エステ ル基を有する高分子物質を含む層 Bとが基板、層 A、層 Bの順で重層されていることを 特徴とするバイオチップ用基板。
(4 2)層 Aのァミノ基の一部又は全てが層 Bの活性エステル基と反応して共有結合を 形成して!/、る (4-1)記載のバイオチップ用基板。
(4 3)層 Bの活性エステル基の一部が層 Aのァミノ基と反応して共有結合を形成して Vヽる (4-1)又は (4 2)記載のノィォチップ用基板。
(4-4)層 Aがアミノシランを含む (4 1)一 (4-3) V、ずれか記載のノィォチップ用基 板。
(4-5)ホスホリルコリン基が 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン基である（4 -1)一 (4-4) V、ずれか記載のバイオチップ用基板。
(4-6)活性エステル基が p—-トロフエ-ルエステル基である（4 1)一 (4-5) V、ずれ か記載のバイオチップ用基板。 (4-7)前記高分子物質がブチルメタタリレート基を含む共重合体である (4 1)一 (4 6) Vヽずれか記載のバイオチップ用基板。
(4-8)固相基板がプラスチック製である（4 1)一 (4-7) V、ずれか記載のバイオチッ プ用基板。
(4-9)プラスチックが飽和環状ポリオレフインである（4 8)記載のバイオチップ用基 板。
(4-10)固相基板がガラス製である（4 1)一 (4-7) V、ずれか記載のノィォチップ用 基板。
(4-11) (4-1)一 (4-10) V、ずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法であって 、（1)基板表面とアミノ基を有する化合物との接触工程、及び (2)ホスホリルコリン基 及び活性エステル基を有する高分子物質との接触工程、を含むバイオチップ用基板 の製造方法。
(5-1)基板表面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質を有 するバイオチップ用基板に活性エステル基と反応して生理活性物質が固定化され、 前記生理活性物質が固定化されている以外の基板表面の活性エステル基部に親水 性基を有するポリマーが導入されていることを特徴とするバイオチップ。
(5— 2)親水性ポリマーが、アミノ基を有する親水性ポリマーである（5— 1)記載のバイ ォチップ。
(5—3)親水性ポリマーがポリアルキレンォキシド、ポリエチレンォキシド、ポリプロピレ ンォキシド、及びこれらの共重合体のいずれかを構造中に含むものである（5— 1)又 は（5— 2)記載のバイオチップ。
(5-4)ホスホリルコリン基が 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン基である（5 1)一 (5-3) V、ずれか記載のバイオチップ。
(5-5)活性エステル基力 ¾ -トロフエ-ルエステル基である（5— 1)一 (5-4) V、ずれ か記載のバイオチップ。
(5-6)前記高分子物質がブチルメタタリレート基を含む共重合体である（5— 1)一 (5 5) V、ずれか記載のバイオチップ。
(5-7)固相基板がプラスチック製である（5— 1)一 (5-6) V、ずれか記載のバイオチッ プ。
(5-8)プラスチックが飽和環状ポリオレフインである（5— 7)記載のバイオチップ。 (5-9)固相基板がガラス製である（5— 1)一 (5-6) V、ずれか記載のバイオチップ。 (5— 10)生理活性物質が核酸、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質の内 、少なくとも一つである（5— 1)一（5— 9)いずれかに記載のバイオチップ。
(5-11) (5— 1)一（5— 10)いずれか記載のバイオチップの製造方法であって、基板 表面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質を有するバイオ チップ用基板に生理活性物質を固定ィ匕する工程、及び生理活性物質が固定化され ている以外の基板表面の活性エステル基部に親水性基を有するポリマーを導入する 工程、を含むことを特徴とするのバイオチップの製造方法。
(6-1)固相基板の表面の生理活性物質を固定ィ匕するバイオチップ用基板であって 、基板表面にホスホリルコリン基及び N—ヒドロキシスクシンイミドエステルを有する高 分子物質を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
(6-2)ホスホリルコリン基が 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンである（6— 1)記載のバイオチップ用基板。
(6-3)前記高分子物質がブチルメタタリレート基、を含む共重合体である（6— 1)又 は（6— 2)記載のバイオチップ用基板。
(6-4)固相基板がプラスチック製であることを特徴とする（6— 1)一 (6-3) Vヽずれか記 載のバイオチップ用基板。
(6-5)プラスチックが飽和環状ポリオレフインである（6— 4)記載のバイオチップ用基 板。
(6-6)固相基板がガラス製である（6— 1)一 (6-3) V、ずれか記載のバイオチップ用 基板。
(6-7) (6—1)—（6— 6)いずれか記載のノィォチップ用基板に生理活性物質を固定 化する工程、及び生理活性物質を固定化した以外の基板表面の活性エステル基を 不活性化する工程を有することを特徴とするバイオチップの製造方法。
(6-8)活性エステル基の不活性ィ匕をアルカリィ匕合物を用いて行う（6— 7)記載のバイ ォチップの製造方法。 (6-9)活性エステル基の不活性ィ匕を 1級のアミノ基を有する化合物を用いて行う（6— 7)記載のバイオチップの製造方法。
(6-10) 1級のアミノ基を有する化合物がアミノエタノール、又はグリシンである（6— 9) 記載のバイオチップの製造方法。
(6—11)生理活性物質が核酸、アブタマ一、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖タ ンパク質の内、少なくとも一つである（6— 7)—（6— 10)いずれかに記載のバイオチッ プの製造方法。
(6-12) (6— 7)—（6— 11)いずれか記載のバイオチップの製造方法により製造され たバイオチップ。
(7-1) ホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質、あるいは前記 高分子物質とホスホリルコリン基及びブチルメタタリレート基力もなるポリマーとの混合 ポリマーを基板の表面に有することを特徴とするバイオチップ。
(7-2) 高分子物質、あるいは混合ポリマーに含まれるホスホリルコリン基の割合が 2 0モル0 /0以上 40モル0 /0未満である（7— 1)記載のバイオチップ。
(7-3) 高分子物質、あるいは混合ポリマーに含まれる活性エステル基の割合が 15 モル％以上 25モル％未満である（7— 1)又は（7— 2)記載のバイオチップ。
(7-4) ホスホリルコリン基が 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン基である（ 7-1)一 (7-3) V、ずれか記載のバイオチップ。
(7-5) 活性エステル基力 ¾ -トロフエ-ルエステル基又は N—ヒドロキシスクシンィ ミドエステルである（7— 1)一 (7-4) V、ずれか記載のバイオチップ。
(7-6) 前記高分子物質がブチルメタタリレート基を含む共重合体である（7— 1)一 ( 7-5) V、ずれか記載のバイオチップ。
(7-7) 固相基板がプラスチック製である（7— 1)一 (7-6) Vヽずれか記載のバイオチ ップ。
(7-8) プラスチックが飽和環状ポリオレフインである（7— 7)記載のバイオチップ。 (7-9) 固相基板がガラス製である（7— 1)一 (7-6) V、ずれか記載のノィォチップ。 (7-10) (7— 1)一（7— 9)いずれか記載のバイオチップの製造方法であって、基板表 面にホスホリルコリン基及び活性エステル基を有する高分子物質、ある ヽは前記高分 子物質とホスホリルコリン基及びブチルメタタリレート基力もなるポリマーとの混合ポリ マーを有するバイオチップ用基板に生理活性物質を固定ィ匕する工程、及び前記生 理活性物質が固定化されている以外の基板表面の活性エステル基部に親水性基を 有するポリマーを導入する工程、を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
