CN1464910A - Dna芯片的信号扩增方法 - Google Patents
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Abstract
一种DNA芯片的信号扩增方法,确立了用PALSAR法有效使得在DNA芯片上所捕捉的靶基因的信号扩增,进而确立了用PALSAR方法的一对HCP的设计可以简便地检出。利用形成寡核苷酸的2条链的有规则的高级结构的自聚体的自聚反应来提高DNA芯片中的靶基因的检出灵敏度。
Description
技术领域
本发明涉及DNA芯片的信号扩增方法。更详细说,涉及利用形成自聚体的一对寡核苷酸,可以提高作为结合用于捕捉靶基因的基因的支撑体或基板(以下称为支撑体),使用微板型、载玻片型、微粒型、导电性基板型等支撑体的DNA芯片(以下有的总称为DNA芯片)上的靶基因的检出灵敏度的基因信号的扩增方法。
背景技术
DNA芯片是,在表面特殊加工的微板型、载玻片型、微粒型、导电性固相基板型支撑体上高密度固定了多个不同DNA探针之后,把核酸(目标)杂交(参见M.Judy,W.Geoffrey,Hybridization of Nucleic AcidsImmobilized on Solid Supports,Analytical Biochemistry,138,267-284,1984;A.Marshall,J.Hodgson,DNA chips:an array of possibilities,Nat Biotechnol.,16,27-31,1988;JP4135498;JP4135500;JP4135498;JP4135500;US005952172A;US6346387B1和US6180346B1),通过测定核酸(目标)的信号来检出基因。
现在,此技术已经被用于基因的表达解析和变异基因等的检出,不过,与过去已经使用的Southern标绘法(E.M.Southern,Detection of Specificsequences among DNA fragments separated by gel lectrophoresis,J.Mol.Biol.,98,503-517,1975)相比较,存在有检出灵敏度低,为十分之一,反应时间长的问题。
还有,为了提高靶基因的检出灵敏度,已经有使用耐热性DNA连接酶来使DNA扩增的LCR法(USP5,792,607)和耐热性DNA聚合酶来使DNA扩增的PCR法(R.Saiki,S.Scharf,F.Faloona,et al.,Enzymatic amplification ofβ-globin genomic sequence and restriction site analysis for diagnosis of sicklecell anemia,Science,230,1350-1354(1985))等基因扩增法,尽管有事前把靶基因扩增的方法,但是需要复杂的操作,而且成本也高。
基于上述问题,本发明人等报道了不使用酶的新型等温核酸扩增法(USP6,261,846;日本专利3267576和EP1,002,877A)。此方法是,使用由3处区域构成的一对寡核苷酸(蜂窝探针,以下称为HCP)的方法,第1HCP和第2HCP各自在3处区域有互为互补的碱基序列,在两者反应的场合,仅在区域的1处变成杂交样的碱基序列。由此变化,在使多个一对HCP反应的场合,相互杂交,可以由HCP的自聚反应而形成自聚体(Probealternation link self-assembly reaction),以下把此由HCP的自聚反应形成自聚体的方法称为PALSAR法)。
发明内容
鉴于上述已有技术的现状,本发明人等对用上述PALSAR法可以提高DNA芯片的检出灵敏度进行了刻意的研究,所取得的结果完成了本发明。
本发明的目的在于确立通过对在DNA芯片上捕捉的靶基因有效使用PALSAR法来使信号扩增、进而提供通过用PALSAR法的一对HCP的设计可以简便地检出的DNA芯片信号扩增方法。
为了解决上述问题,本发明的DNA芯片信号扩增方法是利用形成寡核苷酸的2条链的有规则的高级结构自聚体的自聚反应来提高DNA芯片中靶基因的检出灵敏度的。
作为上述自聚反应,可以利用:第一,通过用几对具有n(n≥3)处互补部分所构成的探针对的相互交叉杂交来使寡核苷酸自聚、形成2条链自聚体的自聚反应。
作为上述自聚反应,可以利用:第二,含有由把1号和2号一对寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’一侧区域、中央区域和5’一侧区域3个区域,在各寡核苷酸的中央区域形成作为互补的碱基序列的二聚体探针的同时,于3’一侧区域和5’一侧区域形成作为不互补的碱基序列的一对形成二聚体用探针的第1体系和含有多对由把3号和4号一对寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’一侧区域和5’一侧区域2个区域且在各寡核苷酸的3’一侧区域和5’一侧区域形成作为不互补的碱基序列的一对交联探针的第2体系,且把此交联探针作为由形成所述二聚体用探针形成的二聚体交联之可能碱基序列,由此探针(把形成二聚体用探针以及此交联探针统称为探针)的杂交来使寡核苷酸自聚而形成自聚体的自聚反应。
上述探针的碱基序列可以用使第1体系的1号寡核苷酸的3’一侧区域与第2体系的3号寡核苷酸的3’一侧区域、第1体系的2号寡核苷酸的5’一侧区域与第2体系的4号寡核苷酸的5’一侧区域、第2体系的4号寡核苷酸的3’一侧区域与第1体系的2号寡核苷酸的3’一侧区域、第2体系的3号寡核苷酸的5’一侧区域与第1体系的1号寡核苷酸的5’一侧区域各自互补的碱基序列。
还有,上述碱基序列可以用使第1体系的1号寡核苷酸的3’一侧区域与第2体系的3号寡核苷酸的3’一侧区域、第1体系的2号寡核苷酸的5’一侧区域与第2体系的3号寡核苷酸的5’一侧区域、第1体系的2号寡核苷酸的3’一侧区域与第2体系的4号寡核苷酸的3’一侧区域、第1体系的1号寡核苷酸的5’一侧区域与第2体系的4号寡核苷酸的5’一侧区域各自互补的碱基序列。
上述DNA芯片具有结合了用于捕捉靶基因的基因的支撑体,作为所述支撑体用微板型、载玻片型、微粒型和导电性基板型支撑体为合适。所述为板型与微粒型支撑体的材质可以使用塑料或聚苯乙烯等。还有载玻片型支撑体可以使用玻璃或塑料等素材。导电性基板型支撑体上可以使用金电极或铟锡氧化物(ITO)电极等。
上述靶基因中可以使用单链DNA和/或RNA。
上述靶基因中可以使用双链DNA和/或RNA。
