CN102628081A - 一种微流体自驱动原位压印生物芯片新方法 - Google Patents

Abstract

一种微流体自驱动原位压印合成生物芯片新方法，属于生物化学分析技术领域。采用4根相同长度且具有微纳米通道的纤维管作为微流体的自驱动装置，四种碱基单体在纤维管的毛细效应作用下从单体储存池经过微纳米通道源源不断地传输到顶端，富足而不过量。机械手抓取载波片自动由上往下压印于纤维管顶端，碱基液就黏附于玻璃载片下表面，以相同方式控制玻璃载片在特定位置压印于四根纤维管，在玻璃载片下表面压印得到一层单体微阵列。经过喷淋清洗、氧化、托保护反应后，接着压印第二层。多个循环压印之后，得到任意探针长度的生物芯片。本发明适合采用自动化设备和装置来实现芯片原位压印合成，在现有条件下探针密度可达400位点/cm²。

Description

一种微流体自驱动原位压印生物芯片新方法

技术领域

本发明涉及一种微流体自驱动原位合成压印生物芯片新方法，属于生物化学分析技术领域。

背景技术

基因芯片的制备技术主要有原位合成法和直接点样法两种。点样法是指运用各种方法（打印、喷印等）将预先合成的DNA探针或cDNA探针固定到玻片或其它固体载片上形成微探针阵列。与原位合成法相比，点样法较简单，只需将预先制备好的寡核苷酸或cDNA等样品通过自动点样装置点于经特殊处理的玻璃片或其它材料上即可。点样法又分为打印和喷印两种方法：其中打印法的优点是探针密度相对较高，通常可打印2500个探针/cm²，缺点是定量准确性及重现性不好，打印针容易堵塞，且使用寿命有限。喷印法的优点是定量准确，重现性好，使用寿命长，其缺点是喷印的斑点大，因此探针密度低，通常只有400位点/cm²。无论是采用打印或者喷印的方法，都需要事先大量地制备纯化、量化、分类PCR产物。采用点样法制备密度基因芯片的过程中，当探针数量较大时，所需探针成本也随着增加。例如，当20目的探针数量达到1000条时，探针成本即在100，000元人民币左右。因而当探针数目较多时，这一技术无法与原位合成技术相比拟，此外还有各种客观因素导致探针密度不均匀因而杂交信号不均匀的缺点。

原位合成是按照预先设计的碱基序列直接将探针合成在基片上，主要有光蚀刻原位合成和喷印原位合成两种，目前只有美国Affymetrix公司拥有的光脱保护原位合成制备专利技术已实现基因芯片的规模化生产，但该技术主要不足之处是特有的光脱保护方法需要制作一系列特定的光掩模，并且对不同的用户需求和不同的基因芯片必须重新设计光掩，成本相当高，不适合小批量需求；此外，光蚀刻法每步合成率较低，一般为95 %左右，合成30 nt产率仅20 %，还需要特殊的光脱保护试剂。

原位喷印合成技术采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，因此无需特殊制备的化学试剂，其原理与喷墨打印类似，不过芯片喷印头和墨盒有多个，墨盒中装的是四种碱基等液体而不是碳粉。喷印头可在整个芯片上移动并根据芯片上不同位点探针的序列需要将特定的碱基喷印在芯片上特定位置。喷印法每步偶联率达99 %以上，合成30 nt产率可达74 %，从这个意义上说喷印法特异性应比光刻法高。此外，它并不需特殊的合成试剂。

国内东南大学吴健雄实验室经过数年的努力，开发了分子印章接触压印DNA微阵列原位合成技术，完全采用现有最成熟的DNA合成路线，可望降低成本。但美中不足的是在掩模设计上和Affymetrix公司拥有的光脱保护原位合成制备专利技术一样，针对不同的用户需求和不同的基因芯片，必须重新设计掩模。

本发明提出和研究了活版印刷原位合成中低密度基因芯片新方法，可望避免现有原位合成方法中烦琐而昂贵的掩模制备过程及点样法中昂贵的探针修饰或标记成本，针对不同用户需求只需重新排列印刷模版即可，易实现自动控制和精确定位，合成速度快，在较短时间内就可快速印刷合成出探针分布均匀的大批量基因芯片。但主要存在的缺陷就是模版的设计需要手动实现，过程繁琐。尤其是当芯片密度较高时，手动排版不仅所需时间长，而且非常容易出错。

发明内容

本发明的目的是针对现有生物芯片制备方法存在的缺陷和不足，提供一种微流体自驱动原位压印合成生物芯片新方法。本发明采用的化学原理与传统的DNA固相合成一致，在原位合成时采用真空纳米纤维管自动驱动碱基单体的自下而上传输，结合计算机技术控制载玻片进行压印。本发明依赖于自动化设备和装置来实现芯片原位压印合成，采用本发明所制备的生物芯片密度取决于纤维管直径大小以及压印头的定位精度，在现有条件下探针密度可达400位点/cm²。