(7— 11)生理活性物質が核酸、ァプタアマ一、タンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、糖 タンパク質の内、少なくとも一つである（7— 10)に記載のバイオチップの製造方法。
[0397] (8-1)固相基板の表面に生理活性物質を固定ィ匕し蛍光色素を用いて検出するため のマイクロアレイ用基板であって、固相基板表面にホスホリルコリン基及び活性エス テル基を有する高分子物質を有することを特徴とするマイクロアレイ用基板。
(8-2)ホスホリルコリン基が 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン基である（8
-1)記載のマイクロアレイ用基板。
(8—3)活性エステル基力 ¾ -トロフエ-ルエステル基又は N—ヒドロキシスクシンイミ ドエステル基である（8— 1)又は（8— 2)記載のマイクロアレイ用基板。
(8-4)前記高分子物質がブチルメタタリレート基を含む共重合体である（8 - 1)一 (8 -3) V、ずれか記載のマイクロアレイ用基板。
(8-5)固相基板がプラスチック製である（8— 1)一 (8-4) V、ずれか記載のマイクロア レイ用基板。
(8-6)プラスチックが飽和環状ポリオレフインである（8— 5)記載のマイクロアレイ用基 板。
(8-7)固相基板がガラス製である請求項 (8— 1)一 (8-4) V、ずれか記載のマイクロア レイ用基板。
(8-8) (8— 1)一（8— 7)いずれか記載のマイクロアレイ用基板に核酸、ァプタマ一、タ ンパク質、オリゴペプチド、糖鎖、及び糖タンパク質の内、少なくとも一つの生理活性 物質を固定ィ匕したマイクロアレイ。
[0398] (9-1)固相基板の表面に生理活性物質を固定ィ匕するためのバイオチップ用基板で あって、固相基板表面上に層 Aが形成され、更に層 A上に層 Bが形成され、層 Aはァ タリレート基、メタタリレート基、ビュル基、及びォレフィン基力 選ばれる少なくとも 1 つの基を有する化合物 Aから形成され、層 Bはホスホリルコリン基を有する単量体の 重合体、及び活性エステル基を有する単量体の重合体から形成されて!ヽることを特 徴とするバイオチップ用基板。
(9—2)化合物 Aのアタリレート基、メタタリレート基、ビュル基、及びォレフィン基から 選ばれる少なくとも 1つの基の一部又は全て力 層 Bのホスホリルコリン基を有する単 量体、及び活性エステル基を有する単量体の共重合体と共有結合を形成している（ 9-1)記載のバイオチップ用基板。
(9—3)化合物 Aがアタリレート基、メタタリレート基、ビニル基、及びォレフィン基から 選ばれる少なくとも 1つの基を有するシランカップリング剤である（9 1)又は（9 2)記 載のバイオチップ用基板。
(9-4)ホスホリルコリン基を有する単量体が、更にメタタリ基又はアクリル基を有する ものである（9 1)一 (9-3) V、ずれか記載のバイオチップ用基板。
(9 5)ホスホリルコリン基を有する単量体が 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリル コリンである（9 4)記載のノ ィォチップ用基板。
(9-6)活性エステル基を有する単量体力 更にメタタリ基又はアクリル基を有するも のである（9 1)一 (9-5) V、ずれか記載のバイオチップ用基板。
(9—7)活性エステル基が p—-トロフエ-ルエステル基又は N—ヒドロキシスクシイミド エステル基である（9 1)一 (9-6) V、ずれか記載のバイオチップ用基板。
(9-8)固相基板がプラスチック製である（9 1)一 (9-7) V、ずれか記載のバイオチッ プ用基板。
(9-9)プラスチックが飽和環状ポリオレフインである（9 8)記載のバイオチップ用基 板。
(9-10)固相基板がガラス製である（9 1)一 (9-7) V、ずれか記載のバイオチップ用 基板。
(9-11) (9 1)一（9 10)いずれか記載のバイオチップ用基板の製造方法であって 、固相基板表面にアタリレート基、メタタリレート基、ビュル基、及びォレフィン基から 選ばれる少なくとも 1つの基を有する化合物 Aを有する層 Aを形成した後、層 A上で ホスホリルコリン基を有する単量体、及び活性エステル基を有する単量体を共重合す ることにより層 Bを形成することを特徴とするバイオチップ用基板の製造方法。 (9-12) (9-1)一 (9-10) ヽずれか記載のバイオチップ用基板に生理活性物質を固 定ィ匕したバイオチップ。
[0399] (10-1)基板と、前記基板に設けられた流路と、を有し、前記流路上に、ホスホリルコ リン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを含む高分子物質 を有し、前記カルボン酸誘導基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、 共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップ。
(10-2) (10-1)に記載のバイオチップにおいて、複数の前記カルボン酸誘導基を 有し、前記複数のカルボン酸誘導基は、前記捕捉物質と反応して共有結合を形成し て 、る力、または不活ィ匕されて 、ることを特徴とするバイオチップ。
(10-3) (10— 1)または（10— 2)に記載のバイオチップにおいて、前記カルボン酸誘 導基が活性エステル基であることを特徴とするバイオチップ。
(10-4) (10-3)に記載のバイオチップにおいて、前記活性エステル基が p—二トロフ ェニル基または N—ヒドロキシスクシンイミド基を有することを特徴とするバイオチップ。 (10— 5)基板と、前記基板に設けられた流路と、を有し、前記流路の表面に、ホスホリ ルコリン基を有する第一単位と下記式（1)に示される一価の基を有する第二単位とを 含む高分子物質を有し、前記式 (1)に示される一価の基と生理活性物質を捕捉する 捕捉物質とが反応して、共有結合を形成して ヽることを特徴とするバイオチップ。
[0400] [化 9]
Figure imgf000083_0001
(ただし、上記式（1)において、 Aは水酸基を除く一価の脱離基である。 ) (10-6) (10-5)に記載のバイオチップにおいて、前記式（1)に示される一価の基が 、下記式 (P)または式 (q)力も選択される 、ずれかの基であることを特徴とするバイオ チップ。 [0402] [化 10]
一 C一 O— CR1
Figure imgf000084_0001
- C - O - NR2
II (q)
O
[0403] (ただし、上記式 (p)および式 (q)にお 、て、 R1および R2は、それぞれ独立して、一価 の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記 式 (p)において、 R1は Cとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式 (q)において、 R2は Nとともに環を形成する二価の基であってもよい。 )
(10-7) (10—1)乃至（10—6)いずれかに記載のバイオチップにおいて、ホスホリル コリン基を含む前記第一単位が 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリン基を有 することを特徴とするノィォチップ。
(10-8) (10— 1)乃至（10— 7)いずれかに記載のバイオチップにおいて、前記高分 子物質は、ブチルメタタリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするバイオチ ップ。
(10-9) (10— 1)乃至（10— 8)に記載のバイオチップにおいて、前記基板の材料が プラスチックであることを特徴とするノィォチップ。
(10-10) (10— 1)乃至（10— 9)いずれかに記載のバイオチップにおいて、前記流路 を覆う保護部材を有することを特徴とするバイオチップ。
(10-11) (10-10)に記載のバイオチップにおいて、前記基板の材料と、前記保護 部材の材料のうち、少なくとも一方が検出光に対して透明なプラスチックであることを 特徴とするバイオチップ。
(10-12) (10— 1)乃至（10— 11)に記載のバイオチップにおいて、前記基板の材料 がガラスであることを特徴とするバイオチップ。
(10-13) (10—1)乃至（10—12)いずれかに記載のバイオチップにおいて、前記捕 捉物質は、核酸、アブタマ一、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、およ び糖タンパク質力もなる群力も選択される一または二以上の物質であることを特徴と するバイオチップ。
