KR20060061324A - 칩 기재상에서의 겔화 반응을 통해 제작된 바이오칩 - Google Patents

칩 기재상에서의 겔화 반응을 통해 제작된 바이오칩 Download PDF

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Abstract

본 발명은 졸-겔 반응을 이용하여 생산된 바이오 칩, 상기 바이오 칩의 제조 방법, 및 상기 바이오 칩의 사용 방법을 제공한다.
상기 바이오 칩은, 칩 기재 표면에 생체 물질이 공유결합에 의해 고정된 종래 바이오 칩과 달리, 생체 물질이 그 안의 포어에 포집되어 캡슐화되어 있는 겔 형태의 스팟이 칩 기재 상에 집적 및 고정된 바이오 칩이다.
바이오 칩, 겔화

Description

칩 기재상에서의 겔화 반응을 통해 제작된 바이오칩{BIOCHIP PREPARED BY GELATION ON A CHIP SUBSTRATE}
도 1는 실시예 4에 따라 제조된 바이오 칩의 감도 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 2a는 문헌(Nicholas Rupcich et al. Chem . Mater., 15 (9), 1803 -1811, 2003)에 기재된 바이오 칩의 스팟의 투명도를 제시한 사진이고, 도 2b는 실시예 4에 따라 제조된 바이오 칩의 스팟의 투명도를 제시한 사진이다.
도 3은 실시예 4에 따라 제조된 바이오 칩의 Shelf life 을 측정결과를 나타낸 것이다.
도 4는 Confocal Laser Scanning Microscope(CLSM)을 이용하여 실시예 4에 따라 제조된 바이오 칩의 스팟을 단면 촬영한 사진이다.
도 5은 본 발명의 바이오 칩 제조 방법에 따라 HIV 관련 표지 단백질을 집적하고, 이를 진단에 응용한 구체예이다.
도 6는 HIV의 여러 가지 진단표지 항원(p24, combo, rgpIII)과 항체 (anti-p24)를 이용하여 AIDS을 진단한 구체예이다.
도 7은 본 발명을 이용하여 제품화한 Prototypes이다.
도 7a는 혈액검사에 사용되는 진단 칩의 두가지 Prototype이다.
도 7b는 암진단에 사용되는 진단 칩의 두가지 Prototype이다.
도 8은 본 발명에 따른 바이오 칩의 스팟의 부분 모식도이다.
본 발명은 졸-겔 반응을 이용하여 생산된 바이오 칩, 상기 바이오 칩의 제조 방법, 및 상기 바이오 칩의 사용 방법에 관한 것이다.
바이오 칩은 새로운 나노테크놀로지 (Nanotechnology, NT), 바이오테크놀로지 (Biotechnology, BT), 정보테크놀로지 (Informationtechnology IT)가 융합된 대표적인 예이다. 바이오칩은 NT등의 물질기술과 그 기술의 컨텐츠 및 응용분야인 BT와 결과를 해석하고 많은 양의 결과를 분석하는 IT기술의 합하여서 만들어진 기술이다.
바이오 칩은 다양한 종류의 생체 물질을 단위면적의 고체상 지지체의 표면에 고집적 미세배열 (High-Density Microarraying)한 것으로서, 표면에 붙이는 생체 물질에 따라서 DNA칩, 단백질 칩, 셀 칩, 뉴론 칩 등 다양한 종류의 칩으로 나뉠 수 있다. 또한 바이오 칩은 미세유체학기술과 합쳐져서 LOC (Lab-on-a-chip)로 발전하고 있다.
바이오 칩의 세부 기술로는 생체 물질을 고정화시키는 기술, 고체상 지지체를 생체 물질 친화적으로 만드는 기술, 생체 물질을 미세 배열하는 기술, 만들어진 칩상에서 여러 가지 생체 반응을 실시하는 에세이 기술, 반응되어진 결과를 감지하 는 기술, 고정화 대상인 생체 물질을 만드는 단백질 공학, 유전자 재조합 기술 등이 필요하다.
본 발명이 대표적으로 응용될 수 있는 단백질 칩은 바이오칩 (biochip)의 한 종류로서, 단백질 칩은 다양한 종류의 단백질을 단위 면적의 고체상 지지체의 표면에 고집적 미세 배열(intense microarray)한 것이다. 단백질 칩을 이용하면, 소량의 시료로 질병 진단, 고효율 스크리닝(HTS), 효소활성측정 등의 단백질을 이용한 여러 목적의 실험을 대규모로 손쉽게 실시할 수 있다.
이미 개발되어 상용화된 DNA 칩의 제작과 같은 원리와 기술요소를 도입하여 단백질 칩을 제작하려는 노력이 행해지고 있다. 일반적으로, 상용화된 DNA 칩의 대부분은 코팅 물질로 표면을 전 처리한 유리판 위에 DNA를 고정화시켜 제작한 것들이다. DNA 칩의 제작에 사용되는 방법과 유사한 방법으로 단백질 칩을 제조하는 경우, 즉 코팅 물질로 표면을 전 처리한 유리판 위에 단백질을 고정화하여 단백질 칩을 제조하는 경우는 고정되는 표적 단백질의 물리화학적 특성 차이로 인해 다양한 문제점들이 발생되고 있다.
초기의 단백질 칩은 표면 처리된 유리판 위에 단백질을 그대로 부착시킨 후 간단한 결합 분석(binding assay)을 수행하는 것이었으나, 고정화된 단백질의 활성 여부에 따라 실제 작동 여부가 좌우되어, 본래의 목적을 달성하는데 어려움이 많았다 (MacBeath 및 Schreiber의 문헌[Science 289:1760, 2000] 참조). 이러한 문제점은 전술한 바와 같이 단백질이 갖는 고유의 물리화학적 특성 차이로 인하여 발생되는 단백질의 변성(denaturation) 혹은 불활성화, 분해(degradation) 등으로부터 야 기되는 것이다. 이러한 문제점을 극복하고자, DNA와는 구별되는 단백질의 특성에 부합하는 단백질 부착 표면 처리 기술 및 단백질 고정 물질 등에 대한 연구가 이루어지고 있다.
그러한 연구는 단백질 칩 표면 상에 고정 반응을 일으키면서 동시에 단백질의 활성을 유지하려는 방법을 제공하는데 초점이 맞추어진 것으로서, 예컨대 퍼킨 엘머 (PerkinElmer)에 최근 인수된 패커드 바이오사이언스 (Packard Bioscience)의 히드로겔(Hydrogel)TM 코팅 슬라이드, 프로링스(Prolinx)의 버사링스(Versalinx) 칩, 지오믹스(Zyomyx)의 바이오 칩인 PDC 칩 등을 들 수 있다.
특히, 히드로겔 코팅 슬라이드는 3차원 폴리아크릴아미드 겔을 이용한 기술로서, 광학적으로 평평한 실란처리된 스위스(Swiss) 유리를 기본 지지 물질로 사용하고, 그 위에 표면을 변형시킨 아크릴아미드 중합체를 올려놓아서 단백질의 결합력 및 구조적 안정성을 향상시킨 것이다. 이때 단백질은 폴리아크릴아마이드 겔의 작용기와 공유결합을 형성하여 고정화 되어 있다.
