CN101280270B - 一种中高密度生物芯片原位合成仪 - Google Patents

Abstract

一种中高密度生物芯片原位合成仪，属于生物芯片制备技术领域，利用该设备可以实现自动化、规模化原位合成生产廉价、可靠、质量高的基因芯片和多肽芯片。仪器设备整体上由生物芯片合成平台和三维直角机器人系统两部分组成，生物芯片合成平台嵌入固定在三维直角机器人系统的底部。其中三维直角机器人系统由直线电机伺服系统和机械操作手构成，而直线电机伺服系统具体由直线电机X-Y平台、伺服驱动器、PC机、伺服运动控制卡构成。机械操作手安装固定于直线电机X-Y平台的定位头上，由小型精密气动滑台和真空吸盘组合而成，实现抓取玻片和压印的功能。生物芯片合成平台主要由底座以及其上设计加工的四个构造相同的微流体自驱动装置和多功能喷淋池以及自动加液装置构成。微流体自驱动装置通过加液管与自动加液装置相连。

Description

一种中高密度生物芯片原位合成仪

技术领域

本发明涉及一种中高密度生物芯片原位合成仪，属于生物芯片制备技术领域。

背景技术

DNA芯片技术是90年代兴起的一种对成百上千甚至上万个基因同时进行检测的新技术，具有高通量和并行性的特点，在基因表达谱分析、检测基因突变和多态性分析、药物筛选以及序列分析等诸多领域呈现出广泛的应用前景。随着研究的不断深入和技术的不断发展，生物芯片必将在生命科学研究领域发挥其非凡的作用。

目前，基因芯片的制备技术主要有原位合成法和直接点样法两种。点样法是指运用各种方法(打印、喷印等)将预先合成的DNA探针或cDNA探针固定到玻片或其它固体载片上形成微探针阵列。与原位合成法相比，点样法较简单，只需将预先制备好的寡核苷酸或cDNA等样品通过自动点样装置点于经特殊处理的玻璃片或其它材料上即可。点样法又分为打印和喷印两种方法：其中打印法的优点是探针密度相对较高，通常可打印2500个探针/cm²，缺点是定量准确性及重现性不好，打印针容易堵塞，且使用寿命有限。喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长，其缺点是喷印的斑点大，因此探针密度低，通常只有400位点/cm²。无论是采用打印或者喷印的方法，都需要事先大量地制备纯化、量化、分类PCR产物。采用点样法制备密度基因芯片的过程中，当探针数量较大时，所需探针成本也随着增加。例如，当20目的探针数量达到1000条时，探针成本即在100,000元人民币左右。因而当探针数目较多时，这一技术无法与原位合成技术相比拟，此外还有各种客观因素导致探针密度不均匀因而杂交信号不均匀的缺点。

原位合成是按照预先设计的碱基序列直接将探针合成在基片上，主要有光蚀刻原位合成和喷印原位合成两种，目前只有美国Affymetrix公司拥有的光脱保护原位合成制备专利技术已实现基因芯片的规模化生产，该技术主要不足之处是特有的光脱保护方法需要制作一系列特定的光掩模，并且对不同的用户需求和不同的基因芯片必须重新设计光掩，成本相当高，不适合小批量需求；此外，光蚀刻法每步合成率较低，一般为95％左右，合成30nt产率仅20％，还需要特殊的光脱保护试剂。

原位喷印合成技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此无需特殊制备的化学试剂，其原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。喷印法每步偶联率达99％以上，合成30nt产率可达74％，从这个意义上说喷印法特异性应比光刻法高。此外，它并不需特殊的合成试剂。

另外，国内东南大学吴健雄实验室经过数年的努力，开发了分子印章接触压印DNA微阵列原位合成技术，完全采用现有最成熟的DNA合成路线，可望降低成本。但美中不足的是在掩模设计上和Affymetrix公司拥有的光脱保护原位合成制备专利技术一样，针对不同的用户需求和不同的基因芯片，必须重新设计掩模。