(10-14) (10— 1)乃至（10— 13)いずれかに記載のバイオチップにおいて、前記生 理活性物質は、核酸、アブタマ一、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、 および糖タンパク質力もなる群力も選択される一または二以上の物質であることを特 徴とするバイオチップ。
産業上の利用可能性
本発明のバイオチップは、タンパク質をはじめとする生理活性物質の非特異的吸着 が少ないため検体中の標的となる生理活性物質のロスが抑制されており、効率よく抗 原抗体反応等の特異的相互作用が生じるため、短時間で高感度な生理活性物質の 検出が可能である。また、基板の自己蛍光が低減ィ匕し、蛍光色素の吸着を低減され た構成であるため、 SZN比を高め、検体のシグナルを精密に検出することができる。

Claims

請求の範囲
[1] 基板の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と活性エステル基を有する第 二単位とを含む高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
[2] 請求の範囲第 1項に記載のバイオチップ用基板において、
前記高分子物質がブチルメタタリレート基を有する第三単位を含み、
前記高分子物質に含まれる前記ホスホリルコリン基の、前記ホスホリルコリン基と前 記活性エステル基と前記ブチルメタタリレート基との合計に対する割合力 20モル％ 以上 40モル％未満であることを特徴とするバイオチップ用基板。
[3] 請求の範囲第 1項に記載のバイオチップ用基板において、
前記高分子物質がブチルメタタリレート基を有する第三単位を含み、
前記高分子物質に含まれる前記ホスホリルコリン基の、前記ホスホリルコリン基と前 記活性エステル基と前記ブチルメタタリレート基との合計に対する割合力 3モル％ 以上 40モル％以下であることを特徴とするバイオチップ用基板。
[4] 請求の範囲第 1項に記載のバイオチップ用基板において、
前記高分子物質がブチルメタタリレート基を有する第三単位を含み、
前記高分子物質に含まれる前記活性エステル基の、前記ホスホリルコリン基と前記 活性エステル基と前記ブチルメタタリレート基との合計に対する割合力 15モル％以 上 25モル％未満であることを特徴とするバイオチップ用基板。
[5] 請求の範囲第 1項に記載のバイオチップ用基板において、
前記高分子物質がブチルメタタリレート基を有する第三単位を含み、
前記高分子物質に含まれる前記活性エステル基の、前記ホスホリルコリン基と前記 活性エステル基と前記ブチルメタタリレート基との合計に対する割合力 1モル％以 上 25モル％以下であることを特徴とするバイオチップ用基板。
[6] 基板の表面に、下記 (a)、 （b)成分を含む高分子物質を有することを特徴とするバ ィォチップ用基板。
(a)ホスホリルコリン基を有する第一単位と活性エステル基を有する第二単位とを含 む高分子
(b)ホスホリルコリン基を有する第一単位とブチルメタタリレート基を有する第三単位 とを含む高分子
[7] 請求の範囲第 6項に記載のバイオチップ用基板において、前記高分子物質に含ま れるホスホリルコリン基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記プチ ルメタタリレート基との合計に対する割合力 20モル％以上 40モル％未満であること を特徴とするバイオチップ用基板。
[8] 請求の範囲第 6項に記載のバイオチップ用基板において、前記高分子物質に含ま れるホスホリルコリン基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記プチ ルメタタリレート基との合計に対する割合力 3モル％以上 40モル％以下であることを 特徴とするバイオチップ用基板。
[9] 請求の範囲第 6項に記載のバイオチップ用基板において、前記高分子物質に含ま れる前記活性エステル基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブ チルメタタリレート基との合計に対する割合力 15モル％以上 25モル％未満であるこ とを特徴とするバイオチップ用基板。
[10] 請求の範囲第 6項に記載のバイオチップ用基板において、前記高分子物質に含ま れる前記活性エステル基の、前記ホスホリルコリン基と前記活性エステル基と前記ブ チルメタタリレート基との合計に対する割合力 1モル％以上 25モル％以下であるこ とを特徴とするバイオチップ用基板。
[11] 基板の表面に、
アミノ基を有する化合物を含む第一の層と、
ホスホリルコリン基を含む第一単位と活性エステル基を含む第二単位とを有する高 分子物質を含む第二の層と、
が、
前記基板、前記第一の層、および前記第二の層の順で積層されていることを特徴 とするバイオチップ用基板。
[12] 請求の範囲第 11項に記載のバイオチップ用基板において、
前記第一の層の前記アミノ基と、前記第二の層の前記活性エステル基とが反応し てアミド結合が形成されたことを特徴とするバイオチップ用基板。
[13] 請求の範囲第 11項に記載のバイオチップ用基板において、前記第一の層が前記 アミノ基を有するシランカップリング剤を含むことを特徴とするバイオチップ用基板。
[14] 請求の範囲第 1項、第 6項、および第 11項のいずれかに記載のバイオチップ用基 板において、
ホスホリルコリン基を含む前記第一単位が 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリル コリン基を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
[15] 請求の範囲第 1項または第 11項に記載のバイオチップ用基板において、前記高分 子物質は、ブチルメタタリレート基を含む第三単位を有することを特徴とするバイオチ ップ用基板。
[16] 基板上に第一の層が形成され、
さらに第一の層上に第二の層が形成され、
前記第一の層は、アタリレート基、メタタリレート基、ビュル基、およびアルケニル基 から選ばれる少なくとも一つの基を有する化合物から形成され、
前記第二の層は、ホスホリルコリン基を有する単量体の重合体と、活性エステル基 を有する単量体と、の共重合体から形成されて 、ることを特徴とするバイオチップ用 基板。
[17] 基板と、
前記基板上に設けられ、オルガノシロキサン力もなる第一の層と、
第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を有する単量体と、活性エステル基を有 する単量体との共重合体からなる第二の層と、
を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
[18] 請求の範囲 16項に記載のバイオチップ用基板において、
前記化合物の、アタリレート基、メタタリレート基、ビニル基、およびァルケ-ル基か ら選ばれる少なくとも 1つの基が、前記第二の層の前記共重合体と共有結合を形成 して！/、ることを特徴とするバイオチップ用基板。
[19] 請求の範囲 16項に記載のバイオチップ用基板において、
前記第一の層が、アタリレート基、メタタリレート基、ビュル基、およびアルケニル基 力も選ばれる少なくとも 1つの基を有するシランカップリング剤により形成されたことを 特徴とするバイオチップ用基板。 [20] 請求の範囲 19項に記載のバイオチップ用基板において、ホスホリルコリン基を有す る前記単量体力 メタクリル基またはアクリル基を有することを特徴とするバイオチップ 用基板。
[21] 請求の範囲 19項に記載のバイオチップ用基板において、ホスホリルコリン基を有す る前記単量体が、 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリルコリンであることを特徴とす るバイオチップ用基板。
[22] 請求の範囲 16項に記載のバイオチップ用基板にぉ 、て、活性エステル基を有する 前記単量体力 S、メタクリル基またはアクリル基を有することを特徴とするバイオチップ 用基板。
[23] 請求の範囲第 1項、第 6項、第 11項、第 16項、および第 17項のいずれかに記載の バイオチップ用基板にぉ 、て、前記活性エステル基が p—二トロフエ-ル基または N— ヒドロキシスクシンイミド基を含むことを特徴とするバイオチップ用基板。