上述靶基因中可以使用SNPs(单碱基多态)。
把使用了上述自聚反应的寡核苷酸的碱基序列预先取为与靶基因为互补序列是优选的。
为使所述靶基因与所述自聚体结合,优选使用对于在靶基因的碱基序列与自聚体形成中使用的寡核苷酸的碱基序列具有各自互补区域的结合探针。
对于通过所述靶基因结合的寡核苷酸的自聚反应形成的自聚体,可以使标记探针杂交来检出自聚体的存在。
作为标记探针可以用以发色类酶、发光类酶或用放射性同位素标记的标记探针。
对于所述自聚体,加入具有与核酸结合性质的荧光物质,通过此荧光物质的光化学变化来检出所述自聚体的存在是可能的。
预先用荧光物质标记形成所述自聚体的寡核苷酸,通过荧光物质的光化学变化来检出所述自聚体的存在是可能的。
预先用放射性同位素标记形成所述自聚体的寡核苷酸,通过放射性同位素来检出所述自聚体的存在是可能的。
预先用发色类酶或发光类酶标记形成所述自聚体的寡核苷酸,通过光化学变化来检出所述自聚体的存在是可能的。
所述寡核苷酸是由从DNA、RNA、PNA或LNA中的任一个选出的碱基所构成的。
附图说明
图1是表示本发明的信号扩增方法的工艺顺序的第1~第4例中的步骤100的原理模式图。
图2是表示本发明的信号扩增方法的工艺顺序的第1~第4例中的步骤102的原理模式图。
图3是表示本发明的信号扩增方法的工艺顺序的第1例中的步骤110的原理模式图。
图4是表示本发明的信号扩增方法的工艺顺序的第1例中的步骤114的原理模式图。
图5是表示本发明的信号扩增方法的工艺顺序的第2例中的步骤122的原理模式图。
图6是表示本发明的信号扩增方法的工艺顺序的第2例中的步骤124的原理模式图。
图7是表示本发明的信号扩增方法的工艺顺序的第3例中的步骤130的原理模式图。
图8是表示本发明的信号扩增方法的工艺顺序的第3例中的步骤132的原理模式图。
图9是表示本发明的信号扩增方法的工艺顺序的第3例中的步骤134的原理模式图。
图10是表示本发明的信号扩增方法的工艺顺序的第4例中的步骤144的原理模式图。
图11是表示实施例1~3和比较例1~3的结果的照片。
图12是表示实施例4~6和比较例4~6的结果的照片。
图13是表示实施例7~9和比较例7~9的结果的照片。
图14是表示实施例10~12和比较例10~12的结果的照片。
图15是表示实施例13~15和比较例13~15的结果的照片。
图16是表示实施例16~18和比较例16~18的结果的照片。
图17是表示实验例1~4的结果的照片。
具体实施方式
下面根据附图来说明本发明的实施方式,这些实施方式是示例,只要不脱离本发明技术的技术思想,可以有各种各样的变化方式。
图1~图4是本发明信号扩增方法的工艺顺序第1例的原理模式图。第1例是利用由3个互补区域构成的一对自身可以自聚形成自聚体的寡核苷酸探针(即,一对HCP:HCP-1,HCP-2)利用PALSAR法的DNA芯片信号扩增方法,而且使用了具有与靶基因互补的区域、预先用荧光物质标记的一对HCP的例子。
如图1所示,在作为支撑体使用的载玻片(符号A)上结合具有与靶基因互补区域的捕捉用DNA探针(符号B)(步骤100)。接着,如图2所示,在捕捉靶基因(符号C)(步骤102)之后,如图3所示,结合上述用荧光物质标记了的、具有与靶基因互补区域、自身可以形成自聚体的一个HCP-1(符号D)(步骤110)。以图3所示的DNA芯片为对象,如图4所示,加入另一HCP-2(符号E)(步骤112),由自聚反应形成自聚体,可以使信号扩增(步骤114)。另外,步骤110与步骤112可以同时进行。
图5和图6是表示本发明的信号扩增方法工艺顺序的第2例中的步骤122的原理模式图。第2例是用一对HCP利用PALSAR法的DNA芯片的信号扩增方法,而且用的是具有与靶基因互补区域而没有用荧光物质标记的一对HCP的例子。
在进行了与上述第1例一样的步骤100和102之后,加入一对HCP。在形成自聚体(步骤120)之后,如图5所示,在形成的自聚体中插入嵌入剂(intercalater,符号F)(步骤122),如图6所示,可以把信号扩增(步骤124)。另外,步骤120和步骤122也可能同时进行。
图7~图9是本发明信号扩增方法工艺顺序第3例的原理示意图。第3例是使用形成自身二聚体的一对二聚体形成用探针和可以使由此二聚体形成用探针所形成的二聚体交联的一对交联探针利用PALSAR法的DNA芯片信号扩增方法,使用预先用荧光物质标记的一对二聚体形成用探针(二聚体形成用探针-1,2)的例子。
在进行了与上述第1例一样的步骤100和步骤102之后,如图7所示,使具有与此靶基因互补区域的、自身形成二聚体的二聚体形成用探针-1、2(符号G、H)与靶基因杂交(步骤130)。接着,如图8所示,与对于形成二聚体的二聚体形成用探针-1、2,使具有互补区域的交联探针-1、2(符号I、J)杂交(步骤132),如图9所示,形成二聚体形成用探针与交联探针通过自聚反应而形成了自聚体,可以使信号扩增(步骤134)。另外,步骤130与步骤132也可能同时进行。
图10是本发明信号扩增方法的工艺顺序第4例的原理示意图。第4例是使用形成自身二聚体的一对二聚体形成用探针和可以使由此二聚体形成用探针形成的二聚体交联的一对交联探针用PALSAR法的DNA芯片信号扩增方法,使用具有与靶基因互补区域的一对二聚体形成用探针(二聚体形成用探针-1,2)而二聚体形成用探针和交联探针为没有标记的情况。
在进行了与上述第1例一样的步骤100和步骤102之后,加入一对二聚体形成用探针和一对交联探针,形成了自聚体(步骤140)之后,如图10所示,在形成的自聚体中插入嵌入剂(符号F)(步骤142),可以把信号扩增(步骤144)。另外,步骤140和步骤142也可能同时进行。
在本发明的信号扩增方法中,在一对寡核苷酸探针中作为预先用于检出的标记物质可以是,例如,I125或P32等放射性同位素、异羟基洋地黄毒配质或吖啶鎓酯等发光物质或Cy3 Cy5等荧光物质、用于利用磷酸4-甲基伞形酮酯等荧光物质的生物素(biotin)等、用于利用荧光共振能量转移(FRET)使给体荧光色素与受体荧光色素加成,也可以检出靶基因。
还有,通过加入有与核酸结合的性质的色素来检出靶基因也是可能的。如图5、图6和图10所示,使用嵌入剂那样的具有与核酸结合性质的荧光物质来检出靶基因是合适的。作为荧光物质,只要是具有与核酸结合性质的荧光物质的话,就没有特别的限制,可以使用,例如,SYBR绿I染剂、SYBR绿II染剂、SYBR绿金染剂、粘胶丝绿染剂、Gelstar染剂、Radlant红染剂、Pico绿、Ribo绿、Oll绿、Hoechst 33258(双苯甲酰亚胺)、丙鎓lodide、YO-PRO-1