또한, 프로링스의 버사링크 칩은 TiO3 표면 위에 비오틴 유도체화된 폴리(L-리신)-g-폴리(에틸렌 글리콜)의 자기조립단층(self assembly monolayer)을 형성하고 그 형성된 표면에 단백질을 고정화하여 단백질의 활성을 증가시킨 것이다.
이 방법들은 3차원인 미세구조를 만들어서 변형된 표면에 단백질을 공유결합 등으로 고정화하여 스팟 상의 단백질들의 활성을 유지하는데 도움을 주려는 것이다. 이러한 방법 외에도 미세가공을 이용한 마이크로웰 형태의 칩들을 만들어서 용 액 상태의 칩을 제작하기도 한다.
한편, 본 발명에서 이용되는 졸-겔 공정은 미세가공을 통해 미세구조를 만드는데 이용되어 온 기술로서, 특히 무기 물질에 생체 분자들을 화학적으로 부착시키는 대신 온화한 공정을 통해 결합 망을 형성하여 이 결합 망 안에 생체 분자들을 공유 결합이 아닌 방법으로 고정화하는데 많이 이용되어 온 기술이다(Gill I. 및 Ballesteros A.의 문헌[Trends Biotechnol . 18:282, 2000] 참조). 효소를 비롯한 많은 생체 분자들이 괴상 졸-겔 매트릭스 안에 고정되어 생체 촉매나 바이오센서의 제작에도 이용되고 있다(Reetz 등의 문헌[Adv . Mater. 9:943, 1997] 참조). 특히, 투명한 광학적 성질 때문에 광학적 발색 검출에도 이용되고 있다 (Edminston 등의 문헌[J. Coll . Interf . Sci . 163:395, 1994] 참조). 또한, 생체 분자는 졸-겔에 고정화되면 화학적으로 안정화될 뿐만 아니라 열적으로도 매우 안정화된다고 알려져 있다(Dave 등의 문헌[Anal. Chem . 66:1120, 1994] 참조).
바이오 센서의 경우 졸-겔 반응은 단순한 고정뿐만 아니라 고체 지지체 위에 미세구조를 형성하여 패턴화(patterning) 하는 방법으로 이용되고 있다. 이때 패턴화 방법은 유체역학을 이용하여 액체 상인 졸 상태에서 몰드로 모양을 만들어서 젤화시킨 후 몰드를 떼내어 패턴을 만드는 것이다. 예컨대, 모세관내 마이크로-모듈링(Micro-moduling in-capillaries; MIMIC) 기법(Kim 등의 문헌[J. Ferment. Bioeng . 82:239, 1995]; Marzolin 등의 문헌[Adv . Mater. 10:571, 1998]; Schuller 등의 문헌[Appl . Optics 38:5799, 1999] 참조)으로 지칭되는 기술은 중시(mesoscopic) 실리카를 패턴화하는 기술이다. 이 기술은 미시 유체 공학의 기본 적인 패턴화에 이용될 수 있다.
그러나, 단백질의 활성은 pH 등의 여러 인자에 의해 영향을 받기 때문에, 졸-겔 과정에서는 졸 상태에서부터 단백질을 첨가하여 활성을 유지하는 조건을 설정하는 것이 중요하다. 이를 위해 중성 pH 등 여러 가지 온화한 조건을 이용하여 단백질과 졸을 함께 미리 섞어주어 단백질을 패턴화하는 등의 기술(Kim 등의 문헌[Biotechnol . Bioeng . 73:331∼337, 2001] 참조)이 발표되고 있지만, 중성 pH에서는 졸-겔 과정이 급격히 진행되어 겔로 될 뿐만 아니라 첨가제의 선택에 따라서 균열이 생기거나 불투명하게 되는 등의 문제점이 있다.
본 발명의 목적은 졸-겔 반응을 이용하여 생산된 바이오 칩, 상기 바이오 칩의 제조 방법, 및 상기 바이오 칩의 사용 방법을 제공하는 것이다.
종래에는 단백질을 비롯한 생체 물질이 포함된 졸-겔 매트릭스를 스팟 형태로 칩 기재 상에 붙일 수 있는 기술이 존재하지 아니하였기 때문에, 생체 물질이 고정된 졸-겔 매트릭스를 스팟 형태로 집적한 바이오 칩이 존재하지 아니하였다. 본 발명은 하기와 같이 칩 기재 표면처리 기술을 개발함으로써, 칩 기재 상에서의 졸-겔 반응을 이용하여 생산된 바이오 칩을 처음으로 제공할 수 있게 되었다. 본 발명에 따른 칩 기재 표면처리 기술에 의해, 생체 물질이 함유된 졸 혼합물을 스팟 형태로 칩 기재 상에 집적할 수 있고, 상기 졸 혼합물을 겔화시키는 졸-겔 반응이 칩 기재 상에서 일어날 수 있고, 또 졸-겔 매트릭스가 칩 기재 상에 고정화될 수 있다.
본 발명은, 칩 기재 표면에 생체 물질이 공유결합에 의해 고정된 종래 바이오 칩과 달리, 생체 물질이 그 안의 포어에 포집되어 캡슐화되어 있는 겔 형태의 스팟이 칩 기재 상에 집적 및 고정된 바이오 칩을 제공한다.
본 발명은 표면 처리된 칩 기재 상에 생체 물질을 포함하는 졸 상태의 혼합물을 스팟 형태로 집적하는 제1 단계; 및 칩 기재 상에 스팟 형태의 졸 혼합물을 겔화 반응시키는 제2 단계를 포함하는 바이오 칩의 제조 방법을 제공한다.
상기 졸 혼합물의 겔화 반응에 의해 겔의 3차원 그물조직이 형성되고, 상기 3차원 그물조직에 의해 포어(pore)가 생기며, 상기 포어 안에 생체 물질이 포집된다. 결국 칩 기재 상에 집적된 겔 형태의 스팟 안에 생체물질이 캡슐화된 바이오 칩이 제공될 수 있다.
또한, 본 발명은 칩 기재 상에서의 졸-겔 반응에 의해 생체 물질이 고정된 바이오 칩에 상기 생체 물질과 결합하는지 여부를 분석할 표적물질을 포함하는 시료를 적용하는 제1 단계;와 상기 생체 물질에 특이적으로 결합된 표적 물질을 검출하는 제2 단계를 포함하는, 바이오 칩 상에 고정된 생체 물질과 표적 물질간의 결합을 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명의 바이오 칩은 칩 기재 상에 집적된 스팟이 그 안에 생체 물질을 캡슐화하여 공유결합 없이 자유로운 방향성을 가질 수 있도록 생체 물질을 담은 담지체 형태로서, 새로운 개념의 바이오 칩이다(도 8 참조).
또, 본 발명에 따라 바이오 칩 제조 시 칩 기재상에서 실리케이트 졸-겔 반 응을 일으켜 고정화시키는 방법은 새로운 개념의 바이오 칩 제조방법이다.