[24] 請求の範囲第 1項、第 6項、第 11項、第 16項、および第 17項のいずれかに記載の バイオチップ用基板にぉ 、て、前記基板の材料がプラスチックであることを特徴とす るバイオチップ用基板。
[25] 請求の範囲第 24項に記載のバイオチップ用基板にぉ 、て、前記プラスチックが飽 和環状ポリオレフインであることを特徴とするバイオチップ用基板。
[26] 請求の範囲第 1項、第 6項、第 11項、第 16項、および第 17項のいずれかに記載の バイオチップ用基板にお!、て、前記基板の材料がガラスであることを特徴とするバイ ォチップ用基板。
[27] 基板の表面に、ホスホリルコリン基を含む第一単位と下記式（1)に示される一価の 基を含む第二単位とを有する高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ用 基板。
[化 11] (ただし、上記式（1)において、 Aは水酸基を除く一価の脱離基である。 ) 請求の範囲第 27項に記載のバイオチップ用基板において、前記式（1)に示される 一価の基が、下記式 (p)または式 (q)力も選択される 、ずれかの基であることを特徴 とするバイオチップ用基板。
[化 12] 一 C 一 O— CR1
II (P)
o
- C - O - NR2
II (q)
O
(ただし、上記式 (p)および式 (q)において、 R1および R2は、それぞれ独立して、一価 の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記 式 (p)において、 R1は Cとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式 (q)において、 R2は Nとともに環を形成する二価の基であってもよい。 )
[29] 基板の表面に、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二 単位とを有する高分子物質を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
[30] 基板の表面に、下記 (a)、 （b)成分を含む高分子物質を有することを特徴とするバ ィォチップ用基板。
(a)ホスホリルコリン基を有する第一単位と下記式（1)で示される一価の基を有する 第二単位とを含む高分子
(b)ホスホリルコリン基を有する第一単位とブチルメタタリレート基を有する第三単位 とを含む高分子
[化 13] C o =
(ただし、上記式（1 A)において、 Aは水酸基を除く一価の脱離基である。 ) [31] 請求の範囲第 30項に記載のバイオチップ用基板において、前記式（1)に示される 一価の基が、下記式 (p)または式 (q)力も選択される 、ずれかの基であることを特徴 とするバイオチップ用基板。 —,、 *
[化 14] 一 C 一 O— CR1
II (P)
o
- C - O - NR2
II (q)
O
(ただし、上記式 (p)および式 (q)において、 R1および R2は、それぞれ独立して、一価 の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記 式 (p)において、 R1は Cとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式 (q)において、 R2は Nとともに環を形成する二価の基であってもよい。 )
[32] 基板の表面に、下記 (a)、（b)成分を含む高分子物質を有することを特徴とするバ ィォチップ用基板。
(a)ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する第二単位とを 含む高分子
(b)ホスホリルコリン基を有する第一単位とブチルメタタリレート基を有する第三単位 とを含む高分子 [33] 基板と、
前記基板上に設けられ、アミノ基を有する化合物を含む第一の層と、
前記第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を有する第一単位と下記式（1)で 示される一価の基を有する第二単位とを含む高分子物質を含む第二の層と、 を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
[化 15]
Figure imgf000092_0001
〇
(ただし、上記式（1)において、 Aは水酸基を除く一価の脱離基である。 ) [34] 請求の範囲第 33項に記載のバイオチップ用基板において、前記式（1)に示される 一価の基が、下記式 (p)または式 (q)力も選択される 、ずれかの基であることを特徴 とするバイオチップ用基板。
[化 16]
― C 一 O— CR1
II (P)
o
一 C 一 〇 一 NR2
II (q)
O
(ただし、上記式 (p)および式 (q)において、 R1および R2は、それぞれ独立して、一価 の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記 式 (p)において、 R1は Cとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式 (q)において、 R2は Nとともに環を形成する二価の基であってもよい。 ) [35] 基板と、
前一記基板上に設けられ、アミノ基を有する化合物を含む第一の層と、
前記第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導 o
基を含む第二単位とを有する高分子物質を含む第二の層と、
を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
[36] 基板と、
前記基板上に設けられ、アタリレート基、メタタリレート基、ビニル基、およびァルケ -ル基から選ばれる少なくとも 1つの基を有する化合物から形成された第一の層と、 前記第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を有する単量体の重合体と、下記 式（1)で示される一価の基を有する単量体と、の共重合体から形成された第二の層 と、
を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
[化 17] 一 A
Figure imgf000093_0001
(ただし、上記式（1)において、 Aは水酸基を除く一価の脱離基である。 ) [37] 請求の範囲第 36項に記載のバイオチップ用基板において、前記式（1)に示される 一価の基が、下記式 (p)または式 (q)力も選択される 、ずれかの基であることを特徴 とするバイオチップ用基板。
[化 18] O— CR1
- C - O - NR2
II (q)
O
(ただし、上記式 (p)および式 (q)において、 R1および R2は、それぞれ独立して、一価 の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記 式 (p)において、 R1は Cとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式 (q)において、 R2は Nとともに環を形成する二価の基であってもよい。 )
[38] 基板と、
前記基板上に設けられ、アタリレート基、メタタリレート基、ビニル基、およびァルケ -ル基から選ばれる少なくとも 1つの基を有する化合物から形成された第一の層と、 前記第一の層上に設けられ、ホスホリルコリン基を有する単量体と、カルボン酸誘 導基を有する単量体と、の共重合体から形成された第二の層と、
を有することを特徴とするバイオチップ用基板。
[39] 請求の範囲第 1項または第 6項に記載のバイオチップ用基板の前記基板の表面に 生理活性物質を捕捉する捕捉物質を固定化し、蛍光色素を用いて前記生理活性物 質を検出するためのマイクロアレイ用基板であって、
前記基板の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と活性エステル基を有す る第二単位とを含む前記高分子物質を有することを特徴とするマイクロアレイ用基板
[40] 請求の範囲第 1項、第 6項、第 11項、第 16項、および第 17項のいずれかに記載の ノィォチップ用基板に、生理活性物質を捕捉する捕捉物質が固定化されたことを特 徴とするバイオチップ。 [41] ホスホリルコリン基を含む第一単位と活性エステル基を含む第二単位とを有する高 分子物質を表面に有する基板を含むバイオチップであって、
