JP4307380B2 - チップ基材上でのゲル化反応により作製されたバイオチップ - Google Patents
チップ基材上でのゲル化反応により作製されたバイオチップ Download PDFInfo
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Description
本発明は、ゾル−ゲル反応を用いて作製したバイオチップ、該バイオチップの作製方法、及び該バイオチップの使用方法に係る。
バイオチップは、新規のナノテクノロジー(Ｎａｎｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＮＴ)、バイオテクノロジー（Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＢＴ）、情報テクノロジー（Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、ＩＴ）が融合された代表的な例のものである。バイオチップは、ＮＴ等の物質技術と該技術のコンテンツ及び応用分野であるＢＴ、及び結果を解析し多量の結果を分析するＩＴ技術とがあいまって出来上がった技術である。
バイオチップは、各種の生体物質を単位面積の固状支持体の表面に高集積マイクロアレイ（Ｈｉｇｈ−Ｄｅｎｓｉｔｙ Ｍｉｃｒｏａｒｒａｙｉｎｇ）したものであって、表面に付着する生体物質によってＤＮＡチップ、タンパク質チップ、セルチップ、ニューロンチップ等の各種のチップに分けることができる。また、バイオチップは、マイクロ流体学技術とあいまってＬＯＣ（Ｌａｂ−ｏｎ−ａ−ｃｈｉｐ）に発展しつつある。
バイオチップの詳細技術としては、生体物質を固定化させる技術、固状支持体を生体物質親和的にする技術、生体物質をマイクロアレイする技術、出来上がったチップ上において種々の生体反応を施すアッセイ技術、反応済みの結果を感知する技術、固定化対象の生体物質を作るタンパク質工学、遺伝子組み換え技術等が必要である。
本発明が代表的に応用され得るタンパク質チップは、バイオチップの一種であって、タンパク質チップは、各種のタンパク質を単位面積の固状支持体の表面に高集積マイクロアレイしたものである。タンパク質チップを用いると、少量の試料で疾病の診断、ハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）、酵素活性測定等のタンパク質を用いた様々な目的の実験を大規模で且つ容易に実施することができる。
既に開発され常用化されたＤＮＡチップの作製と同様な原理と技術要素を導入してタンパク質チップを作製しようとする努力が行われている。一般に、常用化されたＤＮＡチップの大半は、コート物質で表面を前処理したガラス板上にＤＮＡを固定化して作製したものである。ＤＮＡチップの作製に用いられる方法と類似の方法でタンパク質チップを作製する場合、即ち、コート物質で表面を前処理したガラス板上にタンパク質を固定化することでタンパク質チップを製造する場合では、固定されるターゲットタンパク質の物理化学的特性の差により様々な問題点が生じている。
初期のタンパク質チップは、表面処理されたガラス板上にタンパク質をそのまま付着させた後、簡単な結合分析（ｂｉｎｄｉｎｇ ａｓｓａｙ）を行うものであったが、固定化されたタンパク質の活性有無によって実際の作動有無が左右され、本来の目的を達成するのに多くの困難があった（ＭａｃＢｅａｔｈ及びＳｃｈｒｅｉｂｅｒの文献［Ｓｃｉｅｎｃｅ２８９：１７６０、２０００］参照）。かかる問題点は、前述したようにタンパク質が有する固有の物理化学的特性の差により生じるタンパク質の変性（ｄｅｎａｔｕｒａｔｉｏｎ）或いは不活性化、分解（ｄｅｇｒａｄａｔｉｏｎ）等からもたらされるものである。かかる問題点を克服すべく、ＤＮＡとは区別されるタンパク質の特性に符合するタンパク質付着表面の処理技術及びタンパク質固定物質等に関する研究が行われている。
かかる研究は、タンパク質チップの表面上において固定反応を起こしつつ、タンパク質の活性を保持するための方法を提供することにフォーカスが合わせられており、例えば、パーキンエルマー社（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ）に最近引き取られたパッカードバイオサイエンス（Ｐａｃｋａｒｄ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）社製のヒドロゲル（Ｈｙｄｒｏｇｅｌ，登録商標）コートスライド、プロリングス（Ｐｒｏｌｉｎｘ）社製のバーサリンクス（Ｖｅｒｓａｌｉｎｘ）チップ、ザイオミックス（Ｚｙｏｍｙｘ）社製のバイオチップのＰＤＣチップ等が挙げられる。
特に、ヒドロゲル・コートスライドは、三次元ポリアクリルアミド・ゲルを用いた技術であって、光学的に平らなシラン処理されたスイス（Ｓｗｉｓｓ）ガラスを基本支持物質として使用し、その上に表面を変形させたアクリルアミド重合体を載置してタンパク質の結合力及び構造的安定性を向上したものである。ここで、タンパク質は、ポリアクリルアミド・ゲルの官能基と共有結合を形成して固定化されている。
また、プロリングス社のバーサリンクスチップは、ＴｉＯ３表面上にビオチン誘導体化されたポリ（Ｌ-リシン）-ｇ-ポリ（エチレングリコール）の自己組織化単分子膜（ｓｅｌｆ ａｓｓｅｍｂｌｙ ｍｏｎｏｌａｙｅｒ）を形成し、該形成された表面にタンパク質を固定化してタンパク質の活性を増加させたものである。
これらの方法は、三次元的なマイクロ構造をつくり、変形された表面にタンパク質を共有結合等で固定化することでスポット状のタンパク質の活性を保持するのに役立てるものである。これらの方法の他にもマイクロ加工を用いたマイクロウェル形態のチップを作って液状のチップを作製したりもする。
一方、本発明で用いられるゾル−ゲル工程は、マイクロ加工によりマイクロ構造を作るのに用いられてきた技術であって、特に、無機物質に生体分子を化学的に付着させる代わりに、穏和な工程により結合網を形成し、この結合網内に生体分子を共有結合ではない方法で固定化するのに多く用いられてきた技術である（非特許文献１参照）。酵素を始めとする多くの生体分子が塊状ゾル−ゲル・マトリックス内に固定され、生体触媒やバイオセンサの作製にも用いられている（非特許文献２参照）。特に、透明な光学的性質のため、光学的発色の検出にも用いられている。（非特許文献３参照）。また、生体分子は、ゾル−ゲルに固定化されると化学的に安定化するのみならず、熱的にも非常に安定化すると知られている（非特許文献４参照）。
バイオセンサーの場合、ゾル−ゲル反応は単なる固定のみならず、固状支持体上にマイクロ構造を形成しパターン化する方法として用いられている。ここで、パターン化方法では、流体力学を用いて液状のゾルをモールドにて形をつくり、ゲル化した後、モールドを取り外してパターンを形成する。例えば、毛細管内のマイクロ−モジューリング（Ｍｉｃｒｏ−Ｍｏｄｕｌｉｎｇ ｉｎ−ｃａｐｉｌｌａｒｉｅｓ；ＭＩＭＩＣ）技法（非特許文献５、非特許文献６、非特許文献７参照）と指称される技術は、メゾスコピック（ｍｅｓｏｓｃｏｐｉｃ）シリカをパターン化する技術である。この技術は、マイクロ流体工学の基本的なパターン化に用いられ得る。
しかし、タンパク質の活性は、ｐＨ等の各種の因子により影響を受けるため、ゾル−ゲル過程では、ゾル状態からタンパク質を加えることで活性を保つ条件を設定することが重要である。このために、中性ｐＨ等の各種の穏和な条件を用いてタンパク質とゾルとを予め混ぜ合わせてタンパク質をパターン化するといった技術（非特許文献８参照）が発表されているが、中性ｐＨでは、ゾル−ゲル過程が急激に進んでゲルになるのみならず、添加剤の選択によっては割れが生じたり不透明になる等の問題点がある。
Ｇｉｌｌ Ｉ．、Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ Ａ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：２８２、２０００ Ｒｅｅｔｚら、Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．９：９４３、１９９７ Ｅｄｍｉｎｓｔｏｎら、Ｊ．Ｃｏｌｌ．Ｉｎｔｅｒｆ．Ｓｃｉ．１６３：３９５、１９９４ Ｄａｖｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６：１１２０、１９９４ Ｋｉｍら、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．８２：２３９、１９９５ Ｍａｒｚｏｌｉｎら、Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．１０：５７１、１９９８ Ｓｃｈｕｌｌｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｏｐｔｉｃｓ ３８：５７９９、１９９９ Ｋｉｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７３：３３１〜３３７、２００１
