KR20070031781A - 생체분자 고정용 점착성 비드 및 이를 이용한 바이오칩의제조방법 - Google Patents
생체분자 고정용 점착성 비드 및 이를 이용한 바이오칩의제조방법 Download PDFInfo
- Publication number
- KR20070031781A KR20070031781A KR1020060037275A KR20060037275A KR20070031781A KR 20070031781 A KR20070031781 A KR 20070031781A KR 1020060037275 A KR1020060037275 A KR 1020060037275A KR 20060037275 A KR20060037275 A KR 20060037275A KR 20070031781 A KR20070031781 A KR 20070031781A
- Authority
- KR
- South Korea
- Prior art keywords
- beads
- biochip
- substrate
- group
- adhesive
- Prior art date
Links
- 239000011324 bead Substances 0.000 title claims abstract description 151
- 230000001070 adhesive effect Effects 0.000 title claims abstract description 66
- 239000000853 adhesive Substances 0.000 title claims abstract description 65
- 238000000018 DNA microarray Methods 0.000 title claims abstract description 56
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 title claims abstract description 20
- 239000000758 substrate Substances 0.000 claims abstract description 69
- 238000000034 method Methods 0.000 claims abstract description 51
- 239000007900 aqueous suspension Substances 0.000 claims abstract description 25
- 239000000178 monomer Substances 0.000 claims description 30
- 238000001514 detection method Methods 0.000 claims description 19
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims description 16
- 239000013077 target material Substances 0.000 claims description 16
- 239000000725 suspension Substances 0.000 claims description 14
- 230000009477 glass transition Effects 0.000 claims description 13
- 229920003229 poly(methyl methacrylate) Polymers 0.000 claims description 12
- 239000004926 polymethyl methacrylate Substances 0.000 claims description 12
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 11
- 239000012736 aqueous medium Substances 0.000 claims description 10
- OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N Methanol Chemical compound OC OKKJLVBELUTLKV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 9
- 239000004793 Polystyrene Substances 0.000 claims description 9
- 238000002156 mixing Methods 0.000 claims description 9
- HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N Acrylamide Chemical compound NC(=O)C=C HRPVXLWXLXDGHG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N Butadiene Chemical compound C=CC=C KAKZBPTYRLMSJV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N Hydroxyethyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCO WOBHKFSMXKNTIM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- BAPJBEWLBFYGME-UHFFFAOYSA-N Methyl acrylate Chemical compound COC(=O)C=C BAPJBEWLBFYGME-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N Styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1 PPBRXRYQALVLMV-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- XXROGKLTLUQVRX-UHFFFAOYSA-N allyl alcohol Chemical compound OCC=C XXROGKLTLUQVRX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N arachidonic acid Chemical compound CCCCC\C=C/C\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCC(O)=O YZXBAPSDXZZRGB-DOFZRALJSA-N 0.000 claims description 8
- 238000001035 drying Methods 0.000 claims description 8
- 239000003995 emulsifying agent Substances 0.000 claims description 8
- 239000000839 emulsion Substances 0.000 claims description 8
- 229920002223 polystyrene Polymers 0.000 claims description 8
- XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N water Substances O XLYOFNOQVPJJNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 8
- 229920002818 (Hydroxyethyl)methacrylate Polymers 0.000 claims description 6
- CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N Acetone Chemical compound CC(C)=O CSCPPACGZOOCGX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N Ethanol Chemical compound CCO LFQSCWFLJHTTHZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 6
- 239000002202 Polyethylene glycol Substances 0.000 claims description 6
- 239000000463 material Substances 0.000 claims description 6
- 239000012528 membrane Substances 0.000 claims description 6
- 229920001223 polyethylene glycol Polymers 0.000 claims description 6
- JAHNSTQSQJOJLO-UHFFFAOYSA-N 2-(3-fluorophenyl)-1h-imidazole Chemical compound FC1=CC=CC(C=2NC=CN=2)=C1 JAHNSTQSQJOJLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 230000002209 hydrophobic effect Effects 0.000 claims description 5
- 238000002032 lab-on-a-chip Methods 0.000 claims description 5
- LVHBHZANLOWSRM-UHFFFAOYSA-N methylenebutanedioic acid Natural products OC(=O)CC(=C)C(O)=O LVHBHZANLOWSRM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 5
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 5
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 5
- 229920001296 polysiloxane Polymers 0.000 claims description 5
- 239000013076 target substance Substances 0.000 claims description 5
- OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N (9Z,12Z)-9,10,12,13-tetratritiooctadeca-9,12-dienoic acid Chemical compound C(CCCCCCC\C(=C(/C\C(=C(/CCCCC)\[3H])\[3H])\[3H])\[3H])(=O)O OYHQOLUKZRVURQ-NTGFUMLPSA-N 0.000 claims description 4
- WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N (E)-8-Octadecenoic acid Natural products CCCCCCCCCC=CCCCCCCC(O)=O WRIDQFICGBMAFQ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 2-(2-methoxy-5-methylphenyl)ethanamine Chemical compound COC1=CC=C(C)C=C1CCN SMZOUWXMTYCWNB-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- GOXQRTZXKQZDDN-UHFFFAOYSA-N 2-Ethylhexyl acrylate Chemical compound CCCCC(CC)COC(=O)C=C GOXQRTZXKQZDDN-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 2-Propenoic acid Natural products OC(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 20:1omega9c fatty acid Natural products CCCCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O LQJBNNIYVWPHFW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- GNSFRPWPOGYVLO-UHFFFAOYSA-N 3-hydroxypropyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCCCO GNSFRPWPOGYVLO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 9-Heptadecensaeure Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O QSBYPNXLFMSGKH-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M Acrylate Chemical compound [O-]C(=O)C=C NIXOWILDQLNWCW-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N Acrylonitrile Chemical compound C=CC#N NLHHRLWOUZZQLW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000004342 Benzoyl peroxide Substances 0.000 claims description 4
- OMPJBNCRMGITSC-UHFFFAOYSA-N Benzoylperoxide Chemical compound C=1C=CC=CC=1C(=O)OOC(=O)C1=CC=CC=C1 OMPJBNCRMGITSC-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229920000089 Cyclic olefin copolymer Polymers 0.000 claims description 4
- 239000004713 Cyclic olefin copolymer Substances 0.000 claims description 4
- 238000002965 ELISA Methods 0.000 claims description 4
- IMROMDMJAWUWLK-UHFFFAOYSA-N Ethenol Chemical compound OC=C IMROMDMJAWUWLK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- JIGUQPWFLRLWPJ-UHFFFAOYSA-N Ethyl acrylate Chemical compound CCOC(=O)C=C JIGUQPWFLRLWPJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N Methyl methacrylate Chemical compound COC(=O)C(C)=C VVQNEPGJFQJSBK-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N N-Methylpyrrolidone Chemical compound CN1CCCC1=O SECXISVLQFMRJM-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000005642 Oleic acid Substances 0.000 claims description 4
- ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N Oleic acid Natural products CCCCCCCCC=CCCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M Sodium laurylsulphate Chemical compound [Na+].CCCCCCCCCCCCOS([O-])(=O)=O DBMJMQXJHONAFJ-UHFFFAOYSA-M 0.000 claims description 4
- XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N Vinyl acetate Chemical compound CC(=O)OC=C XTXRWKRVRITETP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000002253 acid Substances 0.000 claims description 4
- DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N alpha-linolenic acid Chemical compound CC\C=C/C\C=C/C\C=C/CCCCCCCC(O)=O DTOSIQBPPRVQHS-PDBXOOCHSA-N 0.000 claims description 4
- 235000020661 alpha-linolenic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N ammonium persulfate Chemical compound [NH4+].[NH4+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O ROOXNKNUYICQNP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 229940114079 arachidonic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 235000021342 arachidonic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- 235000019400 benzoyl peroxide Nutrition 0.000 claims description 4
- CQEYYJKEWSMYFG-UHFFFAOYSA-N butyl acrylate Chemical compound CCCCOC(=O)C=C CQEYYJKEWSMYFG-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000011248 coating agent Substances 0.000 claims description 4
- 238000000576 coating method Methods 0.000 claims description 4
- 239000011521 glass Substances 0.000 claims description 4
- VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N glycidyl methacrylate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC1CO1 VOZRXNHHFUQHIL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 238000003018 immunoassay Methods 0.000 claims description 4
- QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N isooleic acid Natural products CCCCCCCC=CCCCCCCCCC(O)=O QXJSBBXBKPUZAA-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N lamivudine Chemical compound O=C1N=C(N)C=CN1[C@H]1O[C@@H](CO)SC1 JTEGQNOMFQHVDC-NKWVEPMBSA-N 0.000 claims description 4
- 229960001627 lamivudine Drugs 0.000 claims description 4
- 229960004488 linolenic acid Drugs 0.000 claims description 4
- KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N linolenic acid Natural products CC=CCCC=CCC=CCCCCCCCC(O)=O KQQKGWQCNNTQJW-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 125000005395 methacrylic acid group Chemical group 0.000 claims description 4
- 229940065472 octyl acrylate Drugs 0.000 claims description 4
