CN1438327A - 活版化合物微阵列及其制备方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种生物大分子微阵列，同时还涉及其制备方法，属于生物化学分析技术领域。该微阵列包括基板和基片，基板上按照预定排布规律，固定有至少两种表面性状有别的微小块体材料，构成可以所述预定规律附着反应试剂的组合阵列压印母版；基片表面制有功能化修饰层，并通过化学偶联附着有至少一层按对应所述预定规律排布的反应试剂组合阵列压印层。制备时，将表面性状有别的微小块体材料按预定规律固定在母板基板上，构成压刷母板，再压印到基片上，进行化学偶联，得到化合物微阵列。本发明完全免除了昂贵而烦琐的掩模制作过程，操作简单，易实现自动控制，保障了极高的偶联效率，提高了效率和准确性，对传统药物的现代化具有重要的价值。

Description

活版化合物微阵列及其制备方法

技术领域

本发明涉及一种化合物微阵列，尤其是一种生物大分子微阵列，同时本发明还涉及制备化合物微阵列的方法，属于生物化学分析技术领域。

背景技术

生物芯片在生物检测、医学检验和疾病诊断、药物筛选和基因序列分析上有着极其重要的意义。传统生物检测所采用的方法包含一系列繁杂的步骤，尤其在大规模生物化合物检测和筛选方面费时、费力、成本高，不能满足需要。例如，多孔检测板(如96孔板)是现行普遍使用的一种用于医药、生化检测和筛选的常规器具。其基本方法是分别把不同蛋白质、核酸探针、细胞株、或生物组织放置或固定于不同的孔洞之中，通过加入不同的化学物，或化合物组合，或生化试剂，或被检测的生物样品，观察不同化学/生物物质的反应，进行快速并行的生化分析、临床检验、或药物筛选。其上的96个反应池彼此隔离，根据用户需要可任意选用反应池的个数。作为现行生化研究和开发中普遍使用的一种方法，由于研究对象化合物数目的庞大，使得研究过程中化合物合成或者购买需要花费大量的时间和费用。同时样品的有序排布也将花费大量的时间。

在对传统方法进行改进的过程中，以基因芯片为代表的生物芯片技术应运而生。这一技术的成熟和应用将为新药的开发和鉴定、食品和环境等生命科学相关领域带来一场革命，为生物信息的获取及分析提供强有力的手段。

基因芯片制备技术可分为点样法和原位合成法。所谓点样法，即运用各种方法(打印、喷印、点样)将预先合成的DNA探针或cDNA探针固定到玻片或其它固体载片上形成微探针阵列。原位合成则是按照预先设计的碱基序列直接将探针合成在基片上。点样法适合于低密度基因芯片的制备，稍高的探针数量即需要很高的成本(例如，当20目的探针数量达到1000条时，探针成本即在300,000元人民币左右)，因而当探针数目较多时，这一技术无法与原位合成技术想比拟，此外还有各种客观因素导致探针密度不均匀因而杂交信号不均匀的缺点。从今后大规模的批量化生产及应用前景的角度，利用高度自动化技术平台批量化制备基因芯片是重要的发展趋势，目前在国际上，已经开发了多种DNA阵列原位合成技术，但由于这样那样的不足，仅美国Affymetrix公司拥有的光脱保护原位合成制备专利技术已有规模化的基因芯片生产线为需求者提供商业芯片，其主要不足之处是特有的光脱保护方法需要制作一系列特定的光掩模，成本高，不适合小批量需求。并且对不同的用户需求和不同的基因芯片必须重新设计光掩模。

东南大学吴健雄实验室经过数年的努力，开发了分子印章接触压印DNA微阵列原位合成技术，完全采用现有最成熟的DNA合成路线，可望降低成本。美中不足是在掩模设计上和Affymetrix公司拥有的光脱保护原位合成制备专利技术一样，针对不同的用户需求和不同的基因芯片，必须重新设计掩模，此外，由于所使用的PDMS材料的的高度疏水性，因而需要对印章进行表面改性增加极性，但这种改性效果的保持具有时效性，只能保持一定时间。另一个有待进一步改进之处是受光刻材料和技术的限制，所制备的印章表面的阵点突出高度有限(理想状况可达到40μm以上，通常在10-20μm之间)，容易导致不同区域之间的交叉污染。