lodide、YO-PRO-3
lodide(以上由Molecular Probes公司生产)、溴化乙鎓、偏端霉素A、TOTO、补骨脂灵、吖啶橙、AOAO(均二聚体)等。
构成上述一对寡核苷酸的核酸通常是由DNA或RNA构成的,即使是核酸类似物也无所谓。作为核酸类似物列举有,例如,肽核酸(PNA,WO92/20702)或锁核酸(LNA,Koshkin AA et al.,Tetrahedron,1998,54,3607-3630,Koshkin AA et al.,J.Am.Chem.Soc.,1998,120,13252-13253,Wahlestedt C et al.,PNAS.,2000,97,5633-5638.)。还有,一对寡核苷酸探针通常是由同一种类的核酸所构成的,不过由例如DNA探针与RNA探针成为一对也无所谓。即,探针核酸的种类可以从DNA、RNA或核酸类似物(例如PNA或LNA)中来选择。另外,一个探针内的核酸组成没有必要只是一种例如DNA所构成,根据需要,使用例如由DNA和RNA构成的寡核苷酸探针(嵌合体探针)也是可能的,这也包括在本发明之内。
寡核苷酸探针的各互补碱基序列区域的长度是,以碱基数来说,至少要5个碱基,优选10个~100个碱基,进一步优选是15个~30个碱基。
这些探针可以用已知方法来合成。例如,DNA探针的场合,可以使用应用生物系统公司(Applied Biosystem Inc.)的DNA合成装置394型通过磷酸酰胺法来合成。作为其它的方法,还有磷酸三酯法、H-磷酸盐法、硫代磷酸盐法等,不过,用任何方法合成都行。
本发明是,对于在DNA芯片上捕捉的靶基因,以具有互补区域的一对HCP或一对形成二聚体用探针和一对交联探针来形成自聚体。虽然对于所使用的寡核苷酸探针的数目没有特别的限制,不过选用在102~1015范围之内。对反应缓冲液的组成、浓度也没有特别的限制,可以合适使用在核酸扩增中常用的普通缓冲液。pH也选在常用的范围内,优选pH7.0~9.0范围。反应温度为40℃~80℃,优选55℃~65℃。
本发明中,测定靶基因(DNA和/或RNA)用的样品可以使用有可能含此核酸的所有样品。靶基因可以是由样品适当调制或分离者也行。没有特别的限制。列举有,例如,血液、血清、尿、粪便、脑脊髓液、组织液、细胞培养物等来自于生物体的样品、含有或可能感染了病毒、细菌、霉菌等的样品等。还有,也可以用已知方法扩增后的DNA和/或RNA等核酸来用作样品中的靶基因。
实施例
以下列举的本发明的实施例进行进一步具体说明,由于这些实施例是示例,不可以解释成只限于这些。
(1)材料
以下示出实施例中所用的寡核苷酸探针。
[1]探针1:捕捉用DNA探针-1a
5’-NH2-AAAAAAGCGG GAAATCGTGC GTGACATTAA-3’
[2]探针2:靶基因-1
5’-CGTGGCCATC TCTTGCTCGA AGTCCAGGGC GACGTAGCACAGCTTCTCCT TAATGTCACG CACGATTTCC CGCTCGGCCG-3’
[3]探针3:HCP-1
5’-CCTGGACTTC GAGCAAGAGA TGGCCGGCAC CACCATGTACCCTGGCATTG GTCCACCGCA AATGCTTCTA GGCGG-3’
[4]探针4:HCP-2
5’-GGCCATCTCT TGCTCGAAGT CCAGGCAATG CCAGGGTACATGGTGGTGCC CCGCCTAGAA GCATTTGCGG TGGAC-3’
[5]探针5:HCP-3
5’-CCCTGGACTT CGAGCAAGAG CGTGGACATC CGCAAAGACCGCAGGAGTAT GACGAGTCCG-3’
[6]探针6:HCP-4
5’-CTCTTGCTCG AAGTCCAGGG GGTCTTTGCG GATGTCCACGCGGACTCGTC ATACTCCTGC-3’
[7]探针7:二聚体形成用探针-1
5’-GACTTCGAGC AAGAGATGGC CCTGATAGGG TGCTTGCGAGCCATTGGCAA TGAGCGGTTC-3’
[8]探针8:二聚体形成用探针-2
5’-GAGCATCCCC CAAAGTTCAC CTCGCAAGCA CCCTATCAGGGTGGCATCCA CGAAACTACC-3’
[9]探针9:交联探针-1
5’-GCCATCTCTT GCTCGAAGTC GAACCGCTCA TTGCCAATGG-3’
[10]探针10:交联探针-2
5’-GTGAACTTTG GGGGATGCTC GGTAGTTTCG TGGATGCCAC-3’
[11]探针11:捕捉用DNA探针-2a
5’-NH2-GATCAGACAC TTCAAGGTCT CTGGCGCTTTAAGATTAGCC TGCGTCCGAT-3’
[12]探针12:捕捉用DNA探针-1b
5’-NH2-AAAAAAGCGG GAAATCGTGC GTGACATTAAGGAGAAGCTG-3’
[13]探针13:靶基因-2
5’-TGCTTCTTCT GTGGGTAACG TCCAGTTAAT CAGCTCTTAACCTATCAACC CTCCAACTAG CTAATCGGAC GCAGGCTAATCTTAAAGCGC CAGGCCCGAA-3’
[14]探针14:HCP-5
5’-GAGGGTTGAT AGGTTAAGAG CTGGTAGAGA TCGGAAGGAACACCAGCAGC AAACGCGATA AGTTGACCG-3’
[15]探针15:HCP-6
5’-CAGCTCTTAA CCTATCAACC CTCCTGGTGT TCCTTCCGATCTCTACCGGT CAACTTATCG CGTTTGCTG-3’
[16]探针16:捕捉用DNA探针-2b
5’-SH-GATCAGACAC TTCAAGGTCT CTGGCGCTTTAAGATTAGCC TGCGTCCGAT-3’
作为杂交液,用的是(0.8μg/μL聚dA,0.1μg/μL酵母tRNA,0.15μg/μL人Cot-I DNA,5×Denhardt’s液,0.1mg/mL Sarmon sperm DNA,0.2%SDS,6×SSC)的杂交液。(实施例1~3和比较例1~3)(1)目的
用Cy3标记的一对HCP(HCP-1和HCP-2)来研究信号扩增效果。(2)材料(实施例1~3)
(a)捕捉用探针分别使用在500ng/μL(实施例1)、50ng/μL(实施例2)、5ng/μL(实施例3)中调制的具有与靶基因-1互补区域的捕捉用DNA探针-1a。