본 발명의 바이오 칩은 생체 물질을 포함한 졸 혼합물을 칩 기재 상에서 겔화 반응시킴으로써, 생체 물질을 겔 매트릭스에 공유결합으로 결합시키는 것이 아니라, 생체 물질이 겔 매트릭스에 의해 형성된 포어 안에 담지되고 겔 매트릭스로 형성된 스팟에 의해 캡슐화된 상태로, 생체 물질의 반응성이 향상될 수 있다.
따라서, 본 발명을 단백질 칩에 응용할 경우, 단백질을 개별 스팟 안에 단백질의 입체구조를 유지한 채 많은 양으로 넣을 수 있기 때문에, 향상된 민감도를 가진 칩을 만들 수 있다. 또, 많은 단백질들이 졸-겔 반응의 기본 물질인 실리케이트 구조물에 있는 생체 친화적인 첨가물에 의해서 안정화될 수 있으므로 활성도 또한 놀랍게 향상될 수 있다.
(1) 칩 기재의 표면 처리
본 발명은 분자량 범위가 800 ∼ 200,000인 폴리비닐아세테이트(PVAc), 분자량 범위가 70,000-120,000인 폴리(비닐 부티랄-co-비닐알콜-co-비닐 아세테이트[Poly (vinyl butyral-co-vinyl alcohol-co vinyl acetate)], 분자량이 10,000이상인 폴리 (메틸 메타크릴레이트-co-메타크릴산) [Poly (methyl methacrylate-co-metacrylic acid)], 분자량이 200,000이상인 폴리 (메틸 비닐 에테르-말레산 무수물) [Poly (methyl Vinyl ether -alt-maleic anhydride)], 분자량이 1,000,000 이상인 폴리 (메틸 비닐 에테르-말레산 무수물) [Poly (methyl Vinyl ether alt-maleic anhydride)], 분자량이 10,000 이상인 폴리 (메틸 아크릴레이트) [poly (methyl acrylate)], 3-글리시드옥시프로필트리메톡시실란 (3- Glycidoxypropyltrimethoxysilane, GPTMOS)로 구성된 군에서 선택된 코팅제를 염화메틸렌 (MC), 테트라히드로푸란 (THF), 에탄올 메탄올, 부탄올, 메틸에틸케톤 (Methly Ethly ketone), 아세톤, 이소프로필 알코올(IA), 에틸 아세테이트 (EA), 메틸 이소부틸 케톤(MIBK), 디-아세톤 알코올 (Di-acetone alcohol, DAA) 등으로 구성된 군에서 선택된 용매에 용해시킨 것이 특징인 칩 기재용 코팅액을 제공한다.
상기 용매는 끓는점이 낮은 유기 용매이다.
상기 용매의 사용 농도는 총 코팅액 중 5 ∼ 20중량% 범위가 바람직하고, 5 중량%, 10 중량%, 15 중량%, 20 중량%인 것이 특히 바람직하다.
상기와 같은 코팅제를 사용하여 칩 기재를 코팅하면, 기능적으로 칩 기재 상에서 겔화 반응을 촉진시키고, 겔화 후에도 항원 항체 반응 등 수용액 상의 에세이와 심한 세척(washing) 단계에서도 겔 상태가 분리되지 않을 뿐만 아니라, 물성면에서 소수성이어서 스팟의 모양을 유지시키고, 경도가 높으며, 광학적으로 투명하게 코팅이 되어 반응 후 background level을 낮추어 준다. 상기의 코팅제의 사용 분자량과 농도는 위와 같은 물성과 기능성을 유지시켜 주는데 가장 적절한 것으로 실험 결과 나타났다.
또, 본 발명은 상기 코팅액으로 칩 기재를 코팅한 바이오 칩용 기재를 제공한다. 상기 코팅방법으로는 스핀 코팅이 바람직하다.
나아가, 본 발명에 사용가능한 칩 기재는 일반적으로 사용되는 유리, 석영, 실리콘, 플라스틱, 폴리프로필렌, 폴리카보네이트 또는 활성화된 아크릴아마이드 등을 사용할 수 있으나, 광학적인 방법으로 측정 및 분석하기 위해서 칩 기재는 광 학적으로 투명한 것이 바람직하다. 따라서, 이를 위해 칩 기재로, 폴리 메틸 메타크릴산 (Poly Methyl Metacrylic Acid, PMMA), 폴리 카보네이트(poly carbonate, PC), 시클릭 올레핀 공중합체 (cyclic olefin copolymer, COC) 등의 광학적으로 우수한 고분자를 사용할 수 있다.
칩 기재의 형태는 많은 양의 샘플을 많은 마커로 반응시킬 수 있는 형태로 제조할 수 있다.
(2) 칩 기재 상에서의 겔화 반응을 위한 졸 형태의 혼합물 제조
칩 기재 상에서 겔화 반응을 통해서 칩 기재 표면에 단백질을 비롯한 생체 물질을 캡슐화한 스팟들을 고밀도로 집적 고정화하기 위해, 본 발명은 졸-겔 캡슐화에 사용되는 졸-겔 매트릭스용 기본 물질로, 실리케이트 단량체, 하기 첨가제들을 사용할 수 있다.
첨가제로는 폴리 글리세릴 실리케이트 (PGS), 3-글리시드옥시 프로필 트리 메톡시 실란 (3-Glycidoxypropyltrimethoxysilane, GPTMOS, 98%), (N-트리에톡시실릴프로필)-O-폴리에틸렌 옥사이드 우레탄 [(N-triethoxysilylpropyl)-O-polyethylene oxide urethane, PEOU], 글리세롤, 분자량 400-10,000 범위의 폴리에틸렌 글리콜 (polyethylene glycol, PEG ) 등이 있다.
실리케이트 단량체로는 테트라메틸오르토실리케이트 (TMOS), 테트라에틸오르토실리케이트 (TEOS), 메틸트리메톡시실란 (MTMOS), 에틸트리에톡시실란 (ETrEOS), 트리메톡시실란 (TMS), 메틸트리메톡시실리케이트 (MTMS), 3-아미노프로필트리메톡시실리케이트 등이 있다.
특히, 실리케이트 단량체, 및 첨가제 중 PGS, GPTMOS, PEOU는 단독으로도 졸-겔 반응이 가능하여 졸-겔 매트릭스를 형성할 수 있다.
바람직하게는 실리케이트 단량체 중 1종 이상과 상기 첨가제 중 1종 이상의 혼합물을 졸-겔 매트릭스용 기본 물질로 사용할 수 있다.
졸-겔 매트릭스용 기본 물질로 실리케이트 단량체와 첨가제는 총 졸용액 중 30-60 부피% 범위 내에서 사용하는 것이 바람직하다.
