CN1185353C - 一种用于人白细胞抗原基因复合体分型的基因微阵列 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种基因微阵列的设计方法，这种微阵列用于医学中对人白细胞抗原基因复合体分型(HLA)。其特点是把针对人白细胞抗原基因复合体各等位基因的探针固定在各种膜基质上，固定在膜上的各探针位置之间的间距在500μm～1000μm之间，且其最终检测的方法是酶联底物显色法。

Description

一种用于人白细胞抗原基因复合体分型的基因微阵列

本发明涉及生物医学领域，主要是提供一种用于人白细胞抗原(humanleukocyte antigen，HLA)分型的成本低廉的基因微阵列设计方法。

HLA基因复合体位于6p21.3，全长约4000kb，是最复杂的人类遗传多态性系统。HLA为迄今已知基因中多态性最高的基因复合体，现已知的有1200多个等位基因。HLA复合物可分为三个区，分别称之为I、II、III类基因。I类基因包括HLA-A，-B，-C，-E，-H，-G和-F等。II类基因有三个亚区：-DR，-DQ和DP以及-DOB，-DNA等基因，其分子主要分布于抗原呈递细胞表面。HLA基因的多态性与疾病的遗传易感性有明显关系。HLA基因产物控制着对病原的免疫反应，对移植物的耐受或排斥以及肿瘤监视。故在临床上尤其实移植医学，必须对受供体进行HLA分型。传统的HLA分型技术主要有三类，血清学、细胞学和分子生物学检测法。血清学、细胞学HLA分型方法在分型准确性、分辨率和实验操作上有许多不足之处。近年来国内外已将血清学和细胞学的方法逐渐淘汰，主要发展分子生物学的方法来分型。目前分子生物学的方法有多种。主要包括限制性片段长度多态性检测技术、PCR/SSO技术、PCR/SSP技术。但所有这些方法操作都较麻烦，一次只能检测一个或数个等位基因，若要一次检测成百上千个等位基因是不可能的。

90年代以来，基因微阵列(microarray)或称基因芯片(genechip)技术发展很快。所谓基因微阵列是指将各种特定序列的DNA片段(称为探针，probe)，通过微点样或分子操纵和微电子芯片技术等手段集成至玻璃芯片或硅芯片上。应用时，这种集成有众多的探针芯片与处理后的待测样本DNA杂交。如果病人DNA的序列与探针一致，这种精确的配对结合将被标记信号探测出来。如果不配对，意味着有突变，也将为预置的软件所自动识别。它在基础研究中可应用于基因鉴别、快速DNA序列重新测定、基因突变多态性的研究和基因表达活性测定等重要领域。它在医学中可用作分子遗传病的综合诊断，应用于法医学和癌症研究。基因微阵列的主要特点是在很小的区域内集成了大量的探针。这个特点非常适合用于对HLA分型，它比传统的PCR-SSO、PCR-SSP技术效率要高得多。有研究已将微阵列的技术用于HLA分型。但是通常的基因微阵列最终是用荧光显色的，需要昂贵的激光扫描仪来探测信号，使得用户使用成本很高，严重影响了这类产品的推广应用。本发明的主要目的是在于设计一种用于HLA分型的芯片系统，能避免使用昂贵的激光扫描仪。