发明内容

本发明的目的在于：针对以上现有技术存在的不足，提出一种制备工艺简捷、成本经济、使用方便的活版，同时给出应用其制备活版化合物微阵列的方法，从而加速该技术的推广应用进程。

为了达到以上目的，本发明活版化合物微阵列的基本技术方案为：活版化合物微阵列包括基板和基片，所述基板上按照预定排布规律，固定有至少两种表面性状有别的微小块体材料，构成可以所述预定规律附着反应试剂的组合阵列压印母版；所述基片表面制有功能化修饰层，并通过化学偶联附着有至少一层按对应所述预定规律排布的反应试剂组合阵列压印层。

以上表面性状的不同可以是亲水与疏水的区别、实体与多孔体的区别，或者是高凸与低凹的区别，也可以是以上几种性状特征的相互组合。

制备本发明活版化合物微阵列的方法为：预备至少两种表面性状有别的微小块体材料(可以将整块无机或有机块体材料分割成小块，或直接应用微小无机或有机块体材料)，将微小块体材料按预定规律固定在母板基板上，构成可以预定规律附着反应试剂的组合阵列的压刷母板，再将反应试剂附着于(可以涂附或吸附)压印母板上，形成微阵列印章；对基片表面进行功能化修饰，应用组合化学原理循序将压印母版压印到基片上，进行化学偶联，得到所需的化合物微阵列。

本发明的组合压印母版完全免除了原位合成技术中昂贵而烦琐的掩模制作过程，不仅使操作简单化，易实现自动控制，而且提供了类似于液相反应环境，因而又保障了极高的偶联效率，有利于提高工效。

此外，由于具有类似于液相的反应环境，因而所耗试剂甚微，可以显著降低成本，适用于化合物及其组合、生物分子或药物的高通量筛选，传统药物的现代化研究，多疾病多人份的高通量同时检测与分析，以及基因组或cDNA文库的筛选，新基因的发现和基因功能的研究，蛋白质组学的研究等。

总之，本发明将大大加快新药开发的速度，减少开发成本，提高效率和准确性，而且对传统药物(包括中药)的现代化具有重要的价值。

附图说明

下面结合附图和具体实施方式对对本发明的技术方案作进一步详细的描述。

图1为本发明实施例一的结构示意图。

图2为本发明实施例二的结构示意图。

图3为本发明实施例三的结构示意图。

具体实施方式

应该特别指出的是：在以下实施例中，寡核苷酸所含碱基个数为8，而所合成的寡核苷酸微阵列点阵数为16，纯粹只是为了简单明了地说明原理，并不受此限制，实际需求中寡核苷酸所含碱基个数可以多至任何现有DNA合成仪所能达到的数目，而微阵列点阵总数及单位面积内点阵点数目可以很高，能达到的水平完全取决于现有微细加工水平。还应该指出的是，除了上述说明中对微小块体a和b有所要求外，对组合压印母版基材g及芯片基片材料S只要求它们与所用试剂相互之间没有化学作用即可，其它方面并没有什么特别要求，可以是任何合适的有机或无机材料。例如玻璃、功能化的聚四氟乙烯、功能化的聚丙稀、尼龙、硅片、云母、金属、陶瓷、天然和人造纤维等。实施例一：平面组合压印母版的构建及8mer 16阵点寡核苷酸化合物微阵列芯片的原位合成。

在图1中，图1-1a、b为两种微小块体材料，在基板g上构成图1-2中组合压印母版c、d、e、f。两微小块体材料a、b的立体几何形状并没有一定的限制，既可以由整块材料切割而成，也可以直接微模铸出，或直接造粒而来。两种材料中一种具有疏水性质(设为a)，另一种具有亲水性质(设为b)，其不同的表面性质可以由于自身固有性质所决定，也可以通过表面物理化学改性而来。例如等离子处理改性、化学接枝改性、表面组装改性等。

为了改善表面接触反应微环境，其中一种可以为实体，而另一种可以为多孔。当两种材料皆为实体时，两种微小块体材料表面性质必须不同，每次反应前需将反应试剂涂抹在整个压印母版表面，借助于两种微小颗粒材料表面性质的不同达到按设计要求在压印母版表面选区分布反应试剂的效果。