Ｇｉｌｌ Ｉ．、Ｂａｌｌｅｓｔｅｒｏｓ Ａ．ら、Ｔｒｅｎｄｓ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．１８：２８２、２０００ Ｒｅｅｔｚら、Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．９：９４３、１９９７ Ｅｄｍｉｎｓｔｏｎら、Ｊ．Ｃｏｌｌ．Ｉｎｔｅｒｆ．Ｓｃｉ．１６３：３９５、１９９４ Ｄａｖｅら、Ａｎａｌ．Ｃｈｅｍ．６６：１１２０、１９９４ Ｋｉｍら、Ｊ．Ｆｅｒｍｅｎｔ．Ｂｉｏｅｎｇ．８２：２３９、１９９５ Ｍａｒｚｏｌｉｎら、Ａｄｖ．Ｍａｔｅｒ．１０：５７１、１９９８ Ｓｃｈｕｌｌｅｒら、Ａｐｐｌ．Ｏｐｔｉｃｓ ３８：５７９９、１９９９ Ｋｉｍら、Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌ．Ｂｉｏｅｎｇ．７３：３３１〜３３７、２００１
本発明の目的は、ゾル−ゲル反応を用いて作製したバイオチップ、前記バイオチップの作製方法、及び前記バイオチップの使用方法を提供することである。
従来では、タンパク質を始めとする生体物質が含有されたゾル−ゲル・マトリックスをスポット状にチップ基材上に付着可能な技術が存在していなかったため、生体物質が固定されたゾル−ゲル・マトリックスをスポット状に集積したバイオチップが存在していなかった。
従来では、タンパク質を始めとする生体物質が含有されたゾル−ゲル・マトリックスをスポット状にチップ基材上に付着可能な技術が存在していなかったため、生体物質が固定されたゾル−ゲル・マトリックスをスポット状に集積したバイオチップが存在していなかった。
本発明は、下記のようにチップ基材の表面処理技術を開発することにより、チップ基材上でのゾル−ゲル反応を用いて作製したバイオチップを初めて提供することができるようになった。本発明に係るチップ基材の表面処理技術により、生体物質が含有されたゾル混合物をスポット状にチップ基材上に集積でき、前記ゾル混合物をゲル化させるゾル−ゲル反応をチップ基材上で引き起こすことができ、更に、ゾル−ゲル・マトリックスをチップ基材上に固定化できる。
本発明は、チップ基材の表面に生体物質が共有結合により固定された従来のバイオチップとは異なって、生体物質がその中の気孔に捕集されカプセル化されているゲル状のスポットがチップ基材上に集積及び固定されたバイオチップを提供する。
本発明は、表面処理されたチップ基材上に生体物質を含有するゾル状の混合物をスポット状に集積する第１のステップ；及びチップ基材上にスポット状のゾル混合物をゲル化反応させる第２のステップと；を含むバイオチップの作製方法を提供する。
前記ゾル混合物のゲル化反応によりゲルの三次元網状組織が形成され、前記三次元網状組織により気孔が生じ、前記気孔中に生体物質が捕集される。結局として、チップ基材上に集積されたゲル状のスポット中に生体物質がカプセル化されたバイオチップを提供することができる。
また、本発明は、チップ基材上でのゾル−ゲル反応により生体物質が固定されたバイオチップに、前記生体物質との結合可否を分析するターゲット物質を含む試料を適用する第１のステップ；及び前記生体物質に特異的に結合されたターゲット物質を検出する第２のステップと；を含むバイオチップ上に固定された生体物質とターゲット物質との結合を分析する方法を提供する。
本発明は、チップ基材の表面に生体物質が共有結合により固定された従来のバイオチップとは異なって、生体物質がその中の気孔に捕集されカプセル化されているゲル状のスポットがチップ基材上に集積及び固定されたバイオチップを提供する。
本発明は、表面処理されたチップ基材上に生体物質を含有するゾル状の混合物をスポット状に集積する第１のステップ；及びチップ基材上にスポット状のゾル混合物をゲル化反応させる第２のステップと；を含むバイオチップの作製方法を提供する。
前記ゾル混合物のゲル化反応によりゲルの三次元網状組織が形成され、前記三次元網状組織により気孔が生じ、前記気孔中に生体物質が捕集される。結局として、チップ基材上に集積されたゲル状のスポット中に生体物質がカプセル化されたバイオチップを提供することができる。
また、本発明は、チップ基材上でのゾル−ゲル反応により生体物質が固定されたバイオチップに、前記生体物質との結合可否を分析するターゲット物質を含む試料を適用する第１のステップ；及び前記生体物質に特異的に結合されたターゲット物質を検出する第２のステップと；を含むバイオチップ上に固定された生体物質とターゲット物質との結合を分析する方法を提供する。
本発明は、チップ基材の表面処理技術を開発することにより、チップ基材上でのゾル−ゲル反応を用いて作製したバイオチップを初めて提供することができるようになった。本発明に係るチップ基材の表面処理技術により、生体物質が含有されたゾル混合物をスポット状にチップ基材上に集積でき、前記ゾル混合物をゲル化させるゾル−ゲル反応をチップ基材上で引き起こすことができ、更に、ゾル−ゲル・マトリックスをチップ基材上に固定化できる。
本発明のバイオチップは、チップ基材上に集積されたスポットがその中に生体物質をカプセル化し、共有結合することなくフリー方向性を呈することができるように生体物質を担持したキャリア形態であって、新規概念のバイオチップである（図８参照）。
また、本発明によるバイオチップの作製時、チップ基材上でシリケートによるゾル−ゲル反応を引き起こして固定化させる方法は、新規概念のバイオチップの作製方法である。
本発明のバイオチップでは、生体物質を含むゾル混合物をチップ基材上でゲル化反応させることにより、生体物質をゲル・マトリックスに共有結合にて結合させることではなく、生体物質をゲル・マトリックスにより形成された気孔中に担持し、ゲル・マトリックスで形成されたスポットによりカプセル化することにより、生体物質の反応性を向上することができる。
従って、本発明をタンパク質チップに応用する場合、多くの量のタンパク質を個別のスポット中にタンパク質の立体構造を保ったまま入れることができるため、向上した敏感度を有するチップを作製することができる。また、多くのタンパク質がゾル−ゲル反応の基本物質であるシリケート構造物中の生体親和的な添加物により安定化し得るため、活性も同じく顕著に向上することができる。
また、本発明によるバイオチップの作製時、チップ基材上でシリケートによるゾル−ゲル反応を引き起こして固定化させる方法は、新規概念のバイオチップの作製方法である。
本発明のバイオチップでは、生体物質を含むゾル混合物をチップ基材上でゲル化反応させることにより、生体物質をゲル・マトリックスに共有結合にて結合させることではなく、生体物質をゲル・マトリックスにより形成された気孔中に担持し、ゲル・マトリックスで形成されたスポットによりカプセル化することにより、生体物質の反応性を向上することができる。
従って、本発明をタンパク質チップに応用する場合、多くの量のタンパク質を個別のスポット中にタンパク質の立体構造を保ったまま入れることができるため、向上した敏感度を有するチップを作製することができる。また、多くのタンパク質がゾル−ゲル反応の基本物質であるシリケート構造物中の生体親和的な添加物により安定化し得るため、活性も同じく顕著に向上することができる。
（１）チップ基材の表面処理
本発明は、分子量の範囲が８００(２００,０００のポリビニルアセテート（ＰＶＡｃ）、分子量の範囲が７０,０００(１２０,０００のポリ（ビニルブチラール-ｃｏ-ビニルアルコール-ｃｏ-ビニルアセテート）、分子量が１０,０００以上のポリ（メチルメタクリレート-ｃｏ-メタクリル酸）、分子量が２００,０００以上のポリ（メチルビニルエーテル-無水マレイン酸）、分子量が１,０００,０００以上のポリ（メチルビニルエーテル-無水マレイン酸）、分子量が１０,０００以上のポリ（メチルアクリレート）、３-グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）よりなる群から選ばれたコート剤を塩化メチレン（ＭＣ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、エタノール、メタノール、ブタノール、メチルエチルケトン、アセトン、イソプロピルアルコール（ＩＡ）、エチルアセテート（ＥＡ）、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、ジ-アセトンアルコール（ＤＡＡ）等よりなる群から選ばれた溶媒に溶解させたことを特徴とするチップ基材用コート液を提供する。