技术方案：

本发明的实质是提供一种可用于HLA分型的成本低廉的基因微阵列系统设计方法。本发明采用了膜-酶联显色-普通扫描仪扫描的系统。它的基本设计思路和操作的流程是：将探针点于膜上、探针交联、与扩增后的基因杂交、洗涤后与酶联结物孵育、加底物显色、最终判读结果。膜的作用是作为探针的固相支持物，膜的种类有很多，凡能结合核酸的膜基质都可，常见的为尼龙膜和硝酸纤维膜。尼龙膜有不带电荷的、有带正电荷或负电荷的，最理想的是带正电荷的尼龙膜。尼龙膜和硝酸纤维膜可以通过商业途径方便购得，主要生产厂家有德国的Schleicher & Schuel公司、美国的Bio-Rad公司和瑞士的Roche公司。芯片制作时首先将探针溶液用微量点样仪点于尼龙膜上，微量点样仪有多种，常见的自动点样仪生产厂家有美国的Genomic solutions、美国的Cartesion。点样时探针与探针的距离控制在500～1000微米，理想的间距为550～800微米。探针的序列和来源并不限。可以通过化学合成取得，也可以通过PCR(PolymeraseChain Reation)取得。探针的序列取决于要检测的基因序列。点样结束后通过热烘烤的方法或紫外线交联的方式，热烘烤时间一般为80℃2h，紫外交联一般采用254nm的波长，时间为0.5～10分钟，理想的时间是1～5分钟，固定的探针的膜即可与待检的基因杂交，HLA基因位点有27个，通常临床研究较多的是A、B、DRB1、DRP1等位点。待检样本一般要经过PCR技术扩增，扩增时通常要使扩增产物带上一标记物。标记物有多种，常见的是生物素和地高辛。标记的方法也有多种，常用的是在扩增时加入一定量的标记dNTP，最常用的是生物标记的dCTP和dUTP，这些试剂可以方便地通过商业公司构得。也可以在引物合成时标记素(Biotin)上标记物，常见的是生物素标记的引物。带标记的扩增产物与前述固定好探针的膜进行杂交，杂交后洗涤，再通过酶联显色的方法显色。酶联显色的方法有多种，首先酶可以是过氧化物酶和碱性磷酸酶，用过氧化物酶时底物可以是二氨基联苯胺(3’，3’Diaminlobenzidine，DAB)、3，3’，5，5’-四甲基联苯胺(tetramethyl-benzidine，TMB)，理想的底物是TMB，其毒性较低，灵敏度高，当用碱性磷酸酶时，其底物常见的是5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸(5-bromo-4-chloro-3-indoxyl phorsphate，BCIP)/氮蓝四唑(nitro blue tetrazolium，NBT)。这些酶可以接合在多种载体上，载体的选择决定于基因扩增时基因所带的标记。若扩增的基因是带生物素标记时，一般将酶连接在卵白素上，卵白素与生物素有很强的亲和力。若扩增的基因是带地高辛标记时，一般将酶标记在抗地高辛抗体上。这些试剂也可方便地通过商业公司购得。显色后将膜在去离子水中清洗，取出后在吸水纸上吸去多余水分。随后，该膜即可以用于判读信号。信号的判读可以是肉眼观察也可以扫描仪扫描。通常在探针点大于20个以上时，用扫描仪扫描比较快捷，扫描仪是普通的光学扫描仪，一般都是基于CCD的原理，这所指的扫描仪特指非激光扫描仪。扫描后可以人工分析结果，也可通过软件来完成。这种基因阵列的主要用途是HLA基因复合体分型。以下是用微阵列系统制作和检测HLA-A、HLA-B、HLA-DRB1三个位点的基因微阵列实例，但本发明并不限用于该三个实施例。

