CN212222993U - 基于微流控冲击打印的生物检测装置 - Google Patents

Abstract

本实用新型涉及生物芯片领域，特别涉及基于微流控冲击打印的生物检测装置。该装置包括微流控芯片2、微流控打印平台和基底8。本实用新型使用的材料成本低，可以实现大规模生产，达到一次性使用目的，芯片与致动器分离，无需清洗，减小交叉污染的可能性。同时芯片最小工作体积仅为2微升，浪费的死体积在亚微升量级，试剂的消耗与浪费少，在稀有目标检测时尤其关键。本实用新型可实现液滴体积的灵活调控，通过改变打印电压，微流控芯片喷口和定点打印次数来产生的可调谐体积的液滴，大大扩宽了数字PCR系统的检测范围。本实用新型提供的装置简单，易与生物实验室常见的平板PCR仪和荧光显微镜结合完成整个数字PCR。

Description

基于微流控冲击打印的生物检测装置

技术领域

本实用新型涉及生物芯片领域，特别涉及基于微流控冲击打印的生物检测装置。

背景技术

聚合酶链式反应(PCR)自1983年出现以来已成为基因检测的黄金标准，它能够在短时间内复制大量靶基因来扩增样品浓度。其中，传统的PCR技术，如琼脂糖凝胶电泳和实时PCR，仅能进行定性和相对检测。而数字PCR技术提供单分子水平的绝对基因定量，同时也不需要与标准曲线进行比较。使用数字PCR，目标分子被极度稀释并分散到不同的反应室中进行单分子扩增，因此可以通过计数阳性反应室直接计算靶基因的拷贝，同时这也与扩增效率无关。由于其独特的绝对定量能力，高准确度和灵敏度，数字PCR在生物学研究中得到越来越广泛的应用，如稀有突变的检测，拷贝数变异，和新一代测序。

1999年，Vogelstein等人在多孔板中实施了最早的数字PCR系统。为了解决较少反应单元，样品试剂浪费和人为操纵错误的固有缺陷，微流体技术被开发用于在液滴中进行DNA扩增，因为其独特的能够有效且自动地分散小体积液滴的优势。已经建立了许多基于微流体的液滴数字PCR平台并将其商业化用于单细胞分析，早期癌症诊断和产前诊断。例如，Fluidigm和Thermal Fisher Scientific公司使用集成的微流体芯片和专门设计的硅阵列芯片，将液体物理隔离到独立的反应室中；Bio-rad公司和Raindance Technologies公司使用液滴微流体技术生产大量均匀的油包水微乳液，同时发生数万个平行反应。然而，这些商业化的数字PCR系统通常需要复杂的芯片的制造，或者需要用微型阀和泵专门在外部控制液滴产生，而且通常配备了用于信号读取的专用测试设备，设备成本较高。因此专利CN201210551846.5提出了利用多个打印喷头交替打印实现油包液滴阵列结构，实现了高效的数字PCR扩增，但是这种多喷头价格较高，不能做到一次性使用，因此更换试剂时需要进行清洗，操作较为复杂。此外，此类商用喷头需要的初始加载的试剂体积较大，最后浪费的死体积(不能被打印出的体积)较多，会浪费昂贵的生物试剂与宝贵的生物样本。专利总的来说，这些方法大都使用商用化打印喷头，存在使用成本高和交叉污染的风险，同时这些方法调节液滴体积的灵活性较低，不能实现更宽的动态检测范围，所以有必要开发实现操纵简单，成本低廉，检测范围灵活宽泛的的数字PCR系统，这对于数字PCR系统在临床应用上有着重要意义。

发明内容

有鉴于此，本实用新型提供一种基于微流控冲击打印的生物检测装置。基于微流控冲击打印的数字PCR液滴制备与DNA浓度检测的装置和方法，主要解决现有数字PCR技术中制作工艺繁琐、结构复杂、成本高昂，存在污染风险和调节液滴体积不够灵活的问题。