(b)作为1次杂交液,把50ng靶基因-1溶解在10μL杂交液中,在95℃加热2min,调制成1次杂交液A。
(c)作为2次杂交液,把25pmol用Cy3标记的HCP-1和25pmol用Cy3标记的HCP-2溶解在10μL杂交液中,在95℃加热2min,调制成2次杂交液A。(比较例1~3)
(a)捕捉用探针分别使用在500ng/μL(比较例1)、50ng/μL(比较例2)、5ng/μL(比较例3)中调制的捕捉用DNA探针-1a。
(b)作为1次杂交液,使用上述的1次杂交液A。
(c)作为2次杂交液,把25pmol用Cy3标记的HCP-1溶解在10μL杂交液中,在95℃加热2min,调制成2次杂交液B。(3)方法
将捕捉用探针把点在载玻片上进行探针固定。在此载玻片的点面上滴下1次杂交液25μL,用盖玻片覆盖后装入杂交室,在42℃静置24h。其后,取出载玻片,在室温的2×SSC、0.1%SDS中把盖玻片拿掉,用2×SSC、0.1%SDS冲洗载玻片。进一步在1×SSC、室温的0.2×SSC中分别静置2min后,用空气喷枪把载玻片干燥。
再在此载玻片的点面上滴下2次杂交液10μL,用盖玻片覆盖后装入杂交室,在42℃静置16h。其后,取出载玻片,在室温的2×SSC、0.1%SDS中把盖玻片拿掉,用2×SSC、0.1%SDS冲洗载玻片。进一步在1×SSC、室温的0.2×SSC中分别静置2min后,用空气喷枪把载玻片干燥。(4)检出方法
用荧光显微镜(580nm)观察上述载玻片。(5)结果
图11示出了实施例1~3和比较例1~3的结果。如图11中所示,形成了自聚体的实施例1~3,与没有形成自聚体的比较例1~3相比,荧光强度的增大非常大。通过利用由Cy3标记的一对HCP的形成自聚体的反应,使得DNA芯片的依赖于捕捉用探针的浓度的信号有明显扩增。(实施例4~6和比较例4~6)(1)目的
用一对HCP(HCP-1和HCP-2)由SYBR绿I来检出。(2)材料(实施例4~6)
(a)捕捉用探针分别使用在500ng/μL(实施例4)、50ng/μL(实施例5)、5ng/μL(实施例6)中调制的捕捉用DNA探针-1a。
(b)作为1次杂交液,使用上述1次杂交液A。
(c)作为2次杂交液,把25pmolHCP-1和25pmolHCP-2溶解在10μL杂交液中,在95℃加热2min,调制成2次杂交液C。(比较例4~6)
(a)捕捉用探针分别使用在500ng/μL(比较例4)、50ng/μL(比较例5)、5ng/μL(比较例6)中调制的捕捉用DNA探针-1a。
(b)作为1次杂交液,使用上述的1次杂交液A。
(c)作为2次杂交液,把25pmolHCP-1溶解在10μL杂交液中,在95℃加热2min,调制成2次杂交液D。(3)方法
按实施例1~3和比较例1~3同样的顺序和条件进行实验。(4)检出方法
把原液用0.5×TBE稀释为1000倍的SYBR绿I滴在载玻片的点面上,在室温静置3min。用室温的0.5×TBE冲洗3次,用空气喷枪干燥,用荧光显微镜(475nm)进行观察。(5)结果
图12示出了实施例4~6和比较例4~6的结果。如图12中所示,形成了自聚体的实施例4~6,与没有形成自聚体的比较例4~6相比,荧光强度的增大非常大。利用一对HCP的形成自聚体的反应由SYBR绿I检出,使得DNA芯片的依赖于捕捉用探针的浓度的信号有明显扩增。(实施例7~9和比较例7~9)(1)目的
用一对HCP(HCP-1和HCP-2)由Pico绿来检出。(2)材料(实施例7~9)
(a)捕捉用探针分别使用在500ng/μL(实施例7)、50ng/μL(实施例8)、5ng/μL(实施例9)中调制的捕捉用DNA探针-1a。
(b)作为1次杂交液,使用上述的1次杂交液A。
(c)作为2次杂交液,使用上述的2次杂交液C。(比较例7~9)
(a)捕捉用探针分别使用在500ng/μL(比较例7)、50ng/μL(比较例8)、5ng/μL(比较例9)中调制的捕捉用DNA探针-1a。
(b)作为1次杂交液,使用上述的1次杂交液A。
(c)作为2次杂交液,使用上述的2次杂交液D。(3)方法
按上述实施例1~3和比较例1~3的(3)同样的顺序和条件进行实验。(4)检出方法
把原液用TE稀释为200倍的Pico绿滴在载玻片的点面上,在室温静置30min。用室温的0.5×TBE冲洗3次,用空气喷枪干燥,用荧光显微镜(475nm)进行观察。(5)结果
图13示出了实施例7~9和比较例7~9的结果。如图13中所示,形成了自聚体的实施例7~9,与没有形成自聚体的比较例7~9相比,荧光强度的增大非常大。利用一对HCP的形成自聚体的反应由Pico绿检出,使得DNA芯片的依赖于捕捉用探针的浓度的信号有明显扩增。(实施例10~12和比较例10~12)(1)目的
用一对HCP(HCP-1和HCP-2)由EtBr来检出。(2)材料(实施例10~12)
(a)捕捉用探针分别使用在500ng/μL(实施例10)、50ng/μL(实施例11)、5ng/μL(实施例12)中调制的捕捉用DNA探针-1a。
(b)作为1次杂交液,使用上述的1次杂交液A。
(c)作为2次杂交液,使用上述的2次杂交液C。(比较例10~12)
(a)捕捉用探针分别使用在500ng/μL(比较例10)、50ng/μL(比较例11)、5ng/μL(比较例11)中调制的捕捉用DNA探针-1a。
(b)作为1次杂交液,使用上述的1次杂交液A。
(c)作为2次杂交液,使用上述的2次杂交液D。(3)方法
按实施例1~3和比较例1~3的(3)同样的顺序和条件进行实验。(4)检出方法
把10μg/μL的EtBr滴在载玻片的点面上,在室温静置30min。用室温的0.5×TBE冲洗3次,用空气喷枪干燥,用荧光显微镜(580nm)进行观察。(5)结果
图14示出了实施例10~12和比较例10~12的结果。如图14中所示,形成了自聚体的实施例10~12,与没有形成自聚体的比较例10~12相比,荧光强度的增大非常大。利用一对HCP的形成自聚体的反应由EtBr检出, 使得DNA芯片的依赖于捕捉用探针的浓度的信号有明显扩增。(实施例13~15和比较例13~15)(1)目的
用一对与实施例1~3的HCP不同的一对HCP(HCP-3和HCP-4)来研究用Cy3标记的一对HPC使信号扩增。(2)材料(实施例13~15)
(a)捕捉用探针分别使用在500ng/μL(实施例13)、50ng/μL(实施例14)、5ng/μL(实施例15)中调制的捕捉用DNA探针-1a。