本発明は、分子量の範囲が８００(２００,０００のポリビニルアセテート（ＰＶＡｃ）、分子量の範囲が７０,０００(１２０,０００のポリ（ビニルブチラール-ｃｏ-ビニルアルコール-ｃｏ-ビニルアセテート）、分子量が１０,０００以上のポリ（メチルメタクリレート-ｃｏ-メタクリル酸）、分子量が２００,０００以上のポリ（メチルビニルエーテル-無水マレイン酸）、分子量が１,０００,０００以上のポリ（メチルビニルエーテル-無水マレイン酸）、分子量が１０,０００以上のポリ（メチルアクリレート）、３-グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）よりなる群から選ばれたコート剤を塩化メチレン（ＭＣ）、テトラヒドロフラン（ＴＨＦ）、エタノール、メタノール、ブタノール、メチルエチルケトン、アセトン、イソプロピルアルコール（ＩＡ）、エチルアセテート（ＥＡ）、メチルイソブチルケトン（ＭＩＢＫ）、ジ-アセトンアルコール（ＤＡＡ）等よりなる群から選ばれた溶媒に溶解させたことを特徴とするチップ基材用コート液を提供する。
前記溶媒は、低い沸点を有する有機溶媒である。
前記溶媒の使用濃度は、総コート液に対し、５(２０重量％の範囲が好ましく、より好ましくは、５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％である。
前記のようなコート剤を使用してチップ基材をコートすると、機能的にチップ基材上におけるゲル化反応を促進させ、ゲル化後も抗原・抗体反応等の水溶液中でのアッセイと激しい洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）段階でもゲル状態が崩れないのみならず、物性面でも疎水性であることからスポットの形状を保ち、硬度が高く、光学的に透明にコートされており、反応後におけるバックグラウンド・レベルを下げる。前記コート剤の使用分子量と濃度は、実験の結果、上述のような物性と機能性を保たせるのに最も適していると示された。
前記溶媒の使用濃度は、総コート液に対し、５(２０重量％の範囲が好ましく、より好ましくは、５重量％、１０重量％、１５重量％、２０重量％である。
前記のようなコート剤を使用してチップ基材をコートすると、機能的にチップ基材上におけるゲル化反応を促進させ、ゲル化後も抗原・抗体反応等の水溶液中でのアッセイと激しい洗浄（ｗａｓｈｉｎｇ）段階でもゲル状態が崩れないのみならず、物性面でも疎水性であることからスポットの形状を保ち、硬度が高く、光学的に透明にコートされており、反応後におけるバックグラウンド・レベルを下げる。前記コート剤の使用分子量と濃度は、実験の結果、上述のような物性と機能性を保たせるのに最も適していると示された。
また、本発明は、前記コート液でチップ基材をコートしたバイオチップ用基材を提供する。前記コート方法としては、スピンコートが好ましい。
更に、本発明に使用可能なチップ基材としては、一般に使用されるガラス、石英、シリコン、プラスチック、ポリプロピレン、ポリカーボネートまたは活性化したアクリルアミド等を使用することができるが、光学的な方法で測定及び分析するために、チップ基材は、光学的に透明なものであることが好ましい。従って、このために、チップ基材として、ポリメチルメタクリル酸（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）等の光学的に優れた高分子を使用することができる。
チップ基材は、多量のサンプルを多くのマーカーで反応させ得る形態で作製することができる。
更に、本発明に使用可能なチップ基材としては、一般に使用されるガラス、石英、シリコン、プラスチック、ポリプロピレン、ポリカーボネートまたは活性化したアクリルアミド等を使用することができるが、光学的な方法で測定及び分析するために、チップ基材は、光学的に透明なものであることが好ましい。従って、このために、チップ基材として、ポリメチルメタクリル酸（ＰＭＭＡ）、ポリカーボネート（ＰＣ）、環状オレフィン共重合体（ＣＯＣ）等の光学的に優れた高分子を使用することができる。
チップ基材は、多量のサンプルを多くのマーカーで反応させ得る形態で作製することができる。
（２）チップ基材上でのゲル化反応のためのゾル状の混合物の調製
チップ基材上でのゲル化反応によりチップ基材の表面にタンパク質を始めとする生体物質をカプセル化したスポットを高密度にて集積固定化するために、本発明は、ゾル−ゲルカプセル化に使用されるゾル−ゲル・マトリックス用基本物質として、シリケート単量体、下記の添加剤を使用することができる。
添加剤としては、ポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、３-グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン（３-Ｇｌｙｃｉｄｏｘｙｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ；ＧＰＴＭＯＳ、９８％）、（Ｎ-トリエトキシシリルプロピル）-Ｏ-ポリエチレンオキサイドウレタン［（Ｎ-ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌｐｒｏｐｙｌ）-Ｏ-ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ ｕｒｅｔｈａｎｅ；ＰＥＯＵ］、グリセロール、分子量４００(１０,０００範囲のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等が挙げられる。
チップ基材上でのゲル化反応によりチップ基材の表面にタンパク質を始めとする生体物質をカプセル化したスポットを高密度にて集積固定化するために、本発明は、ゾル−ゲルカプセル化に使用されるゾル−ゲル・マトリックス用基本物質として、シリケート単量体、下記の添加剤を使用することができる。
添加剤としては、ポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、３-グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン（３-Ｇｌｙｃｉｄｏｘｙｐｒｏｐｙｌｔｒｉｍｅｔｈｏｘｙｓｉｌａｎｅ；ＧＰＴＭＯＳ、９８％）、（Ｎ-トリエトキシシリルプロピル）-Ｏ-ポリエチレンオキサイドウレタン［（Ｎ-ｔｒｉｅｔｈｏｘｙｓｉｌｙｌｐｒｏｐｙｌ）-Ｏ-ｐｏｌｙｅｔｈｙｌｅｎｅ ｏｘｉｄｅ ｕｒｅｔｈａｎｅ；ＰＥＯＵ］、グリセロール、分子量４００(１０,０００範囲のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）等が挙げられる。
シリケート単量体としては、テトラメチルオルソシリケート（ＴＭＯＳ）、テトラエチルオルソシリケート（ＴＥＯＳ）、メチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、トリメトキシシラン（ＴＭＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）、３-アミノプロピルトリメトキシシリケート等が挙げられる。
特に、シリケート単量体、及び添加剤のうちのＰＧＳ、ＧＰＴＭＯＳ、ＰＥＯＵは、単独でもゾル−ゲル反応が可能であるためゾル−ゲル・マトリックスを形成することができる。
好ましくは、シリケート単量体のうちの少なくとも１種と前記添加剤のうちの少なくとも１種との混合物を、ゾル−ゲル・マトリックス用基本物質として使用することができる。
ゾル−ゲル・マトリックス用基本物質としてのシリケート単量体と添加剤は、総ゾル溶液に対し、３０〜６０体積％の範囲で使用することが好ましい。
シリケート単量体は、総ゾル混合物に対し、１０〜４０体積％の範囲で使用することが好ましく、より好ましくは、２０〜４０体積％の範囲である。前記添加剤は、総ゾル混合物に対し、２〜１０体積％の範囲で使用することがより好ましい。前記添加剤の使用量が１０体積％を超える場合、ゾル混合物との相容性に劣り、チップ基材上へのスポットの形成がうまく行われない。
一方、表１、２に提示されたように、所望の生体物質の大きさ、タンパク質の活性、ゾル−ゲルの反応速度、スポットのモーフォロジー（Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）等を考慮し、用途に合わせて前記添加剤を選択し使用することができる。
特に、シリケート単量体、及び添加剤のうちのＰＧＳ、ＧＰＴＭＯＳ、ＰＥＯＵは、単独でもゾル−ゲル反応が可能であるためゾル−ゲル・マトリックスを形成することができる。
好ましくは、シリケート単量体のうちの少なくとも１種と前記添加剤のうちの少なくとも１種との混合物を、ゾル−ゲル・マトリックス用基本物質として使用することができる。
ゾル−ゲル・マトリックス用基本物質としてのシリケート単量体と添加剤は、総ゾル溶液に対し、３０〜６０体積％の範囲で使用することが好ましい。