- ANISOHQJBAQUQP-UHFFFAOYSA-N octyl prop-2-enoate Chemical compound CCCCCCCCOC(=O)C=C ANISOHQJBAQUQP-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N oleic acid Chemical compound CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC(O)=O ZQPPMHVWECSIRJ-KTKRTIGZSA-N 0.000 claims description 4
- 229960002969 oleic acid Drugs 0.000 claims description 4
- 235000021313 oleic acid Nutrition 0.000 claims description 4
- PNJWIWWMYCMZRO-UHFFFAOYSA-N pent‐4‐en‐2‐one Natural products CC(=O)CC=C PNJWIWWMYCMZRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 4
- 239000003505 polymerization initiator Substances 0.000 claims description 4
- 235000019333 sodium laurylsulphate Nutrition 0.000 claims description 4
- 229920003048 styrene butadiene rubber Polymers 0.000 claims description 4
- FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 4-amino-1-[(2r)-6-amino-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-[[(2r)-2-amino-3-phenylpropanoyl]amino]-3-phenylpropanoyl]amino]-4-methylpentanoyl]amino]hexanoyl]piperidine-4-carboxylic acid Chemical group C([C@H](C(=O)N[C@H](CC(C)C)C(=O)N[C@H](CCCCN)C(=O)N1CCC(N)(CC1)C(O)=O)NC(=O)[C@H](N)CC=1C=CC=CC=1)C1=CC=CC=C1 FWMNVWWHGCHHJJ-SKKKGAJSSA-N 0.000 claims description 3
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 3
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 3
- 239000004372 Polyvinyl alcohol Substances 0.000 claims description 3
- XECAHXYUAAWDEL-UHFFFAOYSA-N acrylonitrile butadiene styrene Chemical compound C=CC=C.C=CC#N.C=CC1=CC=CC=C1 XECAHXYUAAWDEL-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 3
- 239000004676 acrylonitrile butadiene styrene Substances 0.000 claims description 3
- 229920000122 acrylonitrile butadiene styrene Polymers 0.000 claims description 3
- 239000000919 ceramic Substances 0.000 claims description 3
- 230000001804 emulsifying effect Effects 0.000 claims description 3
- 208000002672 hepatitis B Diseases 0.000 claims description 3
- 239000000017 hydrogel Substances 0.000 claims description 3
- 230000003100 immobilizing effect Effects 0.000 claims description 3
- 229910052751 metal Inorganic materials 0.000 claims description 3
- 239000002184 metal Substances 0.000 claims description 3
- 239000012299 nitrogen atmosphere Substances 0.000 claims description 3
- 239000004417 polycarbonate Substances 0.000 claims description 3
- 229920000515 polycarbonate Polymers 0.000 claims description 3
- 229920002451 polyvinyl alcohol Polymers 0.000 claims description 3
- USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L potassium persulfate Chemical compound [K+].[K+].[O-]S(=O)(=O)OOS([O-])(=O)=O USHAGKDGDHPEEY-UHFFFAOYSA-L 0.000 claims description 3
- 238000001179 sorption measurement Methods 0.000 claims description 3
- 108010010803 Gelatin Proteins 0.000 claims description 2
- BCKXLBQYZLBQEK-KVVVOXFISA-M Sodium oleate Chemical compound [Na+].CCCCCCCC\C=C/CCCCCCCC([O-])=O BCKXLBQYZLBQEK-KVVVOXFISA-M 0.000 claims description 2
- 150000001413 amino acids Chemical class 0.000 claims description 2
- SWLVFNYSXGMGBS-UHFFFAOYSA-N ammonium bromide Chemical compound [NH4+].[Br-] SWLVFNYSXGMGBS-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims description 2
- 229910001870 ammonium persulfate Inorganic materials 0.000 claims description 2
- 150000001720 carbohydrates Chemical class 0.000 claims description 2
- 235000014633 carbohydrates Nutrition 0.000 claims description 2
- 238000004945 emulsification Methods 0.000 claims description 2
- 239000008273 gelatin Substances 0.000 claims description 2
- 229920000159 gelatin Polymers 0.000 claims description 2
- 235000019322 gelatine Nutrition 0.000 claims description 2
- 235000011852 gelatine desserts Nutrition 0.000 claims description 2
- 239000003446 ligand Substances 0.000 claims description 2
- 150000002632 lipids Chemical class 0.000 claims description 2
- 238000004020 luminiscence type Methods 0.000 claims description 2
- 229920000609 methyl cellulose Polymers 0.000 claims description 2
- 239000001923 methylcellulose Substances 0.000 claims description 2
- 235000010981 methylcellulose Nutrition 0.000 claims description 2
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 claims description 2
- 150000007523 nucleic acids Chemical class 0.000 claims description 2
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 claims description 2
- 239000002245 particle Substances 0.000 claims description 2
- 229920000636 poly(norbornene) polymer Polymers 0.000 claims description 2
- 230000000379 polymerizing effect Effects 0.000 claims description 2
- 235000019422 polyvinyl alcohol Nutrition 0.000 claims description 2
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 2
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 2
- 238000003756 stirring Methods 0.000 claims description 2
- OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 2-(2-cyanopropan-2-yldiazenyl)-2-methylpropanenitrile Chemical compound N#CC(C)(C)N=NC(C)(C)C#N OZAIFHULBGXAKX-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 4
- IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N Dimethylsulphoxide Chemical compound CS(C)=O IAZDPXIOMUYVGZ-UHFFFAOYSA-N 0.000 claims 3
- 239000004721 Polyphenylene oxide Substances 0.000 claims 1
- 230000005611 electricity Effects 0.000 claims 1
- 229920000570 polyether Polymers 0.000 claims 1
- 229910052710 silicon Inorganic materials 0.000 claims 1
- 239000010703 silicon Substances 0.000 claims 1
- 238000009739 binding Methods 0.000 abstract description 5
- 238000012545 processing Methods 0.000 abstract description 5
- 230000027455 binding Effects 0.000 abstract description 4
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 17
- ZJUKTBDSGOFHSH-WFMPWKQPSA-N S-Adenosylhomocysteine Chemical compound O[C@@H]1[C@H](O)[C@@H](CSCC[C@H](N)C(O)=O)O[C@H]1N1C2=NC=NC(N)=C2N=C1 ZJUKTBDSGOFHSH-WFMPWKQPSA-N 0.000 description 17
- 229940098773 bovine serum albumin Drugs 0.000 description 17
- 239000000523 sample Substances 0.000 description 17
- 238000006243 chemical reaction Methods 0.000 description 10
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 8
- 229920000642 polymer Polymers 0.000 description 8
- 230000009871 nonspecific binding Effects 0.000 description 7
- 230000002860 competitive effect Effects 0.000 description 6
- 230000008569 process Effects 0.000 description 6
- 102000036639 antigens Human genes 0.000 description 5
- 108091007433 antigens Proteins 0.000 description 5
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 5
- 239000008363 phosphate buffer Substances 0.000 description 5
- 230000035484 reaction time Effects 0.000 description 5
- 241000700721 Hepatitis B virus Species 0.000 description 4
- 108091034117 Oligonucleotide Proteins 0.000 description 4
- 239000008367 deionised water Substances 0.000 description 4
- 229910021641 deionized water Inorganic materials 0.000 description 4
- 229940079593 drug Drugs 0.000 description 4
- 230000010354 integration Effects 0.000 description 4
- -1 polyethylene Polymers 0.000 description 4
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 4
- PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N Glycerine Chemical compound OCC(O)CO PEDCQBHIVMGVHV-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 3
- 108700024845 Hepatitis B virus P Proteins 0.000 description 3
- 108060003951 Immunoglobulin Proteins 0.000 description 3
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 3
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 3
- 102000018358 immunoglobulin Human genes 0.000 description 3
- 238000005259 measurement Methods 0.000 description 3
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000007790 solid phase Substances 0.000 description 3
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 3
- YCIGYTFKOXGYTA-UHFFFAOYSA-N 4-(3-cyanopropyldiazenyl)butanenitrile Chemical compound N#CCCCN=NCCCC#N YCIGYTFKOXGYTA-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N Formamide Chemical compound NC=O ZHNUHDYFZUAESO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N Silicium dioxide Chemical compound O=[Si]=O VYPSYNLAJGMNEJ-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 2
- 230000004888 barrier function Effects 0.000 description 2
- 230000000903 blocking effect Effects 0.000 description 2
- 239000000872 buffer Substances 0.000 description 2
- 239000001913 cellulose Substances 0.000 description 2
- 229920002678 cellulose Polymers 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 230000000052 comparative effect Effects 0.000 description 2
- 229920001577 copolymer Polymers 0.000 description 2
- 238000007334 copolymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000006185 dispersion Substances 0.000 description 2
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 2
- 239000012530 fluid Substances 0.000 description 2
- 239000007850 fluorescent dye Substances 0.000 description 2
- 230000006870 function Effects 0.000 description 2
- 238000013537 high throughput screening Methods 0.000 description 2
- 230000036039 immunity Effects 0.000 description 2
- 239000011159 matrix material Substances 0.000 description 2
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 2
- 239000013642 negative control Substances 0.000 description 2
- 229920003023 plastic Polymers 0.000 description 2
- 239000004033 plastic Substances 0.000 description 2
- 238000006116 polymerization reaction Methods 0.000 description 2
- 239000013641 positive control Substances 0.000 description 2
- 238000012360 testing method Methods 0.000 description 2
- NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 1,2-bis(ethenyl)benzene;1-ethenyl-2-ethylbenzene;styrene Chemical compound C=CC1=CC=CC=C1.CCC1=CC=CC=C1C=C.C=CC1=CC=CC=C1C=C NWUYHJFMYQTDRP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 1-[4-[(2,5-dioxopyrrol-1-yl)methyl]cyclohexanecarbonyl]oxy-2,5-dioxopyrrolidine-3-sulfonic acid Chemical compound O=C1C(S(=O)(=O)O)CC(=O)N1OC(=O)C1CCC(CN2C(C=CC2=O)=O)CC1 FPKVOQKZMBDBKP-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229920000936 Agarose Polymers 0.000 description 1