当其中微小块体b为多孔材料时，两种材料表面性质可以一样或类似，只需让多孔微小块体b事先吸满饱和反应试剂，在后面的压印过程中就不需再每次涂抹反应试剂。如图1-3所示，基片S表面经过功能化修饰的，修饰方法可以是化学接枝改性、等离子改性，或表面化学组装改性。当将表面分别涂有或吸满A、T、C、G反应试剂的压印母版分别压印到微阵列基片S上时，就相应在基片S上选区偶联上了A、T、C、G(参见图1-3(1)和(2))，然后更换另一套压印母版，就可偶联上第二层单体如图1-3(3)所示，…………………，依次类推，可以在微阵列基片S上偶联上若干层单体。图1-4是偶联8层单体的示意图，容易理解，如果只有四种单体，每一层就只需用a、b两种微小块体组合构件四张压印母版。当总共偶联n层单体时，只需用a、b两种微小块体组合构建n×4张压印母版。

确切些说，如图1所示，将图1-1中的两种微小块体a、b粘在基板g上，构建成图1-2中组合压印母版c、d、e、f。由于用于寡核苷酸合成的单体试剂是极性的，所以用微小块体材料b按设计要求转印反应试剂。因此，微小块体材料a表面是疏水的(如聚合二甲基硅烷PDMS)。当微小块体材料b是实体材料时，其表面应该具有相当的极性(如聚脂、聚胺脂、表面极性功能化改性PDMS、功能化聚四氟乙烯材料等)。当微小块体b是多孔材料时，则b可以是极性也可以是非极性材料。压印时，将单体反应试剂dA涂布于组合压印母版c上，然后压印到基片S上，单体A就被偶联到基片上相应的区域。类似地，将涂布有单体dT、dC和dG的组合母版d、e、f压印到基片S上，则单体T、C、G被分别转移偶联到基片上相应的区域，见图1-3。然后经洗涤、氧化、洗涤、脱保护和洗涤过程后，即可用对应于第二层的四张组合压印母版开始第二层单体的压印偶联，…………，依次循环下去，直至完成设计的全部过程，最终得到如图1-4所示的8mer点阵数为16的寡核苷酸微阵列芯片，单步偶联效率大于98％。实施例二：凸凹组合压印母版的构建及8mer 16阵点寡核苷酸化合物阵列芯片的原位合成。

本实施例如图2所示，其原理、方法及过程与实施实例一相同，但因为采用凸凹结构的组合印刷母版，凸出的高度足以防止压印时单体反应试剂对非反应区的污染，所以对应于非反应区的微小块体a的表面并不特别需要是非极性的来阻止反应单体的浸润污染。其它方面和具体操作完全等同于实施例一。最终得到如图2-5所示的8mer点阵数为16的寡核苷酸微阵列芯片。单步偶联效率大于98％。

具体来说，在图2中，将图2-1的a、b两种微小块体材料固定在基板g上构成图2-2中组合压印母版c、d、e、f。为了有效地防止压印时反应试剂对不需压印区域的污染，特地使按设计拟压印反应物的微小颗粒块体(设为b)比不压印反应物的微小块体a高一些，即压印反应试剂的微小块体b凸出于由a、b组合构建而成的组合压印母版平面。由于b凸出于表面，压印时微小块体a不会与基片接触，所以a、b可以具有相同的表面性质。为了获得最佳压印效果，a、b两种材料最好具于不同的表面性质。为了改善表面接触反应微环境，两种微小块体中，其中a可以为实体，而b可以为多孔。此时两种材料可以具有完全一样的表面性质。

当两种材料皆为实体时，每次偶联反应前需将反应试剂涂抹在整个压印母版表面，但只有凸出的微小块体b会将反应试剂压印到基片S上，当其中微小块体b是多孔材料时，只需让多孔微小块体b事先吸满饱和反应试剂，在后面的压印过程中就不需再每次涂抹反应试剂。如图2-3所示，当将表面分别涂有或吸满A、T、C、G反应试剂的压印母版分别压印到基片S上时，就相应在基片S上选区偶联上了A、T、C、G(示意图见图2-3(1)和(2))，然后更换另一套压印母版，就可偶联上第二层单体如图2-3(3)所示，………………，依次类推，可以在基片上偶联上若干层单体，…………，图2-5是偶联8层单体的示意图。当总共偶联n层单体时，只需用a、b两种微小块体组合构建n×4张压印母版。实施例三：具有微沟槽及储液槽之组合压印母版的构建及8mer 16阵点寡核苷酸化合物阵列芯片的原位合成。

