CN1681943A - 在芯片基板上凝胶化制备的生物芯片 - Google Patents

Abstract

本发明提供了通过凝胶化制备的生物芯片、制备这种芯片的方法以及使用这种芯片的方法。本发明的生物芯片不同于生物材料共价结合在芯片基板表面上的现有生物芯片，其中生物材料存在与凝胶型斑点的孔中并且被凝胶型斑点包被，所述斑点集成并且固定在芯片基板上。

Description

在芯片基板上凝胶化制备的生物芯片

技术领域

本发明涉及使用溶胶-凝胶反应制备的生物芯片，制备这种芯片的方法和使用这种芯片的方法。

背景技术

生物芯片是结合纳米技术(NT)、生物技术(BT)和信息技术(IT)的新技术的典型例子。生物芯片是一种通过结合了作为材料技术的NT、作为内容和材料技术应用领域的BT以及作为分析大量结果技术的IT而建立起来的技术。

生物芯片通过各种生物材料在单位面积的固相支持物表面上高密度微阵列形成，并且根据附着在表面上的生物材料分为不同的芯片类型，例如DNA芯片、蛋白质芯片、细胞芯片、神经元芯片等。同时，生物芯片通过结合微流体技术而发展成为LOC(芯片实验室)。

生物芯片包括生物材料固定化的技术、制备生物兼容的芯片表面的技术、生物材料微阵列的技术、在已制备的芯片上进行各种生物过程的技术、检测反应结果的技术以及修饰蛋白质和基因以制备固定用生物材料的技术。

可使用本发明的蛋白质芯片是通过各种蛋白质在单位面积的固相支持物表面上密集微阵列而形成的。使用这种蛋白质芯片，可以用少量样品进行多种目的的实验，例如疾病诊断、高通量筛选(HTS)、酶活性检测等等。

通过采用制备已经发展并广泛应用的DNA芯片相同的原理和技术因素来制备蛋白质芯片的尝试已存在。通常，多数广泛使用的DNA芯片通过在包被材料(coating meterial)预处理过的玻璃板上固定DNA来制备。根据类似于制备DNA芯片中所使用的方法，当蛋白质被固定到包被物质预处理过的玻璃板表面上以制备蛋白质芯片时，由于待固定目标蛋白质物理和化学性质的差异可能出现各种问题。

早期的蛋白质芯片通过在表面预处理的玻璃板上固定蛋白质而制备，并进行简单的结合分析。蛋白质芯片的性能通过固定的蛋白质的活性来测定，其很难顺利进行(见MacBeath和Schreiber，Science(科学)289：1760，2000)。这种问题是如上所述由于蛋白质固有的物理和化学性质的差异导致的蛋白质的变性、失活和降解引起的。为了解决这些问题，已经进行了对蛋白质性质的表面处理技术和用于固定蛋白质的材料的探索和研究，像从DNA中所区分的那些。

这种探索和研究集中于在蛋白质芯片的表面上进行固定，同时保持蛋白质的活性，包括，例如，来自最近被PerkinElmer(珀金埃尔默)收购的Packard Bioscience(博克生物科技)的Hydrogel^TM(水凝胶^TM)包被片(coated slide)、来自Prolinx的Versalinx芯片、PDC芯片、来自Zyomyx(吉欧米克斯)的生物芯片等。

具体的说，水凝胶包被片是使用三维聚丙烯酰胺凝胶的技术，其中使用带有光学水平硅烷处理的表面的瑞士玻璃(Swiss glass)作为支持材料，并且在其上使用表面改性丙烯酰胺聚合物以改善蛋白质的结合力和结构稳定性。这里，蛋白质通过与聚丙烯酰胺凝胶的功能基团的共价键固定。

同时，Prolinx的Versalinx芯片包含形成于TiO₃表面结合生物素的聚(L-赖氨酸)-g-聚乙二醇的自组装单层，其中蛋白质被固定在自组装单层的表面，从而能够改善蛋白质的活性。

这些方法在修饰表面上形成一个三维微结构和共价固定的蛋白质，以便保持斑点中蛋白质的活性。此外，使用其它方法，用显微加工制造微孔型芯片来生产溶液态芯片。

其中，本发明所使用的溶胶-凝胶方法是一种通过显微加工制备微结构的技术，具体的说其已用于一些方法，这些方法包括通过温和方法形成结合网，和在无机材料上以并非共价结合的另一种方法代替化学方法，固定生物分子(见Gill I.和Ballesteros A，[TrendsBiotechnol.18：282，2000]。生物分子，包括酶，被固定在用于制备生物催化剂或生物传感器的大规模溶胶-凝胶基质中(见Reetz等人[Adv.Mater.9：943，1997]。特别是由于它的透明光学性能，它被用在光学彩色显影的检测中(见Edminston等人[J.Coll.Interf.Sci.163：395，1994]。同时，已知当生物分子被固定在溶胶-凝胶基质上时，它们不仅化学稳定而且热稳定(见Dave等人[Anal.Chem.66：1120，1994]。