シリケート単量体は、総ゾル混合物に対し、１０〜４０体積％の範囲で使用することが好ましく、より好ましくは、２０〜４０体積％の範囲である。前記添加剤は、総ゾル混合物に対し、２〜１０体積％の範囲で使用することがより好ましい。前記添加剤の使用量が１０体積％を超える場合、ゾル混合物との相容性に劣り、チップ基材上へのスポットの形成がうまく行われない。
一方、表１、２に提示されたように、所望の生体物質の大きさ、タンパク質の活性、ゾル−ゲルの反応速度、スポットのモーフォロジー（Ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）等を考慮し、用途に合わせて前記添加剤を選択し使用することができる。
添加剤は、総ゾル溶液に対し、それぞれＰＧＳ：０．５〜６体積％、ＧＰＴＭＯＳ：１〜１０体積％、ＰＥＯＵ：５〜１５体積％、グリセロール：１〜５体積％、ＰＥＧ：１〜６体積％の範囲で使用することが好ましい。
ポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）は、シリケート単量体とグリセロールとの反応で得られる重合中間体である。
ポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）は、シリケート単量体とグリセロールとの反応で得られる重合中間体である。
前記重合中間体（ＰＧＳ）は、気孔の大きさを調節するに当たって重要な機能を果たす物質である。バイオチップの表面に集積された生体物質（例えば、タンパク質）と反応物質との反応が起こり易くするためには、固定されたゲルが最適化された気孔の大きさを有することが好ましい。従って、好ましくは、前記ＰＧＳは、総ゾル溶液に対し、０．５〜６体積％の範囲で添加して気孔の大きさを調節することができる。
ポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）は、単量体として、テトラメチルオルソシリケート（ＴＭＯＳ）、テトラエチルオルソシリケート（ＴＥＯＳ）、メチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、トリメトキシシラン（ＴＭＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）、３-アミノプロピルトリメトキシシリケートから選ばれる少なくとも１種のシリケート誘導体とグリセロールとを反応させて得られる。ポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）は、当分野における公知された方法により作製することができる。
チップ基材の表面上でゲル化反応するゾル混合物は、シリケート及び前記添加剤よりなる群から選ばれた少なくとも１種の物質とチップの表面上に集積しようとする生体物質（例えば、タンパク質）を含む。
本発明によりバイオチップに固定され得る生体物質としては、ターゲット物質と特異的に結合することでこれら間の結合を分析可能にする物質であればいずれでもよい。好ましくは、ＤＮＡ、ＲＮＡまたはＰＮＡを含む核酸、タンパク質またはオリゴペプチド等が挙げられる。
本発明によりチップ基材の表面に高密度で集積可能な生体物質のうちのタンパク質の非制限的な例としては、ＨＩＶ ｐ２４、Ｃｏｍｂｏ、ＲｇｐＩＩＩ、ＩｇＧ−Ｃｙ３を含み、感染性疾病の診断（ｉｎｆｅｃｔｉｏｕｓ ｄｉｓｅａｓｅ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）用抗原或いは抗体、またはＡＦＰ（Ａｌｐｈａ Ｆｅｐｔｏ Ｐｒｏｔｅｉｎ）を含むガン診断（ｃａｎｃｅｒ ｄｉａｇｎｏｓｉｓ）用抗原或いは抗体、活性の測定に用いられる酵素等がある。また、タンパク質、抗原、抗体のみならず、新薬の開発に用いられる低分子物質も集積が可能である。
前記ゾル混合物は、ｐＨ緩衝溶液を更に含むことが好ましい。前記ｐＨ緩衝溶液としては、リン酸塩緩衝液を使用することが好ましく、ｐＨは、４〜９の範囲から選択することができ、非制限的な例として、ｐＨ５、５．５、６、６．５、７、７．５、８、８．５がある。
前記ｐＨ緩衝溶液の濃度は、５〜１００ｍＭの範囲が好ましく、非制限的な例として、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭがある。
前記ｐＨ緩衝溶液の濃度は、５〜１００ｍＭの範囲が好ましく、非制限的な例として、５、１０、２０、３０、４０、５０、６０、７０、８０、９０、１００ｍＭがある。
タンパク質チップの場合、集積のためには、ゾルのゲルになる時間が遅延するように調節することがゾル−ゲル過程の勝敗を決め付ける重要な要素の一つである。また、組成の適切な配合によりゾル−ゲル過程の間適宜の粘度を保ち、ゲルになった後、光学的に有用な物質に作り上げることもタンパク質チップの作製におけるもう一つの重要な要素である。
このために、本発明は、ゾル−ゲル化合物の添加剤の種類、及び添加組成とゲル化反応条件（温度、湿度）等を調節し、本発明の実施例で明示した条件に基づき、ゲル化時間を最大２４時間まで延ばすことができる。
（３）ゾル−ゲルカプセル化反応を用いて生体物質をバイオチップの表面に固定化
本発明は、前記調製されたゾル混合物を前記チップ基材上にスポット状に適用し、前記チップ基材上でゲル化反応させ、ゲルの三次元網状組織により形成された気孔（ｐｏｒｅ）に生体物質が捕集されたバイオチップを提供する。
本発明は、前記調製されたゾル混合物を前記チップ基材上にスポット状に適用し、前記チップ基材上でゲル化反応させ、ゲルの三次元網状組織により形成された気孔（ｐｏｒｅ）に生体物質が捕集されたバイオチップを提供する。
前記生体物質は、チップ基材上でゲル状のスポットによりカプセル化されており、ゲル状のスポットカプセルは、チップ基材上に固定されている。
前記ゾル混合物は、前記本発明の方法でコートされたチップ基材の表面に高密度マイクロ集積機を用いて集積することができる。この時、ゲル化反応条件は、温度４℃〜２５℃、湿度４０〜８０％である。
前記ゾル混合物は、前記本発明の方法でコートされたチップ基材の表面に高密度マイクロ集積機を用いて集積することができる。この時、ゲル化反応条件は、温度４℃〜２５℃、湿度４０〜８０％である。
タンパク質チップの場合、スポット径は、約１００〜５００μｍが好ましく、１ｃｍ２当たりに１〜１０００個のスポットを集積することが好ましい。
下記の実施例では、１００スポット／ｃｍ２のチップを製作したが、高集積時には、１,０００スポット／ｃｍ２まで可能である。
本発明のバイオチップは、タンパク質チップ、ＤＮＡチップのみならず、新薬のスクリーニングチップと環境及び毒性の分析チップにも使用可能である。
下記の実施例では、１００スポット／ｃｍ２のチップを製作したが、高集積時には、１,０００スポット／ｃｍ２まで可能である。
本発明のバイオチップは、タンパク質チップ、ＤＮＡチップのみならず、新薬のスクリーニングチップと環境及び毒性の分析チップにも使用可能である。
（４）本発明のバイオチップの応用
本発明は、前記チップ基材上でのゾル−ゲル反応により生体物質が固定されたバイオチップに、前記生体物質との結合可否を分析するターゲット物質を含む試料を適用するステップと；前記生体物質に特異的に結合されたターゲット物質を検出するステップと；を含むバイオチップ上に固定された生体物質とターゲット物質との結合を分析する方法を提供する。
本発明は、前記チップ基材上でのゾル−ゲル反応により生体物質が固定されたバイオチップに、前記生体物質との結合可否を分析するターゲット物質を含む試料を適用するステップと；前記生体物質に特異的に結合されたターゲット物質を検出するステップと；を含むバイオチップ上に固定された生体物質とターゲット物質との結合を分析する方法を提供する。
本発明では、気孔中に生体物質を捕集し生体物質をカプセル化したゲル状のスポット内の気孔中で生体物質とターゲット物質との反応が起きる。
ターゲット物質は、検出が容易になるように、蛍光染料等のような信号誘発物質をラベルすることが好ましい。生体物質とターゲット物質との結合に関する検出は、ターゲット物質にラベルする信号誘発物質の種類によって、現在多用されている蛍光検出法、電気化学的検出法、質量の変化を用いた検出法、電荷量の変化を用いた検出法、または光学的性質の差を用いた検出法等の各種の方法により行うことができる。
ターゲット物質は、検出が容易になるように、蛍光染料等のような信号誘発物質をラベルすることが好ましい。生体物質とターゲット物質との結合に関する検出は、ターゲット物質にラベルする信号誘発物質の種類によって、現在多用されている蛍光検出法、電気化学的検出法、質量の変化を用いた検出法、電荷量の変化を用いた検出法、または光学的性質の差を用いた検出法等の各種の方法により行うことができる。
本発明によりゾル−ゲル反応で作製されたバイオチップの場合、反応時間が既存の免疫診断やバイオチップに比べて３０分から２時間内に抗原−抗体反応を含む診断に要する反応と分析結果を出すことができる。