- 108010039224 Amidophosphoribosyltransferase Proteins 0.000 description 1
- 229920001661 Chitosan Polymers 0.000 description 1
- 229920002307 Dextran Polymers 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M Methacrylate Chemical compound CC(=C)C([O-])=O CERQOIWHTDAKMF-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 1
- 108020005187 Oligonucleotide Probes Proteins 0.000 description 1
- 229910019142 PO4 Inorganic materials 0.000 description 1
- 239000004698 Polyethylene Substances 0.000 description 1
- 108010039918 Polylysine Proteins 0.000 description 1
- 239000004820 Pressure-sensitive adhesive Substances 0.000 description 1
- JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N [3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-[[5-(2-amino-6-oxo-1H-purin-9-yl)-3-hydroxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxyoxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(5-methyl-2,4-dioxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(6-aminopurin-9-yl)oxolan-2-yl]methoxy-hydroxyphosphoryl]oxy-5-(4-amino-2-oxopyrimidin-1-yl)oxolan-2-yl]methyl [5-(6-aminopurin-9-yl)-2-(hydroxymethyl)oxolan-3-yl] hydrogen phosphate Polymers Cc1cn(C2CC(OP(O)(=O)OCC3OC(CC3OP(O)(=O)OCC3OC(CC3O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)C(COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3COP(O)(=O)OC3CC(OC3CO)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3ccc(N)nc3=O)n3cc(C)c(=O)[nH]c3=O)n3cnc4c3nc(N)[nH]c4=O)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)n3cnc4c(N)ncnc34)O2)c(=O)[nH]c1=O JLCPHMBAVCMARE-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000001042 affinity chromatography Methods 0.000 description 1
- PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N aluminium oxide Inorganic materials [O-2].[O-2].[O-2].[Al+3].[Al+3] PNEYBMLMFCGWSK-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 229940024606 amino acid Drugs 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000000427 antigen Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 239000000227 bioadhesive Substances 0.000 description 1
- 229920000249 biocompatible polymer Polymers 0.000 description 1
- 230000004071 biological effect Effects 0.000 description 1
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 1
- 230000008878 coupling Effects 0.000 description 1
- 238000010168 coupling process Methods 0.000 description 1
- 238000005859 coupling reaction Methods 0.000 description 1
- 238000011161 development Methods 0.000 description 1
- 238000000502 dialysis Methods 0.000 description 1
- 230000004069 differentiation Effects 0.000 description 1
- 239000000975 dye Substances 0.000 description 1
- 230000000694 effects Effects 0.000 description 1
- 230000005684 electric field Effects 0.000 description 1
- 238000001917 fluorescence detection Methods 0.000 description 1
- 238000002073 fluorescence micrograph Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 125000002791 glucosyl group Chemical group C1([C@H](O)[C@@H](O)[C@H](O)[C@H](O1)CO)* 0.000 description 1
- 238000009396 hybridization Methods 0.000 description 1
- 230000028993 immune response Effects 0.000 description 1
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 description 1
- 238000012688 inverse emulsion polymerization Methods 0.000 description 1
- 239000003456 ion exchange resin Substances 0.000 description 1
- 229920003303 ion-exchange polymer Polymers 0.000 description 1
- 150000002500 ions Chemical class 0.000 description 1
- 229960000310 isoleucine Drugs 0.000 description 1
- AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N isoleucine Natural products CCC(C)C(N)C(O)=O AGPKZVBTJJNPAG-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 125000000741 isoleucyl group Chemical group [H]N([H])C(C(C([H])([H])[H])C([H])([H])C([H])([H])[H])C(=O)O* 0.000 description 1
- 150000002739 metals Chemical class 0.000 description 1
- 125000002496 methyl group Chemical group [H]C([H])([H])* 0.000 description 1
- 239000004530 micro-emulsion Substances 0.000 description 1
- 230000004048 modification Effects 0.000 description 1
- 238000012986 modification Methods 0.000 description 1
- 230000035772 mutation Effects 0.000 description 1
- 239000002751 oligonucleotide probe Substances 0.000 description 1
- 230000003287 optical effect Effects 0.000 description 1
- 238000003921 particle size analysis Methods 0.000 description 1
- 239000010452 phosphate Substances 0.000 description 1
- NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K phosphate Chemical compound [O-]P([O-])([O-])=O NBIIXXVUZAFLBC-UHFFFAOYSA-K 0.000 description 1
- 229920000083 poly(allylamine) Polymers 0.000 description 1
- 229920001485 poly(butyl acrylate) polymer Polymers 0.000 description 1
- 229920002401 polyacrylamide Polymers 0.000 description 1
- 229920000573 polyethylene Polymers 0.000 description 1
- 229920000656 polylysine Polymers 0.000 description 1
- 229920000136 polysorbate Polymers 0.000 description 1
- 239000005373 porous glass Substances 0.000 description 1
- FBCQUCJYYPMKRO-UHFFFAOYSA-N prop-2-enyl 2-methylprop-2-enoate Chemical compound CC(=C)C(=O)OCC=C FBCQUCJYYPMKRO-UHFFFAOYSA-N 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000011002 quantification Methods 0.000 description 1
- 238000004445 quantitative analysis Methods 0.000 description 1
- 230000009467 reduction Effects 0.000 description 1
- 238000004626 scanning electron microscopy Methods 0.000 description 1
- 238000001338 self-assembly Methods 0.000 description 1
- 238000000926 separation method Methods 0.000 description 1
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 description 1
- 239000000377 silicon dioxide Substances 0.000 description 1
- 239000002356 single layer Substances 0.000 description 1
- 239000002904 solvent Substances 0.000 description 1
- 239000007921 spray Substances 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 1
- 238000005406 washing Methods 0.000 description 1
- 239000010457 zeolite Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J19/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J19/0093—Microreactors, e.g. miniaturised or microfabricated reactors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/68—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving nucleic acids
- C12Q1/6813—Hybridisation assays
- C12Q1/6834—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase
- C12Q1/6837—Enzymatic or biochemical coupling of nucleic acids to a solid phase using probe arrays or probe chips
-
- B—PERFORMING OPERATIONS; TRANSPORTING
- B01—PHYSICAL OR CHEMICAL PROCESSES OR APPARATUS IN GENERAL
- B01J—CHEMICAL OR PHYSICAL PROCESSES, e.g. CATALYSIS OR COLLOID CHEMISTRY; THEIR RELEVANT APPARATUS
- B01J2219/00—Chemical, physical or physico-chemical processes in general; Their relevant apparatus
- B01J2219/00274—Sequential or parallel reactions; Apparatus and devices for combinatorial chemistry or for making arrays; Chemical library technology
- B01J2219/00583—Features relative to the processes being carried out
- B01J2219/00603—Making arrays on substantially continuous surfaces
- B01J2219/00605—Making arrays on substantially continuous surfaces the compounds being directly bound or immobilised to solid supports
- B01J2219/00608—DNA chips
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2563/00—Nucleic acid detection characterized by the use of physical, structural and functional properties
- C12Q2563/149—Particles, e.g. beads
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q2565/00—Nucleic acid analysis characterised by mode or means of detection
- C12Q2565/60—Detection means characterised by use of a special device
- C12Q2565/629—Detection means characterised by use of a special device being a microfluidic device
Landscapes
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Zoology (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- Apparatus Associated With Microorganisms And Enzymes (AREA)
Abstract
본 발명은 생체분자 고정용 비드 및 이를 이용한 바이오칩의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생체분자를 고정하는 지지체와 칩 기판 표면에 대한 점착제로서의 특징을 동시에 가지는 점착성 비드 및 상기 점착성 비드에 생체분자를 결합시켜, 생체분자가 고정된 비드의 수성 현탁액을 제조한 다음, 이를 기판 상에 고정하는 것을 특징으로 하는 바이오칩의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명에 따른 점착성 비드는 생체분자를 고정하는 지지체와 칩 기판 표면에 대한 점착제로서의 특징을 동시에 가져서 별도의 장치 및 처리 과정 없이 바이오칩 상에 직접 고정시킬 수 있다.
점착성, 비드, 바이오칩, 생체분자
Description
도 1은 본 발명에 따른 점착성 비드(600nm)가 기판 상에 고착된 것을 주사전자현미경으로 10,000배 확대 관찰한 사진이고, 도 2는 상기 도 1의 비드를 900,000배 확대 관찰한 사진이다.
도 3은 투입되는 유화제의 함량에 따라, 비드의 크기가 변화되는 것을 나타낸 그래프이고, 도 4는 주단량체와 공단량체의 공중합비에 따라, 제조되는 비드의 유리전이온도(Tg)가 변화되는 것을 나타낸 그래프이다.
도 5는 서로 다른 유리전이온도를 가지는 비드를 주사전자현미경으로 관찰한 사진이다.
도 6은 생체분자의 농도가 높을수록 생체분자의 비드에 대한 표면 커버리지가 증가하는 것을 나타낸 그래프이다.
도 7은 비드에 생체분자를 고정하는 반응시간에 따라, 생체분자의 본 발명의 점착성 비드 및 폴리스티렌 비드에 대한 표면 커버리지가 증가하는 것을 나타낸 그래프이다.
도 8은 점착성 비드를 포함하는 비드 수성 현탁액을 각각의 중량% 별로 폴리메틸메타크릴레이트 기판 상에 스팟팅한 것을 주사전자현미경으로 관찰한 사진이다.
도 9는 플라스틱 기판을 점착성 비드 수성 현탁액으로 침지코팅하여 형성된 요철구조물을 주사전자현미경으로 관찰한 것이다.
도 10은 단백질이 고정된 점착성 비드의 수성 현탁액을 칩 기판상에 스팟팅하여 형성한 스팟의 자체 형광을 측정하여 정량한 그래프이고, 도 11은 단백질이 고정된 점착성 비드의 수성 현탁액을 칩 기판상에 스팟팅하여 형성한 스팟에 비특이적 단백질을 처리하여 결합 정도를 정량한 그래프이다.
도 12는 본 발명의 바이오칩을 이용하여 다양한 농도의 SAH(S-아데노실-L-호모시스테인)를 경쟁적 면역 검출법으로 검출한 형광 스캐너 사진이고, 도 13은 본 발명의 비이오칩과 넝크(Nunc)사의 맥시소프(MaxiSorp)칩을 이용하여 표적물질 SAH에 대한 경쟁적 면역 검출을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 14는 본 발명의 바이오칩을 이용하여 B형 간염 바이러스(HBV)의 폴리머레이즈 유전자 시퀀스를 가지는 올리고누클레오티드의 SNP(single nucleotide polymorphism)를 다양한 농도로 검출한 형광 스캐너 사진이고, 도 15는 도 14의 형광 스캐너 사진을 분석하여 형광 시그널 세기를 나타낸 그래프이다.
도 16은 본 발명의 바이오칩을 이용하여 단백질 항원인 면역글로불린(IgG)을 직접 면역 검출법으로 검출한 형광 스캐너 사진이고, 도 17은 도 16의 형광 스캐너 사진을 분석하여 형광 시그널 세기를 나타낸 그래프이다.
본 발명은 생체분자 고정용 비드 및 이를 이용한 바이오칩의 제조방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 생체분자를 고정하는 지지체와 칩 기판 표면에 대한 점착제로서의 특징을 동시에 가지는 점착성 비드 및 상기 점착성 비드에 생체분자를 결합시켜, 생체분자가 고정된 비드의 수성 현탁액을 제조한 다음, 이를 기판 상에 고정하는 것을 특징으로 하는 바이오칩의 제조방법에 관한 것이다.