실리케이트 단량체는 전체 졸 혼합물 중 10-40 부피% 범위로 사용하는 것이 바람직하며, 20-40 부피%가 더욱 바람직하다. 상기 첨가제는 전체 졸 혼합물 중 2-10 부피% 범위로 사용하는 것이 바람직하다. 상기 첨가제의 사용량이 10 부피% 초과인 경우 졸 혼합물에 상용성이 떨어지고 칩 기재 상에 스팟 형성이 제대로 되지 않는다.
한편, 표 1, 2 에 제시한 바와 같이, 원하는 생체 물질의 크기, 단백질의 활성, 졸-겔 반응속도, 스팟의 Morphology 등을 고려하여 용도에 맞게 상기 첨가제들을 선택하여 사용할 수 있다.
첨가제는 총 졸용액에서 각각 0.5-6 부피% PGS, 1-10 부피% GPTMOS, 5-15 부피% PEOU, 1-5 부피% 글리세롤, 1-6 부피% PEG로 사용하는 것이 바람직하다.
폴리글리세릴실리케이트 (PGS)는 실리케이트 단량체와 글리세롤의 반응으로 얻어지는 중합 중간체이다.
상기 중합 중간체(PGS)는 공극 크기를 조절하는데 있어서 중요한 기능을 하는 물질이다. 바이오 칩 표면에 집적된 생체 물질(예, 단백질)과 반응물질의 반응 이 용이하게 일어나기 위해서는 고정된 겔이 최적화된 공극 크기를 갖는 것이 바람직하다. 따라서, 바람직하게 상기 PGS은 0.5 - 6 부피%로 총 졸 용액에 첨가하여 포어 사이즈를 조절할 수 있다.
폴리글리세릴실리케이트 (PGS)는, 단량체로서 테트라메틸오르토실리케이트 (TMOS), 테트라에틸오르토실리케이트 (TEOS), 메틸트리메톡시실란 (MTMOS), 에틸트리에톡시실란 (ETrEOS), 트리메톡시실란 (TMS), 메틸트리메톡시실리케이트 (MTMS), 3-아미노프로필트리메톡시실리케이트 중에서 선택되는 1종 이상의 실리케이트 유도체와 글리세롤을 반응시켜 얻을 수 있다. 폴리글리세릴실리케이트 (PGS)는 당 분야에 공지된 방법에 따라 제조할 수 있다.
칩 기재의 표면에서 겔화 반응할 졸 혼합물은 실리케이트 및 상기 첨가제들로 구성된 군에서 1종 이상 선택된 물질과 칩의 표면 상에 집적하고자 하는 생체 물질(예, 단백질들)을 포함한다.
본 발명에 따라 바이오 칩에 고정될 수 있는 생체 물질은 표적 물질과 특이적으로 결합할 수 있어, 이들 간의 결합을 분석할 수 있게 하는 모든 물질이 될 수 있다. 바람직하기로는, DNA, RNA 또는 PNA를 포함하는 핵산, 단백질 또는 올리고펩타이드 등이 있다.
본 발명을 통해 칩 기재 표면에 고밀도로 집적 가능한 생체 물질 중 단백질의 비제한적인 예로는 HIV p24, Combo, RgpIII, IgG-Cy3 을 포함하여, 감염성 질병 진단(infectious disease diagnosis)용 항원 혹은 항체, 또는 AFP (Alpha fepto Protein)을 포함한 암진단(cancer diagnosis) 용 항원 혹은 항체, 활성 측정에 이 용되는 효소들이 있다. 또한 단백질, 항원, 항체 뿐 아니라 신약 개발에 사용되어지는 저분자 물질 역시 집적이 가능하다.
상기 졸 혼합물은 pH 완충용액을 더 포함하는 것이 바람직하다. 상기 pH 완충용액으로는 인산염 완충액을 사용하는 것이 바람직하며, pH는 4 ∼ 9의 범위에서 선택할 수 있고, 비제한적인 예로 pH 5, 5.5, 6, 6.5, 7, 7.5, 8, 8.5가 있다.
상기 pH 완충용액의 농도는 5-100mM 범위가 바람직하며, 비제한적인 예로 5, 10, 20, 30, 40, 50, 60, 70, 80,90, 100mM이 있다.
단백질 칩의 경우, 집적을 위해서는 졸이 겔로 되는 시간을 늦추도록 조절하는 것이 졸-겔 과정의 승패를 결정하는 중요한 요소 중 하나이다. 또, 조성의 적절한 배합을 통해 졸-겔 과정 동안에 적당한 점도를 유지하고, 겔이 된 후에 광학적으로 유용한 물질로 만드는 것도 단백질 칩을 만드는 데 있어서 또 하나의 중요한 요소이다.
이를 위해 본 발명은 졸겔 화합물의 첨가제의 종류 및 첨가 조성과 겔화 반응 조건(온도, 습도) 등을 조절하여 본 발명의 실시예에서 명시한 조건을 바탕으로 겔화 시간을 최대 24시간까지 연장시킬 수 있다.
(3) 졸-겔 캡슐화 반응을 이용하여 표적 단백질을 단백질 칩의 표면에 고정화
본 발명은 상기에서 제조된 졸 혼합물을 상기 칩 기재 상에 스팟 형태로 적용하고 상기 칩 기재 상에서 겔화 반응시켜, 겔의 3차원 그물조직에 의해 형성된 포어(pore)에 생체 물질이 포집된 바이오 칩을 제공한다.
상기 생체 물질은 칩 기재 상에서 겔 형태의 스팟에 의해 캡슐화되어 있고, 겔 형태의 스팟 캡슐은 칩 기재 상에 고정되어 있다.
상기 졸 혼합물은 상기 본 발명의 방법으로 코팅된 칩 기재의 표면에 고밀도 미세 집적기를 이용하여 집적할 수 있다. 이때 겔화 반응 조건은 온도 4℃-25℃, 습도 40-80%이다.
단백질 칩의 경우, 스팟의 직경은 약 100 ∼ 500 ㎛가 바람직하고, 1 cm2당 1∼1000개의 스팟을 집적시키는 것이 바람직하다.
하기 실시예에서는 100 스팟/cm2의 칩을 제작하였으나 고집적시에는 1,000 스팟/cm2까지 가능하다.
본 발명의 바이오 칩은 단백질 칩, DNA 칩 뿐 아니라 신약 탐색 칩과 환경 및 독성 분석 칩에도 사용가능하다.
(4) 본 발명의 바이오 칩의 응용
본 발명은 상기 칩 기재 상에서의 졸-겔 반응에 의해 생체 물질이 고정된 바이오 칩에 상기 생체 물질과 결합하는지 여부를 분석할 표적물질을 포함하는 시료를 적용하는 단계;와 상기 생체 물질에 특이적으로 결합된 표적 물질을 검출하는 단계를 포함하는 바이오 칩 상에 고정된 생체 물질과 표적 물질간의 결합을 분석하는 방법을 제공한다.
본 발명에서는 포어 안에 생체 물질을 포집하여 생체물질을 캡슐화한 겔 형태의 스팟 내 포어에서 생체 물질과 표적 물질간의 반응이 일어난다.
