CN1281324C - 阵列板和阵列板的构建方法 - Google Patents

Abstract

一个实施方案中，提供了制造阵列板的方法以及由此制造的阵列板，方法包括：a)提供包括多个两个末端敞开的空腔的主体，一个末端具有一凹槽；b)提供表面上包括多个阵列的晶片；c)涂敷粘合剂到主体的凹槽中；d)主体与晶片对准将空腔置于晶片上，空腔围绕并封闭一阵列以及e)将晶片连接主体上形成微孔。另一实施方案中，提供了制造阵列板的方法以及由此制造的阵列板，方法包括：a)提供包括多个在两个末端敞开的主体上形成微孔壁的空腔的主体，b)提供表面包括多个阵列的晶片；c)提供压板；d)将晶片与主体末端对准使空腔位于晶片上，空腔围绕并封闭一阵列；e)通过使用压板将晶片连接主体上以及f)将压板连接到晶片周边外侧主体上。

Description

阵列板和阵列板的构建方法

发明领域

本发明涉及阵列板以及阵列板的构建方法。

技术背景

本申请要求在2001年12月19日递交的美国临时申请60/344,084的优先权。60/344,084申请在此处引入作为通用的参考。

WO01/34290公开了一阵列，可以进行在相同阵列中进行高通量合成，筛选和/或鉴定，而不需要从阵列转移样品。所述阵列可以包括热通道以及微孔。

WO01/54814公开了一装置，可以在其上具有多重寡核苷酸结合位点的基质层上利用具有绕性覆盖物的基质进行核酸杂交反应。

EP 347 579公开了一具有空腔的微机械结构，用于检验样品物质物理和/或化学特性的任意改变，其中所述结构包括半导体材料，玻璃，陶瓷，金刚石或者碳。

发明内容

本发明的一个实施方案涉及制造阵列板的方法，高通量筛选生物样品的装置，以及同时进行平行筛选对比相同阵列的复制物的多个样品以及平行筛选对比相同样品的多个阵列的系统。

本发明的一个实施方案提供了制造阵列板的几种方法。在一种方法中，提供了一种晶片以及一种主体。晶片包括一种基质以及一种有多个阵列探针附着其上的表面。主体为一种板具有多个网格形空腔或微孔，所述主体在两个末端是敞开的。晶片附着于主体的表面，其中晶片以及主体用粘合剂固定在一起，凭此粘合剂涂层被施用于主体上从而形成限定接受样品间隔的微孔。

在本发明的一个实施方案中，所述方法还包括通过UV紫外线照射、加热、压力，空气或这些方式的任何组合进行的粘合剂固化过程。在本发明另外一实施方案中，主体粘合剂施加其上的一个表面中具有一凹槽。凹槽具有防止微孔限定间隔中粘合剂渗漏的用途。

在本发明的另一个方法中，提供了一种晶片以及一种主体。主体为一种板具有多个网格形空腔或微孔，所述主体在两个末端是敞开的。主体包括衬垫或O形圈模塑在主体的一个表面上。然后将晶片模塑到主体的表面，衬垫或O形圈位于主体的表面上。使用压板将晶片和主体固定在一起。压板附着于主体的外周边。在某些实施方案中，压板通过粘合剂、螺钉、超声波焊接或揿扭附着于主体的外周边。

在本发明的另一个方法中，提供了一种主体和至少一种阵列。主体为一种板具有至少一种多个网格形空腔或微孔，所述主体在两个末端是敞开的。每个阵列捕获在主体每个微孔的底部。在本发明的某些实施方案中，单独的阵列可以通过粘合剂、螺钉、超声波焊接或揿扭附着于主体上。

在本发明的另一个方法中，提供了一种主体和大量的阵列。主体为一种板具有多个网格形空腔或微孔，所述主体在两个末端是敞开的。每个阵列用压板捕获在主体每个微孔的底部。然后将压板连接每个微孔的外周边。在本发明的某些实施方案中，压板通过粘合剂、螺钉、超声波焊接或揿扭连接每个微孔的外周边。

在本发明的另一种方法中，提供了一种主体和大量的阵列。主体为一种板具有多个网格形空腔或微孔，所述主体在两个末端是敞开的。阵列位于主体的空腔上，在主体中围绕着阵列的主体壁比阵列的厚度高。加热板或超声波焊头用来熔化或锻造并重新形成围绕每个阵列的壁，从而将阵列捕获到主体上。在本发明的一个实施方案中，可以一次捕获一个单独的阵列或者同时捕获几个阵列。在另一个实施方案中，衬垫可能是直接附着于主体上沿着高壁内部的阵列周边。当通过超声波焊接熔化或锻造壁时，衬垫压紧阵列，将阵列密封在微孔中。

本发明的其它目的特征和优点通过参考附图、下述说明书和权利要求对于本领域技术人员将是显而易见的。

附图说明

图1表明本发明的一种系统具有：阵列板、液体送运装置、阵列板读数器和电计算机；

图2表明通过阵列板读数器扫描阵列板；

图3表明一种生物学的微孔板；

图4表明包含多个阵列的晶片与具有通道的主体配合形成阵列板；

图5表明一种阵列板的横截面，主体附着于晶片上形成封闭的微孔，其中探针阵列暴露于微孔的空间中；

图6表明一种生物学微孔板的横截面，主体具有单独的阵列附着于微孔的底部；

图7为包含阵列的微孔的自顶向下视图；

图8表明在基质表面上产生一阵列寡核苷酸探针的方法，所述方法利用避光膜将表面的某些部分暴露于光照，从而除去可光去除的保护基，并将核苷酸附着到暴露的活性基团上。

图9表明本发明的一个实施方案，其中晶片与网格通过粘合剂结合配合在一起。

图10A-10C表明本发明的一个实施方案，具有晶片和带有凹槽和/或衬垫或O形圈的网格，其中粘合剂放在凹槽中用于将晶片粘解到网格上。

图11A-11C表明本发明的一个实施方案，其中晶片与网格用一种压板附着在一起。

图12A-12D表明本发明的一个实施方案，其中单独的阵列被捕获在一个网格上。

图13表明本发明的另一个实施方案，其中单独的阵列通过利用加热板或超声波焊头的熔化被捕获在一个网格上。

具体实施方式

下面将详细参考本发明典型的实施方案。虽然本发明连同典型的实施方案进行描述，但是应该清楚并非将将本发明限制到这些实施方案的范围内。相反，本发明应该覆盖可能包括在本发明的精神和范围内的替换物，改性物和等价物。

因此本发明涉及由分子间相互作用特性影响的不同领域，包括化学、生物学、医学和诊断学。分子间相互作用的有效评估对于迅速需要大量信息的装置是非常有利的，诸如临床诊断实验室或大规模项目诸如人基因组计划。

本发明具有多个优选的实施方案并且依赖于多个专利、申请及本领域技术人员公知的其它参考文献。因此，当引用或在下重复引用一专利、申请或其它参考文献时，应该理解为将其全部引入作为通用的以及所论述提议的参考。

在本申请中，单数形成的“一，”“一个”以及“这个”包括除上下文清楚限定之外的多个参考文献。例如，术语“一种试剂”包括包含其混合物的多种试剂。

一个体不局限于人还可能为其它生物体，包含但不限于哺乳动物、植物、细菌、或来源于任何上述生物体的细胞。

贯穿这个公开，本发明的多个方面可以一个范围的形式出现。应该清楚范围形式的描述仅仅为了方便以及简短起见并且将不会被认为是死板的限制本发明的范围。因此，一个范围的说明应该被理解为具体地描述了所有可能的子范围以及在那个范围内的单个数值。例如，诸如从1到6的范围描述应该被理解为具有具体公开的子范围，诸如从1到3，从1到4，从1到5，从2到4，从2到6，从3到6等等，以及在那个范围内的单个数字，例如，1、2、3、4、5和6。这种理解适用于无论多么宽泛的范围。