생체분자의 고정이 가능한 고체상 지지체는 생체분자 간의 선택적 친화력(affinity)을 이용하는 많은 생물학적 응용 분야에서 일찍이 활용되고 있으며, 대표적으로 아가로오즈, 셀룰로오즈, 다공성 유리, 실리카, 알루미나, 지올라이트 등의 천연 지지체에서 폴리아크릴아미드계 비드, 폴리메타크릴산계 비드, 폴리스티렌계 비드, 멤브레인 등의 합성 지지체 등이 있다(Regnier, F.E., J. Chromatogr. Sci., 14:316, 1976; Hjerten, S., Anal . Biochem ., 3:109, 1962).
이러한 고체상 지지체는 단백질의 분리ㆍ정제 또는 어피니티(affinity) 크로마토그래피 등의 전통적인 분야 외에도 고효율 스크리닝(High Throughput Screening; HTS)과 진단의 용도로 사용되는 바이오칩(biochip) 분야에서도 생체분자를 칩 기판에 고정하기 위한 담체로서 널리 활용되고 있다(Sato, K., Adv. Drug Deliv. Rev., 55:379, 2003; Andersoon, H., Electrophoresis, 22:249, 2001; Choi, J.W., Biomed. Microdevices, 3:191, 2001). 이것은 기존에 당해 분야에서 사용되던 자기조립(self-assembly)과 같은 2차원 고정 방법이 갖는 기술적인 한계점, 즉, 생체분자의 집적화와 생리활성 보존이 어려운 문제를 해결하기 위한 대안으로 제안된 것인데, 고체상 지지체가 가지는 3차원의 넓은 표면적을 매개체로 이용하여 생체분자를 고농도로 담지하고 이것을 칩 기판 상에 고정함으로써 생체분자의 생체친화적인 집적화를 가능하게 하였다.
사용 가능한 고체상 지지체로는 여러 가지 형태가 있는데, 예컨대, 멤브레인 형태는 셀룰로오스처럼 특징적인 다공 구조를 가지는 넓은 표면을 생체분자의 고정면으로 활용하는 것이며, 고분자 매트리스 형태는 기판 위에 글루코오스, 폴리라이신, 키토산, 덱스트란, 폴리알릴아민, 폴리비닐알콜 등의 생체친화성 고분자로 이루어진 얇은 고분자 매트릭스를 형성하여 고정화면을 넓게 하고, 생체분자의 기판에 대한 입체 장애를 개선한 지지체이다(한국특허공개번호 제2004-0004725호; Yakovleva, J., Biosens. Bioelectron., 19:21, 2003; Gill, I., Trends in Biotechnology, 18:282, 2000; US Patent 5,034,428; US Patent 5,482,996).
한편, 비드 형태의 지지체는 구모양을 가지는 개개의 비드에 생체분자를 고정하고, 이것을 모아 넓은 겉넓이를 가지는 3차원의 구조체를 이루게 하는 고정화 지지체로, 칩 기판 상에 형성시킬 경우 바이오칩 목적으로 활용이 가능하다(Sato, K., Adv. Drug Deliv. Rev., 55:379, 2003); Andersoon, H., Electrophoresis, 22:249, 2001; Choi, J.W., Biomed. Microdevices, 3:191, 2001). 상기 멤브레인 또는 고분자 매트릭스 지지체는 생체분자의 고정이 외부와 접촉하는 겉표면 주위로 제한되거나, 생체분자의 고정력을 높이기 위하여 공유적으로 결합할 경우 외부 환경에 민감한 효소나 기타 다른 단백질들의 생리활성을 유지하는 것에 제약을 가지는 것에 반해, 비드는 이미 생체분자가 고정된 개개의 비드를 가지고 3차원 구조체를 만들기 때문에 표면적의 활용율이 높고, 또한 생체분자의 활성을 유지시키는 다양한 고정화 방법을 활용할 수 있어 장점이 크다. 특히, 취급이 매우 용이하여 랩온어칩과 같이 미세유로 내에 생체분자를 고정해야 하는 바이오칩 제작공정에서 있어서 칩의 가공성을 증대시킬 수 있는 좋은 재료가 된다.
또한, 기존의 비드는 비드 자체가 칩 기판에 대한 점착성을 가지지 않기 때문에 미세유로 내에 비드를 고정하기 위한 별도의 방법들이 필요하다는 단점이다. 현재까지 개발되어 쓰이는 고정 방법으로는 물리적 장벽을 이용하여 비드를 미세유로 내에 가두는 방법과 자기장을 이용하여 고정하는 방법 그리고 초음파나 레이저 트위저(laser tweezer)를 이용한 방법이 대표적인데, 상기와 같은 방법들은 비드의 선택이 제한되고, 칩을 제작하는 가공 공정이 복잡하며 또한 광학 측정시 노이즈가 크고, 칩 내부 혹은 외부에 별도의 장치를 필요로 하여 랩온어칩 목적으로 적용하기에는 다소 비경제적이라는 문제점이 존재한다(Sato, K., Adv. Drug Deliv. Rev., 55:379, 2003; Andersoon, H., Electrophoresis, 22:249, 2001; Choi, J.W., Biomed. Microdevices, 3:191, 2001; Meng, A., Transducers, Sendai, Japan, 876, 1999; Dorre, K., Bioimaging, 5:139, 1997).
한편, 본 출원인은 프로브 또는 프로브가 고정된 비드를 점착제를 이용하여 기판의 표면에 고정시키는 것을 특징으로 하는 바이오칩의 제조방법에 대해 특허출원(대한민국 특허출원번호 제10-2004-104944호)한 바 있다. 상기 특허에 따르면, 프로브가 고정된 비드를 기판에 물리적 장벽이나 전기장에 의하지 않고 점착제에 의해 고정시키는 것이 가능하나, 이 역시 비드를 기판에 고정시키기 위해서는 별도의 점착제를 첨가해야 하는 번거로움이 여전히 존재한다.
따라서, 당업계에서는 생체분자를 고정하는 지지체와 칩 기판 표면에 대한 점착제로서의 특징을 동시에 가져서 별도의 장치 및 처리 과정 없이 바이오칩 상에 직접 고정시킬 수 있는 점착성 비드 및 이를 이용한 바이오칩의 개발이 절실히 요구되고 있다.
이에 본 발명자들은, 생체분자를 고정하는 지지체와 칩 기판 표면에 대한 점착제로서의 특징을 동시에 가지고 있어 별도의 장치 및 처리 과정 없이 바이오칩 상에 직접 고정시킬 수 있는 점착성 비드 및 이를 이용한 바이오칩을 개발하고자 예의 노력한 결과 본 발명을 완성하게 되었다.
결국 본 발명의 목적은, 생체분자를 고정하는 지지체와 칩 기판 표면에 대한 점착제로서의 특징을 동시에 가지는 점착성 비드 및 그 제조방법을 제공하는데 있다.
본 발명의 다른 목적은, 상기 점착성 비드에 생체분자를 부착시켜, 생체분자가 고정된 비드의 수성 현탁액을 제조한 다음, 이를 기판 상에 고정시키는 것을 특 징으로 하는 바이오칩의 제조방법을 제공하는데 있다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 수성 매질에 친수성 모노머, 주단량체 및 공단량체를 유탁시킨 다음, 중합시켜 제조된, 생체분자를 고정하는 지지체와 칩 기판 표면에 대한 점착제로서의 특징을 동시에 가지는 점착성 비드를 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 친수성 모노머는 메타크릴산, 아크릴산, 이타콘산, 히드록시에틸메타크릴레이트, 히드록시프로필메타크릴레이트, 아크릴아미드, 글리시딜 메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 아크릴레이트, 폴리에텔렌글리콜 메타크릴레이크, 팔리톨레산, 올레산, 리놀레산, 아라키돈산, 리놀렌산, 알릴알콜 및 비닐알콜로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 주단량체는 부타디엔, 에틸아크릴레이트, 부틸아크릴레이트, 에틸헥실아크릴레이트 및 옥틸아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 공단량체는 비닐 아세테이트, 아크릴로니트릴, 아크릴아미드, 스티렌, 메틸메타크릴레이트 및 메틸아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 유화제 수용액에 단량체를 첨가하고 혼합하여 유탁액을 만드는 단계; (b) 수성 매질에 친수성 모노머를 첨가하고, 질소 분위기에서 온도를 약 75℃까지 상승시킨 다음, 여기에 상기 (a) 단계에서 수득된 유탁액을 첨가하고, 교반하여 유탁시키는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계에서 수득된 유탁액에 중합 개시제를 첨가한 다음, 반응시키는 단계를 포함하는 점착성 비드의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 수성 매질은 물, 에탄올, 메탄올, 디엠에프, 디엠에스오, 아세톤 및 엔엠피로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 친수성 모노머는 메타크릴산, 아크릴산, 이타콘산, 히드록시에틸메타크릴레이트, 히드록시프로필메타크릴레이트, 아크릴아미드, 글리시딜 메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 아크릴레이트, 폴리에텔렌글리콜 메타크릴레이크, 팔리톨레산, 올레산, 리놀레산, 아라키돈산, 리놀렌산, 알릴알콜 및 비닐알콜로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단량체는 부타디엔, 에틸아크릴레이트, 부틸아크릴레이트, 에틸헥실아크릴레이트 및 옥틸아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 주단량체와 비닐 아세테이트, 아크릴로니트릴, 아크릴아미드, 스티렌, 메틸메타크릴레이트 및 메틸아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 공단량체를 함유하는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 주단량체와 공단량체의 배합비는 상기 점착성 비드의 유리전이온도(Tg)에 의해 결정되며, 상기 유리전이온도(Tg)는 바이오칩의 제작 또는 사용 온도보다 0~45℃ 낮은 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 유화제는 소디움라우릴설페이트, 젤라틴, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐알콜, 세틸트리메틸브롬화 암모니움 및 소디움 올레이트로 이루어 진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 중합 개시제는 포타슘퍼설페이트, 암모늄퍼설페이트, 아조비스부티로니트릴(AIBN) 및 벤조일퍼옥사이드(BPO)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, (a) 상기 점착성 비드에 생체분자를 부착시켜, 생체분자가 고정된 비드의 수성 현탁액을 제조하는 단계; 및 (b) 상기 수성 현탁액을 기판 상에 고정시키는 단계를 포함하는 바이오칩의 제조방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 (b) 단계는 수성 현탁액을 기판상에 스팟팅(spotting) 시킨 다음, 이를 건조하여 기판 상에 고정시키는 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 스팟팅은 잉크젯에 의해 수행하는 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 점착성 비드에 생체분자를 부착하는 방법은 소수성 흡착법, 공유결합법 및 정전기적 인력에 의한 결합법으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 생체분자는 핵산, 아미노산, 단백질, 펩타이드, 지질, 탄수화물, 효소기질, 리간드 및 코팩터로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있고, 상기 기판은 마이크로웰, 슬라이드 기판 및 랩온어칩의 미세유로로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 할 수 있으며, 상기 기판의 재료는 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 시클릭 올레핀 코폴리머, 폴리노르보넨, 스틸렌-부타디엔 코폴리머, 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌, 유리, 실리콘, 히드로겔, 실리콘, 금속, 세라믹 및 다공성 멤 브레인으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고, 생체분자가 부착되어 있는 점착성 비드가 기판에 고정되어 있는 바이오칩을 제공한다.