本课题组提出和研究了活版印刷原位合成中低密度基因芯片新方法，可望避免现有原位合成方法中烦琐而昂贵的掩模制备过程及点样法中昂贵的探针修饰或标记成本，针对不同用户需求只需重新排列印刷模版即可，易实现自动控制和精确定位，合成速度快，在较短时间内就可快速印刷合成出探针分布均匀的大批量基因芯片。但主要存在的缺陷就是模版的设计需要手动实现，过程繁琐。尤其是当芯片密度较高时，手动排版不仅所需时间长，而且非常容易出错。在上述基础之上，课题组研究了一种微流体自驱动原位合成压印生物芯片新方法。

发明内容

本发明其目的是针对现有技术的缺点而研究开发的一套制备生物芯片的仪器设备。利用该设备可以实现自动化、规模化原位合成生产廉价、可靠、质量高的中高密度基因芯片和多肽芯片。

实现上述发明的技术方案是：用于制备生物芯片的仪器设备整体上由生物芯片合成平台和三维直角机器人系统两部分组成，生物芯片合成平台嵌入固定在三维直角机器人系统的底部。其中三维直角机器人系统由直线电机伺服系统和机械操作手构成，而直线电机伺服系统具体由直线电机X-Y平台、伺服驱动器、PC机、伺服运动控制卡构成。机械操作手安装固定于直线电机X-Y平台的定位头上，由小型精密气动滑台和真空吸盘组合而成，实现抓取玻片和压印的功能。生物芯片合成平台主要由底座以及其上设计加工的四个构造相同的微流体自驱动装置和多功能喷淋池以及自动加液装置构成。微流体自驱动装置通过一个通道或细管与自动加液装置相连。

所述技术方案中：

伺服运动控制卡插入PC机的基于PCI总线的插槽中，构成主从式控制结构，PC计算机负责人机界面的管理和控制系统的实时监控，伺服运动控制卡则具体完成运动控制的所有细节，包括运动脉冲数的电机旋转方向信号的输出，自动升降速处理，原点和限位信号的检测等。整个控制系统的开发可以在Visual Basic或者Visual C++开发环境中完成。

每个微流体自驱动装置由碱基液体存储池，池盖和具有微纳米通道的纤维管或者其他金属管组成，纤维管穿过具有一定厚度的池盖而垂直固定在底座上，其下端深入存储池而接近其底面，其上端露出底座上层表面一定距离。四个碱基液体存储池分别用来存储A，T，C，G四种不同的单体液体。

所述多功能喷淋池上设计有3排喷淋孔，每排均采用由下而上喷淋的方式。为保证反应液体能够充分接触整个玻片下表面，采取多个并排喷液孔，即多功能喷淋池的表面有3排类似的喷淋装置，分别用于清洗、氧化和脱保护反应。

自动加液装置由储液池，电磁药液阀，加液瓶，加液管和加压气管构成。加液管穿过加液瓶的密封口而深入到瓶内，其中加压气管与高压氩气相通以便需要时驱动液体到储液池。加液瓶通过一定口径的加液管与储液池相连，药液电磁阀控制加液管的导通和截止，导通时即向储液池压入碱基液体。

与其他相关技术和设备制备生物芯片相比较，采用本发明制备生物芯片有以下几个方面的明显优点：

1、采用本发明的仪器制备基因芯片，避免了现有原位合成方法中烦琐而昂贵的掩模制作过程以及点样法中探针的修饰和标记成本。

2、真空微孔纤维管的毛细效应带来了类似于液相的压印反应环境，则赋予了合成探针极高的偶联效率和探针位点的信号均匀性，从而确保了获取生物信息的准确性。

3、也避免了活版印刷原位合成基因芯片技术中模板的设计和排版过程。无需对模板进行手工或者额外的机械手进行排版，只需在计算机接口程序中输入一定的探针布局即可。

4、无需提前制备大量制备，纯化，量化，分类PCR产物，因而芯片制备工序得到简化。同时，采用传统的DNA固相合成方法，不需要购买特殊的专利试剂，芯片的制备成本得以降低。