实施例：

实施例1：HLA-A基因分型基因微阵列设计和检测

膜：购自德国S&S公司的硝酸纤维膜

探针：共25条，其序列如下：

1. TATT TCT TC ACA TCC GTG T

2. TAT TTC TAC ACC TCC GTG T

3. TCT ACA CTT CCG TGT CCC G

4. TAC ACC TCC ATG TCC CGG C

5. GGA ACA CAC GGA AAG TGA A

6. ACA CGG AAT ATG AAG GCC C

7. GAC ACG GAA TGT GAA GGC C

8. TGA AGG CCC AGT CAC AGA

9. TGA AGG CCC ACT CAC AGA

10.TCA CAG ACT CAC CGA GTG G

11.ACA GAC TGA CCG AGT GGA C

12.CCG AGC GAA CCT GGG GAC C

13.CCG AGT GGA CCT GGG GAC

14.CCG AGA GAA CCT GGG GAC C

15.GTG GAC CTG GCG ACC CTG C

16.CAC ACC ATC CAG ATA ATG T

17.CAC ACC GTC CAG AGG ATG T

18.TAC CAG CAG GAC GCT TAC G

19.TAC CAC CAG TAC GCC TAC G

20.TAC CAG CAG GAC GCC TAC G

21.TCG CCT TGA ACG AGG ACC

22.TCG CCC TGA AAG AGG ACC

23.TCA GAT CAC CCA GCG CAA G

24.TCA GAT CAC CAA GCG CAA G

25.GGA GGC GGC CCA TGT GGC G

点样仪：Cartesion公司5510型

探针在膜上的间距：550μm

探针交联在膜上的方法：254nm紫外交联5分钟

引物2条，序列如下：

(1)GGCCTCTG(T/C)GGGGAGAAGCAA

(2)GTCCCAATTGTCTCCCCTCCTT

基因标记方法：PCR时掺入3μmol/L的生物素标记dUTP

酶联结物：辣根过氧化物酶标记的卵白素

酶催化显色底物：TMB

检测扫描仪：Epson 1250 perfection

操作过程大致是：点样、与PCR产物杂交、洗涤、酶联结物孵育、加底物显色，这些步骤与常规的操作过程无异。最终显色后判读结果。

实施例2：HLA-B基因分型基因微阵列设计和检测

膜：购自瑞士Roche公司的正电荷尼龙膜

探针：30条，其序列如下：

1. 5′-TAT TGG GAC GGG GAG ACA C-3′

2. 5′-TAT TGG GAC CGG GAG ACA C-3′

3. 5′-GG GAC CGG AAC ACA CAG A-3′

4. 5′-G AAC ACA CAG ATC TCC AAG-3′

5. 5′-AG ATC TTC AAG ACC AAC AC-3′

6. 5′-AG ATC TGC AAG ACC AAC AC-3′

7. 5′-G AAC ATG AAG GCC TCC GCG-3′

8. 5′-AG AAG TAC AAG CGC CAG GC-3′

9. 5′-CA CAG ATC TAC AAG GCC CA-3′

10.5′-AG ATC TCC AAG ACC AAC AC-3′

11.5′-CAG ATC TAC AAG ACC AAC A-3′

12.5′-GC AAG GCC AAG GCA CAG AC-3′

13.5′-ACT TAC CGA GAG AGC CTG C-3′

14.5′-G ACT TAC CGA GAG AAC CTG-3′

15.5′-A GAG AAC CTG CGG ATC GCG-3′

16.5′-GA GAG AGC CTG CGG AAC CT-3′

17.5′-C CTG CGC ACC GCG CTC CGC-3′

18.5′-G CGG ATC GCG CTC CGC TAC-3′

19.5′-CGG AAC CTG CGC GGC TAC-3′

20.5′-C CTG CTC CGC TAC TAC AAC-3′

21.5′-CTG CGC GGC TAC TAC AAC C-3′

