CN1558236A - 一种卷曲折叠式化合物微阵列芯片棒及其制备方法 - Google Patents

Abstract

一种卷曲折叠式化合物微阵列芯片及其制备方法，属于生物化学分析技术领域。该微阵列为一种卷曲折叠式化合物微阵列，包括薄膜、多孔微棒和粘合膜。所述薄膜和多孔微棒自身带有－OH、－NH₂、－COOH、－SH等功能基团，也可以通过功能化修饰如等离子处理改性、化学接枝、水解等改性方法而带有上述功能基团。所述薄膜上每张合成和固定有一种化合物，然后卷曲成多孔微棒，或者每根多孔微棒上直接合成和固定有一种化合物。将上述多孔微棒按照预定排布规律粘合在粘合膜上；然后将粘合有多孔棒的粘合膜卷曲折叠成棒状，构成多孔微棒阵列，将多孔微棒阵列进行切片，每一切片即为一张卷曲折叠式化合物微阵列芯片。本发明完全免除了现有生物芯片制备过程中昂贵而繁琐的掩模制作过程和重复定位过程，操作极为简单，设备投资很少，易实现自动控制，并保障了极高的偶联效率。同时，本发明阵点之间没有填充物，所以没有背景信号干扰，适合各种分析方法。

Description

一种卷曲折叠式化合物微阵列芯片棒及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种用提供薄层方法或用多级平面盘的微生物装置，以及一种微生物的测定或检验方法，同时也涉及到一种化合物微阵列装置及其测定或检验方法，尤其是一种生物大分子微阵列及其制备化合物微阵列的方法，属于生物化学分析技术领域。

背景技术

生物芯片在生物检测、医学检验和疾病诊断、药物筛选和基因序列分析上有着极其重要的意义。传统生物检测所采用的方法包含一系列繁杂的步骤，尤其在大规模生物化合物检测和筛选方面费时、费力、成本高，不能满足需要。例如，多孔检测板(如96孔板)是现行普遍使用的一种用于医药、生化检测和筛选的常规器具。其基本方法是分别把不同蛋白质、核酸探针、细胞株、或生物组织放置或固定于不同的孔洞之中，通过加入不同的化学物，或化合物组合，或生化试剂，或被检测的生物样品，观察不同化学/生物物质的反应，进行快速并行的生化分析、临床检验、或药物筛选。其上的96个反应池彼此隔离，根据用户需要可任意选用反应池的个数。作为现行生化研究和开发中普遍使用的一种方法，由于研究对象化合物数目的庞大，使得研究过程中化合物合成或者购买需要花费大量的时间和费用。同时样品的有序排布也将花费大量的时间。

在对传统方法进行改进的过程中，生物芯片技术应运而生。这一技术的成熟和应用将为疾病的早期快速检测和新药开发、食品检测和环境监测等生命科学相关领域带来一场革命，为生物信息的获取及分析提供有力的手段。

基因芯片制备技术可分为点样法和原位合成法。所谓点样法，即运用各种方法(打印、喷印、点样)将预先合成的DNA探针或cDNA探针固定到玻片或其它固体载片上形成微探针阵列。原位合成则是按照预先设计的碱基序列直接将探针合成在基片上。点样法适合于低密度基因芯片的制备，稍高的探针数量即需要很高的成本(例如，当20目的探针数量达到1000条时，探针成本即在300,000元人民币左右)，因而当探针数目较多时，这一技术无法与原位合成技术想比拟，此外还有各种客观因素导致探针密度不均匀因而杂交信号不均匀的缺点。从今后大规模的批量化生产及应用前景的角度，质量可靠的高密度基因芯片批量化制备技术是重要的发展趋势，即使是临床诊断急需开发的较低密度的基因芯片，由于原位合成制备的产品质量更为稳定平行可靠，也较点样法优越，因而具有广泛的需求和市场前景。目前在国际上，已经开发了多种DNA阵列原位合成技术，但由于这样那样的不足，仅美国Affymetrix公司拥有的光脱保护原位合成制备专利技术已有规模化的基因芯片生产线为需求者提供商业芯片，其主要不足之处是特有的光脱保护方法需要制作一系列特定的光掩模，成本高，不适合小批量需求。并且对不同的用户需求和不同的基因芯片必须重新设计光掩模。