在生物传感器的情况下，溶胶-凝胶反应被用作通过在固体支持物上形成微结构的成型(patterning)方法，和简单的固定方法。这里，这种成型方法包括通过流体力学使用模具，使液体状态的溶胶成型，然后凝胶化，分离模具以形成图案。例如，称为毛细管微成型技术(micro-moduling in-capillaries，MIMIC)的技术用于中型二氧化硅(mesoscopic silica)成型(见Kim等人[J.Ferment.Bioeng.82：239，1995]；Marzolin等人[Adv.Mater.10：577，1998]；Schuller等人[Appl.Optics 38：5799，1999])。该技术能够用于微流体工程的基础成型。

然而，由于蛋白质的活性能够被例如pH的多种因素影响，当将蛋白质以溶胶状态加入到溶胶-凝胶过程中时，设定保持活性的条件很重要。因此，提出了通过使用如中性pH的各种温和条件预先混合蛋白质和溶胶的蛋白质成型技术(见Kim等人[Biotechnol.Bioeng.73：331至337页，2001]，但是在中性pH下存在溶胶-凝胶过程迅速进行到凝胶和由于添加剂可能发生破裂或凝胶变得不透明的问题。

发明内容

本发明的一个目的是提供通过使用溶胶-凝胶反应制备的生物芯片、这种芯片的制备方法和使用这种芯片的方法。

迄今为止，不存在能够将含有例如蛋白质的生物材料的斑点状溶胶-凝胶基质粘附到芯片基板上的技术，因此不存在含有以斑点状集成的溶胶-凝胶基质的生物芯片。通过发展芯片基板表面处理技术，本发明第一次提供了一种在芯片基板上使用溶胶-凝胶反应制备的生物芯片。通过根据本发明的芯片基板表面处理技术，能够在芯片基板上以斑点状集成含有生物材料的溶胶化合物，能够在芯片基板上发生该溶胶混合物凝胶化的溶胶-凝胶反应，并且能够在芯片基板上固定溶胶-凝胶基质。

本发明提供一种生物芯片，其中在芯片基板上结合并且固定化凝胶型斑点，同时生物材料包埋在该斑点的孔中并且被该斑点包被，这种芯片不同于生物材料共价固定在芯片基板的表面上的常规生物芯片。

本发明提供了一种制备生物芯片的方法，包括(1)在经表面处理的芯片基板上集成斑点状溶胶状态的含有生物材料的溶胶混合物；和(2)使芯片基板上斑点形状的溶胶混合物凝胶化。

在溶胶混合物的凝胶化过程中，形成三维网状结构，结果产生了孔。生物材料包埋在该孔中。因此，能够制备含有包被在孔中的生物材料的以凝胶状态集成在芯片基板上的生物芯片。

同时，本发明提供了一种生物芯片上的生物材料和目标物质之间结合的检测方法，包括(1)将含有待检测目标物质的样品，无论其是否结合，用于生物芯片的生物材料上，所述生物材料通过溶胶-凝胶反应固定在芯片基板上；和(2)检测具体连接到生物材料上的目标物质。

根据本发明的生物芯片是一种新概念的生物芯片，其中每一个集成在芯片基板上的斑点形成具有包被在孔中的生物材料的载体，以使生物材料取向自由而非共价结合(见图8)。

同时，根据本发明通过在固定用芯片基板上通过硅酸盐的溶胶-凝胶反应制备生物芯片的方法，是一种制备生物芯片的新概念方法。

由于根据本发明的生物芯片是通过含有生物材料的溶胶混合物在芯片基板上凝胶化而形成的，该生物材料与凝胶基质并非共价结合，而是装在该凝胶基质中形成的孔中，并且包被在凝胶基质形成的斑点中，由此这种生物芯片提高了反应性。

因此，在本发明应用于蛋白质芯片的情况下，斑点中能够含有大量蛋白质，同时保持其三维结构，因此可以制备灵敏性提高的芯片。同时，由于许多蛋白质能够通过硅酸盐(作为溶胶-凝胶反应基本组分)结构的生物相容添加剂而稳定，活性能够明显提高。