본 발명은 또한, (a) 제19항의 바이오칩에 표적물질을 함유하는 시료를 적용하는 단계; 및 (b) 상기 바이오칩 상의 생체분자와 특이적으로 결합하는 표적물질을 검출하는 단계를 포함하는 시료 내 표적물질의 검출방법을 제공하며, 상기 표적물질의 검출은 방사성 동위 원소나 발광(luminescence) 또는 발색 염료 등의 생체표지자(biolabel)를 이용한 검출법, 생체 효소를 이용한 면역 검출법(enzyme-linked immunoassay, ELISA), 전기화학적 검출법(electrochemical immunoassay), 입자탁도를 이용한 검출법(particle turbidimetric immunoassay) 및 형광 발색단(fluorophore)을 이용한 검출법으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 이용하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또한, 상기 방법에 의해 제조되고, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 SNP (Single nucleotide polymorphism)가 부착되어 있는, 라미부딘 약재에 내성을 가지는 B형 간염 바이러스 감염 여부 확인에 사용되는 바이오칩을 제공한다.
본 발명은 또한, 상기 점착성 비드를 칩 기판 표면에 전체 또는 국부적으로 코팅하여 제조된 요철구조물을 제공한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명에 따른 바이오칩의 제조방법을 단계별로 설명하면 다음과 같다.
제1단계: 점착성
비드를
함유하는 수성 현탁액의 제조
본 발명의 점착성 비드는 수성 현탁액 중에서 점착 성질이 있는 고형분을 말하며, 점착성을 가지게 하는 주단량체, 고형성을 가지게 하는 공단량체 및 수계 분산을 위한 친수성 모노머를 기본 구성 물질로 한다.
본 발명의 점착성 비드는 수성 매질에 주단량체, 공단량체 및 친수성 모노머를 혼합하고 통상적인 중합방법, 예를 들면, 현탁, 유화, 분산, 마이크로유화, 미니유화, 역유화 중합 등의 방법으로 제조할 수 있으며, 중합 조건에 따라 다양한 크기를 얻을 수 있는데, 생체분자를 고정하는 지지체로 이용하기 위하여 통상적으로 수십 나노 미터 내지 수 마이크론 직경 범위로 제조한다.
또한, 상기 비드에 지지체와 점착제로서의 두 가지 기능을 동시에 부여하는 것은 비드를 구성하는 주단량체와 공단량체의 배합비를 조절함으로써 가능하다. 구체적으로 주단량체의 유연하고 끈적끈적한 점착 특성과 공단량체의 단단한 고형 특성을 이용하여, 바이오칩의 사용환경에서 동시에 나타날 수 있는 공중합 비율을 선택함으로써 가능하다. 이때 주단량체와 공단량체의 배합비를 결정하는 가장 중요한 요인은 제조된 비드가 갖는 고유의 유리전이온도(Tg)인데, 상기 Tg는 바이오칩의 제작 또는 사용 온도보다 0~45℃ 낮은 것이 바람직하다. 예를 들어, 상온(25℃)에서 바이오칩을 제작 또는 사용하는 경우, 점착성 비드의 Tg는 상온 보다 0~45℃ 낮은 온도인 -15~25℃ 범위가 바람직하고, -15~10℃ 범위가 더욱 바람직하다.
제2단계: 점착성
비드에
생체분자의 고정 및 이를 함유하는
비드
수성 현탁액의 제조
본 발명의 바이오칩은, 칩 기판 상에 고정되는 생체분자의 집적율을 높이기 위하여 넓은 표면적을 가지는 점착성 비드를 매개체로 활용한다.
생체분자를 비드에 고정하는 방법으로는 소수성의 비드 자체의 표면과 상호작용 시키는 소수성 흡착법, 그리고 비드를 이루는 공중합체 사슬의 특정 반응기를 이용하는 공유결합법, 정전기적 인력에 의한 결합법 등이 있다. 상기 비드의 수성 현탁액을 제조할 때 사용되는 수성 매질은 수성 특성을 갖는 임의의 용매를 사용할 수 있다. 즉, 상기 수성 매질에는 물, 에탄올, 메탄올, 디엠에프, 디엠에스오, 아세톤, 엔엠피가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니며, 바람직하게는 물을 사용할 수 있다.
제3단계:
비드
수성 현탁액의
스팟팅
상기 생체분자를 고정한 비드 현탁액이 제조되면, 그 현탁액을 기판 상에 스팟팅함으로써 기판 표면에 고정화가 가능하다. 상기 스팟팅은 당업계에서 통상적으로 사용되는 임의의 스팟팅 방법을 이용할 수 있으며, 대표적으로 잉크젯에 의해 스팟팅을 수행할 수 있다. 잉크젯 방법을 사용할 경우 본 발명에 따른 개발된 비드 수성 현탁액을 정량적으로 기판 위에 분사하는 것이 용이하므로 유리하다.
점착성 비드를 고정하는 기판은 바이오칩 분야에서 사용되는 다양한 기판이 사용될 수 있는데, 대표적인 예로는 마이크로웰, 슬라이드 기판 또는 랩온어칩의 미세유로가 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 또한, 상기 기판의 재료로는 폴리메틸메타크릴레이트(PMMA), 폴리카보네이트(PC), 폴리스티렌(PS), 시클릭 올레핀 코폴리머(Cyclic olefin copolymer), 폴리노르보넨(polynorbonene), 스틸렌-부타디엔 코폴리머(SBC), 및 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌(acrylonitrile butadiene styrene), 유리, 실리콘, 히드로겔, 실리콘, 금속, 세라믹, 다공성 멤브레인이 사용될 수 있으며, 이에 한정되는 것은 아니다.
제4단계: 건조
건조는 스팟팅에 의한 바이오칩을 제조할 때 사용되는 통상적인 건조방법이 사용될 수 있으며, 예를 들어 상온 건조가 있다. 물질에 따라 적정한 건조 온도가 있는데, 단백질의 경우는 15~33℃이고 DNA의 경우는 15~90℃이다.
상기와 같은 과정을 거쳐 제조된 바이오칩을 주사현미경으로 관찰한 결과, 도 1 및 도 2에 나타난 바와 같이, 고착 과정을 거치면서 나타나는 비드가 기판상에 결합하는 것을 확인할 수 있었고, 이로부터 본 발명에 따른 점착성 비드를 이용하여 바이오칩의 제작이 가능하다는 것을 알 수 있었다.
본 발명에 의해 제조된 바이오칩의 응용
본 발명은 생체분자가 고정된 점착성 비드를 상기 칩 기재상에 스팟팅하여 고정하고 검출하고자 하는 표적물질 시료를 적용하는 단계와 상기 생체분자에 특이 적으로 결합된 표적물질을 검출하는 단계를 포함하며 검출 시료 내에 존재하는 표적물질의 유무 및 함량 분석에 응용할 수 있다.
또한, 본 발명에서 개발된 상기 점착성 비드는 비드 자체를 칩 기판 표면에 전체적 또는 국부적으로 코팅하여 비드들로 이루어진 요철구조물 제조하는데 사용할 수 있다(도 9).
이러한 입체적인 구조물은 바이오칩 내에서 여러 가지 유용한 기능, 예컨대 검출부에 적용되어 생체분자를 직접 스팟팅하여 고정하는 다면적 기판 표면으로 사용되거나, 모세관 흐름을 이용하는 랩온어칩의 특정 미세유로에 적용되어 소수성 작용을 통한 유체 지연부로 활용될 수 있다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예
1: 점착성
비드를
함유하는 수성 현탁액의 제조
주 반응기(reactor)에 탈이온수 622.1g과 이타콘산 3.5g을 투입하고 질소 분위기에서 온도를 75℃까지 상승시켰다. 별도의 반응기(reactor)에 부틸아크릴레이트 35.0g, 메틸메타크릴레이트 31.4g, 알릴메타크릴레이트 0.1g, 3 중량% 소디움라우릴설페이트 수용액 1.2g를 혼합한 유탁액을 준비하였다.
주 반응기의 온도가 안정되면, 상기 별도의 반응기에서 준비한 유탁액을 투입하고 1시간 이상 교반하여 충분히 유탁시킨 다음, 3 중량% 포타슘퍼설페이트 수용액을 두 차례에 걸쳐 7.0g과 1.0g을 투입하고, 2시간 동안 반응을 진행함으로써 점착성 비드를 포함하는 중합물을 합성하였다.
상기 중합물을 투석(dialysis)과 이온교환수지를 이용하여 세척한 후, 탈이온수에 희석함으로써 점착성 비드를 포함하는 수성 현탁액을 제조하였다. 상기 점착성 비드는 투입되는 유화제의 양을 조절하여 그 크기를 조절할 수 있다. 도 3은 유화제인 소디움라우릴설페이트의 투입량을 달리하여 제조된 비드를 입도 분석한 결과인데, 0.1~0.05 중량% 범위의 유화제를 투입할 경우 평균 서브마이크로 크기 수준의 비드가 제조됨을 알 수 있었다.
한편, 공중합체인 점착성 비드의 유리전이온도는 일반적으로 주단량체의 고분자인 폴리부틸아크릴레이트와 공단량제의 고분자인 폴리메틸메타크릴레이트가 가지는 유리전이온도의 중간값에 해당하는 값을 나타내는데, 따라서 각 단량체의 배합비를 조절함으로써 목적하는 유리전이온도를 확보할 수 있었다(도 4).