(b)作为1次杂交液,使用上述的1次杂交液A。
(c)作为2次杂交液,把25pmol用Cy3标记的HCP-3和25pmol用Cy3标记的HCP-4溶解在10μL杂交液中,在95℃加热2min,调制成2次杂交液E。(比较例13~15)
(a)捕捉用探针分别使用在500ng/μL(比较例13)、50ng/μL(比较例14)、5ng/μL(比较例15)中调制的捕捉用DNA探针-1a。
(b)作为1次杂交液,使用上述的1次杂交液A。
(c)作为2次杂交液,把25pmol用Cy3标记的HCP-5溶解在10μL杂交液中,在95℃加热2min,调制成2次杂交液F。(3)方法
将捕捉用探针点在载玻片上进行探针固定。在此载玻片的点面上滴下1次杂交液25μL,用盖玻片覆盖后装入杂交室,在42℃静置2h。其后,取出载玻片,在室温的2×SSC、0.1%SDS中把盖玻片拿掉,用2×SSC、0.1%SDS冲洗载玻片。进一步在1×SSC、室温的0.2×SSC中分别静置2min后,用空气喷枪把载玻片干燥。
再在此载玻片的点面上滴下2次杂交液10μL,用盖玻片覆盖后装入杂交室,在54℃静置6h。其后,取出载玻片,在室温的2×SSC、0.1%SDS中把盖玻片拿掉,用2×SSC、0.1%SDS冲洗载玻片。进一步在1×SSC、室温的0.2×SSC中分别静置2min后,用空气喷枪把载玻片干燥。(4)检出方法
用荧光显微镜(580nm)进行观察上述载玻片。(5)结果
图15示出了实施例13~15和比较例13~15的结果。如图15中所示,形成了自聚体的实施例13~15,与没有形成自聚体的比较例13~15相比,荧光强度的增大非常大。利用一对用Cy3标记的HCP形成自聚体的反应,使得DNA芯片的依赖于捕捉用探针的浓度的信号有明显扩增。通过与实施例1~3的比较可以知道,通过调节一对HCP的碱基序列以及反应条件,可以更提高检出灵敏度。(实施例16~18和比较例16~18)(1)目的
用一对Cy3标记的二聚体形成用探针和一对交联探针来研究信号扩增的效果。(2)材料(实施例16~18)
(a)捕捉用探针分别使用在500ng/μL(实施例16)、50ng/μL(实施例17)、5ng/μL(实施例18)中调制的捕捉用DNA探针-1a。
(b)作为1次杂交液,使用上述的1次杂交液A。
(c)2次杂交液按如下调制:把25pmol用Cy3标记的二聚体形成用探针-1和25pmol用Cy3标记的二聚体形成用探针-2溶解在10μL杂交液中,在95℃加热2min,在45℃静置16h。在其中加入0.5μL的50μM的交联探针-1溶液和50μM的交联探针-2溶液调制成2次杂交液G。(比较例16~18)
(a)捕捉用探针分别使用在500ng/μL(比较例16)、50ng/μL(比较例17)、5ng/μL(比较例18)中调制的捕捉用DNA探针-1a。
(b)作为1次杂交液,使用上述的1次杂交液A。
(c)2次杂交液按如下调制:把25pmol用Cy3标记的二聚体形成用探针和25pmol用Cy3标记的二聚体形成用探针溶解在10μL杂交液中,在95℃加热2min后,在45℃静置16h。在其中加入蒸馏水0.5μL调制成2次杂交液H。(3)方法
将捕捉用探针点在载玻片上进行探针固定。在此载玻片的点面上滴下1次杂交液25μL,用盖玻片覆盖后装入杂交室,在42℃静置2h。其后,取出载玻片,在室温的2×SSC、0.1%SDS中把盖玻片拿掉,用2×SSC、0.1%SDS冲洗载玻片。进一步在1×SSC、室温的0.2×SSC中分别静置2min,用空气喷枪把载玻片干燥。
再在此载玻片的点面上滴下2次杂交液10μL,用盖玻片覆盖后装入杂交室,在58℃静置2h。其后,取出载玻片,在室温的2×SSC、0.1%SDS中把盖玻片拿掉,用2×SSC、0.1%SDS冲载玻片。进一步在1×SSC、室温的0.2×SSC中分别静置2min后,用空气喷枪把载玻片干燥。(4)检出方法
用荧光显微镜(580nm)进行观察上述载玻片。(5)结果
图15示出了实施例16~18和比较例16~18的结果。如图16中所示,形成了自聚体的实施例16~18,与没有形成自聚体的比较例16~18相比,荧光强度的增大非常大。利用用Cy3标记的一对HCP和一对交联探针的形成自聚体的反应,使得DNA芯片的依赖于捕捉用探针的浓度的信号有明显扩增。(实验例1~4)(1)目的
用2种Cy3标记的一对HCP(HCP-3和HCP-4、HCP-5和HCP-6)来研究用HCP使信号扩增的特异性。(2)材料
(a)捕捉用探针使用分别在50pmol/μL或5 pmol/μL调制的具有与靶基因-2互补区域的捕捉用DNA探针2a或具有与靶基因-1互补区域的捕捉用DNA探针1b。
(b)作为实验例1的1次杂交液,使用按如下调制的1次杂交液B:把3pmol靶基因-1溶解在30μL的杂交液X(5×Denhardt’s液,0.1mg/mL Salmon spermDNA,0.2%SDS,6×SSC)中,在95℃加热2min,调制成1次杂交液B。
作为实验例2的1次杂交液,使用按如下调制的1次杂交液C:把3pmol靶基因-2溶解在30μL的杂交液X中,在95℃加热2min后,调制成1次杂交液C。
作为实验例3的1次杂交液,使用按如下调制的1次杂交液D:把各为3pmol靶基因-1和靶基因-2溶解在30μL的杂交液X中,在95℃加热2min,调制成1次杂交液D。
作为实验例4的1次杂交液,使用按如下调制的1次杂交液E:把不加靶基因的30μL杂交液X在95℃加热2min,调制成1次杂交液E。
(c)作为2次杂交液是把各自为30pmol的用Cy3标记的HCP-5、用Cy3标记的HCP-6、用Cy3标记的HCP-3和用Cy3标记的HCP-4溶解在30μL杂交液X中,在95℃加热2min,调制成2次杂交液X。(3)方法
将捕捉用DNA探针-2(50pmol/μL或5 pmol/μL)或捕捉用DNA探针-1b(50pmol/μL或5 pmol/μL)各自点在载玻片上进行探针固定。在原位PCR用室内分别向同样的4片载玻片点滴上25μL1次杂交液B~E,密封后,在42℃静置2h。其后,从室取出,在室温的2×SSC、0.1%SDS中冲洗2次。接着在1×SSC、室温的0.2×SSC中分别静置2min后,用空气喷枪把载玻片干燥。
再在原位PCR用室内滴下2次杂交液25μL,密封,在57.7℃静置2h。其后,从室取出,在室温的2×SSC、0.1%SDS中冲洗2次。接着在1×SSC、室温的0.2×SSC中分别静置2min后,用空气喷枪把载玻片干燥,用荧光显微镜(580nm)进行观察。(4)结果