(1)芯片基板的表面处理

本发明提供一种用于芯片基板的包被溶液，该包被溶液含有选自分子量在800至200,000范围内的聚乙酸乙烯酯(PVAc)、分子量在70,000至120,000范围内的聚(乙烯基丁醛-羰基-乙烯醇-羰基-乙酸乙烯酯)、分子量为10,000或更高的聚(甲基丙烯酸甲酯-羰基-甲基丙烯酸)、分子量为200,000或更高的聚(甲基乙烯基醚-alt-马来酸酐)、分子量为1,000,000或更高的聚(甲基乙烯基醚-alt-马来酸酐)、分子量为10,000或更高的聚丙烯酸甲酯、3-环氧丙氧基(glycidoxy)丙基三甲氧基硅烷(GPTMOS)的包被剂，溶解在选自二氯甲烷(MC)、四氢呋喃(THF)、乙醇、甲醇、丁醇、甲基乙基酮、丙酮、异丙醇(IA)、醋酸乙酯(EA)、甲基异丙基酮(MIBK)、双丙酮醇(DAA)(di-acetonealcohol)等的溶剂中。

该溶剂是低沸点有机溶剂。

该溶剂优选以包被溶液总重的5至20％的浓度使用，特别是以5wt.％，10wt.％，15wt.％，20wt.％的浓度使用。

当上述包被溶液包被在芯片基板上时，促进了芯片基板上的凝胶化，该凝胶态不会从在包括抗原-抗体反应的水相检测中和凝胶化后的严格洗涤中分离出来，具有憎水性质的涂层能够保持斑点的形状，并且由于该涂层硬度很高并且是光学透明的，能够降低反应后背景的水平。实验显示所述包被剂的分子量和浓度最适于保持上述性质和性能。

同时，本发明提供一种用于生物芯片的基板，其中芯片基板以所述的包被溶液包被。包被方法优选旋转涂布。

此外，本发明中可用的生物基板包括常用的玻璃、石英、硅氧烷、塑料、聚丙烯、聚碳酸酯或活化的丙烯酰胺。然而，对于通过光学方法的测量和检测，优选光学透明的芯片基板。因此，这种芯片基板合适的例子包括光学上出色的聚合物，例如聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚碳酸酯(PC)、环烯烃共聚物(COC)等等。

芯片基板能够以与大量样品反应，具有许多标记的形式制备。

(2)用于芯片基板上凝胶化的溶胶型混合物的制备

对于本发明，为了通过芯片基板上的凝胶化，在芯片基板的表面上制备高密度结合并且固定化的具有例如蛋白质的生物材料包被其中的斑点，硅酸盐单体和/或以下添加剂可以用作该溶胶-凝胶基质的基本组分。

添加剂包括聚甘油基硅酸盐(PGS)、3-环氧丙氧基三甲氧基硅烷(GPTMOS，98％)，(N-三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷氨基甲酸乙酯(PEOU)、甘油、平均分子量在400至10,000范围内的聚乙二醇(PEG)等。

硅酸盐单体包括四甲基原硅酸盐(TMOS)、四乙基原硅酸盐(TEOS)、甲基三甲氧基硅烷(sillane)(MTMS)、乙基三乙氧基硅烷(ETEOS)、三甲氧基硅烷(TMS)、3-氨基丙基三甲氧基硅酸盐(APTMOS)等。

具体的说，硅酸盐单体和上述添加剂中的PGS、GPTMOS和PEOU即使单独使用时就能够进行溶胶-凝胶反应，形成溶胶-凝胶基质。

优选至少一种硅酸盐单体和至少一种添加剂的混合物能够用作溶胶-凝胶基质的基本组分。

作为溶胶-凝胶基质的基本组分，硅酸盐单体和/或添加剂的混合物以溶胶溶液总体积的30至60％的范围使用。

硅酸盐单体优选以溶胶混合物总体积的10至40％的范围使用，更优选以溶胶混合物总体积的20至40％使用。添加剂优选以溶胶混合物总体积的2至10％的范围使用。如果添加剂的使用量超过10体积％，溶胶混合物的相容性恶化并且芯片基板上斑点的形成不易完成。

同时，如表1和2所示，考虑到预期生物材料的尺寸、蛋白质的活性、溶胶-凝胶反应的速率，以及斑点的形态，前述添加剂能够根据目的选择性使用。

至于添加剂在总溶胶溶液中的量，分别是PGS在0.5至6体积％的范围内，GPTMOS在1至10体积％的范围内，PEOU在5至15体积％的范围内，甘油在1至5体积％的范围内，并且PEG在1至6体积％的范围内。

聚甘油基硅酸盐(PGS)是硅酸盐单体和甘油间反应的聚合中间体。

该聚合中间体(PGS)在孔径尺寸中任务关键。固定的凝胶应当具有最优化的孔径尺寸，以使结合在生物芯片表面的生物材料(例如蛋白质)能够容易地与活性物质反应。因此，PGS优选以总溶胶溶液体积的0.5至6％的量加入，以控制孔径尺寸。