前記活性エステル基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合 を形成して 、ることを特徴とするバイオチップ。
[42] 基板の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と、活性エステル基を有する 第二単位を複数と、を含む高分子物質を有するバイオチップであって、
一部の前記活性エステル基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して共有 結合を形成しており、
残りの前記活性エステル基と親水基を有する親水性ポリマーとが反応して共有結 合を形成して 、ることを特徴とするバイオチップ。
[43] 請求の範囲第 42項に記載のバイオチップにおいて、前記親水性ポリマーがァミノ 基を有することを特徴とするバイオチップ。
[44] 請求の範囲第 42項に記載のバイオチップにお 、て、前記親水性ポリマーは、ポリ アルキレンォキシドまたは複数種類の前記ポリアルキレンォキシドを構造中に含むこ とを特徴とするバイオチップ。
[45] 請求の範囲第 41項または第 42項に記載のバイオチップにおいて、前記基板の材 料がプラスチックであることを特徴とするバイオチップ。
[46] 請求の範囲第 45項に記載のバイオチップにおいて、前記プラスチックが飽和環状 ポリオレフインであることを特徴とするバイオチップ。
[47] 基板と、前記基板に設けられた流路と、を有し、
前記流路の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と活性エステル基を有す る第二単位とを含む高分子物質を有し、
前記活性エステル基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合 を形成して 、ることを特徴とするバイオチップ。
[48] 請求の範囲第 47項に記載のバイオチップにお 、て、
複数の前記活性エステル基を有し、
前記複数の活性エステル基は、前記捕捉物質と反応して共有結合を形成して ヽる 力 または不活ィ匕されて 、ることを特徴とするノィォチップ。 [49] 請求の範囲第 47項に記載のバイオチップにお 、て、前記流路を覆う保護部材を有 することを特徴とするノィォチップ。
[50] 請求の範囲第 49項に記載のバイオチップにおいて、前記基板の材料と前記保護 部材の材料のうち、少なくともがプラスチックであることを特徴とするノィォチップ。
[51] 請求の範囲第 47項に記載のバイオチップにおいて、前記基板の材料が、検出光 に対して透明なプラスチックであることを特徴とするバイオチップ。
[52] 請求項の範囲第 41項、第 42項および第 47項のいずれかに記載のバイオチップに おいて、さらに前記捕捉物質に前記生理活性物質が捕捉されたことを特徴とするバ ィォチップ。
[53] 請求の範囲第 41項、第 42項および第 47項のいずれかに記載のバイオチップにお いて、
ホスホリルコリン基を含む前記第一単位が 2—メタクリロイルォキシェチルホスホリル コリン基を有することを特徴とするノィォチップ。
[54] 請求の範囲第 41項、第 42項および第 47項のいずれかに記載のバイオチップにお
V、て、前記活性エステル基力 ¾ ニトロフエニル基または N—ヒドロキシスクシンイミド基 を有することを特徴とするバイオチップ。
[55] 請求の範囲第 41項、第 42項および第 47項のいずれかに記載のバイオチップにお いて、前記高分子物質は、ブチルメタタリレート基を含む第三単位を有することを特 徴とするバイオチップ。
[56] 請求の範囲第 41項、第 42項および第 47項のいずれかに記載のバイオチップにお
V、て、前記基板の材料がガラスであることを特徴とするバイオチップ。
[57] 請求の範囲第 41項、第 42項および第 47項のいずれかに記載のバイオチップにお いて、前記捕捉物質は、核酸、アブタマ一、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド 、糖鎖、および糖タンパク質力 なる群力 選択される一または二以上の物質である ことを特徴とするバイオチップ。
[58] 請求の範囲第 41項、第 42項および第 47項のいずれかに記載のバイオチップにお いて、生理活性物質を捕捉する捕捉物質が、中性またはアルカリ性の条件で前記基 板の表面に固定ィ匕されてなることを特徴とするノィォチップ。 [59] 請求の範囲第 41項、第 42項および第 47項の 、ずれかに記載のバイオチップにお い一て、前記生理活性物質は、核酸、アブタマ一、タンパク質、酵素、抗体、オリゴぺプ チド、糖鎖 C o、 =および糖タンパク質力もなる群力 選択される一または二以上の物質で あることを特徴とするノィォチップ。
[60] ホスホリルコリン基を含む第一単位と下記式（1)に示される一価の基を含む第二単 位とを有する高分子物質を表面に有する基板を含むバイオチップであって、 前記式 (1)に示される一価の基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して 、共有結合を形成して ヽることを特徴とするバイオチップ。
[化 19]
Figure imgf000097_0001
(ただし、上記式（1)において、 Aは水酸基を除く一価の脱離基である。 )
[61] 請求の範囲第 60項に記載のバイオチップにおいて、前記式（1)に示される一価の 基力 下記式 (P)または式 (q)力も選択される 、ずれかの基であることを特徴とするバ ィォチップ。
[化 20]
― C 一 O— CR1
II (P)
o
一 C 一 〇 一 NR2
II (q)
O
(ただし、上記式 (p)および式 (q)において、 R1および R2は、それぞれ独立して、一価 の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記 式 (p)において、 R1は Cとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式 (q)において、 R2は Nとともに環を形成する二価の基であってもよい。 )
C o =
[62] ホスホリルコリン基を含む第一単位とカルボン酸誘導基を含む第二単位とを有する 高分子物質を表面に有する基板を含むバイオチップであって、
前記カルボン酸誘導基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結 合を形成して 、ることを特徴とするバイオチップ。
[63] 基板の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と、下記式（1)で示される一価 の基を有する第二単位を複数と、を含む高分子物質を有するバイオチップであって、 一部の前記式（1)で示される一価の基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反 応して共有結合を形成しており、
残りの前記式（1)で示される一価の基と親水基を有する親水性ポリマーとが反応し て共有結合を形成していることを特徴とするバイオチップ。
[化 21] 一 A
( 1 )
(ただし、上記式（1)において、 Aは水酸基を除く一価の脱離基である。 ) [64] 請求の範囲第 63項に記載のバイオチップにおいて、前記式（1)に示される一価の 基力 下記式 (P)または式 (q)力も選択される 、ずれかの基であることを特徴とするバ ィォチップ。
[化 22] ― C— O— CR1
II (P)
o
- C - O - NR2
II (q)
O
(ただし、上記式 (p)および式 (q)において、 R1および R2は、それぞれ独立して、一価 の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記 式 (p)において、 R1は Cとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式 (q)において、 R2は Nとともに環を形成する二価の基であってもよい。 )
[65] 基板の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有する 第二単位を複数とを含む高分子物質を有するバイオチップであって、
一部の前記カルボン酸誘導基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して共 有結合を形成しており、