本实施例如图3所示，其原理、方法及过程与实施例一和实施例二基本相同，但用于压印转移单体的微小块体b或b′是多孔的，对其表面是否为极性则没有严格的要求。整个组合印刷母版上的所有多孔微小块体由基板上的微细沟槽相互连接与贯通。又因组合压印基板上具有储液槽及便于液体浸润与流动的微沟槽，所以在整个寡核苷酸微阵列芯片制备前先通过组合印刷基板上的储液槽上的小孔将槽内注满反应单体，反应单体即通过微沟槽充满于多孔微小块体b或b′中，芯片制备过程中所耗又可由储液槽中储备之单体溶液经由微细沟槽得到补充，所以此实施例除了具有实施例一和二的各种优点外，更有反应试剂分布极其理想且整个芯片原位合成过程中不需补充单体反应试剂的特点。对反应单体的控制变得非常简单易行，其它方面和具体操作完全等同于实施例一。最终得到如图3-5所示的8mer点阵数为16的寡核苷酸微阵列芯片。单步偶联效率大于98％。

结合图3更具体些说，为了更好地避免压印时反应试剂对非压印区的污染以及避免整个反应过程中不断补充试剂的烦琐，本实施例不仅用于压印偶联单体到芯片基片上的微小块体b是多孔的，还特别采用了图3-1中g′和g″所示的组合印刷基板。特别地，在组合压印母版基底g′和g″底面表面具有微沟槽wgc，即可用于储存试剂，又可吸收压印时挤出的试剂。而在基板g″一侧更设有密闭储液槽cyc用于储备反应试剂，储液槽cyc上有一可以打开和封闭的小孔cyk用于重新注入试剂。此储液槽cyc的设置使得具有更好的缓冲调节作用，不仅可不断通过基板上的微沟槽wgc向基板上的多孔微小块体补充消耗的反应液，而且又可更好地吸收压印时挤出的试剂。这样设计便于反应试剂在多孔微小块体b中的分配和不断充填，图3-1a、b及b′为三种微小块体材料，a和b一样高，b′比b高，在基板g′和g″上构成图3-2组合压印母版a、d、e、f和图3-3组合压印母版c′、d′、e′、f′。实际上a、b、b′其立体几何形状并没有一定的限制，它们可以是由整块材料切割而来，也可以直接微铸模而来，或直接造粒而来。但为了有效地防止压印时反应试剂对不需压印区域的污染，特地使按设计拟压印反应物的微小颗粒块体(设为b′)比不压印反应物的微小块体a高一些，即压印反应试剂的微小块体b′凸出于由a、b′组合构建而成的组合压印母版平面。由于b′凸出于表面，压印时微小块体a不会与基片接触，所以a、b′可以具有相同的表面性质。为了获得最佳压印效果，a、b′两种材料最好具于不同的表面性质，即，可以一种具有疏水性质(设为a)，另一种具有亲水性质(设为b′，此时反应物为极性试剂；若反应物为非极性试剂，则应使微小块体a表面为极性，微小块体b′表面为非极性)，两种材料不同的表面性质，可以是由于自身固有性质所决定，也可以是通过表面物理化学改性而来，例如等离子处理改性、化学接枝改性、表面组装改性等。为了改善表面接触反应微环境，两种微小块体中，其中a可以为实体，而b′则为多孔。压印时，先将多孔微小块体b′事先吸满饱和反应试剂，在后面的压印过程中就不需再补充反应试剂。只有凸出的微小块体b′会将反应试剂压印到基片S上。消耗的反应试剂由储液槽通过组合压印母版上的微小沟槽不断补充到多孔微小块体a中，如图3-4所示，当将分别吸满A、T、C、G反应试剂的压印母版分别压印到基片S上时，就相应在基片S上按设计要求选区偶联上了A、T、C、G，示意图见图3-4(1)和(2))，然后更换另一套压印母版，就可偶联上第二层单体如图3-4(3)所示，………，类似地，可以在基片上偶联上若干层单体，图3-5是偶联8层单体的示意图，很容易理解，如果只有四种单体，每一层就只需用a、b或b′两种微小块体组合构建四张压印母版。当总共偶联n层单体时，只需用a、b或b′两种微小块体组合构建n×4张压印母版。