聚甘油基硅酸盐(PGS)能够通过使至少一种选自四甲基原硅酸盐(TMOS)、四乙基原硅酸盐(TEOS)、甲基三甲氧基硅烷(MTMS)、乙基三乙氧基硅烷(ETEOS)，三甲氧基硅烷(TMS)、3-氨基丙基三甲氧基硅酸盐(APTMOS)等的硅酸盐衍生物作为单体与甘油反应来制备。聚甘油基硅酸盐(PGS)可以根据本领域已知的方法制备。

将要在芯片基板上凝胶化的溶胶混合物包括选自硅酸盐、上述添加剂中的至少一种，和将要结合在芯片表面上的生物材料(例如蛋白质)。

根据本发明能够固定在生物芯片上的生物材料包括任何能够具体结合在目标物质上的生物材料，由此检测实验其间的结合。优选例子包括核酸，例如DNA、RNA或PNA、蛋白质或寡肽。

根据本发明的生物材料中蛋白质的非限定的例子包括HIV(人类免疫缺陷性病毒)p24、Combo、RgpIII、IgG-Cy3、用于传染病诊断的抗原或抗体、或用于癌症诊断的抗原或抗体，包括AFP(Alpha fepto蛋白质)和活性检测中使用的酶，其中所述的生物材料能够高密度结合在芯片基板表面上。同时，除蛋白质、抗原和抗体外，可以结合新药开发中使用的低分子物质。

优选溶胶混合物可以进一步含有pH缓冲液。作为pH缓冲液，优选使用磷酸盐缓冲液，并且pH选自4至9的范围内。非限定的例子包括pH5、5.5、6、6.5、7、7.5、8和8.5。

pH缓冲液的浓度优选在5至100mM的范围内，并且非限定的例子包括5、10、20、30、40、50、60、70、80、90和100mM。

对于蛋白质芯片，决定溶胶-凝胶方法成功的最关键的因素之一是溶胶凝胶化所需时间和结合持续的时间。同时，在蛋白质芯片的制备中，通过使用正确组成的组合，在溶胶-凝胶过程中严格保持合适的粘度，从而在凝胶化后制备光学可用的物质。

对于本发明，通过控制加入到溶胶-凝胶混合物中的添加剂的组成和类型、凝胶化的条件(温度和湿度)等等，基于本发明实施例所规定的条件，可以使凝胶化最多延迟24小时。

(3)通过溶胶-凝胶包被在芯片表面固定目标蛋白质

本发明提供一种生物芯片，其通过在芯片基板上的斑点中如上所述使用溶胶混合物，并且使芯片基板上的斑点凝胶化制备，其中生物材料包埋在凝胶的三维网状结构形成的孔中。

生物材料包被在芯片基板上凝胶型斑点中，并且该凝胶型斑点固定于该芯片基板上。

溶胶混合物能够通过使用高密度微阵列机集成在根据本发明包被的芯片基板的表面上。这里，凝胶化的条件是温度为4℃至25℃，并且湿度为40至80％。

对于蛋白质芯片，优选斑点具有大约100至500μm的直径，并且集成的斑点数目为1至1000/cm²。

虽然以下实施例中制备的芯片为100个斑点/cm²，在高密度集成的情况下可以高达1,000个斑点/cm²，。

根据本发明的生物芯片能够应用于新药筛选芯片、环境和毒性分析芯片以及蛋白质芯片和DNA芯片。

(4)发明的生物芯片的应用

本发明提供了一种用于检测固定于生物芯片上的生物材料和目标物质之间的结合的方法，包括以下步骤：将含有用于检测与生物材料间结合的目标物质的样品涂到带有通过溶胶-凝胶反应固定了的生物材料的生物芯片上；检测具体结合到生物材料上的目标物质。

根据本发明，生物材料和目标物质之间的反应在凝胶型斑点的孔中发生，其中该生物材料包埋在孔中并且被斑点包被。

为了容易检测，优选目标物质被包括例如荧光染料的信号标记。生物材料和目标物质间结合的检测能够根据信号的类型，包括附着在目标物质上的物质，通过多种目前广泛应用的方法进行，例如荧光检测法、电化学检测法、使用质量变化检测法、使用电荷变化检测法或使用光学性质差异检测法。