图17示出了实验例1~4的结果。如图17中所示,捕捉用DNA探针-1b被固定的地点,靶基因-1被捕捉,由HCP扩增了信号。还有,捕捉用DNA探针-2a被固定的地点,捕捉靶基因-2,由HCP扩增了信号。(实验例5和6)(1)目的
使用可以用微分脉冲伏特计法测定在支撑体上的电流值的金电极,使用电化学活性的嵌入剂来代替荧光用嵌入剂,研究用HCP的基因信号扩增。
(实验例5)(2)材料与方法
用0.05μm铝粉悬浮液(バイカロツクス公司生产)研磨金电极(BAS公司生产)、用无菌蒸馏水淋洗之后,在100%乙醇中超声洗涤15min。在用无菌蒸馏水淋洗后,把金表面干燥,把2μL的在10pmol/μL中调制的捕捉用DNA探针2b用于金上。为了防止干燥把它罩了起来,放入湿润箱中,室温下静置一夜。
用无菌蒸馏水淋洗后,在测定缓冲液[0.1M醋酸缓冲液(pH5.6,醋酸钾/醋酸)、0.1M氯化钾、50μM Hoechist 33258]中静置180s杂交,用ALS630(BSA公司生产)由微分脉冲伏特计法测定电流值(捕捉用探针的值为i0)。
作为目标溶液用的是由含有1pmol/μL靶基因-2的5×SSC溶液调制的。在无菌蒸馏水淋洗之后,把2μL上述靶基因用于金电极上。
罩起来之后,放入湿润箱中,在45℃静置180min进行杂交,用2×SSC+0.1%SDS洗1次、0.2×SSC+0.1%DS洗2次、1×SSC洗1次和0.2×SSC洗1次,然后干燥。
在测定缓冲液(0.1M醋酸缓冲液(pH5.6,醋酸钾/醋酸)、0.1M氯化钾、50μM Hoechist 33258)中静置180s后,由微分脉冲伏特计法测定电流值(捕捉用探针结合了目标时的值为i1)。
在无菌蒸馏水淋洗之后,于金电极上使用2μL含有一对HCP的溶液[HCP-5和HCP-6各0.156pmol/μL、12×SSC、10μM Hoechist 33258]。
罩起来之后,放入湿润箱中,在58℃静置120min,形成聚合物。
用2×SSC+0.1%SDS洗1次、0.2×SSC+0.1%DS洗2次、1×SSC洗1次和0.2×SSC洗2次之后,干燥。在测定缓冲液[0.1M醋酸缓冲液(pH5.6,醋酸钾/醋酸)、0.1M氯化钾、50μM Hoechist 33258]中静置180s后,由微分脉冲伏特计法测定电流值(在捕捉用探针上已经结合的目标上结合的HCP的自聚值为i2)。
(实验例6)
作为目标溶液,除了用含有0.5pmol/μL的5×SSC溶液调制的靶基因-2代替含有1pmol/μL靶基因-2的5×SSC溶液之外,以与上面的实验例5同样的顺序及条件进行实验。(5)结果
表1和表2分别给出了实验例5(靶基因-2;1pmol/μL)和实验例6(靶基因-2;0.5pmol/μL)的结果。
如表1和表2所示,即使是表1和表2中仅靶基因被杂交时,使用了HCP而自聚时,所得到的电流峰值增加率变大。
表1 1pmol/μL的靶基因-2
1pmol/μL | 电流值(A) | 增加量(Δi) | 增加率(%) | |
峰值i0 | -5.60E-07 | |||
↓ | -1.91E-07 | 34.1 | Δi0→i1 | |
峰值i1 | -7.51E-07 | |||
↓ | -9.02E-07 | 120.1 | Δi1→i2 | |
峰值i2 | -1.65E-06 | |||
总和 | -1.09E-06 | 195.2 | Δi0→i2 |
表2 0.5pmol/μL的靶基因-2
1pmol/μL | 电流值(A) | 增加量(Δi) | 增加率(%) | |
峰值i0 | -5.72E-07 | |||
↓ | -1.16E-07 | 20.3 | Δi0→i1 | |
峰值i1 | -6.88E-07 | |||
↓ | -1.13E-06 | 164.2 | Δi1→i2 | |
峰值i2 | -1.82E-06 | |||
总和 | -1.25E-06 | 217.8 | Δi0→i2 |
如上所述,本发明是利用寡核苷酸的自聚反应来使DNA芯片的信号扩增的方法,不要进行繁杂的操作,可以简便地明显提高DNA芯片的靶基因的检出灵敏度。
序列表SEQUENCE LISTING<110>三光纯药株式会社<120>DNA芯片的信号扩增方法<130>76161-PCT-CN<140>PCT/JP02/10034<141>2002-09-27<150>JP 2001-303816<151>2001-09-28<160>16<210>1<211>30<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc-feature<222>(1)<223>5′端连接的氨基<220><213>人工序列的描述:探针1<400>1aaaaaagcgg gaaatcgtgc gtgacattaa 30<210>2<211>80<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述:探针2<400>2cgtggccatc tcttgctcga agtccagggc gacgtagcac agcttctcct taatgtcacg 60cacgatttcc cgctcggccg 80<210>3<211>75<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述:探针3<400>3cctggacttc gagcaagaga tggccggcac caccatgtac cctggcattg gtccaccgca 60aatgcttcta ggcgg 75<210>4<211>75<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述:探针4<400>4ggccatctct tgctcgaagt ccaggcaatg ccagggtaca tggtggtgcc ccgcctagaa 60gcatttgcgg tggac 75<210>5<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述:探针5<400>5ccctggactt cgagcaagag cgtggacatc cgcaaagacc gcaggagtat gacgagtccg 60<210>6<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述:探针6<400>6ctcttgctcg aagtccaggg ggtctttgcg