为了实现上述发明目的，本实用新型提供以下技术方案：

本实用新型提供了基于微流控冲击打印的生物检测装置，包括微流控芯片2、微流控打印平台和基底8；

所述微流控芯片2装载于所述微流控打印平台；

所述微流控打印平台还设置有芯片驱动器，所述芯片驱动器设置有刚性延长件4，所述刚性延长件4远离所述芯片驱动器的一端还设置有冲击头5，通过所述芯片驱动器转动所述刚性延长件4从而改变所述冲击头5与所述微流控芯片2的相对位置；

所述基底8与所述微流控芯片2对应设置，承接所述微流控芯片2打印的液滴；

还包括环境控制装置、可编程加热装置10或检测装置11中的一个或多个。

在本实用新型的一些具体实施方案中，所述微流控芯片2固定在Z轴，基底8固定在移动平台XY平面，可以通过所述微流控芯片2移动来形成液滴排列，也可以通过移动基底8来形成液滴排列。

在本实用新型的一些具体实施方案中，所述微流控芯片2包括微流控管道3和喷口，所述微流控管道3与所述喷口连通，所述喷口与所述基底8对应设置且不接触。

在本实用新型的一些具体实施方案中，所述喷口的直径为60～120μm。

在本实用新型的一些具体实施方案中，所述基底8的表面经疏水处理，所述基底8的表面接触角为60°～100°。

在本实用新型的一些具体实施方案中，所述基底8还设置有围框7，所述围框7的高度小于所述液滴的高度。

在本实用新型的一些具体实施方案中，所述生物检测装置还包括盖片9，所述围框7支撑所述盖片9。可以是先覆盖矿物油再盖上透明盖片，也可以先盖透明盖片再填充矿物油。盖上盖片后，液滴在基底与盖片之间形成液桥，三者成三明治结构。这样有利于提高液滴荧光强度的一致性，减小体积变化带来的误差。在另外的实施方案中，围框高度也可以不小于所述液滴的高度，不形成液桥，后续反应与检测依然可以进行。

在本实用新型的一些具体实施方案中，使用一次性微流控芯片，芯片所需试剂最小到微升范围，死体积在亚微升范围，同时芯片与基底使用一次性材料，都无需清洗，减小交叉污染的可能性。

在本实用新型的一些具体实施方案中，液滴产生可以从单个微流控通道 3产生，也可以由多个微流控通道3并行产生；可以提前配置好PCR体系注入微流控芯片2，也可以利用微流控芯片2将PCR反应所需的各种试剂进行片上混合。

在本实用新型的一些具体实施方案中，液滴可以是等体积，也可以是不等体积的；可以通过改变微流控打印芯片的打印电压60伏～160伏，微流控芯片2的喷口的直径为60～120μm和原位定点打印次数(液滴总体积＝次数×单个液滴体积)，实现不同体积液滴阵列，从而可以扩大检测范围。

本实用新型还提供了所述的生物检测装置在生物检测中的应用。

在本实用新型的一些具体实施方案中，所述液滴可以用于数字PCR，也可以用于其他生物检测，凡是生物领域的检测样本(包括核酸、蛋白、细胞、微生物等)均在本实用新型的保护范围之内，本实用新型在此不做限定。

在本发明的一些具体实施方案中，环境控制装置，可以利用提高环境湿度减少液滴蒸发；也可以通过控制基底温度在0-4℃和气体(如：氮气，氦气等)保护措施来减少液滴蒸发。可编程加热装置10，用来对平面基底上的液滴进行加热；可以是变温PCR，也可以是等温PCR。检测装置11可以为荧光检测装置，可以利用带有可拼接功能的荧光显微镜，也可以利用小动物成像仪，还可以在相机上安装小荧光镜头进行荧光液滴拍摄。

本实用新型还提供了基于所述生物检测装置的检测方法，包括如下步骤：

步骤1、向所述微流控芯片2中加注试剂；

步骤2、控制所述微流控打印平台，通过所述芯片驱动器转动所述刚性延长件4从而改变所述冲击头5与所述微流控芯片2的相对位置，敲击所述微流控芯片2，使所述试剂以液滴形式喷出，将液滴打印在所述基底8，形成液滴阵列；