本发明的实际应用除非另有陈述可以使用本领域技术人员知道的范围内的有机化学、聚合物技术、分子生物学(包含重组技术)、细胞生物学、生物化学和免疫学的传统技术和描述。这样的传统技术包含聚合物阵列合成、杂交、连接、和利用标记探测杂交。适用技术的具体说明可以参考下列的实施例。然而，当然还可以使用其它等价的常规程序。这样的传统技术和说明可以在标准实验手册中发现，诸如GenomeAnalysis：A Laboratory Manual Series(Vols.I-IV)，Using Antibodies：ALaboratory Manual，Cells：A Laboratory Manual，PCR Primer：A LaboratoryManual，and Molecular Cloning：A Laboratory Manual(所有都来自ColdSpring Harbor Laboratory Press)，Stryer，L(1995)Biochemistry(第四版)Freeman，New York，Gai，“Olignonucleotide Synthesis：A PracticalApproach”1984，IRL Press，London，Nelson and Cox(2000)，Lehninger，Principles of Biochemistry第三版，W. H.Freeman Pub，New York，NY和Berg等人的(2002)Biochemistry，5th Ed.，W H.Freeman Pub.，NewYork，NY，所有都在此处全部引入作为通用的参考。

本发明可以使用固体基质，包含一些优选实施方案中的阵列。适用于聚合物(包含蛋白质)阵列合成的方法和技术已经描述在下列专利申请中：美国专利09/536,841，WO00/58516，美国专利5,143,854，5,242,974，5,252,743，5,324,633，5,384,261，5 405,783，5,424,1 86，5,451,683，5,482,867，5,491,074，5,527,681，5,550,215，5,571,639，5,578,832，5,593,839，5,599,695，5,624,711，5,631,734，5,795,716，5,831,070，5,837,832，5,856,101，5,858,659，5,936,324，5,968,740，5,974,164，5,981,185，5,981,956，6,025,601，6,033,860，6,040,193，6,090,555，6,136,269，6,269,846和6,428,752，PCT申请PCT/US99/00730(国际公布号为WO 99/36760)和PCT/US01/04285，其全部引入作为通用的参考。

在具体实施方案中描述合成技术的专利包含美国专利5,412,087，6,147,205，6,262,216，6,310,189，5,889,165和5,959,098。核酸阵列描述在多个上述专利中，但是相同的技术被用于多肽阵列。

用于本发明的核酸阵列包含从Affymetrix(Santa Clara，CA)以商品名GeneChip市售获得的产品。示范性阵列显示在affymetrix.com的网址上。

本发明还涉及附着于固体基质的聚合物的多个应用。这些应用包含基因表达监控，作图，文库筛选，基因分型和诊断。基因表达监控，和作图的方法显示在下列专利申请中：美国专利5,800,992，6,013,449，6,020,135，6,033,860，6,040,138，6,177,248和6,309,822。基因分型和其应用显示在USSN 60/319,253，10/013,598，和美国专利5,856,092，6,300,063，5,858,659，6,284,460，6,361,947，6,368,799和6,333,179中。其它应用概括在美国专利5,871,928，5,902,723，6,045,996，5,541,061和6,197,506中。

本发明在某些优选实施方案中还涉及样品制备方法。在基因分型之前或者同时，基因组样品可能通过多种机理进行扩增，其中一些可以使用PCR。参见，例如PCR Technology：Principles and Applications forDNA Amplification(Ed.H.A.Erlich，Freeman Press，NY，NY，1992)；PCRProtocols：A Guide to Methods and Applications(Eds Innis，等人，Academic Press，San Diego，CA，1990)；Mattila等人的，Nucleic Acids Res19，4967(1991)；Eckert等人的，PCR Methods and Applications 1，17(1991)；PCR(Eds.McPherson等人，IRL Press，Oxford)；和美国专利4,683,202，4,683,195，4,800,159，4,965,188，和5,333,675，并且每个都全部引入作为通用的参考。样品可以在阵列上扩增。参见，例如美国专利6,300,070以及美国专利申请09/513,300，其在此处引入作为参考。

其它合适的扩增方法包含连接酶链式反应(LCR)(例如，Wu和Wallace，Genomics 4，560(1989)，Landegren等人的，Science 241，1077(1988)和Barringer等人的Gene 89：117(1990)，转录扩增(Kwoh等人，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 86，1173(1989)和WO88/10315)，自动维持序列扩增(Guatelli等人，Proc Nat.Acad.Sci.USA，87，1874(1990)和WO90/06995，靶聚核苷酸序列的选择性扩增(美国专利6,410,276)，共有序列引物聚合酶链式反应(CD-PCR)(美国专利4,437,975)，任意引物聚合酶链式反应(AP-PCR)(美国专利5,413,909，5,861,245)和基于核酸的序列扩增(NABSA)。(参见美国专利5,409,818，5,554,517和6,063,603，每个都在此处引入作为参考)。其它可以使用的扩增方法描述在美国专利5,242,794，5,494,810，4,988,617以及美国专利09/854,317其中每个在此处引入作为参考。

另外的样品制备方法和减少核样品复杂性的技术描述在Dong等人的，Genome Research 11 1418(2001)，美国专利6,361,947，6,391,592和美国专利09/916,135，09/920,491，09/910,292，和10/013,598中。

进行多核苷酸杂交分析的方法已经在本领域中得到了很好的发展。杂交分析程序和条件将依赖于应用而改变，并且根据已知的常规结合方法进行选择，所述常规结合参考：Maniatis等人的分子克隆实验指南(第二版，Cold Spring Harbor，N.Y，1989)；Berger和Kimmel的Methods in Enzymology，Vol.152，Guide to Molecular Cloning Techniques(Academic Press，Inc.San Diego，CA，1987)；Young和Davism，P.N.A.S，80：1194(1983)。进行重复和控制杂交反应的方法和装置描述在美国专利5,871,928，5,874,219，6,045,996和6,386,749，6,391,623中，每个都在此处引入作为参考。

在某些优选实施方案中，本发明还涉及在配体之间检测杂交信号。参见美国专利5,143,854；5,578,832；5,631,734；5,834,758；5,936,324；5,981,956；6,025,601；6,141,096；6,185,030；6,201,639；6,218,803；和6,225,625，美国专利申请60/364,731以及PCT申请PCT/US99/06097(公布为W099/47964)，每个都全部引入作为通用的参考。

信号检测以及处理大量数据的方法和装置公开在，例如美国专利5,143,854，5,547,839，5,578,832，5,631,734，5,800,992，5,834,758；5,856,092，5,902,723，5,936,324，5,981,956，6,025,601，6,090,555，6,141,096，6,185,030，6,201,639；6,218,803；和6,225,625中，美国专利申请60/364,731和PCT申请PCT/US99/06097中(公开为WO99/47964)，其中每个都在此处引入作为通用的参考。

本发明的应用还可能使用传统的生物学方法、软件以及系统。本发明的计算机软件产品典型地包含计算机可读介质，具有电脑可执行指令用于执行本发明方法的逻辑步骤。合适的计算机可读介质包含软盘，CD-ROM/DVD/DVD-ROM，硬盘驱动器，闪速存储器，ROM/RAM，磁带等。计算机可执行命令可以写入合适的计算机语言或几个语言的组合。基础计算生物学方法描述在例如Setubal和Meidanis等人的Introduction to Computational Biology Methods(PWS Publishing Company，Boston，1997)；Salzberg，Searles，Kasif，(Ed)，Computational Methods inMolecular Biology，(Elsevier，Amsterdam，1998)；Rashidi和Buehler，Bioinformatics Basics：Application in Biological Science and Medicine(CRC Press，London，2000)和Ouelette与Bzevanis的Bioinformatics：APractical Guide for Analysis of Gene and Proteins(Wiley & Sons，Inc.，第二版，2001)。参见美国专利6,420,108。

本发明还可以应用多种计算机程序产品和软件用于多种目的，诸如探针设计，数据处理，分析和仪器操作。参见美国专利5,593,839，5,795,716，5,733,729，5,974,164，6,066,454，6,090,555，6,185,561，6,188,783，6,223,127，6,229,911和6,308,170。

本发明还可以应用阵列的几个实施方案而且处理过程描述在美国专利5,545,531和5,874,219中。这些专利全部引入作为通用的参考。

另外，本发明可能具有包括如下方法的优选实施方案：所述方法提供了覆盖网络诸如国际互联网络的遗传信息，显示在美国专利申请10/063,559，60/349,546，60/376,003，60/394,574，60/403,381中。