도 5는 서로 다른 유리전이온도(Tg)를 가지는 비드를 주사전자현미경으로 관찰한 사진으로, 상온 건조 조건에서 유리전이온도가 낮은 비드는 점착성이 강하여 기판에 쉽게 점착되나 필름화되어 입체 구조를 가지지 못하며, 반대로 유리전이온가 높은 비드는 고형성이 강하여 뚜렷한 비드 형상을 나타내지만 쉽게 부스러져 기판에 잘 고착되지 못하는 경향을 나타내었다. 따라서 상온 건조할 경우 -15~10℃ 범위의 유리전이온도를 가지는 점착성 비드가 적절함을 알 수 있었다.
실시예
2: 생체분자 농도에 따른 고정화 효율 시험
상기 실시예 1에서 제조한 비드의 겉표면은 생체분자가 고정되는 면과 기판에 점착되는 면을 모두 지니고 있으므로, 전체 비드 겉면적에서 생체분자가 차지하는 면적을 조절하여, 본 발명의 목적인 점착성 비드의 사용 효율을 조절할 수 있었다.
고정화 생체분자로서 소혈청알부민(bovine serum albumin) 포스페이트버퍼(pH 7.2) 수용액을 0.16, 0.31, 0.93, 1.55, 3.10 mg/mL 농도로 준비한 후, 상기 비드를 2 중량% 포함하는 수성 현탁액과 1:1로 혼합하고, 상온에서 14시간 흔들어 반응시켰다. 반응 종료 후, 원심분리하여 상층액을 모은 다음, 고정화되지 않은 소혈청알부민의 양을 측정하여 비드에 고정된 소혈청알부민의 양을 정량하였다(도 6). 그 결과, 도 6에 나타낸 바와 같이, 고정화하는 생체분자의 반응양을 조절함으로써 비드 표면의 커버리지를 조절할 수 있었다.
비교예
1: 고정시간에 따른 고정화율 측정 및 폴리스티렌
비드와
비교
시험
상기 비드에 고정되는 생체분자의 양을 반응시간에 따라 측정하고, 상용화된 대표적인 비드인 폴리스티렌 비드의 경우와 비교하였다.
소혈청알부민 포스페이트버퍼(pH 7.2) 수용액 1.6mg/mL과 점착성 비드(직경 510nm) 또는 폴리스티렌 비드(직경 600nm)를 2 중량% 포함하는 수성 현탁액을 준비하여 실시예 2와 같은 방법으로 고정화 과정을 진행하였다. 비드에 생체분자를 고 정하는 반응 시간에 따른 표면 커버리지를 측정하였다(도 7). 그 결과, 도 7에 나타난 바와 같이, 실시예 2에서 제조된 점착성 비드는 반응시간을 조절함으로써 생체분자의 표면 커버리지를 조절할 수 있었으며, 또한 상용화된 폴리스티렌 비드 수준만큼 우수한 고정화 효율을 나타냄을 알 수 있었다.
실시예
3: 점착성
비드의
농도에 따른
스팟의
형상
점착성 비드를 이용한 바이오칩 제작에 있어서, 기판에 형성된 스팟의 형상은 분주되는 비드 수성 현탁액의 비드 함량에 영향을 받는다.
실시예 1에서 제조된 점착성 비드 (평균 직경 510nm, Tg -8℃)를 포함하는 비드 수성 현탁액 0.05, 0.1, 0.5, 1 중량%를 각각 준비하고, 폴리메틸메타크릴레이트 기판 상에 각각 0.5mL씩 스팟팅하였다. 상기 기판을 상온에서 12시간 건조한 후, 각 스팟의 표면 형상을 관찰하였다 (도 8). 그 결과, 도 8에 나타난 바와 같이, 스팟 내 비드의 함량이 높아질수록 고착된 비드의 밀도가 커지는 것을 알 수 있는데, 0.5 중량%를 넘으면서 비드가 복층으로 고착되어 고분자사슬 거동으로 인한 필름화가 진행되는 것을 알 수 있었다.
실시예
4: 점착성
비드의
코팅에 의한 요철구조물의 형성
실시예 1에서 제조된 점착성 비드(직경 510nm, Tg -8℃) 8.5 중량%를 포함하는 비드 수성 현탁액을 폴리메틸메타크릴레이트 기판 표면에 전체적 또는 국부적으로 침지코팅(dip coating)하였다 (도 9), 그 결과, 도 9에 나타난 바와 같이, 단층 의 비드로 이루어진 요철구조물이 형성되는 것을 확인할 수 있었다. 이러한 요철구조물은 바이오칩 내에서 다면적 기판 표면 또는 유체 지연구조로 활용이 가능하다.
실시예
5:
스팟의
자체 형광 측정 및 비특이적 단백질 결합
본 발명의 비드를 바이오칩에 응용하기 위한 사전 실험으로서, 비드 수성 현탁액을 칩 기재상에 나노스팟팅하고, 자체 형광(autofluorescence)과 비특이적 결합(non-specific binding) 정도를 측정하였다.
3.1mg/mL 농도의 소혈청알부민 또는 SAH(S-아데노실-L-호모시스테인)가 표지된 소혈청알부민 포스페이트 수용액 200μL와 실시예 1에서 제조된 2 중량% 점착성 비드 수성 현탁액 200μL를 혼합하고, 상온에서 15시간 흔들어 반응시켰다. 반응 종료 후, 원심분리 과정을 거쳐 세척한 다음, 전체 비드 함량이 0.2 및 0.4 중량%인 현탁액을 각각 제조하였다. 상기 비드 수성 현탁액을 잉크젯어레이어를 이용하여 50nL 부피로 폴리메틸메타크릴레이트 (PMMA) 기판 상에 스팟팅하였으며, 형광이미지 스캐너(엑슨사)를 이용하여 고착된 스팟의 자체 형광세기를 측정하였다 (도 10). 정량 결과, 도 10에 나타난 바와 같이, 점착성 비드 스팟의 자체 형광세기는 기저(background)의 형광세기 대비(SNR: signal to noise ratio) 3을 넘지 않는 미미한 수준임을 알 수 있었다.
한편, 상기와 같은 방법으로 스팟팅된, 소혈청알부민이 코팅된 비드를 항 SAH 항체 수용액으로 처리하여 단백질의 비특이적 결합 정도를 정량하였다 (도 11). 정량 결과, 도 11에 나타난 바와 같이, 항 SAH 항체의 비특이적 결합 반응 후 에 측정한 스팟의 형광세기는 기저 형광세기 대비 3을 넘지 않아 단백질의 비특이적 결합이 거의 없음을 알 수 있었다.
자체 형광세기 및 비특이적 결합이 미미하다는 상기 실험 결과는, 본 발명의 비드와 표적물질과의 반응 시, 상기 비드가 표적물질의 형광 검출을 방해하지 않는다는 것을 의미하며, 이를 통해 본 발명의 비드 지지체가 바이오칩에 적절하게 사용될 수 있다는 것을 알 수 있었다.
실시예
6:
SAH
표적물질에 대한 경쟁적 면역 검출
SAH 표적물질을 검출할 수 있는 바이오칩을 제작하기 위하여, 상기 실시예 5와 같은 방법으로, 점착성 비드에 소혈청알부민과 SAH가 표지된 소혈청알부민을 각각 코팅하고, 포스페이트버퍼를 수성매질로 하는 0.4 중량% 비드 수성 현탁액을 제조하였다. 상기 제조된 비드 수성 현탁액을 PMMA 슬라이드에 50nL 부피로 스팟팅 한 후, 30℃에서 30분, 상온에서 20시간 건조한 다음, 3 중량% 소혈청알부민과 0.05 부피% Tween이 포함된 포스페이트버퍼(pH 7.4)로 30분간 블록킹(blocking)하고 세척하였다. 형광검출을 위하여 Cy3가 표지된 2차 항체(secondary antibody)를 항 SAH 항체와, 미리 30분간 반응시킨 후, 여기에 검출하고자 하는 표적물질로서 SAH를 농도별로 혼합하여 칩의 스팟과 경쟁적 면역반응을 진행하였다.
SAH 농도에 따른 스팟의 형광 스캐너 사진 및 검출 결과를 도 12 및 도 13(-●-)에 각각 나타내었다. 형광신호는 표적물질 SAH를 첨가하지 않았을 때의 시그널을 100으로 하여 상대값으로 나타내었다. 본 실시예에서 제작된 칩의 경쟁적 면 역 검출에 의한 SAH의 검출은 표적물질 SAH가 없는 경우에 비해 90%이상 형광신호가 감소하였으며, 이때의 검출 상한(highest detection limit)은 2~5μM 수준이었다.
비교예
2: 2차원 생체분자 고정화법과 비교
본 발명의 점착성 비드를 이용한 3차원 고정화법의 우수성을 검증하기 위하여, 생체분자 고정화법으로서 상용화된 종래의 2차원 고정화법과 면역검출 성능을 비교하였다.
생체분자의 2차원 고정화가 가능한 대표적인 칩으로서 넝크(Nunc)사의 맥시소프(MaxiSorp)칩을 선택하여 SAH 표적물질에 대한 경쟁적 면역검출을 시험하고 그 결과를 실시예 6과 비교하였다.
소혈청알부민과 SAH(S-아데노실-L-호모시스테인)가 표지된 소혈청알부민을 각각 글리세롤 20 부피%가 포함된 포스페이트버퍼에 0.5 mg/mL의 농도 용액으로 준비한 후, 맥시소프칩에 스팟팅하고 항습 챔버(humidity chamber)에서 20시간 동안 건조하였다. 스팟팅된 칩을 세척한 후, 실시예 6과 같은 방법으로 경쟁적 면역반응을 진행하였다. 그 결과, 도 13(-■-)에 나타난 바와 같이, 경쟁 반응에 의한 형광신호의 최대 감소값은 50% 수준이었으며, 표준 정량 범위는 0.01~0.5μM로 실시예 6의 점착성 비드를 이용한 고정화법의 검출 수준에 크게 미치지 못하였다.
상기 결과는 맥시소프칩을 이용한 종래의 2차원 고정화법은 생체분자의 집적화 정도가 낮고, 칩표면에 대한 입체 장애가 큰 것에 기인한 것이다. 이 결과로부 터, 본 발명에 따른 점착성 비드를 이용한 바이오칩이 종래의 바이오칩보다 상대적으로 우수함을 확인할 수 있었다.