本発明によるバイオチップは、疾病の診断に応用することができ、新薬開発の基盤技術のみならず、環境及び毒性の分析に使用することができ、速く且つ非常に敏感なバイオチップとしての役割を果たすことができる。
本発明によるバイオチップは、疾病の診断に応用することができ、新薬開発の基盤技術のみならず、環境及び毒性の分析に使用することができ、速く且つ非常に敏感なバイオチップとしての役割を果たすことができる。
本発明により作製されたタンパク質チップは、免疫診断の方法としてＳａｎｄｗｉｃｈ Ａｓｓａｙ方法と同様に抗原を蛍光染料でラベルして診断に使用することができる。ここで、結果を測定するステップにおいて蛍光スキャナーを使用し、所定のプログラムにより診断結果を分析し定量化することができる。
本発明により作製されたタンパク質チップは、ＨＩＶの診断方法に使用することができる。
本発明により作製されたタンパク質チップは、ＨＩＶの診断方法に使用することができる。
本発明は、混合ゾル溶液状態で生体物質を添加することができるため、タンパク質または低分子物質の高集積が可能であり、この結果、作製されたバイオチップを用いてハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）が可能である。
また、混合ゾル溶液にタンパク質の活性の測定に用いられる酵素物質が集積可能であるため、この結果、作製されたバイオチップを酵素の活性測定方法に使用することができる。前記活性測定用酵素として、毒性分析、環境分析、食品菌分析に用いられる酵素等がある。
かかる抗原−抗体の診断反応は、Ｍｅｍｏｒｅｃ社製の自動化されたＡ−Ｈｙｂ ｃｈａｍｂｅｒで実施することができ、また手動で外部において反応を実施することもできる。
かかる抗原−抗体の診断反応は、Ｍｅｍｏｒｅｃ社製の自動化されたＡ−Ｈｙｂ ｃｈａｍｂｅｒで実施することができ、また手動で外部において反応を実施することもできる。
（５）本発明の技術を用いた種々の製品群のプロトタイプ
本発明のチップ上でのゲル反応を用いると、一つのチップ上において最大１０,０００個以上のスポットに各種のタンパク質、及び抗原、抗体のみならず、低分子物質、バクテリア等を集積することができる。図７に示すように、本発明は、代表的に採血時における輸血適合性（感染疾患マーカー、例えば、ＨＩＶ Ｉ、ＩＩ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、マラリア、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ、Ｓｙｐｈｉｌｌｉｓ）をスクリーニングするＢｌｏｏｄ Ｂａｎｋ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇに用いることができるのみならず（図７ａ）、一般のガンの診断マーカーと特定のガンの診断マーカーを一遍に診断することができる（図７ｂ）。
本発明のチップ上でのゲル反応を用いると、一つのチップ上において最大１０,０００個以上のスポットに各種のタンパク質、及び抗原、抗体のみならず、低分子物質、バクテリア等を集積することができる。図７に示すように、本発明は、代表的に採血時における輸血適合性（感染疾患マーカー、例えば、ＨＩＶ Ｉ、ＩＩ、ＨＣＶ、ＨＢＶ、マラリア、Ｈ．ｐｙｌｏｒｉ、Ｓｙｐｈｉｌｌｉｓ）をスクリーニングするＢｌｏｏｄ Ｂａｎｋ Ｓｃｒｅｅｎｉｎｇに用いることができるのみならず（図７ａ）、一般のガンの診断マーカーと特定のガンの診断マーカーを一遍に診断することができる（図７ｂ）。
本発明を実施例に基づいて詳細に説明すると、次の通りである。なお、下記の実施例は、本発明を例示するためのものに過ぎず、これらの実施例で限定されるものではない。
第１の実施例：ＰＧＳ合成の例
テトラメチルオルソシリケート（ＴＭＯＳ）０．０４８モルとメタノール（１０％）をよく混ぜ合わせた後、ＨＣｌ（０．２５Ｍ）を加えた。この混合溶液を還流しながら７０℃で６時間反応させた。
反応混合溶液の温度を５０℃まで下げた後、グリセロール（０．１９２モル）を加えた後、この混合溶液を５０℃で１６時間反応させた。メタノールを除去することで得られたポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）を次のプロセスに使用した。
第１の実施例：ＰＧＳ合成の例
テトラメチルオルソシリケート（ＴＭＯＳ）０．０４８モルとメタノール（１０％）をよく混ぜ合わせた後、ＨＣｌ（０．２５Ｍ）を加えた。この混合溶液を還流しながら７０℃で６時間反応させた。
反応混合溶液の温度を５０℃まで下げた後、グリセロール（０．１９２モル）を加えた後、この混合溶液を５０℃で１６時間反応させた。メタノールを除去することで得られたポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）を次のプロセスに使用した。
第２の実施例：チップ上でのゲル化反応によるタンパク質チップの作製
第１の実施例で合成されたポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）２０％（ｇ／ｍｌ）水溶液とその他の添加剤を含むゾルをチップ上にスポットし、チップ上でのゲル化反応によりタンパク質チップを作製した。
第１の実施例で合成されたポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）２０％（ｇ／ｍｌ）水溶液とその他の添加剤を含むゾルをチップ上にスポットし、チップ上でのゲル化反応によりタンパク質チップを作製した。
ステップ１：チップ基材の表面処理
ＰＭＭＡで作製したスライド（７６ｍｍ×２６ｍｍ）上に３％のポリ（メチルアクリレート）／ＴＨＦからなるコート液でスピンコートを施した。スピンコートは、Ｌａｕｒｅｌｌスピンコーターにて５００ｒｐｍで１０秒間前処理を施した後、１,０００ｒｐｍで４０秒間実施した。
ＰＭＭＡで作製したスライド（７６ｍｍ×２６ｍｍ）上に３％のポリ（メチルアクリレート）／ＴＨＦからなるコート液でスピンコートを施した。スピンコートは、Ｌａｕｒｅｌｌスピンコーターにて５００ｒｐｍで１０秒間前処理を施した後、１,０００ｒｐｍで４０秒間実施した。
ステップ２：ゾル混合物の調製
ゾル混合物を調製するために、ポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）水溶液、ＰＥＯＵ、ＰＥＧ、グリセロール、ＧＰＴＭＯＳ、ＭＴＭＳのうちから選ばれたいずれか１種の添加剤；テトラメチルオルソシリケート（ＴＭＯＳ）；メチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）を混ぜ合わせた。ＨＣｌ（最終濃度：５ｍＭ）を添加して混ぜ合わせた後、リン酸ナトリウム（最終濃度：１０ｍＭ、ｐＨ７）、タンパク質（最終量：５０ｐｇ）及びＰＢＳ溶液（１５％）を入れて十分に混ぜ合わせた。使用されたタンパク質は、第３の実施例乃至第５の実施例で詳細に説明されている。
ゾル混合物を調製するために、ポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）水溶液、ＰＥＯＵ、ＰＥＧ、グリセロール、ＧＰＴＭＯＳ、ＭＴＭＳのうちから選ばれたいずれか１種の添加剤；テトラメチルオルソシリケート（ＴＭＯＳ）；メチルトリメトキシシラン（ＭＴＭＯＳ）を混ぜ合わせた。ＨＣｌ（最終濃度：５ｍＭ）を添加して混ぜ合わせた後、リン酸ナトリウム（最終濃度：１０ｍＭ、ｐＨ７）、タンパク質（最終量：５０ｐｇ）及びＰＢＳ溶液（１５％）を入れて十分に混ぜ合わせた。使用されたタンパク質は、第３の実施例乃至第５の実施例で詳細に説明されている。
ステップ３：タンパク質チップの作製
前記ステップ１で表面処理を施したスライド上にステップ２で用意されたゾル混合物をアレイヤー（Ｃａｒｔｅｘｉａｎ）のインクジェット集積プログラムを用いて直径１００〜５００μｍ程の円形スポットになるようにチップの表面に集積し、２５℃、８０％の湿度でそのまま放置しゲル化反応を進めさせることでタンパク質チップを完成した。
前記ステップ１で表面処理を施したスライド上にステップ２で用意されたゾル混合物をアレイヤー（Ｃａｒｔｅｘｉａｎ）のインクジェット集積プログラムを用いて直径１００〜５００μｍ程の円形スポットになるようにチップの表面に集積し、２５℃、８０％の湿度でそのまま放置しゲル化反応を進めさせることでタンパク質チップを完成した。
第３の実施例：ゾル混合物の組成と生体物質との関係
本実施例では、シリケート単量体のみならず、各種の添加剤を使用することにより、タンパク質チップに固定しようとするタンパク質の大きさと種類（例えば、ｐ２４またはＢＳＡタンパク質の大きさによって）或いは、抗原または抗体の使用によって最高の性能を示す組成を見出すことを目的としている。