附图说明

图1是本发明的整体结构示意图。

图2是本发明生物芯片合成平台以及三维直角机器人系统的俯视图。

图3是本发明生物芯片合成平台以及三维直角机器人系统的主视图。

图4是本发明生物芯片合成平台以及三维直角机器人系统的左视图。

图5是本发明中多功能喷淋池的原理和结构示意图。

图6是本发明中自动加液装置和微流体自驱动体的结构示意图。

图7是本发明生物芯片合成原理的流程图。

图8是本发明生物芯循环压印的示意图。

下面结合附图和实施方式对本发明作进一步说明。

具体实施方式

见图1至4，本发明主要由生物芯片合成平台和三维直角机器人系统两部分组成，生物芯片合成平台嵌入固定在三维直角机器人系统的底部。其中三维直角机器人系统由直线电机伺服系统和机械操作手14构成。直线电机伺服系统具体由直线电机X-Y平台15、伺服驱动器39、PC机25、伺服运动控制卡26构成，伺服运动控制卡26插入PC机主板上的PCI插槽，伺服驱动器39通过专用的数据传输线27与PC机上的COM串口相连，而伺服驱动器39通过另一条传输线与直线电机X-Y平台上专用接口相连，这样就实现通过PC终端操作实现芯片合成的定位过程。机械操作手14安装固定于直线电机X-Y平台15的定位头16上，由小型精密气动滑台60和真空吸盘13组合而成，实现抓取玻片12和压印的功能。见图1至3，在生物芯片合成平台的底座1中间设计加工了四个构造相同的微流体自驱动装置6，7，8，9，它们底部的液体存储池分别与位于底座左下方的自动加液装置2，3，4，5通过加液管相连，自动加液装置2，3，4，5瓶中分别盛有A，T，C，G四种碱基单体液。在微流体自驱动装置的右侧设有两个矩形槽，分别是取片槽10和放片槽11，取片槽10用来放置经过表面处理的载玻片，而放片槽则用来放置合成后的生物芯片。

所述自动加液装置和微流体自驱动装置的具体结构如图6所示，自动加液装置由储液池34，加液瓶37，微型液位计45，电磁药液阀48，加液管46和通气管51构成。加液管46一端经过加液瓶37的密封盖伸入到加液瓶底端，而与高压氩气相接的通气管51一端则位于加液瓶37上端，位于瓶内液面之上。加液管另一端则与微流体自驱动装置的储液池相连，在加液管46的中间安装一个电磁药液阀48。微型液位计45安装于储液池34的边上，根据储池液面的高低发出信号来控制电磁药液阀的开关。具体工作过程如下所述：

当储液池液面低于下限h1时，微型液位计46检测到一个信号，通过接口电路读入PC机，而PC机根据这一信号执行程序控制给电磁药液阀48，使之处于导通状态，瓶内的碱基液体在高压氩气的作用下通过加液管46自动流向储液池34；当储液池内液面达到上限h2时，微型液位计46检测到信号并发送给电磁药液阀48，使其截止，加液即停止。这样，通过自动加液装置，能保证储液池中始终保持一定量的碱基液体，从而确保纤维管顶端有充分的碱基液体用于芯片压印。

微流体自驱动装置6通过加液管与自动加液装置2相连。具有微纳米通道的纤维管35被牢固地夹装在微流体自驱动装置的池盖47上，其底端浸在存储池34的碱基液体中，顶端露出一定距离。存储池中的液体由于纤维管35的毛细效应而源源不断地传输到纤维管顶端，而且均匀而不富余。当玻璃载片下表面与其压印接触时，碱基液体就黏附其上，经过多次循环压印后则形成一些列微点阵列。

在生物芯片合成平台的中央设计加工了两个多功能喷淋池，分别是清洗池22，氧化和脱保护池23，它们中间分别加工了并排的清洗喷淋孔21，氧化喷淋孔40和脱保护喷淋孔41，而在每个多功能的反应池右端则是废液池42，喷淋到载玻片的液体下落后流入废液池，通过废液池底部的三个小孔排出。其中并排喷淋孔21，40，41分别经过塑料管与瓶子19，18，17相通，每个瓶子分别装有一定量的清洗液，氧化液和脱保护液。

下面对多功能喷淋池的功能实现作进一步说明：

见图5，玻璃载片12压印完一层后，通过机械手的控制运动到多功能喷淋池上方，使PC机25控制的电磁阀28导通，氮气瓶33中的高压氮气则通过管子进入装清洗液的瓶子17形成高压，瓶中的清洗液就通过另一个管子被压入多功能喷淋池底部的缓冲池21，液体最终经喷淋孔30均匀而充分地喷淋玻璃载片12。控制玻璃载片使其朝着与并排喷淋孔所在方向垂直移动，直到玻片下表面完全被喷淋，才关闭电磁阀28。用同样的方式可实现芯片的清洗、氧化和脱保护反应，只是在喷淋孔出来的液体种类不同而已。