실시예
7: 특이적
SNP
검출
B형 간염 치료제인 라미부딘 약재의 내성을 가지는, B형 간염 바이러스(HBV)의 감염여부를 확인하는데 사용되는 올리고뉴클레오티드 서열(oligonucleotide sequence)을 상기 점착성 비드에 고정하여 DNA검출 응용분야 중 하나인 단일염기 다형현상 (SNP: single nucleotide polymorphism)을 검출하였다.
라미부딘 내성을 가지는 HBV는 바이러스 폴리머레이즈(polymerase)의 YMDD 모티프(motif)가 변형된 것으로, 대표적으로 Met552가 이소류신(isoleucine)으로 치환된 YIDD변형체가 있는데, YMDD 모티프를 발현하는 서열번호 1의 정상서열(normal sequence)과 YIDD 모티프를 발현하는 서열번호 2의 돌연변이 서열(mutant sequence) 사이에는 오직 하나의 염기 밖에 차이가 나지 않는다 (표 1).
YMDD 모티프를 가지는 HBV 폴리머레이즈 유전자 서열에 상보적인 정상 프로브와 YIDD 변형체의 유전자 서열에 상보적인 돌연변이 프로브를 각각 상기 점착성 비드를 이용하여 칩 표면에 고정한 후, 형광염료가 표지된 HBV 폴리머레이즈 유전자 서열(타겟)에 대하여 선택적으로 검출이 가능한지 시험하였다.
| 구분 | 서열 | 서열번호 | ||
| 프로브 | 정상 | 5'-NH 2 - TC AGT TAT AT G GAT GAT GTG -3' | 1 | |
| 돌연변이 | 5'-NH2-TC AGT TAT ATC GAT GAT GTG-3' | 2 | ||
| 타겟* | 5'-Cy3-CAC ATG ATC CAT ATA ACT GA-3' | 3 | ||
*HBV 폴리머레이즈 유전자 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드
각각의 올리고뉴클레오티드 프로브를 효과적으로 점착성 비드에 고정하기 위하여, 술포숙신이미딜 4-(N-말레이미도메틸)시클로헥산-1-카르복실레이트(sulfosuccinimidyl 4-(N-maleimidomethyl)cyclohexane-1-carboxylate)를 이용하여 소혈청알부민과 커플링하고, 이것을 실시예 6과 유사한 방법으로 점착성 비드에 코팅하였다.
플라스틱 기판 상에 상기 비드 수성 현탁액을 0.4 중량% 농도로 50nL씩 나노스팟팅하여 유전자칩을 제작하였다. 상기 칩을 탈이온수로 3분간 세척하고 80μL 블록킹 용액(20X SSC 3mL, 포름아미드(formamide) 1.35mL, 1 중량% BSA 500μL, 탈이온수 150μL)으로 40℃에서 30분간 처리한 후, 추가로 타겟시료(0nM~100nM)를 5μL 첨가하여 40℃에서 1시간 동안 혼성화 반응하였다. 비특이적 결합을 하고 있는 타겟 서열을 제거하기 위해 2X SSC로 10분간, 0.2X SSC로 10분간 세척하고, 형광 스캐너로 분석하였다. 도 14는 본 실시예에 따른 바이오칩을 이용하여 B형 간염 바이러스(HBV)의 폴리머레이즈 유전자 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드의 SNP(single nucleotide polymorphism)를 다양한 농도로 검출한 형광 스캐너 사진이고, 도 15는 도 14의 형광 스캐너 사진을 분석하여 형광 시그널 세기를 나타낸 그래프이다.
측정한 형광 스캐너 사진으로부터 형광 시그널 세기를 분석한 결과, 표적물질인 타겟시료에 대해 상보적인 정상 프로브가 단일염기 차이를 가지는 돌연변이 프로브 대비 약 4.1배 수준의 구별능을 나타내었으며, 이로부터 본 발명에 따른 바이오칩은 SNP와 같은 유전자 검출 목적으로도 유용하다는 것을 확인할 수 있었다.
실시예 8: 단백질 표적물질에 대한 직접 면역 검출
표적물질로서 실시예 6에서 예시한 SAH와 같은 저분자 물질이 아닌 단백질 항체에 대해서도 상기 점착성 비드를 이용한 면역 검출이 가능함을 시험하였다.
단백질 항원으로는 BSA (bovine serum albumin)를 사용하였다. 실시예 6과 유사한 방법으로 BSA (Calbiochem사, antigen grade)가 코팅된 점착성 비드를 제조한 후, PMMA 기판 상에 스팟팅하여 IgG(면역글로불린)를 검출할 수 있는 간단한 바이오칩을 제작하였다. 표면 블록킹을 위해서 human serum을 1X PBS 버퍼 수용액에 30%로 희석하여 상온에서 30분간 처리하였다. 음성 (negative) 대조군으로 anti-SAH IgG (polyclonal antibody, 50μg/mL)를, 양성 (Positive) 대조군으로 anti-BSA IgG (monoclonal antibody, 50μg/mL)를 선택하고, 상기 칩 기판 상에서 45분간 상온 반응시킨 후, 2차 항체로서 Cy3 형광염료가 표지된 anti-mouse-Cy3 (polyclonal, 10μg/mL)를 상온에서 20분간 반응시켰다. 1X PBS 버퍼 수용액으로 비특이적 결합을 하고 있는 나머지 항체들을 씻어낸 후, 형광 스캐너를 이용하여 형광 시그널을 검출하였다. 도 16은 본 발명의 바이오칩을 이용하여 단백질 항원인 면역글로불린(IgG)을 직접 면역 검출법으로 검출한 형광 스캐너 사진이고, 도 17은 도 16의 형광 스캐너 사진을 분석하여 형광 시그널 세기를 나타낸 그래프이다.
측정한 형광 스캐너 사진으로부터 형광 시그널 세기를 분석한 결과, 표적물질인 IgG에 대해 특이적인 양성 대조군이 비특이적인 음성 대조군 대비 7.7(양성 시그널 세기/음성 시그널 세기)의 검출능을 보였으며, 이로부터 본 발명에 따른 바이오칩은 단백질 항원의 검출 목적으로도 유용하다는 것을 확인할 수 있었다.
본 발명에 따른 점착성 비드는 생체분자를 고정하는 지지체와 칩 기판 표면에 대한 점착제로서의 특징을 동시에 가져서 별도의 장치 및 처리 과정 없이 바이오칩 상에 직접 고정시킬 수 있다. 또한, 본 발명의 점착성 비드는 고정화하는 생체분자의 반응량 및 생체분자를 비드에 고정하는 반응 시간에 따라, 비드 표면의 커버리지를 조절할 수 있는 장점이 있으며, 상용화된 기존의 비드 만큼 고정화 효율을 나타내면서도, 종래의 2차원 생체분자 고정화법에 비해 생체분자의 집적화율이 높아 바이오칩을 소형으로 제조할 수 있어 경제적인 면에서도 뛰어난 효과가 있다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서, 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항 들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
<110> LG CHEM, LTD.
<120> ADHESIVE BEAD FOR IMMOBILIZATION OF BIOMOLECULES AND METHOD FOR
FABRICATING A BIOCHIP USING THE SAME
<130> P06-B027
<150> KR 10-2005-0086284
<151> 2005-09-15
<160> 3
<170> KopatentIn 1.7
<210> 1
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 1
tcagttatat ggatgatgtg 20
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 2
tcagttatat cgatgatgtg 20
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial Sequence
<220>
<223> Probe
<400> 3
cacatgatcc atataactga 20
Claims (23)
- 수성 매질에 친수성 모노머, 주단량체 및 공단량체를 유탁시킨 다음, 중합시켜 제조된, 생체분자를 고정하는 지지체와 칩 기판 표면에 대한 점착제로서의 특징을 동시에 가지는 점착성 비드.
- 제1항에 있어서, 상기 친수성 모노머는 메타크릴산, 아크릴산, 이타콘산, 히드록시에틸메타크릴레이트, 히드록시프로필메타크릴레이트, 아크릴아미드, 글리시딜 메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 아크릴레이트, 폴리에텔렌글리콜 메타크릴레이크, 팔리톨레산, 올레산, 리놀레산, 아라키돈산, 리놀렌산, 알릴알콜 및 비닐알콜로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 점착성 비드.
- 제1항에 있어서, 상기 주단량체는 부타디엔, 에틸아크릴레이트, 부틸아크릴레이트, 에틸헥실아크릴레이트 및 옥틸아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 점착성 비드.
- 제1항에 있어서, 상기 공단량체는 비닐 아세테이트, 아크릴로니트릴, 아크릴아미드, 스티렌, 메틸메타크릴레이트 및 메틸아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 점착성 비드.
- 다음의 단계를 포함하는 점착성 비드의 제조방법:(a) 유화제 수용액에 단량체를 첨가하고 혼합하여 유탁액을 만드는 단계;(b) 수성 매질에 친수성 모노머를 첨가하고, 질소 분위기에서 온도를 약 75℃까지 상승시킨 다음, 여기에 상기 (a) 단계에서 수득된 유탁액을 첨가하고, 교반하여 유탁시키는 단계; 및(c) 상기 (b) 단계에서 수득된 유탁액에 중합 개시제를 첨가한 다음, 반응시키는 단계.
- 제5항에 있어서, 상기 수성 매질은 물, 에탄올, 메탄올, 디엠에프, 디엠에스오, 아세톤 및 엔엠피로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 친수성 모노머는 메타크릴산, 아크릴산, 이타콘산, 히 드록시에틸메타크릴레이트, 히드록시프로필메타크릴레이트, 아크릴아미드, 글리시딜 메타크릴레이트, 폴리에틸렌글리콜 아크릴레이트, 폴리에텔렌글리콜 메타크릴레이크, 팔리톨레산, 올레산, 리놀레산, 아라키돈산, 리놀렌산, 알릴알콜 및 비닐알콜로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 단량체는 부타디엔, 에틸아크릴레이트, 부틸아크릴레이트, 에틸헥실아크릴레이트 및 옥틸아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 주단량체와 비닐 아세테이트, 아크릴로니트릴, 아크릴아미드, 스티렌, 메틸메타크릴레이트 및 메틸아크릴레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상의 공단량체를 함유하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 유화제는 소디움라우릴설페이트, 젤라틴, 메틸셀룰로오스, 폴리비닐알콜, 세틸트리메틸브롬화 암모니움 및 소디움 올레이트로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제5항에 있어서, 상기 중합 개시제는 포타슘퍼설페이트, 암모늄퍼설페이트, 아조비스이소부티로니트릴(AIBN) 및 벤조일퍼옥사이드(BPO)로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제8항에 있어서, 상기 주단량체와 공단량체의 배합비는 상기 점착성 비드의 유리전이온도(Tg)에 의해 결정되며, 상기 유리전이온도(Tg)는 바이오칩의 제작 또는 사용 온도보다 0~45℃ 낮은 것을 특징으로 하는 방법.