定义

“阵列”是指有目的建立的分子集合，所述分子可以通过合成或者生物合成的方式进行制备。阵列中的分子可以彼此相同或不同。阵列可以假定为多种形式，例如可溶性分子的文库；束缚到树脂粒、硅石碎片或其它固体支持物的化合物的文库。

阵列板或者微孔板是具有多个阵列的主体，其中每个阵列与另一个阵列通过物理障碍分离开，所述物理障碍可以耐受液体的流通并且形成一区域或空间称为微孔。

核酸文库或阵列是有目的建立的核酸集合，所述核酸可以通过合成或者生物合成制备，并且可以各种形式(例如可溶性分子的文库；束缚到树脂粒、硅石碎片或其它固体支持物的寡聚物的文库)筛选其生物活性。另外，术语“阵列”包含那些核酸文库，所述核酸文库可以通过将基本上任何长度(例如从1到约1000个核苷酸单体的长度)的核酸点样到基质上进行制备。这里所用的术语“核酸”是指任何长度的核苷酸聚合物形式，可以为例如描述在美国专利6,156,501中的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或肽核酸(PNAs)，其中包含嘌呤和嘧啶碱类，或其它天然的、化学或生物化学修饰的、非天然的或衍生的核苷酸碱基。多核苷酸的主链可以包含一般如在RNA或DNA中发现的糖和磷酸基或修饰或取代的糖或磷酸基。多核苷酸可以包含修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸的序列可能被非核苷酸组分间断。因此术语核苷、核苷酸、脱氧核苷和脱氧核苷酸通常包含诸如在这里描述的那些类似物。这些类似物为与天然存在的核苷或核苷酸具有某些相同结构特点的分子，因此当这些分子插入核酸或寡核苷序列时能够与天然存在的可溶性核酸序列杂交。一般地，通过取代和/或修饰碱基、核糖或磷酸二酯部分，这些类似物衍生自天然存在的核苷和核苷酸。所述的改变可以适于稳定或去稳定杂交物的形成或增强与希望的互补核酸序列杂交的特异性。

生物聚合物或生物学上的聚合物是指生物学或化学部分的重复单位。典型的生物聚合物包含，但是不限于：核酸、寡核苷酸、氨基酸、蛋白、肽、激素、低聚糖、脂、糖脂、脂多糖、磷脂、上述的合成类似物，包括但不限于：反向核苷酸、肽核酸、间位DNA和上述的组合。“ 生物聚合物合成”包含合成产生一种有机和无机生物聚合物。

与生物聚合物相关的是“生物单体”，是指生物聚合物的单个单位，或不是生物聚合物的一部分的单个单位。因此，例如核苷酸为寡核苷酸生物聚合物中的生物单体，氨基酸为蛋白或肽生物聚合物中的生物单体；例如，抗生物素蛋白、生物素、抗体、抗体片段等也为生物单体。

起始生物单体或“起始物生物单体”是指通过反应性亲核试剂共价连接到聚合物表面的第一个生物单体，或连接到已经连接了聚合物的接头或间隔臂的第一个生物单体，接头或间隔臂通过反应性亲核试剂连接到聚合物上。

压板是指被用来将两个或更多部分扣紧起来的装置。

互补是指在核苷酸或核酸之间的杂交或碱基配对，诸如例如，在两条双链DNA分子之间或寡核苷酸引物和待测序或待扩增的单链核酸上的引物结合位电之间的杂交或者碱基配对。互补核苷酸通常为A和T(或A和U)，或C和G。当任选比对和比较并且带有核苷酸插入或缺失的一条核苷酸与另一条核苷酸至少80％配对，通常至少约90％到95％，更优选地从98到100％配对时，两个单链RNA或DNA分子就说是基本上互补。或者，当RNA或DNA链在选择的杂交条件下与其互补物杂交时，就存在基本上的互补。一般地，当至少14到25个核苷酸长度具有至少约65％互补，优选地至少约75％，更优选地至少约90％互补时，就会存在选择性杂交。参见，M.Kanehisa的Nucleic Acids Res12：203(1984)，此处引入作为参考。

组合合成策略为通过顺序添加试剂平行合成多种聚合物序列的顺序策略，所述合成策略可以由反应物矩阵和阻断矩阵表示，其产物为产物矩阵。反应物矩阵为1列由待增添的构造区块构成的的m行矩阵。阻断矩阵是双数数字的全部或子集，优选地在1和m之间按顺序排列的列。“二元策略”是指其中至少两个连续步骤照射基片的一部分，常常是一半的目的区。在二元合成策略中，形成了所有可以从反应物顺序集形成的化合物。在最优选的实施方案中，二元合成是指也包括先前的添加步骤的合成策略。例如，在所述策略中，避光膜策略的阻断矩阵平分了先前照射的区域，只照射先前照射区域的一半并且保护剩余的一半(同时也保护先前保护区域的约一半并照射先前保护区域的约一半)。应该认识到二元循环可能与非二元循环交替并且只有部分基片可以进行二元方案。组合的“避光膜”策略是运用光或其它空间选择性去保护或活性剂从而从用于添加其它诸如氨基酸的材料上除去保护基的合成策略。

有效量是指足以诱导所希望结果的量。

激发能是指用于激发探测可检测标记的能量，例如照射光标记。用于这种应用的装置包含相干或不相干发光物，诸如激光等、紫外灯、发光二极管、白炽光源或其它任何具有可激发标记的激发带波长，或者能够提供可检测的传输的、反射的或漫辐射的灯或其它电磁能源。

衬垫或者O形圈是指任何在连接的部分之间使用的各式各样的密封或包装以防止气体或液体的泄漏。衬垫或O形圈可由诸如弹性体的材料制成。

基因组为生物体染色体中所有的遗传物质。来源于一种具体生物体染色体中遗传物质的DNA是基因组DNA。基因组文库是由一组随机产生的重叠DNA片段构成的克隆集合，表示生物体的全部基因组。

杂交条件一般包含小于约1M，更通常小于约500mM并且优选地小于约200mM的盐浓度。杂交温度可低达5℃，但是一般高于22℃，更一般高于约30℃，并且优选地超过约37℃。为了特异性杂交，长片段可能需要更高的杂交温度。因为其它因素可能影响杂交的严格性，所述因素包括互补链的碱基组成和长度，有机溶剂的存在和碱基错配的程度，所以参数的组合比任何单独的绝对量度更重要。

杂交，例如，等位基因特异性探针杂交通常在严格条件下进行。例如，盐浓度不超过约1摩尔(M)以及至少25摄氏度的温度的条件，例如，750mM NaCl，50mM磷酸钠，5mM EDTA，pH7.4(5X SSPE)以及从约25到约30℃的温度。

杂交通常在严格条件进行，例如，盐浓度不超过1M，温度至少25℃。例如，5x SSPE(750mM NaCl，50mM磷酸钠，5mM EDTA，pH7.4)以及25-30℃的温度适于等位基因特异性探针杂交。对于严格条件，例如参见，Sambrook，Fritsche和Maniatis等人的“分子克隆实验指南”第二版，Cold Spring Harbor Press(1989)，在此处全部引入作为通用的参考。

术语“ 杂交”是指单链两条多核苷酸非共价结合形成稳定双链多核苷酸的过程；理论上三链杂交也是可能的。产生的(通常)双链多核苷酸为“杂合物”。形成稳定杂合物的多核苷酸数目的比例在这里指“杂交的程度”。

杂交探针是能够以碱基特异性方式结合核酸互补链的寡核苷酸。这样的探针包含描述在Nielsen等人的Science 254，1497-1500(1991)的肽核酸，及其它核酸类似物和核酸模拟物。参见美国专利6,156,501。

“杂交特异性”是指在严格条件下分子实质上只结合、双联或杂交一特定存在于复合混合物(例如，总细胞)中的DNA或者RNA的核苷酸序列。

分离的核酸是发明的目标种类也就是存在的特优种类(即，以一摩尔为基础，它比组合物中任何其它的个体种更丰富)。优选地，分离的核酸含有至少约50、80或90％(以一摩尔为基础)的所有存在的大分子种类。最优选地，目标种类被纯化为基本同源的遗传型(在组合物中不能通过常规的检测方法检测到污染物种类)。