与常规免疫检测或生物芯片相比，根据本发明通过溶胶-凝胶反应制备的生物芯片能够进行诊断所需的反应，包括抗原-抗体反应的，并且在30分钟至2小时之内提供分析结果。

根据本发明的生物芯片能够应用于疾病诊断、环境和毒性分析以及新药开发的基础技术和作为快速灵敏的生物芯片。

根据本发明制备的蛋白质芯片能够用于诊断，其中抗原用夹心(Sandwich)检测中所使用的相同方式，用荧光染料标记，其中夹心检测是一种免疫检测法。这里，在测定结果的步骤中可以使用荧光扫描器，诊断结果可以使用程序分析并量化。

根据本发明所制备的蛋白质芯片能够用于HIV诊断。

根据本发明，因为生物材料能够以混合凝胶溶液的状态加入，蛋白质或低分子物质能够高度结合，因此可以使用制备的生物芯片进行高通量筛选(HTS)。

同时，由于蛋白质活性测定中所使用的酶物质能够结合到混合溶胶溶液中，制备的生物芯片能够用于酶活性测定方法。用于活性测定的酶包括毒性检测、环境检测和食品微生物检测中所使用的那些酶。

抗原-抗体诊断能够在Memorec生产的自动A-Hyb腔(A-Hybchamber)中自动进行，或在外部人工进行。

(5)使用本发明的各种产品的样品

通过使用根据本发明的芯片上的凝胶化，各种蛋白质、抗原、抗体、低分子物质和微生物能够结合到芯片上最多为10,000或更多的斑点中。如图7所示，本发明能够典型地用于血库筛选，以筛选血库中的输血相容性(传染病标记，例如HIV I、II、HCV(丙型肝炎病毒)、HBV(乙型肝炎病毒)、疟疾、H.pylori(幽门螺旋杆菌)、梅毒)(图7a)，并且能够识别常规癌症诊断的标记和常规用于特殊癌症诊断的标记(图7b)。

附图简要说明

图1显示根据实施例4制备的生物芯片灵敏性检测的结果；

图2a显示Nicholas Rupcich等人在Chem.Mater.，15(9)，1803-1811，2003中公开的生物芯片上斑点透明度的照片，和

图2b显示根据实施例4制备的生物芯片中斑点透明度照片；

图3显示根据实施例4制备的生物芯片保存期限检测的结果；

图4显示根据实施例4制备的生物芯片的斑点的横截面的共聚焦激光扫描显微镜(CLSM)照片；

图5显示一个实施方案，其中HIV相关指示蛋白质通过根据本发明制备生物芯片的方法而结合，并且制备的芯片用于诊断；

图6显示使用多种HIV诊断用指示抗原(p24，combo，rgpIII)和抗体(抗p-24)的AIDS(获得性免疫缺陷综合症)诊断的实施方案；

图7显示使用本发明制备的产品的样品；

图7a是血液检查中使用的诊断芯片的两个样品，和

图7b是癌症诊断中使用的诊断芯片的两个样品；

图8是根据本发明的生物芯片中斑点的局部示意图。

具体实施方式

本发明将通过以下实施例详细说明。然而，以下实施例仅为阐明本发明的目的，而本发明并不受其限制。

实施例1：PGS的合成

四甲基原硅酸盐(TMOS，0.048mol)和甲醇(10％)彻底混合，向其中加入盐酸(0.25M)。得到的混合溶液在70℃下回流反应6小时。

反应混合物溶液的温度下降到50℃，向其中加入甘油(0.192mol)。得到的混合物溶液在50℃下反应16小时。除去甲醇，得到聚甘油基硅酸盐(PGS)，然后将其用于下一步。

实施例2：通过芯片上的凝胶化制备生物芯片

含有20％(g/ml)实施例1中合成的聚甘油基硅酸盐(PGS)水溶液和其它添加剂的溶胶用于生物基板上的斑点中，并且在芯片基板上凝胶化以制备蛋白质芯片。

步骤1：芯片基板的表面处理

在PMMA玻璃板(79mm×26mm)上旋转涂布3％聚甲基丙烯酸甲酯/THF的包被溶液。使用Laurell旋转涂布机以500rpm进行10秒钟的旋转涂布，然后以1,000rpm进行40秒钟的旋转涂布。

步骤2：溶胶混合物的制备

为制备溶胶混合物，混合选自聚甘油基硅酸盐(PGS)水溶液、PEOU、PEG、甘油、GPTMOS和MTMS中的一种添加剂；四甲基原硅酸盐(TOMS)；和甲基三甲氧基硅烷(MTMS)。向其中加入盐酸(最终浓度：5mM)，然后混合。加入磷酸钠(最终浓度：10mM，pH7)、蛋白质(最终量：50pg)和PBS溶液(15％)，充分混合。使用的蛋白质在实施例3至5中详细说明。