前記組成は、最高の敏感度を示すゾル混合物の成分を見出すために、血液との反応時のバックグラウンド・レベル（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｌｅｖｅｌ）が最小で且つシグナル（ｓｉｇｎａｌ）が最大を示し、またアッセイ反応の間、表面にゲル化したタンパク質が堅固に付着され、スポットの形状も定量分析し易い形状を示すことを基準にして選定した。これだけでなく、クォリティーの制御を容易にすべくデータ間の変異が小さいことも基準にした。
この結果、下記の表２で表すように、Ｐ２４のような小さい抗原タンパク質を使用した場合、組成５の場合が同基準として最も適していることが分かる。特に、ＰＥＧ８０００を添加剤として使用した場合に最も優れた三次元構造を有するスポットを作るに寄与し、スライドの表面積当たりに多くのスポットを付けることができ、インキュベーションの後、カプセル化されたタンパク質に対して均一なシグナル強度（ｓｉｇｎａｌ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）が示された。
小サイズの抗原とは異なって、そのサイズが比較的に大きい抗体を使用した場合、組成８が前記基準を考慮してみるに最も優れた性能を示している。特に、スポット・モーフォロジー（ｓｐｏｔ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）、シグナル強度（ｓｉｇｎａｌ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）のいずれも均一な様相を示している。
本実施例では、シリケート単量体のみならず、各種の添加剤を使用することにより、タンパク質チップに固定しようとするタンパク質の大きさと種類（例えば、ｐ２４またはＢＳＡタンパク質の大きさによって）或いは、抗原または抗体の使用によって最高の性能を示す組成を見出すことを目的としている。
前記組成は、最高の敏感度を示すゾル混合物の成分を見出すために、血液との反応時のバックグラウンド・レベル（ｂａｃｋｇｒｏｕｎｄ ｌｅｖｅｌ）が最小で且つシグナル（ｓｉｇｎａｌ）が最大を示し、またアッセイ反応の間、表面にゲル化したタンパク質が堅固に付着され、スポットの形状も定量分析し易い形状を示すことを基準にして選定した。これだけでなく、クォリティーの制御を容易にすべくデータ間の変異が小さいことも基準にした。
この結果、下記の表２で表すように、Ｐ２４のような小さい抗原タンパク質を使用した場合、組成５の場合が同基準として最も適していることが分かる。特に、ＰＥＧ８０００を添加剤として使用した場合に最も優れた三次元構造を有するスポットを作るに寄与し、スライドの表面積当たりに多くのスポットを付けることができ、インキュベーションの後、カプセル化されたタンパク質に対して均一なシグナル強度（ｓｉｇｎａｌ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）が示された。
小サイズの抗原とは異なって、そのサイズが比較的に大きい抗体を使用した場合、組成８が前記基準を考慮してみるに最も優れた性能を示している。特に、スポット・モーフォロジー（ｓｐｏｔ ｍｏｒｐｈｏｌｏｇｙ）、シグナル強度（ｓｉｇｎａｌ ｉｎｔｅｎｓｉｔｙ）のいずれも均一な様相を示している。
表２から抗原に適する組成と抗体に適する組成とが異なることが分かる。
第４の実施例：タンパク質チップの性能分析
第２の実施例と同様な方法と表１における組成５と同一の成分で作製され、ＨＩＶ Ｐ２４タンパク質を固定したタンパク質チップに対し、集積されたスポットの物理的な特性、スポット中に固定化されたタンパク質の活性化状態、敏感度等のチップの性能を調べてみた。
第２の実施例と同様な方法と表１における組成５と同一の成分で作製され、ＨＩＶ Ｐ２４タンパク質を固定したタンパク質チップに対し、集積されたスポットの物理的な特性、スポット中に固定化されたタンパク質の活性化状態、敏感度等のチップの性能を調べてみた。
実験１：ＣＬＳＭを用いたスポット断面の観察
実際にスポット内のゲル中にタンパク質が存在し、三次元的にタンパク質が高集積され得るか否かを調べてみるために、共焦点走査型レーザー顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＣＬＳＭ）で断層別に測定した。その結果、図４に示すように、ＨＩＶ Ｐ２４タンパク質がゲル中に存在し、多量のタンパク質が集積されていることが確認できた。
実際にスポット内のゲル中にタンパク質が存在し、三次元的にタンパク質が高集積され得るか否かを調べてみるために、共焦点走査型レーザー顕微鏡（Ｃｏｎｆｏｃａｌ Ｌａｓｅｒ Ｓｃａｎｎｉｎｇ Ｍｉｃｒｏｓｃｏｐｅ；ＣＬＳＭ）で断層別に測定した。その結果、図４に示すように、ＨＩＶ Ｐ２４タンパク質がゲル中に存在し、多量のタンパク質が集積されていることが確認できた。
実験２：タンパク質チップの最大敏感度の測定
実際に血液を処理した血清を用いて抗原−抗体反応を進めさせるために、まず、チップの表面で行われる各種の反応条件でもカプセル化されたタンパク質が依然として残留し得るか否か、また、シグナルが、無作為ではなく正確に抗原−抗体反応によりのみ示されるか否かを調べてみるために、Ｃｙ３でラベルしたＣｙ３−共役の抗−ウサギ ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）をタンパク質の代わりにゾル混合物（第２の実施例で記載したすべての組成に対しいずれも実施する）に入れ、チップ上でのゲル化反応を経て作製されたチップを、既存の診断方法と同様に第１次抗体反応、洗浄、第２次抗体反応、洗浄、乾燥の順に反応させ、スキャナでの感知時にシグナルが鮮明に見えることが確認でき、定量的にもバックグラウンドに比べて数千倍も高いことが分かる（図示せず）。
実際にＡＩＤＳ診断に使用されるＨＩＶ Ｐ２４タンパク質をゾル混合液に入れ、第２の実施例（表１中の組成５）と同様にバイオチップを作製し、ＡＩＤＳ患者の血液中の抗体との反応を試験した。図１ａは、バイオチップに固定されたＰ２４タンパク質が血液中のＨＩＶ抗体と反応し、それをＣｙ３でラベルした抗体が認識したシグナルを示す図である。対照群としてタンパク質をゾルに含んでいない場合は、反応が起こらないことが分かった。
これに基づき、血液中の抗原が測定できる最小濃度を見出すために、知っている濃度のＡＩＤＳ抗原を１００ｎｇ／ｍｌから次第にその濃度を下げながら実験を行った。本発明により作製されたチップでは、バックグラウンドに比べて５倍以上のシグナルを有する濃度は、０．０１ｆｇ／ｍｌまでであることを確認した。図１ｂのグラフによれば、感度の面において既存のＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製のヒドロゲルチップ（１ｐｇ／ｍｌ）に比べて１０,０００倍程度まで敏感度が向上したことが分かる。
実際に血液を処理した血清を用いて抗原−抗体反応を進めさせるために、まず、チップの表面で行われる各種の反応条件でもカプセル化されたタンパク質が依然として残留し得るか否か、また、シグナルが、無作為ではなく正確に抗原−抗体反応によりのみ示されるか否かを調べてみるために、Ｃｙ３でラベルしたＣｙ３−共役の抗−ウサギ ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ社）をタンパク質の代わりにゾル混合物（第２の実施例で記載したすべての組成に対しいずれも実施する）に入れ、チップ上でのゲル化反応を経て作製されたチップを、既存の診断方法と同様に第１次抗体反応、洗浄、第２次抗体反応、洗浄、乾燥の順に反応させ、スキャナでの感知時にシグナルが鮮明に見えることが確認でき、定量的にもバックグラウンドに比べて数千倍も高いことが分かる（図示せず）。
実際にＡＩＤＳ診断に使用されるＨＩＶ Ｐ２４タンパク質をゾル混合液に入れ、第２の実施例（表１中の組成５）と同様にバイオチップを作製し、ＡＩＤＳ患者の血液中の抗体との反応を試験した。図１ａは、バイオチップに固定されたＰ２４タンパク質が血液中のＨＩＶ抗体と反応し、それをＣｙ３でラベルした抗体が認識したシグナルを示す図である。対照群としてタンパク質をゾルに含んでいない場合は、反応が起こらないことが分かった。
これに基づき、血液中の抗原が測定できる最小濃度を見出すために、知っている濃度のＡＩＤＳ抗原を１００ｎｇ／ｍｌから次第にその濃度を下げながら実験を行った。本発明により作製されたチップでは、バックグラウンドに比べて５倍以上のシグナルを有する濃度は、０．０１ｆｇ／ｍｌまでであることを確認した。図１ｂのグラフによれば、感度の面において既存のＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒ社製のヒドロゲルチップ（１ｐｇ／ｍｌ）に比べて１０,０００倍程度まで敏感度が向上したことが分かる。