在国内，东南大学开发了分子印章接触压印DNA微阵列原位合成技术，完全采用现有最成熟的DNA合成路线，可望降低成本。但在掩模设计上和Affymetrix公司拥有的光脱保护原位合成制备专利技术一样，针对不同的用户需求和不同的基因芯片，必须重新设计掩模用于光刻后制备PDMS分子印章。

发明内容

本发明的目的在于：针对以上现有技术存在的不足，提出一种制备工艺简捷、成本经济、使用方便的基因芯片微生物装置及其制备方法，从而加速基因芯片制备技术的推广应用进程。

为了达到以上目的，本发明 所采取的技术实施方案为：按卷曲折叠式化合物微阵列的方法，将基因芯片微生物装置卷曲成卷曲式化合物微阵列棒，卷曲式化合物微阵列棒包括多孔棒和粘合膜，所述多孔棒可以是由薄膜卷曲而成的，也可以是直接用现成的多孔微棒，在每根多孔棒上通过化学方法附着固定有一种化合物，而且所述多孔棒是按照预定排布规律粘合在粘合膜上。然后将粘合有多孔棒的膜卷曲折叠成棒状，构成多孔棒阵列芯片棒，将多孔棒阵列芯片棒进行切片，每一切片即为一张化合物微阵列芯片。

制备本发明卷曲折叠式化合物微阵列的方法包括以下工艺：

1)先用化学方法制备固定有化合物的多孔棒。采取两种方法制备固定有化合物的多孔棒。

第一种方法为：应用组合化学原理，在多孔棒状材料内部和表面原位合成出预设计的化合物分子，或多孔棒状材料浸渍在已经合成好的化合物溶液中负载固定上预设计合成好的化合物分子；

第二种方法为：在薄膜状材料上原位合成出预设计的化合物分子，或将薄膜材料浸渍在已经合成好的化合物溶液中负载固定上预设计合成好的化合物分子，然后将薄膜状材料卷成棒状得到固定有化合物的多孔微棒。此方法可以避免直接应用多孔棒状材料固定化合物分子中扩散阻力可能造成的化合物分布不均匀现象。

2)将固定有化合物的微孔棒状材料并排粘合在一柔软膜片上，然后卷曲成圆柱或折叠成四方柱，即得到化合物棒微阵列芯片棒。

3)将上述化合物棒微阵列沿着横截面切片，每一切片即为一张对应的生物芯片。

本发明的卷筒式化合物微阵列完全免除了原位合成技术中昂贵而烦琐的掩模制作过程，也不需要重复定位装置，更不需要微流体芯片制作中的微阀微流道加工和相应的高精度高可靠性控制体系，整个生产和操作过程及其简单，不需要昂贵的设备投资和人员投资，因而成本低廉，而且有液相反应环境，保障了极高的偶联效率，获得了极高的功效。

上述方法而所耗试剂甚微，可以显著降低成本，适用于化合物及其组合、生物分子或药物的高通量筛选，传统中药的现代化研究，简单实用快速可靠的临床诊断，以及基因组或cDNA文库的筛选，新基因的发现和基因功能的研究，蛋白质组学的研究等。

总之，本发明将大大加快生物芯片在临床诊断研究中的应用，大大加快新药开发的速度，减少开发成本，提高效率和准确性，而且对传统药物(包括中药)的现代化具有重要的价值。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对对本发明的技术方案作进一步详细的描述。