gatgtccacg cggactcgtc atactcctgc 60<210>7<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述:探针7<400>7gacttcgagc aagagatggc cctgataggg tgcttgcgag ccattggcaa tgagcggttc 60<210>8<211>60<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述:探针8<400>8gagcatcccc caaagt tcac ctcgcaagca ccctatcagg gtggcatcca cgaaactacc 60<210>9<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述:探针9<400>9gccatctctt gctcgaagtc gaaccgctca ttgccaatgg 40<210>10<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述:探针10<400>10gtgaactttg ggggatgctc ggtagtttcg tggatgccac 40<210>11<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<222>(1)<223>5′端连接的氨基<220><213>人工序列的描述:探针11<400>11gatcagacac ttcaaggtct ctggcgcttt aagattagcc tgcgtccgat 50<210>12<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<222>(1)<223>5′端连接的氨基<220><213>人工序列的描述:探针12<400>12aaaaaagcgg gaaatcgtgc gtgacattaa ggagaagctg 40<210>13<211>40<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述:探针13<400>13tgctt cttct gtgggtaacg tccagttaat cagctcttaa cctatcaacc ctccaactag 60ctaat cggac gcaggctaat cttaaagcgc caggcccgaa 100<210>14<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述:探针14<400>14gagggttgat aggttaagag ctggtagaga tcggaaggaa caccagcagc aaacgcgata 60agttgaccg 69<210>15<211>69<212>DNA<213>人工序列<220><213>人工序列的描述:探针15<400>15cagctcttaa cctatcaacc ctcctggtgt tccttccgat ctctaccggt caacttatcg 60cgtttgctg 69<210>16<211>50<212>DNA<213>人工序列<220><221>misc feature<222>(1)<223>5′端连接的巯基<220><213>人工序列的描述:探针16<400>16gatcagacac ttcaaggtct ctggcgcttt aagattagcc tgcgtccgat 50
Claims (18)
1.一种DNA芯片信号扩增方法,其特征在于,利用形成寡核苷酸的2条链的有规则的高级结构的自聚体的自聚反应来提高DNA芯片上靶基因的检出灵敏度。
2.根据权利要求项1所述的信号扩增方法,其特征在于,所述自聚反应是用多对由n(n≥3)个互补部分构成的一对寡核苷酸探针相互交叉杂交使寡核苷酸自聚而形成2条链的自聚体。
3.根据权利要求项1所述的信号扩增方法,其特征在于,所述自聚反应具有,含有多对把1号和2号的一对寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’一侧区域、中央区域和5’一侧区域3个区域且在将各寡核苷酸的中央区域作为互补碱基序列形成二聚体探针的同时将3’一侧区域和5’一侧区域作为不互补碱基序列的一对二聚体形成用探针的第1体系和
含有多对把3号和4号的一对寡核苷酸的各寡核苷酸分成3’一侧区域和5’一侧区域2个区域且将各寡核苷酸的3’一侧区域和5’一侧区域作为不互补碱基序列的一对交联探针的第2体系,且将此交联探针作为能够交联由所述二聚体形成用探针形成的二聚体的碱基序列,通过使该探针杂交使寡核苷酸自聚而形成自聚体。
4.根据权利要求项3中所述的信号扩增方法,其特征在于,所述探针的碱基序列是使第1体系的1号寡核苷酸的3’一侧区域与第2体系的3号寡核苷酸的3’一侧区域、第1体系的2号寡核苷酸的5’一侧区域与第2体系的4号寡核苷酸的5’一侧区域、第2体系的4号寡核苷酸的3’一侧区域与第1体系的2号寡核苷酸的3’一侧区域、第2体系的3号寡核苷酸的5’一侧区域与第1体系的1号寡核苷酸的5’一侧区域分别互补的碱基序列。
5.根据权利要求项3中所述的信号扩增方法,其特征在于,所述探针的碱基序列是使第1体系的1号寡核苷酸的3’一侧区域与第2体系的3号寡核苷酸的3’一侧区域、第1体系的2号寡核苷酸的5’一侧区域与第2体系的3号寡核苷酸的5’一侧区域、第1体系的2号寡核苷酸的3’一侧区域与第2体系的4号寡核苷酸的3’一侧区域、第1体系的1号寡核苷酸的5’一侧区域与第2体系的4号寡核苷酸的5’一侧区域分别互补的碱基序列。
6.根据权利要求项1~5中任一项所述的信号扩增方法,其特征在于,所述DNA芯片具有结合了用于捕捉靶基因的基因的支撑体且所述支撑体用的是微板型、载玻片型、微粒型或导电性基板型支撑体。
7.根据权利要求项1~6中任一项所述的信号扩增方法,其特征在于,在所述靶基因中用的是单链DNA和/或RNA。
8.根据权利要求项1~6中任一项所述的信号扩增方法,其特征在于,在所述靶基因中用的是双链DNA和/或RNA。
9.根据权利要求项1~6中任一项所述的信号扩增方法,其特征在于,在所述靶基因用的是SNPs(单碱基多态)。
10.根据权利要求项1~9中任一项所述的信号扩增方法,其特征在于,预先使所述自聚反应中所用的寡核苷酸碱基序列为与靶基因互补的序列。