残りの前記カルボン酸誘導基と親水基を有する親水性ポリマーとが反応して共有 結合を形成して ヽることを特徴とするバイオチップ。
[66] 基板と、前記基板に設けられた流路と、を有し、
前記流路の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位と下記式（1)に示される 一価の基を有する第二単位とを含む高分子物質を有し、
前記活性エステル基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合 を形成して 、ることを特徴とするバイオチップ。
[化 23] C o =
(ただし、上記式（1 A)において、 Aは水酸基を除く一価の脱離基である。 ) [67] 請求の範囲第 66項に記載のバイオチップにおいて、前記式（1)に示される一価の 基力 下記式 (P)または式 (q)力も選択される 、ずれかの基であることを特徴とするバ ィォチップ。 —,、 *
[化 24] 一 C 一 O— CR1
II (P)
o
- C - O - NR2
II (q)
O
(ただし、上記式 (p)および式 (q)において、 R1および R2は、それぞれ独立して、一価 の有機基であり、直鎖状、分岐状、および環状のいずれであってもよい。また、上記 式 (p)において、 R1は Cとともに環を形成する二価の基であってもよい。また、上記式 (q)において、 R2は Nとともに環を形成する二価の基であってもよい。 )
[68] 基板と、前記基板に設けられた流路と、を有し、
前記流路の表面に、ホスホリルコリン基を有する第一単位とカルボン酸誘導基を有 する第二単位とを含む高分子物質を有し、
前記活性エステル基と生理活性物質を捕捉する捕捉物質とが反応して、共有結合 を形成して 、ることを特徴とするバイオチップ。
[69] 請求の範囲第 39項に記載のマイクロアレイ用基板に、 核酸、アブタマ一、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、および糖タンパ ク質力 なる群力 選択される一または二以上の前記捕捉物質が固定化されたことを 特徴とするマイクロアレイ。
[70] 請求の範囲第 11項に記載のバイオチップ用基板の製造方法であって、
(1)前記基板の前記表面とアミノ基を有する前記化合物との接触工程、および
(2)前記アミノ基を有する化合物と前記高分子物質との接触工程、
を含むことを特徴とするバイオチップ用基板の製造方法。
[71] 請求の範囲第 16項に記載のバイオチップ用基板の製造方法であって、
前記基板上に、前記第一の層を形成した後、
前記第一の層上で、ホスホリルコリン基を有する前記単量体と活性エステル基を有 する前記単量体とを共重合することにより前記第二の層を形成することを特徴とする ノィォチップ用基板の製造方法。
[72] 請求の範囲第 1項、第 6項、第 11項、第 16項、および第 17項のいずれかに記載の バイオチップ用基板の使用方法であって、
(1)生理活性物質を捕捉する捕捉物質を中性またはアルカリ性の条件で前記基板 上に固定ィ匕するステップ、および
(2)前記マイクロチップ用基板の表面に、検出される生理活性物質を含む前記条件 以下の pHの液体を接触させて、前記捕捉物質に前記生理活性物質を捕捉させるス テツプ、
を含むことを特徴とするバイオチップ用基板の使用方法。
[73] 請求の範囲第 72項に記載のバイオチップ用基板の使用方法において、
前記捕捉物質は、核酸、アブタマ一、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖 鎖、および糖タンパク質力もなる群力も選択される一または二以上の物質であること を特徴とするバイオチップ用基板の使用方法。
[74] 請求の範囲第 72項に記載のバイオチップ用基板の使用方法において、
検出される前記生理活性物質は、核酸、アブタマ一、タンパク質、酵素、抗体、オリ ゴペプチド、糖鎖、糖タンパク質力もなる群力も選択される一または二以上の物質で あることを特徴とするノィォチップの使用方法。 [75] 請求の範囲第 1項、第 6項、第 11項、第 16項、および第 17項のいずれかに記載の バイオチップ用基板を用 、たバイオチップの製造方法であって、
前記バイオチップ用基板は、複数の前記活性エステル基を有し、
一部の前記活性エステル基と前記捕捉物質とを反応させて、前記捕捉物質を固定 化する工程と、
捕捉物質を固定ィ匕する工程の後、残りの前記活性エステル基を不活性ィ匕する工程 と、
を有することを特徴とするバイオチップの製造方法。
[76] 請求の範囲第 75項に記載のバイオチップの製造方法において、残りの活性エステ ル基を不活性ィ匕する前記工程を、アルカリィ匕合物を用いて行うことを特徴とするバイ ォチップの製造方法。
[77] 請求の範囲第 75項に記載のバイオチップの製造方法において、残りの活性エステ ル基を不活性ィ匕する前記工程を、 1級のアミノ基を有する化合物を用いて行うことを 特徴とするバイオチップの製造方法。
[78] 請求の範囲第 77項に記載のバイオチップの製造方法において、 1級のアミノ基を 有する前記化合物力 アミノエタノールまたはグリシンであることを特徴とするバイオ チップの製造方法。
[79] 請求の範囲第 75項に記載のバイオチップの製造方法にぉ 、て、前記捕捉物質が 核酸、アブタマ一、タンパク質、酵素、抗体、オリゴペプチド、糖鎖、および糖タンパ ク質力 なる群力 選択される一または二以上の物質であることを特徴とするバイオ チップの製造方法。
[80] 請求の範囲第 41項に記載のバイオチップの製造方法であって、前記捕捉物質を 含む酸性または中性の液体を前記基板の前記表面に接触させる工程を含むことを 特徴とするバイオチップの製造方法。
[81] 請求の範囲第 42項に記載のバイオチップの製造方法であって、
前記バイオチップ用基板の一部の前記活性エステル基と前記捕捉物質とを反応さ せて、共有結合を形成させて、前記捕捉物質を固定化する工程と、 捕捉物質を固定ィ匕する前記工程の後、残りの前記活性エステル基と前記親水性ポ リマーとを反応させて、共有結合させる工程と、
を含むことを特徴とするバイオチップの製造方法。
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Cited By (21)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006062009A1 (ja) * 2004-12-09 2006-06-15 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Ｄｎａ鎖伸長方法、ｄｎａ鎖増幅方法およびｄｎａ鎖伸長用マイクロアレイ
JP2006230335A (ja) * 2005-02-28 2006-09-07 Sumitomo Bakelite Co Ltd 遺伝子の検出方法
JP2006234712A (ja) * 2005-02-28 2006-09-07 Sumitomo Bakelite Co Ltd Ｄｎａの固定化方法
JP2006299045A (ja) * 2005-04-19 2006-11-02 Sumitomo Bakelite Co Ltd 医療材料用高分子化合物及び該高分子化合物を用いたバイオチップ用基板
WO2006123647A1 (ja) 2005-05-17 2006-11-23 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. 遺伝子の検出方法
JP2006322739A (ja) * 2005-05-17 2006-11-30 Sumitomo Bakelite Co Ltd 遺伝子の検出方法
JP2006322708A (ja) * 2005-05-17 2006-11-30 Institute Of Physical & Chemical Research 物質固定化方法
JP2007037473A (ja) * 2005-08-04 2007-02-15 Sumitomo Bakelite Co Ltd 遺伝子配列の検出方法
WO2007020847A1 (ja) 2005-08-19 2007-02-22 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. ｃＤＮＡおよびＲＮＡ鎖の製造方法およびヌクレオチド固定化担体
JP2007074928A (ja) * 2005-09-12 2007-03-29 Sumitomo Bakelite Co Ltd Ｄｎａ鎖増幅方法