步骤3：蛋白质芯片的构建

使用Arrayer(Cartesian)的喷墨集成程序，将步骤2中制备的溶胶混合物在步骤1中表面处理过的玻璃片上集成为直径是100至500μm的圆形斑点中，在25℃和80％湿度下保存，进行凝胶化以制备生物芯片。

实施例3：溶胶混合物的组成和生物材料之间的关系

本实施例的目的是根据待固定于蛋白质芯片上的蛋白质的类型和大小(例如根据p24或BSA蛋白质的大小)，或根据抗原或抗体的用途，通过使用各种添加剂以及硅酸盐单体，寻求一种性能最优化的组成。

最高灵敏性的溶胶混合物的组分和组成通过上面血液反应的标准测定，背景水平最小化并且信号最大化，检测反应过程中凝胶化的蛋白质安全的固定在芯片上，并且斑点的形状适合于定量分析。此外，为了方便控制质量，该标准包括数据间的偏差小。

所以，注意到当使用例如p24的小尺寸抗原时，组成5是上述标准(见下表2)下最合适的。具体的说，使用PEG8000作为添加剂对于形成具有最佳三维结构的斑点有贡献。可以在单位表面积的玻璃片上安置许多斑点，培养后观察到被包被的蛋白质的信号强度均匀。

不同于小尺寸抗原，当使用相对大尺寸的抗原时，考虑到上述标准组成8显示最佳性能。具体的说，斑点形态和信号强度都均匀。

                     表1组成

组分编号	溶胶混合物组分
				TMOS	MTMS	2-10％添加剂
	1	25.5％	12.5％				没有添加剂

2	17.5％	17.5％	4％PGS
				3	20.0％	10.0％	5％PEOU
4	25.5％	12.5％	3％PEG400
				5	25.5％	12.5％	5％PEG8000
6	25.5％	12.5％	2.5％甘油
				7	25.0％	7.5％	5％GPTMOS
8	0％	10％	MTMS

表2抗原或抗体蛋白质芯片的最佳组分

由表2的结果，注意到抗原的最佳组成不同于抗体的最佳组成。

实施例4蛋白质芯片性能的分析

检测通过用实施例2描述的相同方法，使用表1中组成5的组分制备的固定了HIV P24蛋白质的蛋白质芯片的性能，包括集成的斑点的物理性质、活化状态以及斑点中固定的蛋白质的灵敏性。

实验1：使用CLSM观察斑点的横剖面

为得知蛋白质是否存在于斑点凝胶中以及是否是三维高度结合的，通过CLSM(共聚焦激光扫描显微镜)X射线断层摄影检验该斑点。结果如图4所示，证明了HIV P24蛋白质存在于凝胶中并且大量蛋白质是结合的。

实验2：测定蛋白质芯片的最高灵敏性

为了使用实际血液处理的血清进行抗原-抗体反应，检测被包被的蛋白质在各种反应条件下是否能够在芯片表面上保持完整，以及信号是否不是随机，而是恰好伴随抗原-抗体反应出现。Cy3-标记的Cy3-结合抗兔IgG(Sigma-Aldrich公司)加入到溶胶混合物中(实施例2所述的所有组成)代替蛋白质，并且在芯片基板上凝胶化以制备芯片。制备的芯片进行初次抗体反应，洗涤，二次抗体反应，洗涤并且干燥，然后以常规诊断方法进行同样的步骤。在扫描器上观察，确认与背景相比(未显示)，信号清晰并且数量上高几千倍。

通过在根据实施例2(表1，组成5)的溶胶混合物溶液中加入AIDS诊断中实际使用的HIV P24蛋白质制备生物芯片，并且检验其与AIDS病人血液中抗体之间的反应。图1a显示了该试验的结果，其中固定在该生物芯片上的P24蛋白质与血液中的HIV抗体发生反应，并且通过Cy3-标记的抗体识别了信号。当不含蛋白质的溶胶混合物溶液作为对照时，没有反应发生。

在上述结果的基础上，接下来从100ng/ml稀释已知浓度的AIDS抗原，确定血液中抗原能够被检测到的检出限。使用根据本发明制备的芯片，低到0.01fg/ml的浓度时，可以观察到背景的5倍或更高倍的信号。根据图1b显示的曲线，本发明的生物芯片与PerkinElmer的水凝胶芯片相比灵敏度有了10,000倍的改进。

实验3：检验在蛋白质芯片上凝胶化形成的斑点

为检验结合在蛋白质芯片表面上的蛋白质斑点的透明度、裂痕和形态，在光学显微镜和CLSM下观察结合的斑点，结果如图2b所示。

斑点透明并且没有裂痕。在抗原-抗体反应后进行图像分析，观察到斑点形态均匀。如图2a所示，根据本发明的斑点的形态和透明度优于其它技术产生的斑点(Chem.Mater.，15(9)，1803-1811，2003)。