图1为实施例一16张表面含有-OH、-NH₂等活性官能团的薄膜示意图；

图2为实施例一将膜片浸泡在容器示意图；

图3为实施例一将得到表面具有寡核苷酸探针的膜片卷曲紧成棒状示意图；

图4为实施例一将多孔棒粘合固定在聚四氟乙烯膜上示意图；

图5为实施例一寡核苷酸探针多孔棒-聚四氟乙烯膜复合体示意图；

图6为实施例一卷曲折叠式寡核苷酸多孔棒微阵列芯片棒示意图；

图7为实施例一将卷曲折叠式寡核苷酸多孔棒微阵列芯片棒切片，得到寡核苷酸芯片示意图；

图8为实施例二16张表面含有-CHO活性官能团的薄膜示意图；

图9为实施例二将膜片浸泡在容器示意图；

图10为实施例二将得到表面具有寡核苷酸探针的膜片卷曲紧成棒状示意图；

图11为实施例二将多孔棒粘合固定在聚四氟乙烯膜上示意图；

图12为实施例二寡核苷酸探针多孔棒-聚四氟乙烯膜复合体示意图；

图13为实施例二卷曲折叠式寡核苷酸多孔棒微阵列芯片棒示意图；

图14为实施例二将卷曲折叠式寡核苷酸多孔棒微阵列芯片棒切片，得到寡核苷酸芯片示意图。

具体实施方式

应该特别指出的是：在以下实施例中，寡核苷酸所含碱基个数为8，而所合成的寡核苷酸微阵列点阵数为16，纯粹只是为了简单明了地说明原理，并不受此限制，实际需求中寡核苷酸所含碱基个数可以多至任何现有DNA合成仪所能达到的数目，而微阵列点阵总数及单位面积内点阵点数目可以很高，能达到的水平完全取决于多孔微小棒体的大小。还应该指出的是，对多孔棒材的材质要求并没有明确的限制，只要求它们在DNA合成过程中除利用表面功能基团偶联第一个碱基或固定DNA探针外，与所用试剂相互之间没有化学作用即可，其它方面并没有什么特别要求，可以是任何合适的有机或无机材料。例如玻璃纤维、聚脂纤维、功能化的聚四氟乙烯、功能化的聚丙稀、尼龙等天然和人造纤维等。

实施例一：

在一薄膜上原位合成寡核苷酸，再将薄膜卷曲成多孔微棒，然后将多孔微棒粘合在惰性柔软膜上并卷曲成卷曲折叠式寡核苷酸多孔棒微阵列芯片棒，然后切片制备相应的基因芯片。具体步骤如下：

(1)合成带有预设计的寡核苷酸探针的膜片。图1为16张表面含有-OH、-NH₂等活性官能团的薄膜示意图，编号为1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16。在其上分别合成寡核苷酸探针为：

1、a：ATCGG TAC

2、b：TCGAC ATG

3、c：CGATT GAC

4、d：TCGAT CCA

5、e： ATGGA TTA

6、f： GACTA AAT

7、g： CCATG CTA

8、h： GGCTA TTG

9、I： TCGTA GCA

10、j：AATGA CGA

11、k：TTCGA ATG

12、l：CGTAA CGA

13、m：CCTAG ATG

14、n：CGGCG TTA

15、o：ATGCA ATC

16、p：TAGAG TAG

合成时，先配制好DNA合成试剂单体dA、dT、dC、dG的溶液。然后如图2所示，将欲合成第一个碱基是A的膜片(1，5，10，15)浸泡在容器17的dA溶液中，将欲合成第一个碱基是T的膜片(2，4，9，11，16)浸泡在容器18的dT溶液中，将欲合成第一个碱基是C的膜片(3，7，12，13，14)浸泡在容器19的dC溶液中，将欲合成第一个碱基是G的膜片(6，8)浸泡在容器20的dG溶液中，反应两分钟后，取出，然后经洗涤、氧化、洗涤、脱保护和洗涤过程后，第一个循环结束，所有膜片第一个碱基合成结束。依此，完成所有膜片第二至第八个碱基的合成，得到表面合成有相应序列a、b、c、d、………p的膜片。