JP2007155387A (ja) * 2005-12-01 2007-06-21 Sumitomo Bakelite Co Ltd バイオチップおよびその使用方法
JP2007163240A (ja) * 2005-12-13 2007-06-28 Sumitomo Bakelite Co Ltd バイオチップおよびその使用方法
WO2007097119A1 (ja) * 2006-02-21 2007-08-30 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. ｍＲＮＡ捕捉用担体及びｍＲＮＡの精製方法
JP2007285835A (ja) * 2006-04-17 2007-11-01 Sumitomo Bakelite Co Ltd バイオプレート用プレート及びその製造方法並びにバイオプレート
WO2007141912A1 (ja) * 2006-06-07 2007-12-13 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Ｒｎａ検出方法
JP2008544000A (ja) * 2005-06-14 2008-12-04 ビーエーエスエフ コンストラクション ポリマース ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ポリエーテル含有コポリマー
WO2009069711A1 (ja) * 2007-11-30 2009-06-04 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. small RNAの取得用担体、取得方法及び取得用試薬
JP4922936B2 (ja) * 2005-07-25 2012-04-25 住友ベークライト株式会社 細菌の検出方法
JP5167811B2 (ja) * 2005-05-19 2013-03-21 住友ベークライト株式会社 医療材料用高分子化合物及び該高分子化合物を用いたバイオチップ用基板
JP5401989B2 (ja) * 2007-01-16 2014-01-29 住友ベークライト株式会社 医療用粒子、及び分析用粒子、並びにそれらの製造方法
US9598544B2 (en) 2005-08-25 2017-03-21 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Particles coated with zwitterionic polymers comprising sulfobetaine or carboxybetaine

Families Citing this family (11)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2002088389A1 (fr) * 2001-04-26 2002-11-07 Nof Corporation Inhibiteurs d'hybridation non specifiques, reactifs d'examen clinique et procede d'examen clinique
KR100842656B1 (ko) * 2006-04-29 2008-06-30 충북대학교 산학협력단 바이오칩의 센싱 구조물 제조방법
WO2008114935A1 (en) * 2007-03-19 2008-09-25 Knu-Industry Cooperation Foundation Chip and method for determining transglutaminase activity
KR101050690B1 (ko) * 2007-09-07 2011-07-20 광주과학기술원 다기능성 고분자막 및 그의 용도
JP5387540B2 (ja) * 2010-10-27 2014-01-15 パナソニック株式会社 電子部品実装用装置および電子部品実装用の作業実行方法
JP5895131B2 (ja) * 2012-12-25 2016-03-30 パナソニックＩｐマネジメント株式会社 電子部品実装システムおよび電子部品実装方法
KR101454206B1 (ko) 2013-03-25 2014-10-23 한국표준과학연구원 고분자 시료의 비특이적 결합방지를 위한 구조체, 기재 및 방법과 이를 이용한 바이오칩, 바이오칩용 기판, 시료용기, 유동관 및 시료기판
JP6534448B2 (ja) * 2015-10-14 2019-06-26 ヤマハ発動機株式会社 部品実装装置
CA3043708A1 (en) * 2016-11-17 2018-05-24 Cleveland State University Chip platforms for microarray 3d bioprinting
US20210023522A1 (en) * 2017-09-07 2021-01-28 Mitsubishi Gas Chemical Company, Inc. Substrate for biochip, biochip, method for manufacturing biochip, and method for preserving biochip
US11262349B2 (en) 2017-10-11 2022-03-01 Cleveland State University Multiplexed immune cell assays on a micropillar/microwell chip platform

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004198402A (ja) * 2002-12-02 2004-07-15 Sumitomo Bakelite Co Ltd マイクロアレイ及びその製造方法

Family Cites Families (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO1997008177A1 (fr) * 1995-08-31 1997-03-06 Nof Corporation Derive d'acide fumarique et son polymere
US6258371B1 (en) * 1998-04-03 2001-07-10 Medtronic Inc Method for making biocompatible medical article
US20020187249A1 (en) * 2001-05-08 2002-12-12 Wilhelm Pluster Process for the production of surface-functionalized supports that serve as starting materials for microarrays used for immobilizing biomolecules
US20050176003A1 (en) * 2001-11-27 2005-08-11 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Plastic substrate for microchips
ES2531326T3 (es) * 2003-02-28 2015-03-13 Biointeractions Ltd Sistemas de red polimérica para dispositivos médicos y métodos de uso

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
JP2004198402A (ja) * 2002-12-02 2004-07-15 Sumitomo Bakelite Co Ltd マイクロアレイ及びその製造方法

Cited By (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2006062009A1 (ja) * 2004-12-09 2006-06-15 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Ｄｎａ鎖伸長方法、ｄｎａ鎖増幅方法およびｄｎａ鎖伸長用マイクロアレイ
JP2006187270A (ja) * 2004-12-09 2006-07-20 Sumitomo Bakelite Co Ltd Ｄｎａ鎖伸長方法、ｄｎａ鎖増幅方法およびｄｎａ鎖伸長用マイクロアレイ