步骤3、经所述盖片9密封所述基底8的液滴阵列；

步骤4、取所述基底8置于所述可编程加热装置10进行扩增；

步骤5、取步骤4的扩增产物经所述检测装置11检测，获得检测结果。

在本实用新型的一些具体实施方案中，所述生物检测可以为核酸检测，也可以用于其他生物样本的检测，凡是生物领域的检测样本(包括核酸、蛋白、细胞、微生物等)均在本实用新型的保护范围之内，本实用新型在此不做限定。

本实用新型公开了一种基于微流控冲击打印的数字PCR液滴制备与 DNA浓度检测方法。提出了一种利用微流控芯片打印技术将样本目标分割到平面基底上，形成皮升到纳升级体积的液滴阵列，再结合平板加热系统和荧光检测系统，完成整个数字PCR的方法，具体如下：通过微流控冲击打印方法在经过改性能够固定液滴形态的平板基片上进行液滴阵列打印，液滴大小能够通过改变微流控打印芯片的打印电压，微流控打印芯片喷口和定点打印次数而改变，同时XYZ三轴移动台控制液滴打印轨迹和图形化，最后通过覆盖油和另一块透明基板材料进行密封，经过平板PCR基因扩增仪扩增后用大视场荧光显微镜进行拍摄观察，统计阳性液滴泊松分布情况完成对目标样本的检测。整个过程中，试剂只与一次性微流控打印芯片和一次性平面基底接触，实现低成本，节省试剂，同时避免试剂的交叉污染。

附图说明

为了更清楚地说明本实用新型实施例或现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍。

图1示本实用新型微流控冲击打印平台液滴生成流程图；

图2示本实用新型的芯片最小工作体积示意图。

图3示本实用新型微流控冲击打印和移动台配合示意图；

图4示本实用新型实施例中的制备方法流程图；

图5示本实用新型实施的三明治结构，将液滴夹在两玻璃中间；

图6示本实用新型实施的平板PCR扩增示意图；

图7示本实用新型荧光检测系统示意图；

图8示有无三明治结构荧光效果对比图，其中图8(A)是有无三明治结构液滴的光学照片对比图；图8(B)是有无三明治结构液滴的荧光效果对比图；

其中，1-试剂注射器；2-微流控芯片；3-微流控管道；4-芯片驱动器上刚性延长件；5-冲击头；6-液滴；7-围框；8-基底；9-盖片；10-可编程加热装置； 11-荧光检测装置。

具体实施方式

本实用新型公开了一种基于微流控冲击打印的生物检测装置，本领域技术人员可以借鉴本文内容，适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是，所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的，它们都被视为包括在本实用新型。本实用新型的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述，相关人员明显能在不脱离本实用新型内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合，来实现和应用本实用新型技术。

本实用新型提供了一种基于微流控冲击打印的数字PCR液滴制备与 DNA浓度检测方法，该方法包括如下步骤：

步骤一：在一次性微流控芯片2中加注试剂；

步骤二：将微流控芯片2装载在微流控打印平台上；

步骤三：控制微流控打印平台，将体积在皮升到纳升范围的微液滴打印在经过表面疏水处理的平面基底8上，形成液滴阵列；

步骤四：在基底8上覆盖矿物油盖住液滴阵列，然后盖上透明盖片9与液滴上部保持接触，保证液滴形态近似呈圆柱形；

步骤五：将基底8置于可编程加热装置10上进行DNA扩增；

步骤六：对扩增后的液滴进行扫描荧光成像，经荧光检测装置11检测阳性表达液滴的数量，并根据阳性表达液滴数量计算待测DNA浓度。

在一些实施例中，液滴产生使用一次性微流控芯片，芯片所需试剂最小到微升范围，死体积在亚微升范围，同时芯片与基底使用一次性材料，都无需清洗，减小交叉污染的可能性。

在一些实施例中，液滴产生可以从单个通道产生，也可以由多个通道并行产生；可以提前配置好PCR体系注入微流控打印芯片，也可以利用微流控芯片将PCR反应所需的各种试剂进行片上混合。

在一些实施例中，液滴可以是等体积，也可以是不等体积的；可以通过改变微流控打印芯片的打印电压60伏-160伏，微流控打印芯片喷口60-120 微米和原位定点打印次数(液滴总体积＝次数×单个液滴体积)，实现不同体积液滴阵列，从而可以扩大检测范围。