总而言之，以上实施例通过将整块材料分割成小块，或直接应用微小块体材料，并将这些微小块体材料按预先设计的方案进行组合，构成一系列组合平面或凹凸结构母版。不需要经过光刻等复杂过程来制备压印母版，特别快捷，特别简单方便；需要的压印位点对反应试剂具有很高的亲和性，因而反应效率类似于均相体系。微小块体是微孔材料时，由于反应试剂储存于微孔内，压印受到挤压作用会充满于界面，因而获得一个类似于液相过程的反应环境，从而保证了很高的偶联效率。应用上述组合母版，可以十分快捷低廉地制备化合物尤其是生物大分子化合物微阵列。

以上实施例的显著优点是所提出的组合压印母版可以完全免除现有寡核苷酸微阵列原位合成技术中昂贵而烦琐的掩模制作过程，当探针密度不是特别高时，特别实用、高效、简洁而成本低廉；而所提出的微孔压印母版因可储存试剂又可免除现有分子印章法由于试剂的挥发须反复涂抹试剂并且难于控制试剂挥发和压印最佳时刻的不足之处，不仅使操作简单化，易实现自动控制，而且提供了类似于液相反应环境，因而又保障了极高的偶联效率，有利于提高工效。此外，由于具有类似于液相的反应环境，因而所耗试剂甚微，可以显著降低成本。还可采用光、声、电、磁等方法加速反应过程。总之，可以廉价高效地在基片表面同时合成或者覆盖大量不同的化合物。利用这些不同的化合物可以进行大量的基因或者蛋白等生物化学信息的定性或定量分析，所得结果可以用光、电、热、声、纳米技术或化学等方法进行检测。例如可用普通光学显微镜、激光共聚焦显微镜、CCD观察或表面激元共振(SPR)，表面干涉反射(RIFS)、纳米颗粒标记检测(如金标-银染)、石英晶振等光学、电学技术和化学方法进行检测，大大提高工作效率，减少试剂用量，真正做到快速、实时、准确、自动化和无污染。它可用于化合物及其组合、生物分子或药物的高通量筛选，多疾病多人份的高通量同时检测与分析，传统药物的现代化研究，以及基因组或cDNA文库的筛选，新基因的发现和基因功能的研究，蛋白质组学的研究等。

本发明将大大加快新药开发的速度，减少开发成本，提高效率和准确性，而且对传统药物(包括中药)的现代化具有重要的价值。

Claims (9)

1.一种活版化合物微阵列，包括基板和基片，其特征在于：所述基板上按照预定排布规律，固定有至少两种表面性状有别的微小块体材料，构成可以所述预定规律附着反应试剂的组合阵列压印母版；所述基片表面制有功能化修饰层，并通过化学偶联附着有至少一层按对应所述预定规律排布的反应试剂组合阵列压印层。

2.根据权利要求1所述活版化合物微阵列，其特征在于：所述微小块体材料分别为亲水材料和疏水材料，所述压印母版为平面组合压印母版。

3.根据权利要求1所述活版化合物微阵列，其特征在于：所述微小块体材料分别为高凸材料和低凹材料，所述压印母版为凹凸组合压印母版。

4.根据权利要求1、2或3所述活版化合物微阵列，其特征在于：所述微小块体材料分别为实体材料和多孔材料。

5.根据权利要求4所述活版化合物微阵列，其特征在于：所述基板表面制有微沟槽，所述微沟槽与有多孔微小块体相互连接贯通。

6.根据权利要求5所述活版化合物微阵列，其特征在于：所述基板表面一侧设有密闭储液槽，所述储液槽上有注入试剂的小孔。

7.一种活版化合物微阵列的制备方法，其特征在于：预备至少两种表面性状有别的微小块体材料，将微小块体材料按预定规律固定在母板基板上，构成可以预定规律附着反应试剂的组合阵列压刷母板，再将反应试剂附着于压刷母板上，形成微阵列印章；对基片表面进行功能化修饰，应用组合化学原理循序将印刷母版压印到基片上，进行化学偶联，得到所需的化合物微阵列。

8.根据权利要求7所述活版化合物微阵列的制备方法，其特征在于：所述微小块体材料的表面性状差异通过功能化修饰获得。

9.根据权利要求7或8所述活版化合物微阵列的制备方法，其特征在于：所述功能化修饰为等离子处理改性、化学接枝改性或表面组装改性。

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