US8765417B2 (en) 2004-12-09 2014-07-01 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Method of elongating DNA through immobilizing primer DNA chains on a substrate, a method of amplifying a DNA chain
JP2006230335A (ja) * 2005-02-28 2006-09-07 Sumitomo Bakelite Co Ltd 遺伝子の検出方法
JP2006234712A (ja) * 2005-02-28 2006-09-07 Sumitomo Bakelite Co Ltd Ｄｎａの固定化方法
JP2006299045A (ja) * 2005-04-19 2006-11-02 Sumitomo Bakelite Co Ltd 医療材料用高分子化合物及び該高分子化合物を用いたバイオチップ用基板
US7968290B2 (en) 2005-05-17 2011-06-28 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Method of detecting gene
WO2006123647A1 (ja) 2005-05-17 2006-11-23 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. 遺伝子の検出方法
JP2006322708A (ja) * 2005-05-17 2006-11-30 Institute Of Physical & Chemical Research 物質固定化方法
JP5003484B2 (ja) * 2005-05-17 2012-08-15 住友ベークライト株式会社 遺伝子の検出方法
JP2006322739A (ja) * 2005-05-17 2006-11-30 Sumitomo Bakelite Co Ltd 遺伝子の検出方法
EP1908848A1 (en) * 2005-05-17 2008-04-09 Sumitomo Bakelite Company, Ltd. Method for detection of gene
JP4505581B2 (ja) * 2005-05-17 2010-07-21 独立行政法人理化学研究所 物質固定化方法
EP1908848A4 (en) * 2005-05-17 2008-08-06 Sumitomo Bakelite Co GENNACHWEISVERFAHREN
US9046515B2 (en) 2005-05-19 2015-06-02 Sumitomo Bakelite Company, Ltd. Polymer compound for medical material, and biochip substrate using the polymer compound
JP5167811B2 (ja) * 2005-05-19 2013-03-21 住友ベークライト株式会社 医療材料用高分子化合物及び該高分子化合物を用いたバイオチップ用基板
JP2008544000A (ja) * 2005-06-14 2008-12-04 ビーエーエスエフ コンストラクション ポリマース ゲゼルシャフト ミット ベシュレンクテル ハフツング ポリエーテル含有コポリマー
JP4922936B2 (ja) * 2005-07-25 2012-04-25 住友ベークライト株式会社 細菌の検出方法
JP2007037473A (ja) * 2005-08-04 2007-02-15 Sumitomo Bakelite Co Ltd 遺伝子配列の検出方法
JP5155660B2 (ja) * 2005-08-19 2013-03-06 住友ベークライト株式会社 ｃＤＮＡおよびＲＮＡ鎖の製造方法
WO2007020847A1 (ja) 2005-08-19 2007-02-22 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. ｃＤＮＡおよびＲＮＡ鎖の製造方法およびヌクレオチド固定化担体
EP1930422A4 (en) * 2005-08-19 2010-03-31 Sumitomo Bakelite Co PROCESS FOR PRODUCING cDNA AND RNA CHAINS AND NUCLEOTIDE IMMOBILIZING MEDIUM
EP1930422A1 (en) * 2005-08-19 2008-06-11 Sumitomo Bakelite Company, Ltd. Method for producing cdna and rna chains and nucleotide-immobilized support
US8822670B2 (en) 2005-08-19 2014-09-02 Sumitomo Bakelite Company, Ltd. Method of synthesizing cDNA and method of synthesizing RNA chains, and nucleotide-immobilized carrier
US9598544B2 (en) 2005-08-25 2017-03-21 University Of Washington Through Its Center For Commercialization Particles coated with zwitterionic polymers comprising sulfobetaine or carboxybetaine
JP2007074928A (ja) * 2005-09-12 2007-03-29 Sumitomo Bakelite Co Ltd Ｄｎａ鎖増幅方法
JP2007155387A (ja) * 2005-12-01 2007-06-21 Sumitomo Bakelite Co Ltd バイオチップおよびその使用方法
JP4682828B2 (ja) * 2005-12-01 2011-05-11 住友ベークライト株式会社 バイオチップおよびその使用方法
JP2007163240A (ja) * 2005-12-13 2007-06-28 Sumitomo Bakelite Co Ltd バイオチップおよびその使用方法
JP4640150B2 (ja) * 2005-12-13 2011-03-02 住友ベークライト株式会社 バイオチップおよびその使用方法
WO2007097119A1 (ja) * 2006-02-21 2007-08-30 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. ｍＲＮＡ捕捉用担体及びｍＲＮＡの精製方法
JP5262708B2 (ja) * 2006-02-21 2013-08-14 住友ベークライト株式会社 ｍＲＮＡ捕捉用担体及びｍＲＮＡの精製方法
JP2007285835A (ja) * 2006-04-17 2007-11-01 Sumitomo Bakelite Co Ltd バイオプレート用プレート及びその製造方法並びにバイオプレート
WO2007141912A1 (ja) * 2006-06-07 2007-12-13 Sumitomo Bakelite Co., Ltd. Ｒｎａ検出方法
US8088580B2 (en) 2006-06-07 2012-01-03 Sumitomo Bakelite Company, Ltd. RNA detection method
JPWO2007141912A1 (ja) * 2006-06-07 2009-10-15 住友ベークライト株式会社 Ｒｎａ検出方法
JP5401989B2 (ja) * 2007-01-16 2014-01-29 住友ベークライト株式会社 医療用粒子、及び分析用粒子、並びにそれらの製造方法
WO2009069711A1 (ja) * 2007-11-30 2009-06-04 Wako Pure Chemical Industries, Ltd. small RNAの取得用担体、取得方法及び取得用試薬
JP2009148243A (ja) * 2007-11-30 2009-07-09 Wako Pure Chem Ind Ltd ｓｍａｌｌＲＮＡの取得用担体、取得方法及び取得用試薬

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