在一些实施例中，平面基底表面进行疏水处理，改变基底表面接触角约 60°-100°，优选80°。

在一些实施例中，平面基底上键合有一围框，围框用于支撑其上的透明盖片，框的高度小于液滴高度。可以是先覆盖矿物油再盖上透明盖片，也可以先盖透明盖片再填充矿物油。

在一些实施例中，提供了一个环境控制系统，可以利用提高环境湿度减少液滴蒸发；也可以通过控制基底温度在0-4℃和气体(如：氮气，氦气等) 保护措施来减少液滴蒸发。

在一些实施例中，利用一可编程平板加热系统，用来对平面基底上的液滴进行加热；可以是变温PCR，也可以是等温PCR。

在一些实施例中，所述微流控打印芯片固定在Z轴，平面基底固定在移动平台XY平面，可以通过打印芯片移动来形成液滴排列，也可以通过移动基底来形成液滴排列。

在一些实施例中，检测系统为一个荧光检测系统系统，可以利用带有可拼接功能的荧光显微镜，也可以利用小动物成像仪，还可以在相机上安装小荧光镜头进行荧光液滴拍摄。

与现有技术相比，本实用新型的有益效果如下：

1，本实用新型应用简单方便的微流控冲击打印技术，利用其材料成本低，制造工艺简单的优势可以实现大规模生产，达到一次性使用目的，芯片与致动器分离，无需清洗，减小交叉污染的可能性。同时芯片最小工作体积仅为 2微升，浪费的死体积在亚微升量级，试剂的消耗与浪费少，在稀有目标检测时尤其关键。

2，本实用新型可实现液滴体积的灵活调控，通过改变打印电压，微流控打印芯片喷口和定点打印次数来产生的可调谐体积的液滴，大大扩宽了数字 PCR系统的检测范围。

3，本实用新型的微流控冲击打印装置简单，易与生物实验室常见的平板 PCR仪和荧光显微镜结合完成整个数字PCR方法。

本实用新型提供的基于微流控冲击打印的生物检测装置与方法中所用原料及试剂均可由市场购得。

下面结合实施例，进一步阐述本实用新型：

如图1所示，本公开实例一种基于微流控冲击打印的数字PCR液滴制备与DNA浓度检测方法，主要由微流控打印头(包括微流控芯片2、微流控打印平台；所述微流控打印平台还设置有芯片驱动器，所述芯片驱动器设置有刚性延长件4，所述刚性延长件4远离所述芯片驱动器的一端还设置有冲击头5，通过所述芯片驱动器转动所述刚性延长件4从而改变所述冲击头5与所述微流控芯片2的相对位置)和XYZ移动台组成。微流控芯片基于微流控原理设计，包括三层结构：上层的弹性层，中间的管道层和下层的支撑层，弹性层和管道层可以采用高分子材料，支撑层可以采用高分子材料或玻璃，高分子材料例如是PDMS(聚二甲基硅氧烷)，芯片尺寸为10毫米×16毫米×3毫米，管道宽度为200微米，在实际制作过程中可以根据需要制作不同的芯片规格。PCR试剂可以通过注射剂1加入到微流控芯片2中，实际可以充满微流控管道3。芯片驱动器上的刚性延长件4通过其上连接的冲击头5来敲击微流控芯片2上的腔体，使腔体内的液体以液滴6方式喷出，刚性延长件4为一细长结构。如图2所示：芯片尺寸小，需要样品体积少。打印过程中，芯片最小工作体积仅为2微升，浪费的死体积在亚微升量级，试剂的消耗与浪费少。电压控制为60伏-160伏，喷口尺寸60～120μm直径，可以实现 1纳升～20纳升液滴体积变化，同时，可以改变原位定点打印次数N(V_总＝次数N×V_单个液滴)实现可调谐液滴阵列的打印生成。微流控打印头的制动器 (芯片驱动器)和一次性微流控芯片2分离，无需清洗，没有交叉污染。承接液滴的基底8四周通过键合高分子材料，例如：PDMS，硅胶垫等形成围框7，基底8经过表面疏水处理，能够固定液滴阵列，保证了在后期盖油过程中也不会发生液滴移动和融合，油完全覆盖液滴后盖上透明盖片9贴住液滴，形成玻璃该片-液滴-玻璃基底的三明治结构，是的液滴形态从近似半圆形变为近似呈圆柱形，提高荧光对比度。也可以先盖透明盖片再填充矿物油。打印过程中液滴可以是等体积，也可以是不等体积的；可以通过改变微流控打印芯片的打印电压，微流控芯片2的喷口和定点打印次数实现不同体积液滴阵列，从而可以扩大检测范围。