实验4：验证通过在芯片上凝胶化制备的蛋白质芯片的稳定性

如图3所示，在长达4个月的时期内，当同样的斑点进行抗原-抗体反应时，无论是4℃还是25℃灵敏度始终保持在灵敏度变化大约5％的范围内。同时，根据本发明通过凝胶化形成的斑点超过6个月(未显示)时是稳定的，因此证实本发明可以制成产品。

实验5：通过芯片上凝胶化得到的斑点中活性蛋白的分布

本实验用于证实通过芯片上凝胶化在表面上三维支撑的蛋白质在斑点中均匀分布。使用CLSM检测实验2中制备的芯片中蛋白质的分布，确认斑点的三维结构。该实验的结果如图4所示。验证了在厚度大约为100至300μm的斑点中，荧光标记蛋白并未附着在外表面上或底部，而是均匀地分布在斑点中。

实施例5：诊断用蛋白质芯片的制备和诊断用抗原-抗体反应

实验1：含有HIV诊断用有抗原的蛋白质芯片

在实施例2中所使用的方法相同的步骤之后，蛋白质-溶胶混合物(表1，组成5)在芯片上凝胶化，其中所使用的蛋白质是纯化的HIVp24蛋白质(1μg/μl)、含有HIV检测用p24的combo蛋白质(1μg/μl)、HIV聚合酶RgpIII(1μg/μl)和BSA(1μg/μl)。

为获得定量的结果，随后将每一种蛋白质稀释10倍，并且确定结合的最适浓度条件(40pg-4ng/斑点)。

如下是使用P24蛋白质、HIV检测指示因子检测人血清中HIV抗原的AIDS诊断反应的条件和步骤。为了检测HIV p24，在25℃下与作为第一抗体的抗-p24反应30分钟，然后洗涤。在第一抗体反应中使用的相同孵育条件下，作为第二抗体的Cy3-结合的抗兔IgG(Sigma-Aldrich公司)反应30分钟，洗涤并在空气中彻底干燥。使用扫描器(Exon)检测Cy3信号。

结果，不含有蛋白质的斑点或含有BSA蛋白质(与HIV无关)的斑点没有信号，同时含有P24的斑点显示与浓度相关的信号。甚至在大约40pg的浓度下，检测能够正常进行(图5)。

同时，含有P24、HIV聚合酶和RgpIII的combo蛋白质显示图6所示的信号。

从以上结果中，可以看到抗原-抗体反应能够在根据本发明制备的蛋白质芯片上实际发生。

实验2：抗体的固定

在实验1中，在蛋白质芯片上仅仅固定了抗原蛋白。然而，观察到当使用通过调节所用的溶胶组成，含有抗体的溶胶混合物时，固定化的抗体能够进行抗原-抗体反应。这里，使用的抗体是AIDS诊断所使用的单克隆抗-P24抗体。带有固定的单克隆抗-P24抗体的蛋白质芯片与血液AIDS蛋白质反应，进行包括第一和第二抗体检测的夹心检测。

图6显示了该实验的结果，其中通过针对抗原向表1的组成5中加入各种指示蛋白质，针对抗体，在表1组成7中加入抗体，制备生物芯片，并且如实验1，进行AIDS诊断。

通过HIV抗体分别在HIV诊断用指示抗原P24、combo和rgpIII的所有复制斑点中检测到抗原，同时在不含有蛋白质的斑点中，没有观察到信号。同时，在使用抗体作为诊断指示剂的抗P-24的情况下，通过HIV抗原检测到抗体。

在不含有抗体的斑点中，没有观察到信号。图6显示了根据本发明的生物芯片并非识别抗体或抗原，但是能够在相同条件下在相同的芯片上既检测出抗原也检测出抗体，这使得本发明的生物芯片区别于常规诊断芯片。

迄今为止，本发明已经说明了优选实施方案，然而在不脱离本发明范围的情况下可以进行各种修改。因此本发明的范围不限于上述实施方式，但是受到权利要求及其等同物范围的限制。

Claims (25)