(2)如图3，将步骤(1)中得到的表面具有寡核苷酸探针的膜片卷曲紧成棒状1’、2’、3’、4’、……16’。

(3)如图4和图5，将多孔棒1’、2’、3’、4’、……16’粘合固定在聚四氟乙烯膜上21上，构成一寡核苷酸探针多孔棒-聚四氟乙烯膜复合体21’。

(4)如图6，将21’折叠卷曲，并在外面再以聚四氟乙烯膜粘合固定，得到卷曲折叠式寡核苷酸多孔棒微阵列芯片棒22。

(5)如图7，将卷曲折叠式寡核苷酸多孔棒微阵列芯片棒22切片，得到寡核苷酸芯片23。

实施例二：

在薄膜上共价偶联固定已经预先合成好的寡核苷酸探针，再将薄膜卷曲成多孔微棒，然后将多孔微棒粘合在惰性柔软膜上并卷曲成卷曲折叠式寡核苷酸多孔棒微阵列芯片棒，然后切片制备相应的基因芯片。具体步骤如下：

(1)图8为16张表面含有-CHO活性官能团的薄膜，编号为1”-16”。如图9，将这些薄膜分别浸入容器24，25，26，……，38，39所盛的5’端修饰有-NH₂基团的探针a，b，c，……，o，p溶液中，通过-CHO活性官能团与寡核苷酸探针5’端修饰的-NH₂基团的之间生成席夫碱结构，在这些膜片上分别共价固定如同实施一中的寡核苷酸探针：

1”、a： ATCGG TAC

2”、b： TCGAC ATG

3”、c： CGATT GAC

4”、d： TCGAT CCA

5”、e： ATGGA TTA

6”、f： GACTA AAT

7”、g： CCATG CTA

8”、h： GGCTA TTG

9”、i： TCGTA GCA

10”、j：AATGA CGA

11”、k：TTCGA ATG

12”、l：CGTAA CGA

13”、m：CCTAG ATG

14”、n：CGGCG TTA

15”、o：ATGCA ATC

16”、p：TAGAG TAG

(2)如图10所示，将步骤(1)中得到的表面具有寡核苷酸探针的膜片卷曲紧成棒状1”、2”、3”、4”、……….15”，16”。

(3)将多孔棒1”、2”、3”、4”、……….15”，16”粘合固定在聚四氟乙烯膜上40上(如图11所示)，构成一寡核苷酸探针多孔棒-聚四氟乙烯膜复合体41(如图12所示)。

(4)将41折叠卷曲，并在外面再以聚四氟乙烯膜粘合固定，得卷曲折叠式寡核苷酸多孔棒微阵列芯片棒42(如图13所示)。

(5)将卷曲折叠式寡核苷酸多孔棒微阵列芯片棒42切片，得到寡核苷酸芯片43(如图14所示)。

实施例三：

在多孔微棒上原位合成寡核苷酸，然后将多孔微棒粘合在惰性柔软膜上并卷曲成卷曲折叠式寡核苷酸多孔棒微阵列芯片棒，然后切片制备相应的基因芯片。具体步骤如实施例一，只是直接以多孔微棒替代实施例一中的薄膜。

实施例四：

在多孔微棒上直接共价偶联固定已经预先合成好的寡核苷酸探针，再将固定有寡核苷酸探针多孔微棒粘合在惰性柔软膜上并卷曲成卷曲折叠式寡核苷酸多孔棒微阵列芯片棒，然后切片制备相应的基因芯片。具体步骤同实施例三，但直接以多孔微棒替代实施例二中的薄膜。