液滴阵列的实现如图2所示，微流控芯片2放在XYZ移动台上，平板基底8固定，控制液滴打印高度和位置，也可以将微流控芯片2放在Z移动台上，平板基底8放在XY移动台上，控制液滴打印高度和位置，也可以将芯片放在XY移动台上，平板基底放在Z移动台上，控制液滴打印高度和位置上，也可以芯片固定，平板基底固定在XYZ移动台上，控制液滴打印高度和位置。整个试验过程中需要加湿器，使作环境保持较高湿度，防止液滴蒸发。

打印完成后，液滴阵列覆盖矿物油后覆盖盖片9贴住液滴，保证液滴形态近似呈圆柱形，如图4所示，然后再放在可编程加热系统10上进行DNA 扩增，如图5所示。最后对扩增后的液滴进行扫描荧光成像，经检测装置11 检测阳性表达液滴的数量，并根据阳性表达液滴数量计算待测DNA含量，如图6所示。图7展示：圆柱形液滴形态保证了液滴荧光一致性更好。加热具体实施如图3流程图，方法包括如下步骤：

步骤一：在一次性微流控打印芯片中加注试剂，所述数字PCR反应试剂含有检测样本和PCR反应体系(试剂，探针，引物等)；

步骤二：将微流控打印芯片装载在微流控打印平台上，设置所需要的打印模式；

步骤三：控制打印平台，将液滴打印在经过表面疏水处理的平面基底上，形成皮升到纳升体积范围液滴阵列；

步骤四：在基底上覆盖矿物油，使油完全覆盖液滴后盖上透明盖片贴住液滴，保证液滴形态呈圆柱形；

步骤五：将基底置于平板加热装置进行DNA扩增；

步骤六：对扩增后的液滴进行扫描荧光成像，检测阳性表达液滴的数量，并根据阳性表达液滴数量计算待测DNA含量。

以上所述仅是本实用新型的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本实用新型原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本实用新型的保护范围。

Claims (6)

1.基于微流控冲击打印的生物检测装置，其特征在于，包括微流控芯片(2)、微流控打印平台和基底(8)；

所述微流控芯片(2)装载于所述微流控打印平台；

所述微流控打印平台还设置有芯片驱动器，所述芯片驱动器设置有刚性延长件(4)，所述刚性延长件(4)远离所述芯片驱动器的一端还设置有冲击头(5)，通过所述芯片驱动器转动所述刚性延长件(4)从而改变所述冲击头(5)与所述微流控芯片(2)的相对位置；

所述基底(8)与所述微流控芯片(2)对应设置，承接所述微流控芯片(2)打印的液滴；

还包括环境控制装置、可编程加热装置(10)或检测装置(11)中的一个或多个。

2.如权利要求1所述的生物检测装置，其特征在于，所述微流控芯片(2)包括微流控管道(3)和喷口，所述微流控管道(3)与所述喷口连通，所述喷口与所述基底(8)对应设置且不接触。

3.如权利要求2所述的生物检测装置，其特征在于，所述喷口的直径为60～120μm。

4.如权利要求1至3任一项所述的生物检测装置，其特征在于，所述基底(8)的表面经疏水处理，所述基底(8)的表面接触角为60°～100°。

5.如权利要求4所述的生物检测装置，其特征在于，所述基底(8)还设置有围框(7)，所述围框(7)的高度小于所述液滴的高度。

6.如权利要求5所述的生物检测装置，其特征在于，还包括盖片(9)，所述围框(7)支撑所述盖片(9)。

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