검출이 용이하도록 표적 물질은 형광염료 등의 신호유발 물질이 부착된 것이 바람직하다. 생체 물질과 표적 물질간의 결합에 대한 검출은 표적 물질에 붙여주는 신호유발 물질의 종류에 따라, 현재 많이 사용되고 있는 형광 검출법, 전기화학적 검출법, 질량 변화를 이용한 검출법, 전하량 변화를 이용한 검출법 또는 광학적 성질의 차이를 이용한 검출법 등 다양한 방법에 의해 수행될 수 있다.
본 발명에 따라 졸-겔 반응으로 제조된 바이오 칩의 경우 반응 시간이 기존의 면역진단이나 바이오칩에 비해서 30분에서 2시간 내에 항원-항체 반응을 포함한 진단에 필요한 반응과 분석결과를 낼 수 있다.
본 발명에 따른 바이오 칩은 질병 진단에 응용될 수 있고, 신약개발의 기반 기술 뿐 아니라 환경 및 독성 분석에 사용될 수 있으며, 빠르고 매우 민감한 바이오 칩으로서 역할을 할 수 있다.
본 발명에 따라 제조된 단백질 칩은 면역진단 방법으로 Sandwich assay방법과 동일하게 항원을 현광 dye로 labeling하여 진단에 사용할 수 있다. 이때, 결과를 측정하는 단계에서 현광 Scanner을 사용하고 프로그램을 통하여 진단 결과를 분석하고 정량화 할 수 있다.
본 발명에 따라 제작된 단백질 칩은 HIV의 진단 방법에 사용될 수 있다.
본 발명은 혼합 졸 용액 상태에서 생체 물질을 첨가할 수 있으므로, 단백질 또는 저분자 물질을 고집적 가능하고, 이로 인해 제조된 바이오 칩을 이용하여 고효율 스크리닝(HTS)이 가능하다.
또, 혼합 졸 용액에 단백질 활성측정에 이용되어지는 효소 물질이 집적 가능 하기 때문에, 이로 인해 제조된 바이오 칩은 효소활성측정 방법에 사용할 수 있다. 상기 활성 측정용 효소로서 독성 분석, 환경 분석, 식품균 분석에 이용되는 효소들이 있다.
이러한 항원-항체 진단반응은 Memorec사의 자동화된 A-Hyb chamber을 통해서 실시할 수 있고 또한 수동으로 외부에서 반응을 수행할 수도 있다.
(5) 본 발명의 기술을 이용한 다양한 제품군의 Prototypes
본 발명의 칩상 겔 반응을 이용하면 한 칩상에 최대 10,000개 이상의 스팟에 다양한 종류의 단백질 및 항원, 항체 뿐 아니라 저분자 물질, 박테리아등을 집적 할 수 있다. 도 7에서 보여 주는 것과 같이, 본 발명은 대표적으로 체혈 시 수혈 적합성(감염 질환 마커, 예, HIV I, II, HCV, HBV, 말라리아, H.pylori, Syphillis)을 스크리닝하는 Blood Bank Screening에 이용할 수 있을 뿐 아니라(도 7a), 일반적인 암의 진단 마커와 특정 암의 진단 마커를 한꺼번에 진단 할 수 있다(도 7b).
본 발명을 실시예에 의거하여 상세히 설명하면 다음과 같다. 단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명이 이들만으로 한정되는 것은 아니다.
실시예 1: PGS 합성의 예
테트라메틸오르토실리케이트(TMOS) 0.048 몰과 메탄올(10%)을 잘 혼합한 후, HCl(0.25 M) 을 가하였다. 이 혼합 용액을 환류하면서 70℃에서 6시간 동안 반응시켰다.
반응 혼합 용액의 온도를 50℃까지 낮춘 뒤 글리세롤(0.192 몰) 을 가한 후 이 혼합 용액을 50℃에서 16시간 동안 반응시켰다. 메탄올을 제거한 후 제조된 폴리글리세릴실리케이트(PGS)을 사용하였다.
실시예 2: 칩상에서의 겔화 반응을 통한 단백질 칩의 제작
실시예 1에서 합성된 폴리글리세릴실리케이트(PGS) 20%(g/ml) 수용액과 기타 첨가제들을 포함한 졸을 칩상에 스팟팅하고 칩상에서 겔화 반응을 통하여 단백질 칩을 제작하였다.
단계 1: 칩 기재의 표면처리
PMMA로 제작한 슬라이드(76 mm x 26 mm)에 3% 폴리(메틸 아크릴레이트)/THF로 된 코팅액으로 스핀 코팅을 실시하였다. 스핀 코팅은 라우렐(Laurell) 스핀 코터로 500 rpm에서 10초간 전처리 후, 1,000 rpm에서 40초간 실시하였다.
단계 2: 졸 혼합물의 제조
졸 혼합물을 제조하기 위해 폴리글리세릴실리케이트(PGS) 수용액, PEOU, PEG, 글리세롤, GPTMOS, MTMS 중에서 선택된 하나의 첨가제; 테트라메틸오르토실리케이트 (TMOS) ; 메틸트리메톡시실란 (MTMOS)을 혼합하였다. HCl(최종농도: 5mM)을 첨가하여 혼합한 후 인산나트륨(최종농도 : 10 mM, pH 7), 단백질(최종량 : 50pg) 및 PBS 용액(15%)을 넣고 충분히 섞어주었다. 사용된 단백질들은 실시예 3 내지 5에 자세히 설명되어 있다.
단계 3: 단백질 칩의 제작
상기 단계 1에서 표면 처리한 슬라이드 상에 단계 2에서 준비된 졸 혼합물을 어레이어(카르텍시안; Cartexian)의 잉크젯 집적 프로그램을 이용하여 직경 100 ∼ 500 ㎛ 가량의 원형 스팟이 되도록 칩의 표면에 집적하고, 25℃, 80% 습도에서 그대로 방치하여 겔화 반응을 진행시켜서 단백질 칩을 완성하였다.
실시예 3: 졸 혼합물의 조성과 생체물질의 관계
실리케이트 단량체 뿐 아니라 다양한 첨가제의 사용으로, 단백질 칩에 고정하고자 하는 단백질 크기와 종류(예를 들면, p24 나 BSA 단백질의 크기에 따라) 또는 항원이나 항체의 사용에 따라 최고의 성능을 나타내는 조성을 찾고자 하였다.
이것은 최고의 민감도를 나타내는 졸 혼합물의 성분을 찾기 위해, 혈액과 반응시 백그라운드 값(background level)이 최소이고 signal이 최대이며 또한 에세이 반응에서 표면에 겔화된 단백질이 잘 붙어 있고 스팟의 모양 또한 정량 분석하기에 좋은 모양을 나타내는 것을 기준으로 하여 선정하였다. 이뿐만 아니라 Quality Control이 용이하게 데이터간 변이가 작은 것도 기준으로 삼았다.