1.一种生物芯片，其特征在于凝胶型斑点集成并且固定化在芯片基板上，同时生物材料包埋在其中的孔中并且被斑点所包被。

2.根据权利要求1所述的生物芯片，其特征在于其可用作蛋白质芯片、DNA芯片、新药筛选芯片、环境检测芯片、毒性检测芯片或食品微生物检测芯片。

3.一种用于芯片基板的包被溶液，其特征在于包括溶解在选自二氯甲烷、四氢呋喃、乙醇、甲醇、丁醇、甲基乙基酮、丙酮、异丙醇、乙酸乙酯、甲基异丙基酮和二丙酮醇的溶剂中的选自分子量在800至200,000范围的聚乙酸乙烯酯(PVAc)、分子量在70,000至120,000范围的聚(乙烯基丁醛-羰基-乙烯醇-羰基-乙酸乙烯酯)、分子量为10,000或更高的聚(甲基丙烯酸甲酯-羰基-甲基丙烯酸)、分子量为200,000或更高的聚(甲基乙烯基醚-马来酸酐)、分子量为1,000,000或更高的(甲基乙烯基醚-马来酸酐)、分子量为10,000或更高的聚(丙烯酸甲酯)、3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTMOS)的包被剂。

4.根据权利要求3所述的包被溶液，其特征在于所述的溶剂以该包被溶液总重量的5至20％的浓度使用。

5.一种以根据权利要求3所述的包被溶液包被的芯片基板。

6.根据权利要求5所述的芯片基板，其特征在于所述包被是通过旋转涂布实现的。

7.根据权利要求5所述的芯片基板，其特征在于所述芯片基板选自聚甲基丙烯酸甲酯、聚碳酸酯或环烯烃共聚物。

8.根据权利要求5所述的芯片基板，其特征在于所述芯片基板是片状的。

9.一种制备生物芯片的方法，其特征在于包括(1)将含有生物材料的溶胶混合物以斑点的形状集成在表面处理过的芯片基板上；和(2)使该芯片基板上斑点形状的溶胶混合物凝胶化。

10.根据权利要求9所述的方法，其特征在于使用如权利要求5中限定的芯片基板。

11.根据权利要求10所述的方法，其特征在于所述的溶胶混合物包括选自硅酸盐单体、聚甘油基硅酸盐(PGS)、3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTMOS)和(N-三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷氨基甲酸乙酯(PEOU)中的至少一种，作为所述的溶胶-凝胶基质的基本组分。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述的硅酸盐单体是选自四甲基原硅酸盐(TMOS)、四乙基原硅酸盐(TEOS)、甲基三甲氧基硅烷(MTMS)、乙基三乙氧基硅烷(ETEOS)、三甲氧基硅烷(TMS)和3-氨基丙基三甲氧基硅酸盐(APTMOS)中的至少一种。

13.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述的溶胶混合物进一步含有选自甘油、分子量为400至8000的聚乙二醇中的至少一种作为所述的溶胶-凝胶基质的基本组分。

14.根据权利要求11或13所述的方法，其特征在于所述的溶胶-凝胶基质的基本组分以所述的溶胶混合物总体积的30％至60％的范围使用。

15.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述的硅酸盐单体以所述的溶胶混合物总体积的10％至40％的范围使用。

16.根据权利要求11或13所述的方法，其特征在于聚甘油基硅酸盐(PGS)、3-环氧丙氧基丙基三甲氧基硅烷(GPTMOS)、(N-三乙氧基甲硅烷基丙基)-O-聚环氧乙烷氨基甲酸乙酯(PEOU)、甘油和聚乙二醇(PEG)以所述的溶胶混合物总体积的2至10％的范围使用。

17.根据权利要求16所述的方法，其特征在于基于总的溶胶混合物，所述的PGS以0.5至6体积％的范围使用，GPTMOS以1至10体积％的范围使用，PEOU以5至15体积％的范围使用，甘油以1至5体积％的范围使用或PEG以1至6体积％的范围使用。

18.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述的聚甘油基硅酸盐(PGS)是硅酸盐单体和甘油反应的聚合中间体。

19.根据权利要求11所述的方法，其特征在于所述的溶胶混合物进一步含有pH缓冲液。

20.根据权利要求19所述的方法，其特征在于所述的pH缓冲液是磷酸盐缓冲液。

21.根据权利要求19所述的方法，其特征在于所述的pH缓冲液的pH范围是4至9。

22.根据权利要求19所述的方法，其特征在于所述的pH缓冲液的浓度在5至100mM的范围内。

23.根据权利要求9所述的方法，其特征在于所述的凝胶化的条件包括4℃至25℃的温度和40至80％的湿度。

24.一种用于检测固定在生物芯片上的生物材料和目标物质之间结合的方法，其特征在于包括以下步骤：

将含有检测与所述的生物材料间结合的所述目标物质的样品应用于权利要求1中限定的生物芯片上，或应用于通过权利要求9中限定的方法制备的生物芯片上；并且

检测具体结合到所述的生物材料上的所述目标物质。

25.根据权利要求24所述的方法，其特征在于所述生物材料与所述目标物质之间的反应发生在所述凝胶型斑点的孔中，其中所述生物材料包埋在该孔中并且被斑点包被。

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