下面结合芯片原位合成的原理对仪器的整个工作过程进行说明：

用户通过计算机执行已经编写好的应用程序操作芯片合成过程，初始化完成后，在用户接口程序中输入所要合成的碱基序列后，即可开始芯片的合成。芯片合成原理和流程见图7和图8，这里以4×4微阵列芯片加以说明，现实中芯片合成的密度完全取决于三维直角机器人系统的定位精度和微流体自驱动装置中纤维管的粗细程度。

机械操作手14运动到取片槽上方，向下抓取载玻片。然后开始压印，先后顺序依次是A，T，C，G：载玻片12运动到微流体自驱动装置6上方，然后根据用户输入的微阵列碱基序列，先向下压印一系列A点，得到的结果如图8中a所示；然后定位平移到微流体自驱动装置7上方，压印碱基阵列T，得到的结果如图8中b所示；接着运动到微流体自驱动装置8上方，压印碱基阵列C，压印后的结果如图8中c所示，最后运动到上方，压印碱基阵列T，这样完成芯片的第一层压印，最后结果如图8中d所示。压印完一层后，将载玻片移动到多功能喷淋池，进行清洗-氧化-清洗-脱保护-清洗的循环喷淋，接着开始芯片的第二层压印，完成相同位点上碱基之间的偶联反应。循环这个过程，直到完成用户所要求的探针长度(芯片压印的层数)为止，最终得到所需的基因芯片，最后将合成完的芯片放片槽中。

Claims (1)

1.一种中高密度生物芯片原位合成仪，其特征在于：该仪器由生物芯片合成平台和三维直角机器人系统组成，所述生物芯片合成平台嵌入固定在三维直角机器人系统的底部；所述三维直角机器人系统由直线电机伺服系统和机械操作手构成；所述直线电机伺服系统由直线电机X-Y平台、伺服驱动器、PC机、伺服运动控制卡构成；

所述伺服运动控制卡插入PC机主板上的PCI插槽，所述伺服驱动器通过专用的数据传输线与PC机上的COM串口相连，而伺服驱动器通过另一条传输线与直线电机X-Y平台上专用接口相连，通过PC终端操作实现芯片合成的定位过程；

所述机械操作手安装固定于直线电机X-Y平台的定位头上，由小型精密气动滑台和真空吸盘组合而成，实现抓取玻片和压印的功能；

所述生物芯片合成平台的底座中间设有四个构造相同的微流体自驱动装置，所述微流体自驱动装置由液体存储池、池盖和具有微纳米通道的纤维管组成；所述纤维管被夹装在微流体自驱动装置的池盖上，其底端浸在液体存储池的碱基液体中，顶端露出一定距离；微流体自驱动装置底部的液体存储池分别与位于底座左下方的四个自动加液装置通过加液管相连，自动加液装置瓶中分别盛有A，T，C，G四种碱基单体液体；在微流体自驱动装置的右侧设有两个矩形槽，分别是取片槽和放片槽；

所述自动加液装置由储液池，加液瓶，微型液位计，电磁药液阀，加液管和通气管构成；加液管一端经过加液瓶的密封盖伸入到加液瓶底端，而与高压氩气相接的通气管一端位于加液瓶上端，位于瓶内液面之上；加液管另一端与微流体自驱动装置的液体存储池相连，在加液管的中间安装一个电磁药液阀；微型液位计安装于储液池的边上，根据储液池液面的高低发出信号来控制电磁药液阀的开关；

所述生物芯片合成平台的中央设有两个多功能喷淋池，分别是清洗池，氧化和脱保护池，它们中间分别加工了并排的清洗喷淋孔，氧化喷淋孔和脱保护喷淋孔，分别经过塑料管与装有清洗液，氧化液和脱保护液的瓶子相通；而在每个多功能喷淋池的右端是废液池，喷淋到载玻片的液体下落后流入废液池，通过废液池底部的三个小孔排出。

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