이 결과 하기 표 2에서 보여주는 바와 같이, P24와 같은 작은 항원 단백질을 사용하였을 경우 조성 5의 경우가 위의 기준으로 가장 좋은 조성임을 알 수 있었다. 특히, PEG8000을 첨가제로 사용하였을 경우 가장 우수한 3차원 구조(three dimensional structure)를 가지는 spot을 만드는데 기여하여 slide의 표면적당 많은 spot을 찍을 수 있으며 Incubation 후, encapsulation된 protein에 대한 signal intensity가 균일하게 나타났다.
작은 크기의 항원과 다르게 크기가 비교적 큰 항체를 사용했을 경우 조성 8이 위의 기준 결과를 고려해 볼 때 가장 우수한 성능을 보이고 있다. 특히, spot morphology, signal intensity 모두 균일한 양상을 보여준다.
조성번호 졸 혼합물 조성
TMOS MTMS 첨가제 2-10%
1 25.5% 12.5% 첨가제 없음
2 17.5% 17.5% PGS 4%
3 20.0% 10.0% PEOU 5%
4 25.5% 12.5% PEG400 3%
5 25.5% 12.5% PEG8000 5%
6 25.5% 12.5% 글리세롤 2.5%
7 25.5% 7.5% GPTMOS 5%
8 0 10% MTMS
Figure 112006033366618-PAT00001
표 2로부터, 항원에 적당한 조성과 항체에 적당한 조성이 다름을 알 수 있다.
실시예 4: 단백질 칩의 성능 분석
실시예 2와 같은 방법과 표 1에서 조성 5와 같은 성분으로 제조되고 HIV P24 단백질을 고정한 단백질 칩에 대하여, 집적된 스팟들의 물리적인 특성, 스팟 속에 고정화된 단백질들의 활성화 상태, 민감도 등 칩의 성능을 살펴보았다.
실험 1: CLSM 을 이용한 스팟 단면 관찰
실제 스팟 안의 겔 속에 단백질이 존재하고, 3차원적으로 단백질이 고집적될 수 있는지를 알아 보기 위해서, CLSM(confocal Laser Scanning Microscpoy)로 단층별로 측정하였다. 그 결과 도 4에 나타난 바와 같이, HIV P24 단백질이 겔 속에 존재하고, 많은 양의 단백질이 집적되어 있는 것을 확인할 수 있었다.
실험 2: 단백질 칩의 최대 민감도 측정
실제 혈액을 처리한 혈청을 이용하여 항원-항체 반응을 진행하기 위해서 우선 칩의 표면에서 이루어지는 다양한 반응 조건에서도 캡슐화된 단백질이 그대로 남아 있을 수 있는지, 또한 무작위적인 것이 아닌 정확히 항원-항체 반응을 통해서만 시그널을 나타내는지를 알아보기 위하여 Cy3로 표지된 Cy3-접합 항-토끼 IgG(시그마-알드리치 컴퍼니)를 단백질 대신 졸 혼합물(실시예 2에 기재한 모든 조성에 대해서 다 실시함)에 넣고 칩상 겔화 반응을 거쳐서 제작된 칩을, 기존의 진단 방법과 동일하게, 1차 항체 반응, 세척, 2차 항체 반응, 세척, 건조 순으로 반응시키고 스캐너로 감지시 시그널이 선명하게 보이는 것을 확인할 수 있었으며, 정량적으로도 백그라운드에 비해서 수천 배 높은 것을 알 수 있었다 (도시되어 있지 않음).
실제 AIDS 진단에 사용되는 HIV P24 단백질을 졸 혼합액에 넣어 실시예 2 (표 1 조성 5)와 같이 바이오 칩을 제조하고 AIDS 환자 혈액 내의 항체와의 반응을 시험하였다. 도 1a는 바이오 칩에 고정된 P24 단백질이 혈액 내 HIV 항체와 반응하고 그것을 Cy3로 표지된 항체가 인식한 시그날을 나타낸 것이다. 대조군으로 단백질을 졸에 포함하지 않았을 경우는 반응이 일어나지 않는 것을 알 수 있었다.
이것을 바탕으로 혈액 내 항원을 측정할 수 있는 최소 농도를 찾기 위해서 아는 농도의 AIDS항원을 100ng/ml부터 시작하여 계속하여 농도를 낮추면서 실험을 하였다. 본 발명에서 제작된 칩으로는 백그라운드 대비 시그날이 5배 이상인 것이 0.01fg/ml까지 인 것을 확인하였다. 도 1b의 그래프에 의하면 감도 면에서 기존의 PerkinElmer사의 Hydrogel칩 (1 pg/ml) 보다 10,000배 정도의 민감도가 향상된 것을 알 수 있다.
실험 3: 단백질 칩 상에 겔화 반응을 통해 이루어진 스팟 형태 관찰
단백질 칩 표면에 집적된 단백질 스팟의 투명도와 균열 그리고 모양을 관찰하기 위해 집적된 스팟을 광학 현미경과 CLSM (Confocal Laser Scanning Microscope)으로 관찰하였고, 그 결과는 도 2b와 같다. 스팟이 투명하고, 균열이 없으며, 항원-항체 반응 후 이미지 분석시 스팟 형태도 일정한 모양을 나타내는 것을 관찰할 수 있었다. 도 2a에 도시된 바와 같이 타 기술(Chem . Mater., 15 (9), 1803 -1811, 2003)과 비교시 스팟의 형태와 투명도에서 본 발명의 우위를 나타낸다.
실험 4: 칩상에서 겔화 반응으로 제작한 단백질 칩의 안정성 확인
도 3에서 보는 바와 같이, 4개월까지 같은 스팟에 대해서 항원-항체 반응을 수행 했을 경우 4℃나 25℃ 관계 없이 감도가 5%정도의 범위에서 일정하게 유지되는 것을 관찰하였다. 또, 본 발명에 따라 겔화 반응으로 형성된 스팟이 6개월 이상 안정하여 제품화 가능하다는 것을 확인하였다 (도시되어 있지 않음).
실험 5: 칩상에서 겔화 반응을 통한 스팟 내에서 반응 가능한 단백질의 분포
칩상 겔화 반응을 통해 표면에 3차원적으로 담지된 단백질이 스팟 내에서 고르게 분포하는지를 확인할 목적으로, 상기 실험 2에서 집적한 칩에 대하여 스팟의 3차원적 구조를 확인하기 위해 공초점 주사 레이저 현미경(CLSM)을 이용하여 단백질의 분포를 살펴보았다. 그 결과는 도 4와 같았고, 100 ~ 300 um 정도 두께를 갖는 스팟 내에서 현광으로 labeling된 단백질이 겉표면이나 바닥에 부착되어 있지 않고 안쪽으로 고르게 분포하고 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 5: 진단용 단백질 칩의 제작 및 진단 항원-항체 반응
실험 1: HIV 진단 항원을 포함하는 단백질 칩
실시예 2에서 사용한 방법과 동일하게 단백질-졸 혼합물(표 1 조성 5)을 칩상에서 겔화 반응시키되 이때 사용된 단백질은 정제된 HIV p24 단백질(1 ㎍/㎕), HIV 진단에 사용되는 p24를 포함하는 콤보(Combo) 단백질(1 ㎍/㎕), HIV 폴리머라제 RgpIII(1 ㎍/㎕), BSA(1 ㎍/㎕) 였다.