実験３：タンパク質チップ上にゲル化反応により形成されたスポット形態の観察
タンパク質チップの表面に集積されたタンパク質スポットの透明度と割れ、及び形状を観察するために、集積されたスポットを光学顕微鏡とＣＬＳＭで観察し、その結果は、図２ｂの通りである。スポットが、透明で割れがなく、抗原−抗体の反応後のイメージ分析の時におけるスポットの形態も一定の形状を示すことが観察できた。図２ａに示すように他の技術（Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ., １５（９）、１８０３−１８１１、２００３）との比較時、スポットの形態と透明度において本発明が優位を示している。
タンパク質チップの表面に集積されたタンパク質スポットの透明度と割れ、及び形状を観察するために、集積されたスポットを光学顕微鏡とＣＬＳＭで観察し、その結果は、図２ｂの通りである。スポットが、透明で割れがなく、抗原−抗体の反応後のイメージ分析の時におけるスポットの形態も一定の形状を示すことが観察できた。図２ａに示すように他の技術（Ｃｈｅｍ．Ｍａｔｅｒ., １５（９）、１８０３−１８１１、２００３）との比較時、スポットの形態と透明度において本発明が優位を示している。
実験４：チップ上でのゲル化反応により製作したタンパク質チップの安定性の確認
図３に示すように、４ヶ月間同スポットに対し抗原−抗体反応を施した場合、４℃または２５℃に関係なく感度が５％程度の範囲内で一定に保たれることを観察した。また、本発明によりゲル化反応で形成されたスポットが、６ヶ月以上も安定しており、製品化可能であることを確認した（図示せず）。
図３に示すように、４ヶ月間同スポットに対し抗原−抗体反応を施した場合、４℃または２５℃に関係なく感度が５％程度の範囲内で一定に保たれることを観察した。また、本発明によりゲル化反応で形成されたスポットが、６ヶ月以上も安定しており、製品化可能であることを確認した（図示せず）。
実験５：チップ上でのゲル化反応により形成されたスポット内で反応可能なタンパク質の分布
チップ上でのゲル化反応により表面に三次元的に担持されたタンパク質がスポット内において均一に分布しているか否かを確認する目的で、前記実験２で集積したチップに対しスポットの三次元的構造を確認するためにＣＬＳＭを用いてタンパク質の分布を調べてみた。その結果は、図４の通りであり、１００〜３００μｍ程度の厚さを有するスポット内において、蛍光でラベルしたタンパク質が外面や底面に付着されておらず、内側に均一に分布していることが確認できた。
チップ上でのゲル化反応により表面に三次元的に担持されたタンパク質がスポット内において均一に分布しているか否かを確認する目的で、前記実験２で集積したチップに対しスポットの三次元的構造を確認するためにＣＬＳＭを用いてタンパク質の分布を調べてみた。その結果は、図４の通りであり、１００〜３００μｍ程度の厚さを有するスポット内において、蛍光でラベルしたタンパク質が外面や底面に付着されておらず、内側に均一に分布していることが確認できた。
第５の実施例：診断用タンパク質チップの作製及び診断用抗原−抗体反応
実験１：ＨＩＶ診断用抗原を含むタンパク質チップ
第２の実施例で使用した方法と同様にタンパク質−ゾル混合物（表１中の組成５）をチップ上でゲル化反応させ、この時に使用されたタンパク質は、精製されたＨＩＶ ｐ２４タンパク質（１μｇ／μｌ）、ＨＩＶ診断に使用されるｐ２４を含むコンボ（Ｃｏｍｂｏ）タンパク質（１μｇ／μｌ）、ＨＩＶポリメラーゼ ＲｇｐＩＩＩ（１μｇ／μｌ）、ＢＳＡ（１μｇ／μｌ）であった。
定量的な実験のために各タンパク質を１０倍ずつ連続希釈し集積して、最も適した濃度条件（４０ｐｇ〜４ｎｇ／ｓｐｏｔ）を見出した。
ＨＩＶ診断標識因子のＰ２４タンパク質を使用して人の血清中のＨＩＶ抗原を感知するＡＩＤＳ診断の反応条件及び手順は、次の通りである。ＨＩＶ ｐ２４の検出のために、抗−ｐ２４を第１次抗体として使用して２５℃で３０分間反応させてから、洗浄を施し、Ｃｙ３−共役の抗−ウサギ ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ）を第２次抗体として使用して第１次抗体のインキュベーション処理と同様の条件で３０分間反応させてから、洗浄を施した後、完全に空気乾燥させる。スキャナ（Ｅｘｏｎ）でＣｙ３のシグナルを確認した。
該結果、タンパク質が入っていないスポットまたはＨＩＶに関係のないＢＳＡタンパク質を入れたスポットの場合は、シグナルが検出されなかったが、Ｐ２４が入っている場合は、濃度依存的に検出され、４０ｐｇ程度の濃度でも適切に検出されることが見られた（図５参照）。
また、Ｐ２４を含むコンボ（Ｃｏｍｂｏ）タンパク質、ＨＩＶポリメラーゼ、ＲｇｐＩＩＩは、反応をしてシグナルを示した（図６参照）。
前記結果をまとめてみるに、本発明で作製されたタンパク質チップ上において抗原−抗体反応が特異的に起こることが分かる。
実験１：ＨＩＶ診断用抗原を含むタンパク質チップ
第２の実施例で使用した方法と同様にタンパク質−ゾル混合物（表１中の組成５）をチップ上でゲル化反応させ、この時に使用されたタンパク質は、精製されたＨＩＶ ｐ２４タンパク質（１μｇ／μｌ）、ＨＩＶ診断に使用されるｐ２４を含むコンボ（Ｃｏｍｂｏ）タンパク質（１μｇ／μｌ）、ＨＩＶポリメラーゼ ＲｇｐＩＩＩ（１μｇ／μｌ）、ＢＳＡ（１μｇ／μｌ）であった。
定量的な実験のために各タンパク質を１０倍ずつ連続希釈し集積して、最も適した濃度条件（４０ｐｇ〜４ｎｇ／ｓｐｏｔ）を見出した。
ＨＩＶ診断標識因子のＰ２４タンパク質を使用して人の血清中のＨＩＶ抗原を感知するＡＩＤＳ診断の反応条件及び手順は、次の通りである。ＨＩＶ ｐ２４の検出のために、抗−ｐ２４を第１次抗体として使用して２５℃で３０分間反応させてから、洗浄を施し、Ｃｙ３−共役の抗−ウサギ ＩｇＧ（Ｓｉｇｍａ−Ａｌｄｒｉｃｈ Ｃｏｍｐａｎｙ）を第２次抗体として使用して第１次抗体のインキュベーション処理と同様の条件で３０分間反応させてから、洗浄を施した後、完全に空気乾燥させる。スキャナ（Ｅｘｏｎ）でＣｙ３のシグナルを確認した。
該結果、タンパク質が入っていないスポットまたはＨＩＶに関係のないＢＳＡタンパク質を入れたスポットの場合は、シグナルが検出されなかったが、Ｐ２４が入っている場合は、濃度依存的に検出され、４０ｐｇ程度の濃度でも適切に検出されることが見られた（図５参照）。
また、Ｐ２４を含むコンボ（Ｃｏｍｂｏ）タンパク質、ＨＩＶポリメラーゼ、ＲｇｐＩＩＩは、反応をしてシグナルを示した（図６参照）。
前記結果をまとめてみるに、本発明で作製されたタンパク質チップ上において抗原−抗体反応が特異的に起こることが分かる。
実験２：抗原の他にも抗体を固定化する方法
前記実験１では、抗原タンパク質だけをタンパク質チップ上に固定したが、ゾル組成を調節して抗体を添加したゾル混合物を用いると、固定された抗体にも抗原−抗体反応が起こることを観察した。この時に使用した抗体は、ＡＩＤＳ診断に使用されるモノクローナル抗Ｐ２４抗体であった。モノクローナル抗Ｐ２４抗体が固定されたタンパク質チップに血液中のＡＩＤＳタンパク質を反応させ、再度第１次、第２次抗体で検出するサンドイッチ方法で検出した。
図６は、第２の実施例と同様な方法にて、抗原の場合に表１中の組成５にそれぞれの標識タンパク質を添加し、抗体の場合に表１中の組成７と８に抗体を添加してチップを作製し、前記実験１と同様にしてＡＩＤＳ診断を実施した。
ＨＩＶ診断用標識抗原のＰ２４、ｃｏｍｂｏ、及びｒｇｐＩＩＩのいずれも デュープリケイトスポットのいずれからその抗原がＨＩＶ抗体により感知され、タンパク質を入れていないスポットからはシグナルが検出されなかった。また、抗体を診断用標識として使用したａｎｔｉ−Ｐ２４の場合もＨＩＶ抗原により感知され、抗体を入れていないスポットからはシグナルが検出されなかった（図６参照）。
図６は、本発明のバイオチップが、既存の診断用チップとは差別化して抗原や抗体のいずれかを選択して診断するものではなく、同一の条件下において同じチップ上で抗原と抗体の両方とも診断できることを示している。
このように、本発明の詳細な説明では、その実施形態について説明したが、本発明の範疇を逸脱しない限度内で各種の変形が可能であることはいうまでもない。ゆえに、本発明の範囲は、説明された実施形態に限られて定められるものではなく、後述する請求の範囲のみならず、この請求の範囲と均等なものにより定められるべきである。
前記実験１では、抗原タンパク質だけをタンパク質チップ上に固定したが、ゾル組成を調節して抗体を添加したゾル混合物を用いると、固定された抗体にも抗原−抗体反応が起こることを観察した。この時に使用した抗体は、ＡＩＤＳ診断に使用されるモノクローナル抗Ｐ２４抗体であった。モノクローナル抗Ｐ２４抗体が固定されたタンパク質チップに血液中のＡＩＤＳタンパク質を反応させ、再度第１次、第２次抗体で検出するサンドイッチ方法で検出した。