以上实施例的显著优点是所提出的卷曲折叠式寡核苷酸多孔棒微阵列芯片棒完全免除了现有寡核苷酸微阵列原位合成技术中昂贵而烦琐的掩模制作过程和重复定位对准装置，当探针密度不是特别高时，特别实用、高效、简洁而成本低廉。由于在溶液中反应，不仅保障了极高的偶联效率，有利于提高工效，而且所耗试剂甚微，这两方面的优点显著降低了成本。总之，可以廉价高效地得到或者覆盖大量不同的化合物。此外，还有一个显著的优点是，由于采用折叠式得到多孔棒状微阵列，得到的芯片探针阵点之间只有起固定作用的薄膜相连，阵点之间其它区域没有任何填料，所以完全没有背景荧光和其它背景信号，特别方便应用光、电、热、磁、声、纳米技术或化学等方法等进行检测。利用这些不同的化合物可以进行大量的基因或者蛋白等生物化学信息的定性或定量分析。例如可用普通光学显微镜、激光共聚焦显微镜、CCD观察或表面激元共振(SPR)，表面干涉反射(RIFS)、纳米颗粒标记检测(如金标-银染)、石英晶振等光学、电学技术和化学方法进行检测，大大提高工作效率，减少试剂用量，真正做到快速、实时、准确、自动化和无污染。它可用于化合物及其组合、生物分子或药物的高通量筛选，传统药物的现代化研究，以及基因组或cDNA文库的筛选，新基因的发现和基因功能的研究，蛋白质组学的研究，以及临床检测等。

本发明将大大加快新药开发的速度，减少开发成本，提高效率和准确性，而且对传统药物(包括中药)的现代化具有重要的价值。还将极大地推动生物芯片普及到普通临床检验或其它分析监测部门。

Claims (7)

1.一种卷曲折叠式化合物微阵列芯片棒，其特征在于按卷曲折叠式化合物微阵列的方法，将基因芯片微生物装置卷曲成卷曲式化合物微阵列棒，卷曲式化合物微阵列棒包括多孔棒和粘合膜，所述多孔棒可以是由薄膜卷曲而成的，也可以是直接用现成的多孔微棒，在每根多孔棒上通过化学方法附着固定有一种化合物，而且所述多孔棒是按照预定排布规律粘合在粘合膜上，然后将粘合有多孔棒的膜卷曲折叠成棒状，构成多孔棒阵列，将多孔棒阵列进行切片，每一切片即为一张化合物微阵列芯片。

2.根据权利要求1所述的一种卷曲折叠式化合物微阵列芯片棒，其特征还在于：所述薄膜和多孔微棒自身带有-OH、-NH₂、-COOH、-SH等功能基团，也可以通过功能化修饰如等离子处理改性、化学接枝、水解等改性方法而带有上述功能基团。

3.根据权利要求1或2所述的一种卷曲折叠式化合物微阵列芯片棒，其特征还在于：薄膜和多孔微棒的材质没有明确的限制，可以是任何合适的有机或无机材料。

4.根据权利要求1或2所述的一种卷曲折叠式化合物微阵列芯片棒，其特征还在于：得到的化合物微阵列探针阵点之间只有起固定作用的薄膜相连，阵点之间其它区域没有任何填料，所以完全没有背景荧光和其它背景信号，特别方便应用光、电、热、磁、声、纳米技术或化学等方法等进行检测。

5、根据权利要求1所述的一种卷曲折叠式化合物微阵列芯片棒，其特征还在于：制备本发明卷曲折叠式化合物微阵列的方法包括以下工艺：

A)先用化学方法制备固定有化合物的多孔棒；

B)将固定有化合物的微孔棒状材料并排粘合在一柔软膜片上，然后卷曲成圆柱或折叠成四方柱，即得到化合物棒微阵列；

C)将上述化合物棒微阵列沿着横截面切片，每一切片即为一张对应的生物芯片。

6、根据权利要求5所述的一种卷曲折叠式化合物微阵列芯片棒的制作方法，其特征还在于：所述的每根多孔棒上通过化学方法附着固定有一种化合物是应用组合化学原理，在多孔棒状材料内部和表面原位合成出预设计的化合物分子，或多孔棒状材料浸渍在已经合成好的化合物溶液中负载固定上预设计合成好的化合物分子。

7、根据权利要求5所述的一种卷曲折叠式化合物微阵列芯片棒的制作方法，其特征在于：所述的每根多孔棒上通过化学方法附着固定有一种化合物是在薄膜状材料上原位合成出预设计的化合物分子，或将薄膜材料浸渍在已经合成好的化合物溶液中负载固定上预设计合成好的化合物分子，然后将薄膜状材料卷成棒状得到固定有化合物的多孔微棒。

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