标记是，例如光标记、光散射标记或放射性标记。荧光标记包含，在其中可以市售获得的荧光素亚磷酰胺，诸如Fluoreprime(Pharmacia)，Fluoredite(Millipore)和FAM(ABI)。参见美国专利6,287,778。

配体是由特定受体识别的分子。被受体结合或者与其反应的因子被称为“配体”，这个术语只有就其对应物受体而言是有确定含义的。术语“配体”不是指任何特定的分子大小或其它结构或组合特征，除了所述的物质能够结合或者与受体互作。同时，配体可能作为受体结合的天然配体，或者作为充当拮抗剂或对抗剂的功能类似物。本发明研究的配体的实例包含但不局限于细胞膜受体的拮抗剂和拮抗物、毒素和毒物、病毒表位、激素(例如，麻醉剂、甾体等等)、激素受体、肽、酶、酶底物、底物类似物、过渡态类似物、辅因子、药物、蛋白和抗体。

连锁不平衡或等位基因相关是指特定的等位基因或遗传标志与附近染色体位置的特异性等位基因或遗传标志的优选结合比群体中偶然的任何特定频率所希望的更频繁。例如，如果位点X具有相同频繁发生的等位基因a和b，并且相连的位点Y具有相同频繁发生的等位基因c和d，人们可以预计组合ac的发生频率为0.25。如果ac更频繁地发生，那么等位基因a和c为连锁不平衡。连锁不平衡可能起因于等位基因特定组合的自然选择或因为等位基因被引入群体中的时间距离现在太近因此尚未与相连的等位基因达到平衡。

微量滴定板是标准形式(96、384和1536微孔)的不连续微孔的阵列，用于平行测验大量样品的物理、化学或生物学特性。

混合群体或 复合群体是指任何包含期望和不希望核酸的样品。作为非限定实施例，核酸的复合群体可以是总基因组DNA、总基因组RNA或其组合。此外，核酸的复合群体也许是对于给定群体已经得到富集，但是还包括其它不希望的群体。例如，核酸的复合群体可以是富集了期望的信使RNA(mRNA)序列但仍然包含一些不希望的核糖体RNA序列(rRNA)的样品。

单体是指任何分子系列的单体，可以连接到一起形成寡聚物或聚合物。用于本发明的单体组包含但不局限于，例如用于(聚)肽合成的L-氨基酸、D-氨基酸或合成的氨基酸组。在这里使用的“单体”是指用于寡聚物合成的碱基组的任何单体。例如，L-氨基酸的二聚物形成用于多肽合成的400个“单体”的碱基组。不同的单体碱基组可用于聚合体合成的连续步骤中。术语“单体”也指可与不同化学亚单位结合形成比任何单独的亚单位更大化合物的化学亚单位。

这里使用的 mRNA或mRNA转录本包括但不限于前信使RNA转录本、转录本加工中间体、准备用于翻译的成熟mRNA和基因的转录本、或者来源于mRNA转录本的核酸。转录本加工可能包含剪接、编辑和降解。这里所用的来源于mRNA转录本的核酸是指mRNA转录本或其子序列最终作为模板合成的核酸。因此，从mRNA反转录而来的cDNA，从所述cDNA转录而来的RNA，从所述cDNA扩增而来的DNA，从所述扩增的DNA转录而来的RNA等全部来源于mRNA转录本，并且这种衍生产物的检测显示样品中原始转录本的存在和/或大量转录本的存在。因此，源于样品的mRNA包含但不限于基因的mRNA转录本、从RNA反转录而来的cDNA、从cDNA反转录而来的cRNA、从基因扩增而来的DNA、从扩增的DNA转录而来的RNA等等。

核酸文库或阵列是指有目的产生的核酸集合，可以合成或者生物合成进行制备，并且可以各种不同的形式(例如，可溶性分子文库；结合到树脂珠、硅芯片或者其它固相支持物的寡聚物的文库)筛选生物活性。另外，术语“阵列”是指包含那些核酸文库，所述核酸文库可以通过将基本上任何长度(例如，从1到1000个核苷酸单体长度)的核酸在基质上点样进行制备。在这里使用的术语“核酸”是指任何长度核苷酸的聚合形式，可以是包括嘌呤和嘧啶碱类或其它天然的化学上或生物化学修饰的非天然的或衍生的核苷酸碱基的核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸或肽核酸(PNAs)。多核苷酸的主链可以包括典型地在RNA或DNA中发现的糖和磷酸基，或修饰或取代的糖或磷酸基。多核苷酸可能包括修饰的核苷酸，诸如甲基化核苷酸和核苷酸类似物。核苷酸序列可以被非核苷酸组分间断。因此术语核苷、核苷酸、脱氧核苷和脱氧核苷酸通常包含诸如描述在这里的那些类似物。这些类似物具有与天然存在的核苷或核苷酸相同的一些结构特点，以致于当掺入到核酸或寡核苷序列时，它们可以与溶解的天然存在的核酸序列杂交。一般地，通过替换和/或修饰碱基、核糖或磷酸二酯部分这些类似物来源于天然存在的核苷和核苷酸。所述改变可以适合于稳定或去稳定杂合物的形成或增强与希望的互补核酸序列杂交的特异性。

根据本发明的 核酸可能包含任何嘧啶和嘌呤碱基，优选地分别为胞嘧啶、胸腺嘧啶和尿嘧啶以及腺嘌呤和鸟嘌呤的聚合体或寡聚物。参见Albert L.Lehninger的，PRINCIPLES OF BIOCHEMISTRY，793-800(Worth Pub.1982)。实际上，本发明涉及任何的脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸或肽核酸组分，及其任何的化学变体，诸如这些碱基的甲基化、羟甲基化或糖基化形式等等。聚合体或寡聚物可以是异源或同源组合物，并且可能分离自天然存在来源或可以是人工或合成产生的。此外，核酸可以是DNA或RNA，或其混合物，并且可能永久或者瞬时地以单链或双链形成存在，包含同源双链，异源双链以及杂合物的形式。

“寡核苷酸”或 “多核苷酸”是指至少2，优选地至少8，更优选地至少20个核苷酸长度的核酸或与多核苷酸特异性杂交的化合物。本发明的多核苷酸包含脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的序列，它们可以分离自天然来源、重组产生或人工合成及其模拟物。本发明多核苷酸的另一个例子可以是肽核酸(PNA)。本发明也包括存在诸如Hoogsteen碱基配对的非传统碱基配对的情况，在特定的tRNA分子中已经鉴定到所述Hoogsteen碱基配对并且猜想可能存在于三链螺旋中。在本申请中可交换使用“多核苷酸”和“寡核苷酸”。

探针是可以被特定的靶识别的固定在表面的分子。本发明研究的探针的实例包含但不限于细胞膜受体的拮抗剂和拮抗物、毒素和毒物、病毒表位、激素(例如，阿片样肽、甾体等等)、激素受体、肽、酶、酶底物、辅因子、药物、凝集素、糖、寡核苷酸、核酸、寡糖、蛋白质和单克隆抗体。

引物是单链寡核苷酸，能够作为在合适的条件下作为模板指导的DNA合成的起始位点，合适的条件为例如，缓冲液和温度，存在四种不同的核苷三磷酸和聚合试剂，诸如例如DNA或RNA聚合酶或逆转录酶。在任何给定情况下引物的长度依赖于例如想要使用的引物，并且通常为从15到20、25、30个核苷酸的范围。较短的引物分子为了与模板形成足够稳定的杂交复合物通常需要较冷的温度。引物不必反映模板的恰切序列但是必须足以互补从而与这种模板杂交。引物位点是引物杂交模板的区域。引物对是包含与待扩增序列的5′末端杂交的5′上游引物和与待扩增的3’末端序列杂交的3′下游引物的引物组。