22.5′-AC ACC CTC CAG AGC ATG TA-3′

23.5′-AC ACT TGG CAG AGG ATG TA-3′

24.5′-C CTC CAG AAT ATG TAT GGC-3′

25.5′-G TCT CAC ACC ATC CAG AGG-3′

26.5′-AC ACC CTC CAG AGG ATG TA-3′

27.5′-TC GCA GCC AAA CAT CCT CT-3′

28.5′-C CAG AGG ATG TAC GGC TGC-3′

29.5′-GGC TGC GAC CTG GGG CC(CG)G-3′

30.5′-GAC GGG CGC CTC CTC CGC G-3′

点样仪：Cartesion公司5510型

探针在膜上的间距：600μm

探针交联在膜上的方法：80℃真空烘烤2小时

引物2条，序列如下：

(1)G GGT CCC AGT TCT AAA GTC CCC ACG

(2)CC ATC CCC GGC GAC CTA TAG GAG ATG

基因标记方法：引物5’端标记地高辛

酶联结构：碱性磷酸酶标记的抗地高辛抗体

酶催化显色底物：BCIP/NBT

检测扫描仪：Epson 1250 perfection

操作过程大致是：点样、与PCR产物杂交、洗涤、酶联物孵育、加底物显色，这些步骤与常规的操作过程无异。最终显色后判读结果。

实施例3：HLA-DRB1基因分型基因微阵列设计和检测

膜：购自瑞士Roche公司的正电荷尼龙膜

探针：30条，其序列如下：

1. G TGG CAG CTT AAG TTT GAA T

2. C AGC CTA AGA GGG AGT GTC A

3. A GTA CTC TAC GTC TGA GTG T

4. G GAG CAG GTT AAA CAT GAG T

5. G GAG TAC TCT ACG GGT GAG T

6. G TGG CAG GGT AAG TAT AAG T

7. T GAA GCA GGA TAA GTT TGA G

8. G GAG GAG GTT AAG TTT GAG T

9. G GAG CTG CTT AAG TCT GAG T

10.G CAG TTC CTG GAA AGA CTC T

11.G GTA TCT GCA CAG AGG CAT G

12.T GCG GTA CCT GGA CAG ATA C

13.TTC CTG GAG AGA TAC TTC C

14.A ACC AGG AGG AGA ACG TGC G

15.A CCA GGA GGA GCT CCT GCG C

16.C GCG CGT ACT CCT CTT GGT T

17.C CAG GAG GAG TTC CTG CGC T

18.C CAG GAG GAG TTC GTG CGC T

19.G GCC TAG CGC CGA GTA CTG G

20.G GCC TGA TGA GGA GTA CTG G

21.G GCC TGC TGC GGA GCA CTG G

22.GAAG GAC CTC CTG GAA GAC

23.C TCC TGG AGC AGA GGC GGG C

24.C ACC GCG GCC CGC TTC TGC T

25.A GCA GAA GCG GGC CGC GGT G

26.C TGG AAG ACA GGC GGG CCG

27.T GAA GAC AGG CGG GCC CTG G

28.C CTG GAA GAC AAG CGG GCC G

29.AAG CGG GGC CGG GTG GAC AA

30.C AAC TAC GGG GCT GTG GAG A

点样仪：Cartesion公司5510型

探针在膜上的间距：700μm

探针交联在膜上的方法：80℃真空烘烤2小时

引物2条，序列如下：

(1)CCG GAT CCT TCG TGT CCC CAC AGC ACG

(2)CCG CTG CAC TGT GAA GCT CT

基因标记方法：引物5’端标记生物素

酶联结构：过氧化物酶标记的卵白素

酶催化显色底物：TMB

检测扫描仪：Epson 1250 perfection

操作过程大致是：点样、与PCR产物杂交、洗涤、酶联物孵育、加底物显色，这些步骤与常规的操作过程无异。最终显色后判读结果。

Claims (12)