図６は、第２の実施例と同様な方法にて、抗原の場合に表１中の組成５にそれぞれの標識タンパク質を添加し、抗体の場合に表１中の組成７と８に抗体を添加してチップを作製し、前記実験１と同様にしてＡＩＤＳ診断を実施した。
ＨＩＶ診断用標識抗原のＰ２４、ｃｏｍｂｏ、及びｒｇｐＩＩＩのいずれも デュープリケイトスポットのいずれからその抗原がＨＩＶ抗体により感知され、タンパク質を入れていないスポットからはシグナルが検出されなかった。また、抗体を診断用標識として使用したａｎｔｉ−Ｐ２４の場合もＨＩＶ抗原により感知され、抗体を入れていないスポットからはシグナルが検出されなかった（図６参照）。
図６は、本発明のバイオチップが、既存の診断用チップとは差別化して抗原や抗体のいずれかを選択して診断するものではなく、同一の条件下において同じチップ上で抗原と抗体の両方とも診断できることを示している。
このように、本発明の詳細な説明では、その実施形態について説明したが、本発明の範疇を逸脱しない限度内で各種の変形が可能であることはいうまでもない。ゆえに、本発明の範囲は、説明された実施形態に限られて定められるものではなく、後述する請求の範囲のみならず、この請求の範囲と均等なものにより定められるべきである。
本発明によりチップ基材上でのゾル−ゲル反応を用いて作製したバイオチップを初めて提供することができるようになった。このようにして得られる本発明が代表的に応用され得るタンパク質チップを用い、少量の試料で疾病の診断、ハイスループット・スクリーニング（ＨＴＳ）、酵素活性測定等のタンパク質を用いた様々な目的の実験を大規模で且つ容易に実施することができる。
Claims (22)
- 生体物質がその中の気孔に捕集されカプセル化されているゲル状のスポットが、コート剤によってコートされたチップ基材上に集積及び固定されてなるバイオチップであり、前記コート剤は、以下のものである：
塩化メチレン、テトラヒドロフラン、エタノール、メタノール、ブタノール、メチルエチルケトン、アセトン、イソプロピルアルコール、エチルアセテート、メチルイソブチルケトン、ジ-アセトンアルコールよりなる群から選ばれた溶媒に溶解させた、分子量の範囲が８００〜２００,０００のポリビニルアセテート（ＰＶＡｃ）、分子量の範囲が７０,０００〜１２０,０００のポリ（ビニルブチラール-ｃｏ-ビニルアルコール-ｃｏ-ビニルアセテート）、分子量が１０,０００以上のポリ（メチルメタクリレート-ｃｏ-メタクリル酸）、分子量が２００,０００以上のポリ（メチルビニルエーテル-無水マレイン酸）、分子量が１,０００,０００以上のポリ（メチルビニルエーテル-無水マレイン酸）、分子量が１０,０００以上のポリ（メチルアクリレート）、３-グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）よりなる群から選ばれたコート剤。 - バイオチップが、タンパク質チップ、ＤＮＡチップ、新薬のスクリーニングチップ、環境の分析チップ、及び毒性の分析チップ、または食品菌の分析チップとして使用されることを特徴とする請求項１に記載のバイオチップ。
- 前記溶媒の使用濃度が、総コート液に対し、５〜２０重量％の範囲であることを特徴とする、請求項１に記載のバイオチップ。
- スピンコート法によりコートされたことを特徴とする、請求項１に記載のバイオチップ。
- チップ基材が、ポリメチルメタクリル酸、ポリカーボネート、環状オレフィン共重合体よりなる群から選ばれることを特徴とする、請求項１に記載のバイオチップ。
- チップ基材が、スライド（Ｓｌｉｄｅ）形態であることを特徴とする、請求項１に記載のバイオチップ。
- 表面処理されたチップ基材上に生体物質を含有するゾル混合物をスポット状に集積する第１のステップ；及び
該チップ基材上にスポット状のゾル混合物をゲル化反応させる第２のステップと；を含むバイオチップの作製方法であって、
前記チップ基材の前記表面処理が、塩化メチレン、テトラヒドロフラン、エタノール、メタノール、ブタノール、メチルエチルケトン、アセトン、イソプロピルアルコール、エチルアセテート、メチルイソブチルケトン、ジ-アセトンアルコールよりなる群から選ばれた溶媒に溶解させた、分子量の範囲が８００〜２００,０００のポリビニルアセテート（ＰＶＡｃ）、分子量の範囲が７０,０００〜１２０,０００のポリ（ビニルブチラール-ｃｏ-ビニルアルコール-ｃｏ-ビニルアセテート）、分子量が１０,０００以上のポリ（メチルメタクリレート-ｃｏ-メタクリル酸）、分子量が２００,０００以上のポリ（メチルビニルエーテル-無水マレイン酸）、分子量が１,０００,０００以上のポリ（メチルビニルエーテル-無水マレイン酸）、分子量が１０,０００以上のポリ（メチルアクリレート）、３-グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）よりなる群から選ばれたコート剤によってコートすることである、前記方法。 - 前記ゾル混合物がゾル−ゲルカプセル化に使用されるゾル−ゲル・マトリックス用基本物質として、シリケート単量体、ポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、３-グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、（Ｎ-トリエトキシシリルプロピル）-Ｏ-ポリエチレンオキサイドウレタン（ＰＥＯＵ）よりなる群から選ばれた少なくとも１種を含むことを特徴とする、請求項７に記載のバイオチップの作製方法。
- シリケート単量体がテトラメチルオルソシリケート（ＴＭＯＳ）、テトラエチルオルソシリケート（ＴＥＯＳ）、メチルトリメトキシシラン（ＭＴｒＭＯＳ）、エチルトリエトキシシラン（ＥＴｒＥＯＳ）、トリメトキシシラン（ＴＭＳ）、メチルトリメトキシシリケート（ＭＴＭＳ）、３-アミノプロピルトリメトキシシリケートよりなる群から選ばれた少なくとも１種であることを特徴とする、請求項８に記載のバイオチップの作製方法。
- 前記ゾル混合物がゾル−ゲル・マトリックス用基本物質として、グリセロール、分子量４００〜８０００範囲のポリエチレングリコール（ＰＥＧ）よりなる群から選ばれた少なくとも１種を更に含むことを特徴とする、請求項８に記載のバイオチップの作製方法。
- ゾル−ゲル・マトリックス用基本物質を総ゾル混合物に対し、３０〜６０体積％の範囲で使用することを特徴とする、請求項８又は１０に記載のバイオチップの作製方法。
- シリケート単量体を総ゾル混合物に対し、１０〜４０体積％の範囲で使用することを特徴とする請求項８に記載のバイオチップの作製方法。
- ポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）、３-グリシドオキシプロピルトリメトキシシラン（ＧＰＴＭＯＳ）、（Ｎ-トリエトキシシリルプロピル）-Ｏ-ポリエチレンオキサイドウレタン（ＰＥＯＵ）、グリセロール、ポリエチレングリコール（ＰＥＧ）を総ゾル混合物に対し、２〜１０体積％の範囲で使用することを特徴とする、請求項８又は１０に記載のバイオチップの作製方法。
- 総ゾル混合物に対し、それぞれＰＧＳ：０．５〜６体積％、ＧＰＴＭＯＳ：１〜１０体積％、ＰＥＯＵ：５〜１５体積％、グリセロール：１〜５体積％、ＰＥＧ：１〜６体積％の範囲で使用することを特徴とする、請求項１３に記載のバイオチップの作製方法。
- ポリグリセリルシリケート（ＰＧＳ）がシリケート単量体とグリセロールとの反応で得られる重合中間体であることを特徴とする、請求項８に記載のバイオチップの作製方法。
- 前記ゾル混合物がｐＨ緩衝溶液を更に含むことを特徴とする、請求項８に記載のバイオチップの作製方法。
- 前記ｐＨ緩衝溶液がリン酸塩緩衝液であることを特徴とする、請求項１６に記載のバイオチップの作製方法。
- ｐＨはが４〜９であることを特徴とする、請求項１６に記載のバイオチップの作製方法。
- ｐＨ緩衝溶液の濃度が５〜１００ｍＭの範囲であることを特徴とする、請求項１６に記載のバイオチップの作製方法。
- ゲル化反応条件が温度４℃〜２５℃、湿度４０〜８０％であることを特徴とする、請求項７に記載のバイオチップの作製方法。
- 請求項１のバイオチップまたは請求項７の作製方法により作製されたバイオチップに、前記生体物質との結合可否を分析するターゲット物質を含む試料を適用する第１のステップ；及び前記生体物質に特異的に結合されたターゲット物質を検出する第２のステップと；を含む、バイオチップ上に固定された生体物質とターゲット物質との結合を分析する方法。
- 気孔中に生体物質を捕集し生体物質をカプセル化したゲル状のスポット内の気孔中で生体物質とターゲット物質との反応が起こることを特徴とする、請求項２１に記載の分析方法。
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