多态性是指在群体中存在两种或多种遗传性测定不同的序列或等位基因。多态性标记或位点是存在差异的位点。优选的标记具有至少两个等位基因，每个的存在频率为所选择群体的大于1％，更优选地大于10％或20％。多态性可能包括一个或者多个碱基改变，一次插入，一次重复或一次缺失。多态性位点可以小到一对碱基。多态性标记包含限制性片段长度多态性，串联重复的可变数(VNTR)，高度可变区，微卫星，二核苷酸重复，三核苷酸重复，四核苷酸重复，单一顺序重复，以及插入诸如Alu的元件。第一个鉴定的等位基因形式被任意指定为参考形式并且其它等位基因形式被指定为可选择的或变异的等位基因。在选择的群体中最频繁存在的等位基因形式有时是指野生型形式。二倍体生物体的等位基因形式可以是纯合或者杂合形式。二对等位基因的多态性具有两种形式。三对等位基因的多态性具有3种形式。单个核苷酸的多态性(SNPs)包括在多态性中。

读出器或板读出器是用来鉴定阵列上杂交结果，诸如阵列上核酸探针和荧光标记靶之间杂交的装置。读出器对于本领域技术人员而言是公知的并且可以从Affymetrix、Santa Clara CA及其它公司市售获得。通常，它们涉及利用激发能(诸如激光器)照射已经杂交到探针上的荧光标记的靶核酸。然后，利用诸如CCD、PMT、光电二极管或类似装置检测重发辐射(在与激发能不同的波长下)记录收集的发射。参见美国专利6,225,625。

受体是对于给定的配体具有亲和力的分子。受体可以是天然存在或人造的分子。同样，它们可以未改变的形式或者与其它类型联合的形式使用。直接的或通过特异性结合物可以将受体共价或者非共价的结合到结合对象上。可用于本发明的受体例子包含但是不限于抗体、细胞膜受体、单克隆抗体和与特异性抗原决定簇(诸如在病毒、细胞或其它物质上)反应的抗血清、药物、多核苷酸、核酸、肽、辅因子、凝集素、糖、多糖、细胞、细胞膜和细胞器。

在本领域中，受体有时是指抗配体。在这里使用的术语受体在意思上没有差别。当两个高分子已经通过分子识别结合形成复合物时，形成“配体受体对”。本发明研究的其它受体的例子包含但不限于在美国专利5,143,854中显示的那些分子，其内容全部引入作为参考。

“固相支持物”，“支持物”和“基质”可互换地使用并且是指所有具有坚硬或半坚硬表面的材料或材料组。在多个实施方案中，至少一种固相支持物的表面实质上是平坦的，尽管在一些实施方案中也许需要用例如微孔、提高的区域、插脚、蚀刻沟等等物理上隔离不同的化合物合成区域。根据其它实施方案，固相支持物将采用珠子、树脂、凝胶、微球或其它几何形状。参见美国专利5,744,305的示范性基质。

靶是对于给定的探针具有亲和力的分子。靶可以是天然存在或人造的分子。同样，它们可以未改变的形式或者与其它类型联合的形式使用。直接的或通过特异性结合物可以将靶共价或者非共价的结合到结合对象上。可用于本发明的靶的例子包括但是不限于抗体、细胞膜受体、单克隆抗体和与特异性抗原决定簇(诸如在病毒、细胞或其它物质上)反应的抗血清、药物、寡核苷酸、核酸、肽、辅因子、凝集素、糖、多糖、细胞、细胞膜和细胞器。在本领域中，靶有时作为抗探针。在这里使用的术语靶意思上没有差异。当两个高分子已经通过分子识别结合形成复合物时，形式“探针靶对”。

晶片是一种基质，具有多个阵列结合其上的表面。在一优选的实施方案中，阵列在基质的表面上合成以产生物理上隔离开的多个阵列。在晶片的一种优选的实施方案中，阵列被物理上隔离成至少约0.1、0.25、0.5、1或1.5毫米的距离。晶片上的阵列可以是相同的、也可以彼此不同、或可能是其的一些组合。尤其优选的晶片为约8”×8”″并且利用光刻工艺进行制造。

概要

本发明提供了同时进行多重分析的自动方法。(即，参见美国专利5,545,531)。本发明的方法能够设置多个试验并且一起进行。在本发明的一些优选方法中，提供了具有多个微孔的微孔板多个。每个微孔可能包含一个或者多个阵列。可能包含靶分子的试验样品被引入微孔中。液体送运装置将微孔暴露于一套选择的反应条件下，例如从微孔中添加或除去液体，在预定的温度下将液体保留在微孔中，以及根据需要搅动微孔并由此进行试验。然后，阵列读出器检测微孔中的探针阵列，由此获得试验的结果。具有合适程序的计算机可进一步分析试验的结果。

参考图1，本发明的一个实施方案是同时进行矩阵分析的系统。所述系统包含微孔板读出器100，液体的送运装置110，微孔板120以及任选的计算机130。操作中，用液体送运装置110将样品放置于阵列板120上的微孔中。微孔板任选地可用站平移装置140进行移动。很清楚可以使用其它装置将微孔板相对于读出器进行平移。读出器100用来鉴定在微孔中靶结合到互补探针的什么位点。系统在计算机130的控制下进行操作，所述计算机130可能任选地解释分析的结果。参见美国专利6,225,625以及5,835,758。

A.读出器

在阵列上进行的分析中，可检测标记的靶分子与探针分子结合。分析结果的读取包括检测由可检测标记产生的信号。读取阵列板上的分析需要读出器。因此，靶与互补探针结合的位置可通过检测标记的位置进行鉴定。通过探针对比位置的特征/序列的知识，可以确定靶的特征。阵列读出器的特性依赖于附着于靶分子的标记的特定类型。参见美国专利6,225,625；6,040,138；6,309,822；和6,495,320。

靶以及探针之间的相互作用可通过动力学以及热力学进行鉴定。同样地，也许需要检测与标记靶溶液接触的阵列。在这种系统中，必须严格选择能够辨别结合表面以及溶于溶液的靶之间区别的检测系统。同样，为了进行定量分析，高密度的探针序列需要能够区别每个特征位点的系统。系统同样应该具有识别低信号以及大动态范围的灵敏度。

在一个实施方案中，读出器包含一共焦检测装置，具有单色的或多色光源、用于从光源将激发光对准基质的聚焦系统、在反应期间控制基质温度的温度控制器，以及检测由靶响应激发光发射的荧光的检波器。在一些实施方案中，检测从基质发射荧光的检测器包含一光电倍增管。光对准的位置可由例如，x-y-z转换表进行控制。x-y-z转换表的转换、温度控制以及数据收集由适当程序设计的数字计算机进行控制和记录。

检测阵列上荧光标记材料更详细的方法提供于美国专利5,631,734；6,225,625；和5,835,758中，此处全部引入作为通用的参考。

图2图解了一具体实施方案的读出器。读出器包括用于固定阵列板的主体200。来自具有第一个波长的激发源210的激发辐射优选地从阵列底下穿过激发光学装置220。然而，可以采用其它方向。因为它对至少这个波长的光是透光的，因此光穿过阵列板。激发辐射刺激阵列板230上的探针阵列区域。

作为应答，在样品上标记的材料发射具有不同于激发波长的波长的射线。然后，优选地也在阵列底下(但可能位于另一位置)的收集光学装置240收集来自样品的发射并将其映射到检测器250上，如下所述检测器250可容纳CCD阵列。可以使用交替光检测装置。检测器产生与其上感应的辐射量成正比的信号。所述信号可汇编起来表示与发射发生的多个区域相关的映射。

根据一种实施方案，多轴转换站260将阵列板移向待扫描不同微孔的位置，并检测探针阵列的不同探针部分。结果，获得每个微孔中探针分析的2-维映射。也应该理解检测器、光学装置或激发能源之间的相对平移例如是可能的。

读出器可包含自聚焦装置从而在整个扫描过程中将样品维持在激发光的聚焦平面上。另外，可以使用温度控制器从而当正在扫描时保持样品在一特定的温度下。通过适当程序设计的数字计算机270控制多轴转换站、温度控制器、自聚焦装置以及与映射和数据收集相关的电子设备。