1.一种用于对人白细胞抗原基因复合体分型的基因微阵列，其特征是它具有固定在膜上的探针并且，所述的探针选自下组：

(a)25条用于HLA-A基因分型的探针，其序列如下：

         1.  TAT TTC TTC ACA TCC GTG T

         2.  TAT TTC TAC ACC TCC GTG T

         3.  TCT ACA CTT CCG TGT CCC G

         4.  TAC ACC TCC ATG TCC CGG C

         5.  GGA ACA CAC GGA AAG TGA A

         6.  ACA CGG AAT ATG AAG GCC C

         7.  GAC ACG GAA TGT GAA GGC C

         8.  TGA AGG CCC AGT CAC AGA

         9.  TGA AGG CCC ACT CAC AGA

         10. TCA CAG ACT CAC CGA GTG G

         11. ACA GAC TGA CCG AGT GGA C

         12. CCG AGC GAA CCT GGG GAC C

         13. CCG AGT GGA CCT GGG GAC

         14. CCG AGA GAA CCT GGG GAC C

         15. GTG GAC CTG GCG ACC CTG C

         16. CAC ACC ATC CAG ATA ATG T

         17. CAC ACC GTC CAG AGG ATG T

         18. TAC CAG CAG GAC GCT TAC G

         19. TAC CAC CAG TAC GCC TAC G

         20. TAC CAG CAG GAC GCC TAC G

         21. TCG CCT TGA ACG AGG ACC

         22. TCG CCC TGAAAG AGG ACC

         23. TCA GAT CAC CCA GCG CAA G

         24. TCA GAT CAC CAA GCG CAA G

         25. GGA GGC GGC CCA TGT GGC G；

(b)30条用于HLA-B基因分型的探针，其序列如下：

         1.  5′-TAT TGG GAC GGG GAG ACA C-3′

         2.   5′-TAT TGG GAC CGG GAG ACA C-3′

         3.   5′-GG GAC CGG AAC ACA CAG A-3′

         4.   5′-G AAC ACA CAG ATC TCC AAG-3′

         5.   5′-AG ATC TTC AAG ACC AAC AC-3′

         6.   5′-AG ATC TGC AAG ACC AAC AC-3′

         7.   5′-G AAC ATG AAG GCC TCC GCG-3′

         8.   5′-AG AAG TAC AAG CGC CAG GC-3′

         9.   5′-CA CAG ATC TAC AAG GCC CA-3′

         10.  5′-AG ATC TCC AAG ACC AAC AC-3′

         11.  5′-CAG ATC TAC AAG ACC AAC A-3′

         12.  5′-GC AAG GCC AAG GCA CAG AC-3′

         13.  5′-ACT TAC CGA GAG AGC CTG C-3′

         14.  5′-G ACT TAC CGA GAG AAC CTG-3′

         15.  5′-A GAG AAC CTG CGG ATC GCG-3′

         16.  5′-GA GAG AGC CTG CGG AAC CT-3′

         17.  5′-C CTG CGC ACC GCG CTC CGC-3′

         18.  5′-G CGG ATC GCG CTC CGC TAC-3′

         19.  5′-CGG AAC CTG CGC GGC TAC-3′

         20.  5′-C CTG CTC CGC TAC TAC AAC-3′

         21.  5′-CTG CGC GGC TAC TAC AAC C-3′

         22.  5′-AC ACC CTC CAG AGC ATG TA-3′

         23.  5′-AC ACT TGG CAG AGG ATG TA-3′

         24.  5′-C CTC CAG AAT ATG TAT GGC-3′

         25.  5′-G TCT CAC ACC ATC CAG AGG-3′

         26.  5′-AC ACC CTC CAG AGG ATG TA-3′

         27.  5′-TC GCA GCC AAA CAT CCT CT-3′

         28.  5′-C CAG AGG ATG TAC GGC TGC-3′

         29.  5′-GGC TGC GAC CTG GGG CC(CG)G-3′

         30.  5′-GAC GGG CGC CTC CTC CGC G-3′；

(c)探针(a)和探针(b)的组合。

2.按权利要求1所述的基因微阵列，其特征是所述探针是固定在尼龙膜上。

3.按权利要求1所述的基因微阵列，其特征是所述探针是固定在硝酸纤维膜上。

4.按权利要求1所述的基因微阵列，其特征是所述的探针还包括以下探针：

(d)30条用于HLA-DRB1基因分型的探针，其序列如下：

         1.   G TGG CAG CTT AAG TTT GAA T

         2.   C AGC CTA AGA GGG AGT GTC A

         3.   A GTA CTC TAC GTC TGA GTG T

         4.   G GAG CAG GTT AAA CAT GAG T

         5.   G GAG TAC TCT ACG GGT GAG T

         6.   G TGG CAG GGT AAG TAT AAG T

         7.   T GAA GCA GGA TAA GTT TGA G

         8.   G GAG GAG GTT AAG TTT GAG T

         9.   G GAG CTG CTT AAG TCT GAG T

         10.  G CAG TTC CTG GAA AGA CTC T

         11.  G GTA TCT GCA CAG AGG CAT G

         12.  T GCG GTA CCT GGA CAG ATA C

         13.  TTC CTG GAG AGA TAC TTC C

         14.  A ACC AGG AGG AGA ACG TGC G

         15.  A CCA GGA GGA GCT CCT GCG C

         16.  C GCG CGT ACT CCT CTT GGT T

         17.  C CAG GAG GAG TTC CTG CGC T

         18.  C CAG GAG GAG TTC GTG CGC T

         19.  G GCC TAG CGC CGA GTA CTG G

         20.  G GCC TGA TGA GGA GTA CTG G

         21.  G GCC TGC TGC GGA GCA CTG G

         22.  G AAG GAC CTC CTG GAA GAC

         23.  C TCC TGG AGC AGA GGC GGG C

         24.  C ACC GCG GCC CGC TTC TGC T

         25.  A GCA GAA GCG GGC CGC GGT G

         26.  C TGG AAG ACA GGC GGG CCG

         27.  T GAA GAC AGG CGG GCC CTG G

         28.  C CTG GAA GAC AAG CGG GCC G

         29.  AAG CGG GGC CGG GTG GAC AA

         30.  C AAC TAC GGG GCT GTG GAG A。

5.按权利要求1所述的基因微阵列，其特征是所述的探针同时包括了用于HLA-A、B、DRB1位点分型检测的探针(a)、探针(b)和探针(d)。

6.按权利要求1所述的基因微阵列，其特征是固定的探针与探针之间的距离为500μm～1000μm。

7.按权利要求2所述的基因微阵列，其中所述的尼龙膜是带正电荷的尼龙膜。

8.如权利要求1所述的基因微阵列的用途，其特征在于，用于通过酶联底物显色法对人白细胞抗原基因复合体进行分型。

9.如权利要求8所述的用途，其特征在于，所述的酶联底物显色法用过氧化物酶催化底物显色。

10.按权利要求8所述的用途，其中所述的酶联底物显色法用碱性磷酸酶催化底物显色。

11.按权利要求9所述的用途，其特征在于，所述的过氧化物酶催化底物显色所用的底物为3，3′，5，5′-四甲基联苯胺。

12.按权利要求10所述的用途，其特征在于，所述的碱性磷酸酶催化底物显色所用的底物为氮蓝四唑/5-溴-4-氯-3-吲哚磷酸。