实现本发明的技术方案是：采用4根相同长度且具有微纳米通道的纤维管作为微流体的自驱动装置，四种碱基单体在纤维管的毛细效应作用下从单体储存池经过微纳米通道源源不断地传输到顶端，富足而不过量，用于生物芯片压印。高定位精度的机械手抓取经过处理的玻璃载片由上往下竖直压印于纤维管顶端，碱基液就黏附于玻璃载片下表面，以相同方式控制玻璃载片在特定位置压印于四根纤维管，在玻璃载片下表面压印得到一层单体微阵列。载玻片经过喷淋清洗、氧化、托保护反应后，继续压印第二层。多个循环压印之后，即可得到任意探针长度的生物芯片。

与现有技术相比，本发明具有如下优点：

1、采用本发明所述的技术制备生物芯片，避免了现有原位合成方法中烦琐而昂贵的掩模制作过程以及点样法中探针的修饰和标记成本。

2、真空微孔纤维管的毛细效应带来了类似于液相的压印反应环境，则赋予了合成探针极高的偶联效率和探针位点的信号均匀性，从而确保了获取生物信息的准确性。

3、也避免了活版印刷原位合成基因芯片技术中模板的设计和排版过程。无需对模板进行手工或者额外的机械手进行排版，只需在计算机接口程序中输入一定的探针布局即可。

4、无需提前制备大量制备，纯化，量化，分类PCR产物，因而芯片制备工序得到简化。同时，采用传统的DNA固相合成方法，不需要购买特殊的专利试剂，芯片的制备成本得以降低。

5、本发明的适合与计算机应用技术和自动控制技术相结合，使其易于实现芯片制备的自动化，进而基因芯片制备的产业化打下基础。下面结合说明书附图对本发明的具体实施方式作进一步说明。

附图说明

图1是本发明实施过程中平台及碱基液存储池示意图；

图2是本发明实施过程中微流体自驱动原位压印生物芯片的原理示意图；

图3是本发明实施过程中第一层碱基微阵列压印过程示意图；

图4是本发明实施过程循环压印后得到基因芯片的过程示意图。

具体实施方式

实施例1： 采用本发明合成32个位点（4*8）探针长度为8的基因芯片

第一步：见图1和2，制作简易微流体自驱动装置。在一个由聚四氟乙烯材料加工而成的平台2上四个相同的的试剂存储池1，用于存放四种碱基单体。采用固定装置4在四个存储池上方固定纤维管3，取直径为0.8 mm，纤维管下端浸入存储池液面以下，上端露出0.5 cm高度，保持四个纤维管顶端在同一个水平面上。

第二步：对载玻片5下表面进行处理，使即将压印的碱基单体能够牢固黏附在玻片上。

第三步：运行自主开发的计算机软件程序，在界面中输入需要合成的基因序列以及探针长度。根据特定算法，将所输入的基因序列转换成相应的的机械手定位信号，由机械手控制的玻璃载片在特定位置进行第一层压印。压印过程如图3所示，先把A碱基位点压印于载玻片，然后压印碱基T，接着压印碱基C，最压印碱基G。

第四步：压印完成第一层碱基阵列后，将玻璃载片在多功能反应池中进行喷淋清洗、氧化、清洗、托保护、清洗等循环反应。

第五步：这样，碱基单体阵列就牢固地黏附于玻璃载片下表面，并在每个碱基上都具有活性基团，以链接下一层碱基。然后以相同的方式进行第二层碱基阵列压印。经过8次循环压印后，合成得到所需的基因芯片，如图4所示。

Claims (5)

1.一种微流体自驱动原位压印生物芯片新方法，其特征在于采用4根相同长度且具有微纳米通道的纤维管作为微流体的自驱动装置，碱基单体在纤维管的毛细效应作用下从单体液储存池经过微纳米通道源源不断地传输到顶端，高定位精度的机械手抓取载玻片由上往下竖直压印于纤维管顶端，碱基液黏附于玻璃载片下表面，以相同方式控制载玻片在特定位置压印于四根纤维管顶端，在载玻片下表面压印得到一层单体微阵列；载玻片经过喷淋清洗、氧化、托保护反应后，接着压印下一层；多个循环压印之后，即可得到任意探针长度的生物芯片。

2.根据权利要求1所述的一种微流体自驱动原位压印生物芯片新方法，其特征在于，四根纤维管除了就有微纳米通道这一特征外，必须具备一定的硬度，被载玻片压印时不能产生过大形变，以保证精确定位。

3.根据权利要求1所述的一种微流体自驱动原位压印生物芯片新方法，其特征在于所述微流体包括A、T、C、G四种碱基单体液体，为减缓试剂挥发，各单体活性溶液中添加20%异丁腈。

4.根据权利要求1所述的一种微流体自驱动原位压印生物芯片新方法，其特征在于：所述微流体自驱动是指四种碱基单体分别通过四根纤维管或其他材料的细管自动传输到顶端用于压印，纤维管以一定方式竖直固定于所述单体液存储池上方，其下端浸入单体液中。

5.根据权利要求1所述的一种微流体自驱动原位压印生物芯片新方法，其特征在于：所述机械手的精确定位以及上下升降动作可以由三维直角定位系统加以实现。

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