在一个实施方案中，利用例如显微镜的物镜或其它光学装置控制光束直径将光束聚焦在微孔板表面上直径为约2μm的点上。(参见，例如美国专利5,631,734。)

在另一实施方案中，荧光探针与CCD成像系统组合使用。这个方法的详述描述在美国专利5,578,832中，此处全部引入作为参考。多个可以市售获得的微孔板读出器中，一般光源放置在微孔上，光电二极管探测器位于微孔下面。在本发明中，光源可用较高功率的灯或激光器代替。在一个实施方案中，使用标准吸收几何结构，但是用CCD摄像机和成象光学设备代替光电二极管探测器以快速映射微孔。一系列拉曼全息照相用或凹痕过滤器可被用于光程中除去激发光，同时将发射传到检测器。在这个方法的变化中，光学纤维映射束被用于产生发射到CCD检测器的光。在另一实施方案中，激光器位于阵列板的底下并且光对准通过透光晶片或形成阵列板底部的基体。在另一实施方案中，CCD阵列做成阵列板的晶片。

CCD阵列的选择将依赖于每个阵列中探针的数目。如果检验名义上正方形(50×50)排列的2500个探针，对每个部件中的6行进行取样以获得良好的映射，则在这个区域需要300×300像素的CCD阵列。然而，如果单独的微孔具有48,400个探针(220×220)，那么需要具有1320×1320像素的CCD阵列。CCD检测器可以从，PrincetonInstruments，市售获得，其可满足每一个这些需要。

在另一实施方案中，检测装置包括行扫描仪，描述在美国专利5,578,832中，此处引入作为参考。激发光学装置将激发光聚焦在样品的一行中，同时扫描或映射样品的一条。表面结合的样品的标记靶响应光照发荧光。收集光学装置映射发射光到光检测器的线性阵列上。通过使用共聚焦技术，实质上只映射来自光聚焦平面的发射光。一旦已经扫描一条，表示1-维映射的数据将存储在计算机的存储器中。根据一种实施方案，多轴转换站以恒定的速度移动装置从而连续地汇集和整理数据。或者，可以使用galvometric扫描器或旋转多面反光镜扫描穿过样品的激发光。结果，获得样品的2-维映射。参见美国专利5,545,901，6,207,960，和6,335,824。

在另一实施方案中，收集光学装置对准发射到一摄谱仪，其映射发射光谱到光探测器的2维阵列上。通过使用摄谱仪，获得样品完全的光谱解析映射。

全部微量滴定板的读出时间将依赖于荧光团的光物理学特征(即，荧光量子产率和光裂解率)以及检测器的灵敏性。对于荧光素而言，在约30秒利用来自氩离子激光器或灯的3mW/cm²和488纳米的激发，用CCD检测器读取芯片映射可获得足够的信号噪音比。通过增加激光功率，并且选择具有低光裂解率、以及其发射更接近匹配CCD检测器的感光度峰值的诸如CY3或CY5的染料，可以在少于5秒内容易地读取每个微孔。因此，可以在少于10分钟内定量检验全部微孔板，即使全部微孔板具有超过4.5百万个探针。

计算机可将数据转化成另外用于显示的形式。数据分析可以包含测定，例如，来自收集的数据作为基质位置函数的荧光强度，除去“异常值”(偏离预定统计分布的数据)，以及从保留的数据计算靶相对结合亲合力的步骤。根据光发射或靶和其探针之间的光发射或者结合亲合力的不同，结果数据可显示为在每个不同区域用颜色表示的映射。

这个系统的一个应用是，当与促进试验操作性能的CCD成像系统结合时，通过检验杂交进行率或者中断率获得分析的结果。在这个方法的一个实施方案中，探针与样品接触后在一些时点测定在每个位置的结合量。总的杂交量可确定为基于在每个时间点结合量的结合动力学函数。因此，不需要等到达到平衡。依赖于温度、样品搅动、洗涤条件(例如pH、溶剂特征、温度)的不同寡核苷酸的杂交率可以很容易的确定以便最佳化比率和信号噪音比的条件。可替换的方法描述在Fodor等人的美国专利5,324,633中，此处全部引入作为通用的参考。参见美国专利6,040,138和6,495,320。

B.液体的送运装置和分析自动化

阵列通常包含将阵列与样品在选择的反应条件下接触，选择性地洗涤微孔除去未反应的分子，以及分析阵列证明靶分子和探针之间的反应。参见美国专利6,495,320。这些步骤包括输送液体。本发明的方法自动进行这些步骤从而能够同时进行多重分析。因此，本发明使用自动化液体送运系统用于同时进行每一微孔中的分析步骤。液体的送运允许微孔中样品的均一化处理。微滴定机器人以及液体输送装置可以从例如Tecan AG市售获得。

微孔板被引入液体递送装置的固定器上。这个机器人装置被编程设置到诸如温度的合适的反应条件，加样品到微孔，温育试验样品合适的时间，除去未反应的样品，洗涤微孔，酌情加入基质并进行检测分析。具体的反应条件依赖于分析的目的而不同。例如，在涉及DNA杂交的测序分析中，选择标准的杂交条件。然而，分析可能包括测定样品是否包含与探针在具体的反应条件下与探针反应的靶分子。在这种情况下，据此选择反应条件。

C.阵列板

图3表明在发明的方法中使用的基于标准96-孔微量滴定板的一阵列板300的例子，其中阵列位于微孔的底部。阵列板包含多个微孔310，每个微孔限定一区域或空间用于导入样品，并且每个微孔包括一阵列320，即，一基质和一吸附探针阵列的表面，探针暴露于空腔的内部。附图7显示本发明阵列板的微孔的自顶向下视图，其中在微孔的底面包含阵列。

本发明涉及阵列板的多个实施方案。在一优选的实施方案中，如图4所示，阵列板包含两个部件。一个部件是包含多个阵列420的晶片410。另一个部件是阵列板的主体430，其包含形成微孔的通道440，但是所述微孔在两端是敞开的直到连接上阵列板。主体连接晶片的表面使得关闭通道的一端由此产生微孔。通道壁位于晶片上以便每个围绕和包括一个阵列。附图5表明本实施方案的一横截面，显示晶片510具有一基质520(优选地透光)和附着探针540阵列的表面530。空腔在晶片上围绕阵列由此产生微孔560。晶片可通过任何本领域公知的附着手段连接主体上，例如通过胶粘(例如，通过紫外线-固化粘合剂或不同的胶粘带)，声学焊接，密封诸如真空或吸力密封，以至通过依靠晶片上主体的重量抵抗微孔之间的流体流动进行。

在另一优选的实施方案中，如图6中的横截面，阵列板包含一具有预形成的微孔620的主体610，其通常是平底的。单独的阵列630连接微孔的底部以便包含探针640的阵列的表面暴露于样品放置的微孔空间。

在另一实施方案中，阵列板具有多个探针阵列以及耐受围绕每个探针阵列的液体样品流动的材料制成的晶片。例如，在用于检测基于水的样品的实施方案中，晶片可用蜡、胶带或其它疏水材料在阵列之间的空间进行划痕形成作为微孔的小室。因此小室包含通过抵抗溢出栅栏以及低抗进入另一小室的方式应用于阵列的液体。如果样品包含非水溶剂，诸如乙醇，选择对于溶剂的侵蚀有抗性的材料。

本发明的阵列板具有多个可以各种方式排列的微孔。在一个实施方案中，阵列板具有以8×12形式排列的96微孔的标准尺寸微量滴定板的常规大小与形状。这种形式的一个优点是已经存在微量滴定板上用于输送以及读取分析的测试设备。因此，在阵列分析中利用这种微孔板不包括大规模的重建市售获得的液体送运装置。然而，所述阵列板也可具有其它形式。

制造阵列板的材料依赖于它所实施的应用进行选择。尤其是，本发明涉及各种已经用于微量滴定板的聚合物，例如(聚)四氟乙烯(PTFE)，(聚)亚乙烯基二氟化物(PVD)，聚丙烯，聚苯乙烯，丙稀腈丁苯二烯(ABS)，Cyrolite G-20 Hi Flow(基于丙烯酸的共聚物)，或其可市售获得的组合。当通过将激发光束穿过阵列板底部，穿过阵列板的底部收集数据进行分析时，阵列板的主体以及阵列的基质应该通透所使用波长的光。