정량적인 실험을 위하여 각 단백질을 10배씩 연속 희석하여 집적하여 가장 적당한 농도 조건(40pg-4ng/spot)을 찾아 주었다.
HIV 진단 표지 인자인 P24 단백질을 사용하여 사람 혈청 속의 HIV항원을 감지하는 AIDS 진단 반응 조건 및 순서는 다음과 같다. HIV p24의 검출을 위하여 항-p24를 1차 항체로서 사용하여 25℃에서 30분 동안 반응시키고. 세척을 실시하고, Cy3-접합 항-토끼 IgG(시그마-알드리치 컴퍼니)를 2차 항체로서 사용하여 1차 항체 항온처리와 같은 조건으로 30분 동안 반응시키고 나서, 세척한 후, 완전히 공기 건조시킨다. 스캐너(Exon)로 Cy3의 시그널을 확인하였다.
그 결과, 단백질이 들어가지 않은 스팟이나 HIV에 관계없는 BSA단백질을 넣은 스팟의 경우는 시그날이 검출이 되지 않으나, P24가 들어 있는 경우는 농도 의존적으로 검출이 되었으며 40pg정도의 농도에서도 적절히 검출되는 것을 볼 수 있었다(도 5 참조).
또, P24를 포함하는 콤보(Combo) 단백질, HIV 폴리머라제, RgpIII은 반응을 하여 시그날을 보여주었다(도 6 참조).
상기 결과를 종합해 볼 때, 본 발명에서 제작한 단백질 칩 상에서 항원-항체 반응이 특이적으로 일어난다는 것을 알 수 있다.
실험 2: 항원 외에도 항체를 고정화하는 방법
상기 실험 1에서는 항원 단백질 만을 단백질 칩상에 고정하였지만, 졸 조성을 조절하여 항체를 첨가한 졸 혼합물을 이용하면 고정된 항체에도 항원-항체 반응이 일어나는 것을 관찰하였다. 이때 사용한 항체는 AIDS 진단에 사용되는 모노클로날 항 P24 항체이었다. 모노클로날 항 P24 항체가 고정된 단백질 칩에 혈액 내 에이즈 단백질을 반응시켜 다시 1차, 2차 항체로 검출하는 샌드위치 방법으로 검출하였다.
도 6는 실시예 2와 같은 방법으로 항원의 경우 표 1 조성 5에 각각의 표지 단백질을 첨가하였고 항체의 경우 표 1 조성 7과 8에 항체를 첨가하여 칩을 제작하고 상기 실험 1과 같이 AIDS 진단을 실시하였다.
HIV 진단 표지 항원 P24, combo, rgpIII 모두 duplicate 스팟 모두에서 항원이 HIV 항체에 의해서 감지되었고 단백질을 넣지 않은 스팟에서는 시그날이 검출되지 않았다. 또한, 항체를 진단 표지로 사용한 anti-P24의 경우도 HIV 항원에 의해서 감지되었고 항체를 넣지 않은 스팟에서는 시그날이 검출되지 않았다(도 6 참조).
도 6는 본 발명의 바이오 칩이, 기존의 진단 칩과는 차별화되게 항원이나 항체 중 택일하여 진단하는 것이 아니라, 동일한 조건에서 같은 칩상에서 항원과 항체 둘 다 함께 진단 할 수 있는 것을 보여 준다.
이와 같이, 본 발명의 상세한 설명에서는 그 실시형태에 관해 설명하였으나, 본 발명의 범주에서 벗어나지 않는 한도내에서 여러가지 변형이 가능함은 물론이다. 그러므로, 본 발명의 범위는 설명된 실시형태에 국한되어 정해져서는 안되며 후술되는 특허청구범위뿐만 아니라 이 특허청구범위와 균등한 것들에 의해 정해져야만 한다.
본 발명의 바이오 칩은 생체 물질을 포함한 졸 혼합물을 칩 기재 상에서 겔화 반응시킴으로써, 생체 물질을 겔 매트릭스에 공유결합으로 결합시키는 것이 아 니라, 생체 물질이 겔 매트릭스에 의해 형성된 포어 안에 담지되고 겔 매트릭스로 형성된 스팟에 의해 캡슐화된 상태로, 생체 물질의 반응성이 향상될 수 있다.
따라서, 본 발명을 단백질 칩에 응용할 경우, 단백질을 개별 스팟 안에 단백질의 입체구조를 유지한 채 많은 양으로 넣을 수 있기 때문에, 향상된 민감도를 가진 칩을 만들 수 있다. 또, 많은 단백질들이 졸-겔 반응의 기본 물질인 실리케이트 구조물에 있는 생체 친화적인 첨가물에 의해서 안정화될 수 있으므로 활성도 또한 놀랍게 향상될 수 있다.

Claims (4)

  1. 젤 형태의 스팟이 칩 기재 상에 집적 및 고정된 바이오 칩으로서, 스팟 안의 포어에 생체 물질이 고정되지 아니하고 자유로운 방향성을 가지면서 포집되어 캡슐화되어 있는 것이 특징인 바이오 칩.
  2. 제1항에 있어서, 단백질 칩, DNA 칩, 신약 탐색 칩, 환경 분석칩, 독성 분석칩, 또는 식품균 분석칩으로 사용되는 것이 특징인 바이오 칩.
  3. 제1항의 바이오 칩에 상기 생체 물질과 결합하는지 여부를 분석할 표적물질을 포함하는 시료를 적용하는 제1 단계;와 상기 생체 물질에 특이적으로 결합된 표적 물질을 검출하는 제2 단계를 포함하는, 바이오 칩 상에 고정된 생체 물질과 표적 물질간의 결합을 분석하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 포어 안에 생체 물질을 포집하여 생체물질을 캡슐화한 겔 형태의 스팟 내 포어에서 생체 물질과 표적 물질간의 반응이 일어나는 것이 특징인 분석 방법.