- 다음의 단계를 포함하는 바이오칩의 제조방법:(a) 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 점착성 비드에 생체분자를 부착시켜, 생체분자가 고정된 비드의 수성 현탁액을 제조하는 단계; 및(b) 상기 수성 현탁액을 기판 상에 고정시키는 단계.
- 제12항에 있어서, 상기 (b) 단계는 수성 현탁액을 기판상에 스팟팅(spotting) 시킨 다음, 이를 건조하여 기판 상에 고정시키는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 스팟팅은 잉크젯에 의해 수행하는 것을 특징으로 하 는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 점착성 비드에 생체분자를 부착하는 방법은 소수성 흡착법, 공유결합법 및 정전기적 인력에 의한 결합법으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 생체분자는 핵산, 아미노산, 단백질, 펩타이드, 지질, 탄수화물, 효소기질, 리간드 및 코팩터로 구성된 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제12항에 있어서, 상기 기판은 마이크로웰, 슬라이드 기판 및 랩온어칩의 미세유로로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제17항에 있어서, 상기 기판의 재료는 폴리메틸메타크릴레이트, 폴리카보네이트, 폴리스티렌, 시클릭 올레핀 코폴리머, 폴리노르보넨, 스틸렌-부타디엔 코폴리머, 아크릴로니트릴 부타디엔 스티렌, 유리, 실리콘, 히드로겔, 실리콘, 금속, 세라믹 및 다공성 멤브레인으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상인 것을 특징으로 하는 방법.
- 제12항의 방법에 의해 제조되고, 생체분자가 부착되어 있는 점착성 비드가 기판에 고정되어 있는 바이오칩.
- 다음의 단계를 포함하는 시료 내 표적물질의 검출방법:(a) 제19항의 바이오칩에 표적물질을 함유하는 시료를 적용하는 단계; 및(b) 상기 바이오칩 상의 생체분자와 특이적으로 결합하는 표적물질을 검출하는 단계.
- 제20항에 있어서, 상기 표적물질의 검출은 방사성 동위 원소나 발광(luminescence) 또는 발색 염료 등의 생체표지자(biolabel)를 이용한 검출법, 생체 효소를 이용한 면역 검출법(enzyme-linked immunoassay, ELISA), 전기화학적 검출법(electrochemical immunoassay), 입자탁도를 이용한 검출법(particle turbidimetric immunoassay) 및 형광 발색단(fluorophore)을 이용한 검출법으로 이루어진 군으로부터 선택된 어느 하나 이상을 이용하는 것을 특징으로 하는 방법.
- 제12항의 방법에 의해 제조되고, 서열번호 1 또는 서열번호 2의 SNP (Single nucleotide polymorphism)가 부착되어 있는, 라미부딘 약재에 내성을 가지는 B형 간염 바이러스 감염 여부 확인에 사용되는 바이오칩.
- 제1항 내지 제4항 중 어느 한 항의 점착성 비드를 칩 기판 표면에 전체 또는 국부적으로 코팅하여 제조된 요철구조물.
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020060037275A KR100794186B1 (ko) | 2005-09-15 | 2006-04-25 | 생체분자 고정용 점착성 비드 및 이를 이용한 바이오칩의제조방법 |
Applications Claiming Priority (2)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| KR1020050086284 | 2005-09-15 | ||
| KR1020060037275A KR100794186B1 (ko) | 2005-09-15 | 2006-04-25 | 생체분자 고정용 점착성 비드 및 이를 이용한 바이오칩의제조방법 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| KR20070031781A true KR20070031781A (ko) | 2007-03-20 |
| KR100794186B1 KR100794186B1 (ko) | 2008-01-11 |
Family
ID=41344029
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| KR1020060037275A KR100794186B1 (ko) | 2005-09-15 | 2006-04-25 | 생체분자 고정용 점착성 비드 및 이를 이용한 바이오칩의제조방법 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| KR (1) | KR100794186B1 (ko) |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100876657B1 (ko) * | 2007-10-15 | 2009-01-07 | 한국기계연구원 | 표면개질된 마이크로비드와 마이크로비드 어레이칩의제조방법과 마이크로비드 어레이칩을 이용한 질병특이항원의 확인방법 |
| CN113307918A (zh) * | 2021-06-07 | 2021-08-27 | 东莞长联新材料科技股份有限公司 | 一种植物油基聚丙烯酸酯非离子乳液及其制备方法和应用 |
Families Citing this family (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR20130067239A (ko) * | 2011-12-13 | 2013-06-21 | 주식회사 나이벡 | 생리활성 펩타이드의 발굴방법 |
| KR101569891B1 (ko) | 2012-02-13 | 2015-11-27 | 동국대학교 산학협력단 | 다공성 지지체를 이용한 저분자 포집용 졸-겔 칩 및 이를 이용한 저분자 특이적 물질의 스크리닝 방법 |
Family Cites Families (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| US6133436A (en) | 1996-11-06 | 2000-10-17 | Sequenom, Inc. | Beads bound to a solid support and to nucleic acids |
-
2006
- 2006-04-25 KR KR1020060037275A patent/KR100794186B1/ko active IP Right Grant
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| KR100876657B1 (ko) * | 2007-10-15 | 2009-01-07 | 한국기계연구원 | 표면개질된 마이크로비드와 마이크로비드 어레이칩의제조방법과 마이크로비드 어레이칩을 이용한 질병특이항원의 확인방법 |
| CN113307918A (zh) * | 2021-06-07 | 2021-08-27 | 东莞长联新材料科技股份有限公司 | 一种植物油基聚丙烯酸酯非离子乳液及其制备方法和应用 |
| CN113307918B (zh) * | 2021-06-07 | 2022-04-15 | 东莞长联新材料科技股份有限公司 | 一种植物油基聚丙烯酸酯非离子乳液及其制备方法和应用 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| KR100794186B1 (ko) | 2008-01-11 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| JP4482025B2 (ja) | 生体分子固定用粘着性ビーズ及びこれを用いたバイオチップの製造方法 | |
| JP4307380B2 (ja) | チップ基材上でのゲル化反応により作製されたバイオチップ | |
| KR101140881B1 (ko) | 바이오칩 | |
| EP1982184B1 (en) | Sol composition for sol-gel biochip to immobilize probe on substrate without surface treatment and method for screening thereof | |
| KR100794186B1 (ko) | 생체분자 고정용 점착성 비드 및 이를 이용한 바이오칩의제조방법 | |
| JP5543179B2 (ja) | 標識独立検出バイオセンサ組成およびその方法 | |
| JP4197279B2 (ja) | 生体由来物検出用基板及びその製造方法 | |
| US20080293592A1 (en) | Method For Covalently Immobilising Biomolecules on Organic Surfaces | |
| US20060228813A1 (en) | Method for immobilizing biomolecules on metal oxide substrates | |
| JP5148818B2 (ja) | 新規固相担体及びその利用 | |
| JP2004513344A (ja) | 生物学的結合のためのパターン化表面を大規模に生産する方法 | |
| KR100766750B1 (ko) | 바이오칩의 제조방법 | |
| KR20070031759A (ko) | 고분자겔을 이용한 바이오칩의 제조방법 | |
| US20060084159A1 (en) | Method for manufacturing of three dimensional composite surfaces for microarrays |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| A201 | Request for examination | ||
| PA0109 | Patent application |
Patent event code: PA01091R01D Comment text: Patent Application Patent event date: 20060425 |
|
| PA0201 | Request for examination | ||
| E902 | Notification of reason for refusal | ||
| PE0902 | Notice of grounds for rejection |
Comment text: Notification of reason for refusal Patent event date: 20070222 Patent event code: PE09021S01D |
|
| N231 | Notification of change of applicant | ||
| PN2301 | Change of applicant |
Patent event date: 20070312 Comment text: Notification of Change of Applicant Patent event code: PN23011R01D |
|
| PG1501 | Laying open of application | ||
| E701 | Decision to grant or registration of patent right | ||
| PE0701 | Decision of registration |
Patent event code: PE07011S01D Comment text: Decision to Grant Registration Patent event date: 20071127 |
|
| GRNT | Written decision to grant | ||
| PR0701 | Registration of establishment |
Comment text: Registration of Establishment Patent event date: 20080107 Patent event code: PR07011E01D |
|
| PR1002 | Payment of registration fee |
Payment date: 20080107 End annual number: 3 Start annual number: 1 |
|
| PG1601 | Publication of registration | ||
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20101223 Start annual number: 4 End annual number: 4 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20120104 Start annual number: 5 End annual number: 5 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20130102 Year of fee payment: 6 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20130102 Start annual number: 6 End annual number: 6 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20131211 Year of fee payment: 7 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20131211 Start annual number: 7 End annual number: 7 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20141217 Year of fee payment: 8 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20141217 Start annual number: 8 End annual number: 8 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20151204 Year of fee payment: 9 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20151204 Start annual number: 9 End annual number: 9 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20161212 Year of fee payment: 10 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20161212 Start annual number: 10 End annual number: 10 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20180102 Year of fee payment: 11 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20180102 Start annual number: 11 End annual number: 11 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20190107 Year of fee payment: 12 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20190107 Start annual number: 12 End annual number: 12 |
|
| FPAY | Annual fee payment |
Payment date: 20200102 Year of fee payment: 13 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20200102 Start annual number: 13 End annual number: 13 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20210104 Start annual number: 14 End annual number: 14 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20220103 Start annual number: 15 End annual number: 15 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20221226 Start annual number: 16 End annual number: 16 |
|
| PR1001 | Payment of annual fee |
Payment date: 20240103 Start annual number: 17 End annual number: 17 |