微孔板的微孔中探针阵列的排列依赖于所涉及的具体应用。例如，对于涉及在多个样品上进行相同测定的诊断应用，每个微孔可具有相同的探针阵列。如果在每个样品上进行一些不同的试验，每排阵列板可具有相同的探针阵列并且每个列可包含不同的阵列。来自单个病人的样品被引入特定列的微孔中。来自不同病人的样品被引入不同列的微孔中。在另一实施方案中，多个病人样品被引入单个微孔中。如果一微孔对特定特性显示“阳性”结果，在每个不同微孔中来自每个病人的样品进行重新处理以测定哪个病人的样品产生阳性结果。

D.阵列

本发明方法中使用的阵列板包含阵列。探针序列的阵列可根据在下列美国专利中公开的最新技术制造在阵列上：5,143,854，5,744,305，5,968,740或者5,571,639，此处引入作为通用的参考。光刻法和制造技术的组合可能例如使每个探针序列(“部件”)占有支持物上每个微小区域(“位点”或“位置”)。在一些实施方案中，这个部件位点可以小到几微米以至单个分子。例如，0.25mm²的探针阵列(约适合典型的96孔微量滴定板的尺寸)可具有至少10，100，1000，10⁴，10⁵或10⁶个部件。在可选择的实施方案中，可以根据在下列美国专利中公开的机械工艺进行这种合成：5,384,261中，此处引入作为参考。可以利用包含点样的可选择的技术生产阵列。参见美国专利6,040,193。

参考附图8，通常在基质上提供接头分子，-O-X。基质优选为平坦的，但是可能具有各种可选择的表面构形。例如，基质可能包含探针所位于的提高或降低的区域。基质及其表面优选地在可形成样品的坚硬支持物上形成。也选择提供合适的吸收光特征的基质及其表面。例如，基质可能是功能玻璃、Si、Ge、GaAs、GaP、SiO₂、SiN₄、改性的硅或任何一种各式各样的凝胶或聚合物诸如(聚)四氟乙烯，(聚)亚乙烯基二氟化物(PVD)，聚苯乙烯，olycarbonate，聚丙烯或其组合。其它基质材料根据本公开对于本领域技术人员而言是显而易见的。在一优选的实施方案中，基质是平面玻璃或硅石。

固体基质上的表面通常虽然未必总是由与基质一样的材料制成。因此，表面可用任何各式各样的材料制成，例如聚合物、塑料、树脂、多糖、硅石或基于硅石的材料、碳、金属、无机玻璃、膜或任何上述列举的基质材料。在一个实施方案中，表面将是透光的并且将具有诸如在硅石表面上具有的表面Si-OH功能性。

接头分子的末端具备用可光去除的保护基团O-X保护的活性官能团。利用光刻方法，可光去除的保护层穿过避光膜M₁暴露于光、hv，所述避光膜暴露了选择的部分表面，然后从第一选择区域除去接头分子。然后冲洗基质或与第一单体接触，所述第一单体与接头分子(-T-X)上暴露的官能团反应。在核酸的情况下，单体可以是亚磷酰胺激活的核苷，其在5′-羟基用对光不稳定的保护基保护起来。参见美国专利5,959,098。

其后，通过避光膜M₂暴露于光的第二套选择的区域以及在连接分子/带保护基的氨基酸或核苷酸上的可光去除的保护基在第二套区域去除。然后将基质与第二个单体接触，所述第二单体包含用于与暴露的官能团反应的可光去除的保护基。重复这个过程有选择地运用单体直到获得期望长度以及期望化学序列的聚合物。然后选择性地除去对光不稳定的基团，其后选择性地加帽。如果存在也去除侧链保护基。

通过曝光除去保护基合成探针，将单体连接到暴露的活性部位，以及对未反应的位点加帽的常规过程在这里是指“可检测光的探针合成”。如果探针是寡核苷酸，所述过程是指“可以检测光的寡核苷酸的合成”等等。

探针可以由任何分子制成，其合成涉及单位的顺序添加。这包括由系列连接的单位以及分子组成的聚合物，所述单位以及分子具有加入不同官能团的通常主链。用作本发明探针的聚合物包括，例如核酸的线性以及环聚合物、多糖、磷脂以及具有α-，β-或ω-氨基酸的肽、其中已知的药物共价结合到任何上述聚合物的杂聚物、聚氨酯、聚酯、聚碳酸酯、聚脲、聚酰胺、聚乙烯亚胺、聚芳烯硫化物、聚硅氧烷、聚酰亚胺、聚乙酸酯或其它对于本公开显而易见的聚合物。具有普通骨架的分子包含苯二氮及其它小分子，诸如描述在美国专利5,288,514中，此处引入作为参考。

优选地，探针排列在选定的排和列的阵列上，其中所述阵列的尺寸符合阵列板微孔的尺寸。已经发展了从这种阵列读取信息的技术。可以存储在每个阵列板上的信息量依赖于用来合成晶片的密度。例如，如果每个部件尺寸在一侧约100微米，每个阵列在1cm²区域可以具有约10,000个探针码址。具有96个微孔的阵列板将包含约192,000个探针。然而，如果阵列在一侧具有20微米的部件尺寸，每个阵列可以具有接近于50,000个探针并且阵列板将具有超过4,800,000个探针。

阵列中探针和它们的组织的选择依赖于阵列所实施的应用。在一个实施方案中，阵列用来测序或重测序核酸分子或者将它们的序列与参照分子进行比较。重测序核酸分子涉及确定特定的分子是否与参考分子的序列具有任何的差异。例如，在一个实施方案中，阵列板用来鉴定一组病人样品中HIV的特定类型。核酸序列检验的Tiling策略描述在美国专利申请08/284,064(PCT/US94/12305)(W095/11995)中，此处引入参考。

在典型的诊断应用中，包含待鉴定的一种或者多种靶的溶液(即，来自病人的样品)接触探针阵列。靶将与互补探针序列结合或杂交。据此，应该选择序列针对(即具有至少一些互补性)待检测的靶序列的探针，例如人或病原体序列。通常，用可检测的标记标记所述靶。可检测的标记可以是，例如光标记、光散射标记或放射性标记。因此，靶与互补探针杂交的位置可以通过定位标记进行鉴定。基于杂交发生的位置，可以提取关于靶序列的信息。突变的存在可以通过将靶序列与野生型序列比较进行确定。参见美国专利6,309,822。

在一优选的实施方案中，可检测的标记是光标记。有用的发光标记包含荧光标记、化学发光标记、生物发光标记以及比色标记。最优选地，标记是诸如荧光素的荧光标记、若丹明、地高辛配基、德克萨斯红、青色素-3、青色素-5等。荧光标记包含，可以市售获得的荧光素亚磷酰胺，诸如Fluoreprime(Pharmacia)，Fluoredite(Millipore)和FAM(ABI)。例如，基质的全部表面暴露于激活的荧光亚磷酰胺，其与所有去保护的5′-羟基反应。然后全部基质暴露于碱性溶液(例如50％的乙二胺乙醇溶液中，室温下1-2小时)。需要从荧光素标记除去保护基。

为了避免阵列表面上荧光团的之间自淬灭相互作用，荧光标记单体应该用等效反应的非荧光类似物进行稀释。例如，在上述提到的荧光素亚磷酰胺的情况下，反应物用诸如标准5′-DMT-核苷亚磷酰胺的非荧光亚磷酰胺进行1∶20比例的稀释已经被认为是适当的。可以通过例行测试确定荧光试剂的背景非特异性结合及其它这种作用的校正值。

有用的光散射标记包含较大胶体以及特别是诸如来自黄金、硒以及二氧化钛的金属胶体。参见美国专利6,294,327。

放射性标记包含例如32^P。这个标记可以通过磷酸成象仪检测。当然检测依赖于成象仪的分辨率。磷酸成象仪可具有50微米的分辨率。因此，这个标记现在可用于具有那个尺寸部件的阵列。