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Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8557564B2 (en) 2006-08-21 2013-10-15 Samsung Electronics Co., Ltd. Method of separating microorganism using nonplanar solid substrate and device for separating microorganism using the same
KR101368178B1 (ko) * 2008-01-07 2014-02-26 삼성전자주식회사 미세유동장치 내의 유체 흐름 경로에 필터를 형성하는 방법

Families Citing this family (27)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100334229C (zh) * 2005-06-17 2007-08-29 东南大学 基于凝胶固定核酸的dna微阵列芯片制备方法
WO2007037069A1 (ja) * 2005-09-27 2007-04-05 Sumitomo Bakelite Company, Ltd. 医療用粒子及びその製造方法
KR100784437B1 (ko) 2006-01-27 2007-12-11 김소연 표면처리 되지 않은 기질에 표지물질을 고정하기 위한졸-겔 바이오칩용 졸 조성물 및 그의 스크리닝 방법
RU2309959C1 (ru) * 2006-02-22 2007-11-10 Институт Молекулярной Биологии Им. В.А. Энгельгардта Российской Академии Наук Применение немодифицированных полимерных материалов для изготовления подложки биочипов, биочип на их основе и способ его изготовления, способ иммобилизации гидрогелей на немодифицированных полимерных материалах
KR100718918B1 (ko) 2006-02-27 2007-05-17 충주대학교 산학협력단 나노기공성 하이드로겔 고분자 팁, 그 제조방법 및 이를이용한 생체물질의 패터닝 방법
US20080261199A1 (en) * 2006-04-26 2008-10-23 Genscript Corporation Rapid detection processes and related compositions
DE102007005462A1 (de) * 2007-01-30 2008-07-31 Universität Zu Köln Verfahren zur Herstellung von biokompatiblen Hybrimeren
KR100866524B1 (ko) 2007-05-23 2008-11-03 전남대학교산학협력단 형광염료 및 효소의 고정화를 위한 졸-겔 조성물, 및 이를이용한 검출키트 및 방법
US8828912B2 (en) 2009-09-21 2014-09-09 Akonni Biosystems, Inc. Method of making a microarray assembly
US20090291214A1 (en) * 2008-05-23 2009-11-26 Battelle Memorial Institute Protein inks of colloidal immobilized proteins
EP2305789A4 (en) * 2008-06-27 2013-12-25 Hitachi Plant Technologies Ltd CASSETTE FOR MICROBEN CELLS, CARRIER, CARRIER TREATMENT DEVICE AND METHOD FOR COUNTING MICROBIAL CELLS
KR100984735B1 (ko) * 2009-05-28 2010-10-01 동국대학교 산학협력단 신개념 신약개발을 위한 타겟 단백질­단백질 상호작용을 저해하는 신약후보물질의 스크리닝 방법
KR101218982B1 (ko) * 2010-05-03 2013-01-04 삼성전기주식회사 세포 칩, 이의 제조방법 및 세포 칩 제조장치
CN102140553B (zh) * 2011-03-30 2012-12-26 中华人民共和国北京出入境检验检疫局 基于全基因组探针的hiv亚型检测基因芯片
KR101274765B1 (ko) * 2011-04-27 2013-06-14 피씨엘 (주) 바이오칩 제조용 졸-겔 키트 및 이를 이용한 바이오 칩의 제조방법
WO2012148017A1 (ko) * 2011-04-27 2012-11-01 피씨엘(주) 바이오칩 제조용 졸-겔 키트 및 이를 이용한 바이오 칩의 제조방법
WO2013096528A1 (en) 2011-12-20 2013-06-27 Siemens Healthcare Diagnostics Inc. Coated substrates for high energy capture phase binding and methods of production and use thereof
KR101569891B1 (ko) * 2012-02-13 2015-11-27 동국대학교 산학협력단 다공성 지지체를 이용한 저분자 포집용 졸-겔 칩 및 이를 이용한 저분자 특이적 물질의 스크리닝 방법
WO2013165133A1 (ko) * 2012-04-30 2013-11-07 피씨엘(주) 졸겔 칩 제작을 위한 개선된 졸 조성물 분주용 노즐 및 이를 함유하는 졸겔 칩 제조용 장치
WO2017146508A1 (ko) * 2016-02-23 2017-08-31 노을 주식회사 진단 방법 및 이를 수행하는 기기
KR20170099737A (ko) 2016-02-23 2017-09-01 노을 주식회사 접촉식 염색 패치 및 이를 이용하는 염색 방법
WO2017146506A1 (ko) * 2016-02-23 2017-08-31 노을 주식회사 혈액 염색 패치, 이를 이용하는 혈액 검사 방법 및 장치
WO2017146507A1 (ko) * 2016-02-23 2017-08-31 노을 주식회사 배양 패치, 배양 방법, 배양 검사 방법, 배양 검사 장치, 약물 검사 방법 및 약물 검사 장치
US10371610B2 (en) 2016-02-23 2019-08-06 Noul Co., Ltd. Contact-type patch, staining method using the same, and manufacturing method thereof
WO2017146505A1 (ko) * 2016-02-23 2017-08-31 노을 주식회사 물질 표지 패치, 이를 이용하는 조직 진단 방법 및 장치
US20210164871A1 (en) * 2018-05-03 2021-06-03 Noul Co., Ltd. Specimen inspecting method
GB2594813A (en) * 2019-01-09 2021-11-10 Hitachi High Tech Corp Substrate for nucleic acid analysis, flow cell for nucleic acid analysis, and image analysis method

Family Cites Families (15)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP0162017B1 (de) * 1984-05-17 1991-08-21 Ciba-Geigy Ag Homo- und Copolymere, Verfahren zu deren Vernetzung und derenVerwendung
US5108891A (en) * 1988-06-09 1992-04-28 Beth Israel Medical Center Aids assay
IL93134A (en) * 1990-01-23 1997-11-20 Yissum Res Dev Co Doped sol-gel glasses for obtaining chemical interactions
DE4409786A1 (de) * 1994-03-22 1995-09-28 Boehringer Mannheim Gmbh Objektträger zur mikroskopischen Auswertung flüssiger Proben
US5624743A (en) * 1996-02-26 1997-04-29 Xerox Corporation Ink jet transparencies
US5725788A (en) * 1996-03-04 1998-03-10 Motorola Apparatus and method for patterning a surface
US6087102A (en) * 1998-01-07 2000-07-11 Clontech Laboratories, Inc. Polymeric arrays and methods for their use in binding assays
DE10011400A1 (de) * 1999-03-11 2000-10-05 Nigu Chemie Gmbh Verfahren zur gezielten photolytischen Abspaltung der bei der DNA-Chip-Herstellung üblichen Schutzgruppen von Nucleosid-Derivaten
US6174683B1 (en) * 1999-04-26 2001-01-16 Biocept, Inc. Method of making biochips and the biochips resulting therefrom
US20020015952A1 (en) * 1999-07-30 2002-02-07 Anderson Norman G. Microarrays and their manufacture by slicing
US7678539B2 (en) * 2000-08-10 2010-03-16 Corning Incorporated Arrays of biological membranes and methods and use thereof
TW523548B (en) * 2000-09-04 2003-03-11 Ind Tech Res Inst High-density functional slide and preparation method thereof
KR20020089315A (ko) * 2000-10-26 2002-11-29 바이오셉트 인코포레이티드 3차원 포맷 바이오칩
US20020123134A1 (en) * 2000-12-26 2002-09-05 Mingxian Huang Active and biocompatible platforms prepared by polymerization of surface coating films
US7427497B2 (en) * 2001-11-01 2008-09-23 Rensselaer Polytechnic Institute In vitro metabolic engineering on microscale devices

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US8557564B2 (en) 2006-08-21 2013-10-15 Samsung Electronics Co., Ltd. Method of separating microorganism using nonplanar solid substrate and device for separating microorganism using the same
KR101368178B1 (ko) * 2008-01-07 2014-02-26 삼성전자주식회사 미세유동장치 내의 유체 흐름 경로에 필터를 형성하는 방법

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