在附图9表明的本发明的一个优选的实施方案中，阵列板900包含两个部件。一个部件是包含多个阵列的晶片930。另一个部件是微孔板920的主体，其包括多个网格形状的空腔形成微孔910的壁940。粘合剂950的涂层被施用于晶片上，其中粘合剂可以通过暴露于空气、UV光、加热、压力或这些的任何组合进行固化。然后将晶片附着于主体上以便关闭主体的一个表面由此产生微孔。空腔壁位于晶片上以便每个围绕和包括一个阵列。附图9d表明这个实施方案的横截面的详述，图解了连接主体的晶片930。空腔壁940覆盖晶片上的一阵列由此产生微孔空间。晶片可以通过粘合剂连接主体上，其中粘合剂可以通过紫外线灯、热压或这些的任何组合或其它普通已知方法进行固化。(即，具有220-259cps粘度以及可在3J/cm²固化的UV固化粘合剂，诸如例如从Dymax市售获得)。

描述在图10A-10c中的本发明另一优选的实施方案中，阵列板包含两个部件。一个部件是包含多个阵列的晶片1050。另一个部件是微孔板1040的主体，其包括多个网格形状的空腔形成微孔1020的壁1030。垫圈或O形圈1070可以位于主体一个表面的壁上以便防止粘合剂在微孔之间的渗漏。微孔的壁在主体的一个表面具有一凹槽1060用于放置粘合晶片到主体上的粘合剂，从而封闭主体的一个表面由此产生微孔。空腔壁位于晶片上以便每个围绕和封闭一个阵列。

描述在图11A-11C的本发明另一个实施方案中，阵列板包含3个部件。一个部件是包含多个阵列的晶片1110。第二部件是微孔板1120的主体，其包括多个手柄形状的空腔形成微孔1140的壁1130。垫圈或O形圈1150位于主体一个表面的壁上以便防止粘合剂在微孔之间的渗漏。另一个部件是压板1160用来固定晶片靠着主体以便封闭主体的一个表面由此产生微孔。空腔壁位于晶片上以便每个围绕和封闭一个阵列。压板连接连接晶片外侧周边的主体上。压板通过任何本领域公知的附着手段连接主体上，例如通过粘合剂，螺旋，超声波焊接或揿钮。

描述在图12A-12D的本发明的另一优选的实施方案中，阵列板包含两个部件。一个部件是多个单独的阵列1220。另一部件是微孔板1210的主体，其包含多个网格形状的空腔形成微孔1240的壁1230，其中主体在一个表面每个微孔的周边具有小袋1250以便俘获单独的阵列从而封闭主体的一个表面由此产生微孔。单独的阵列通过任何本领域公知的附着手段连接主体的小袋上，例如通过粘合剂，螺旋，超声波焊接或揿钮。单独的阵列可以选择性地用一个或者多个压板连接主体的小袋，其中压板可以用超声波焊接、揿钮或胶合到主体上。

参考图13，描述了本发明的另一个实施方案。阵列板包含3个部件。一个部件是多个单独的阵列1340。另一部件是微孔板1310的主体，其包含多个手柄形状的空腔形成微孔1330的壁1320，其中主体在一个表面每个微孔的周边具有较高边缘1350的小袋以便俘获单独的阵列从而封闭主体的一个表面，由此产生微孔。另一个部件是一加热板或超声波焊头，其中加热板或超声波焊头用于熔化主体小袋的高边缘以便俘获单独的阵列从而封闭主体的一个表面，由此产生微孔。单独阵列俘获到主体上可以一次俘获一个阵列或一次俘获几个阵列。本发明的其它实施方案，垫圈或O形圈可能直接连接高壁内部沿着阵列的周边的主体上。当壁通过超声波焊接熔化或进行锻造时，垫圈压缩靠着阵列，将阵列密封在微孔中。

E.应用

本发明的方法尤其是可用于需要高通量的样品。尤其是，本发明可用于临床设备并用于测序例如与人基因组计划相关的大量DNA。

临床设备需要在多个病人样品上进行相同的试验。当试验在阵列上适当进行时，本发明的自动化方法可以用于这些应用。例如，DNA阵列可以基于试验株的DNA序列的特性确定致病生物的特定品种。基于这些分析的先进技术现在可以被引入临床中。来自一些病人的液体样品被引入阵列的微孔中并同时进行分析。

在一些实施方案中，也许需要在多个病人样品上同时进行多重试验。根据这种实施方案，微量滴定板的行(或列)将包含用于诊断特定疾病或特性的探针阵列。例如，一行可能包含设计用于特定癌症的探针阵列，而其它行包含用于另一癌症的探针阵列。然后将病人的样品引入微量滴定板的各列(或行)。例如，一列可被用来引入一个病人的样品，另一列引入另一个病人的样品。因此，可以对多个病人平行进行多重诊断性试验。在更进一步的实施方案中，多个病人样品被引入单个微孔中。在一指示遗传疾病或其它特性存在的特定微孔中，然后分别对将每个病人的样品进行处理以鉴定哪个病人显示那个疾病或特性。对于相对罕有发生的特性，依据这种实施方案可以获得进一步数量级的效率。

在自动化中可以应用的特定分析包含具体设计以检测或鉴定致病生物诸如HIV特定变体的分析。也包括检测或鉴定人或动物基因的分析。在一个实施方案中，分析是从个体DNA获得或遗传的突变检测人的基因变异，所述变异显示一遗传疾病的存在或倾向。这些包含诸如囊性纤维化、糖尿病、和肌肉萎缩的遗传性疾病，以及诸如癌症(与一些癌症有关的P53基因)的疾病，公开在美国专利申请08/143,312(WO95/11995)中，此处引入作为参考。

本发明提供了在阵列上进行分析的基本上新的方法。虽然提供了具体的的实施例，上述说明是说明性的而非限制性的。本发明的多个变化根据本说明书对于本领域技术人员而言是显而易见的。因此本发明的范围应该参考上述说明书进行确定，然而应该参考附加的权利要求连同它们全部的等效范围进行确定。

在这个申请中引用的所有公开和专利文件在这里全部引入作为参考，程度上与这里单独引用的每个公开物或专利文献上相同。

Claims (6)

1.一种制造阵列板的方法，所述方法包括如下步骤：

a)提供包括多个空腔的主体，其中空腔在两个末端是敞开的，并且在一个末端具有一凹槽；

b)提供在其表面上包括多个阵列的晶片；

c)将粘合剂涂敷到主体的凹槽中；

d)将主体与晶片对准以便将空腔放置于晶片上，其中空腔围绕并封闭一阵列；以及

e)牢固地将晶片连接到主体上从而形成微孔。

2.权利要求1的方法，其中任选地将垫圈或O形圈安放在主体的末端，凹槽定位在此末端以防止在微孔之间的渗漏。

3.一种阵列板，包括：

a)晶片，在其表面上包括多个阵列；

b)主体，包括多个空腔在主体上形成微孔的壁，其中主体在两个末端是敞开的；并且其中主体在一个末端具有一凹槽；

c)所述晶片通过粘合剂牢固地连接到主体的一端，其中粘合剂被涂敷到主体的凹槽上。

4.权利要求3的阵列板，其中任选地将垫圈或O形圈安放在主体末端的主体壁上，凹槽定位在此末端防止微孔之间的渗漏。

5.一种制造阵列板的方法，所述方法包括如下步骤：

a)提供一主体，所述主体包括多个在主体上形成微孔壁的空腔，其中主体在两个末端是敞开的，并且主体在一个末端的壁上具有垫圈或O形圈；

b)提供一晶片，所述晶片在其表面包括多个阵列；

c)提供一压板；

d)将晶片与垫圈或O形圈所放置的主体末端对准以便使空腔位于晶片上，其中空腔围绕并封闭一阵列；

e)通过使用压板牢固地将晶片连接到主体上；以及

f)在晶片周边外侧牢固地将压板连接到主体上。

6.一种阵列板，包括：

a)晶片，在其表面包括多个阵列；

b)主体，包括多个空腔在主体上形成微孔壁，其中主体在两个末端是敞开的；并且其中主体在一端的壁上具有垫圈或O形圈；

c)压板；

d)将所述晶片牢固地连接到主体的末端，其中通过使用压板将垫圈或O形圈固定。

Images