11.根据权利要求项1~9中任一项所述的信号扩增方法,其特征在于,为使所述靶基因与所述自聚体结合而使用对于靶基因的碱基序列与自聚体形成中使用的寡核苷酸的碱基序列具有各自互补的区域的结合探针。
12.根据权利要求项1~11中任一项所述的信号扩增方法,其特征在于,对于通过与所述靶基因结合的寡核苷酸的自聚反应形成的自聚体,是使标记探针杂交来检出自聚体的存在。
13.根据权利要求项12中所述的信号扩增方法,其特征在于,所述标记探针为用发色类酶、发光类酶或放射性同位素标记的标记探针。
14.根据权利要求项1~11中任一项所述的信号扩增方法,其特征在于,对于所述自聚体是用加入具有与核酸结合性质的荧光物质而通过此荧光物质的光化学变化来检出所述自聚体的存在。
15.根据权利要求项1~11中任一项所述的信号扩增方法,其特征在于,预先用荧光物质标记形成所述自聚体的寡核苷酸并通过荧光物质的光化学变化来检出所述自聚体的存在。
16.根据权利要求项1~11中任一项所述的信号扩增方法,其特征在于,预先用放射性同位素标记形成所述自聚体的寡核苷酸并通过放射性同位素来检出所述自聚体的存在。
17.根据权利要求项1~11中任一项所述的信号扩增方法,其特征在于,预先用发色类酶或发光类酶标记形成所述自聚体的寡核苷酸并通过光化学变化来检出所述自聚体的存在。
18.根据权利要求项1~17中任一项所述的信号扩增方法,其特征在于,所述寡核苷酸是由选自DNA、RNA、PNA或LNA中任一个的碱基所构成。
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Cited By (1)
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Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
AU2004213716B2 (en) * | 2003-02-21 | 2008-02-28 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Signal amplification method for detecting mutant gene |
JP2005304489A (ja) * | 2004-03-24 | 2005-11-04 | Sysmex Corp | 標的物質検出用プローブセット及び標的物質検出方法。 |
WO2005106031A1 (ja) * | 2004-04-28 | 2005-11-10 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | ハイブリダイゼーション方法 |
WO2006028162A1 (ja) * | 2004-09-08 | 2006-03-16 | Eisai R & D Management Co., Ltd. | シグナルプローブポリマーの形成方法 |
EP1854895A4 (en) * | 2005-02-28 | 2009-04-01 | Eisai R&D Man Co Ltd | SIGNAL AMPLIFICATION METHOD |
US7862998B2 (en) | 2005-02-28 | 2011-01-04 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Assist probe and method of using the same |
EP1939622B1 (en) * | 2005-09-27 | 2011-09-21 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method of forming autoaggregate on microparticle and method of detecting target analyte |
US7927804B2 (en) | 2006-03-15 | 2011-04-19 | Eisai & Managment Co., Ltd. | Method of forming signal probe-polymer |
EP2180063B1 (en) * | 2007-08-14 | 2013-01-09 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method of detecting target substance |
EP2180062B1 (en) | 2007-08-14 | 2012-10-03 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Method of detecting target substance |
US20100256007A1 (en) | 2007-10-24 | 2010-10-07 | Mitsugu Usui | Nucleic acid probe, and method of forming probe-polymer |
US20110171639A1 (en) * | 2007-10-31 | 2011-07-14 | Eisai R&D Management Co., Ltd. | Polymer for detection of target substance, and method for detection of target substance |
JP5712382B2 (ja) * | 2010-03-31 | 2015-05-07 | 学校法人東京理科大学 | 生体分子相互作用解析ツールの構成とそれを用いた解析方法 |
JPWO2021095829A1 (zh) * | 2019-11-14 | 2021-05-20 | ||
US20230323448A1 (en) * | 2020-09-17 | 2023-10-12 | Yokogawa Electric Corporation | Nucleic acid sequence measurement method and nucleic acid sequence measurement kit |
Family Cites Families (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US5175270A (en) * | 1986-09-10 | 1992-12-29 | Polyprobe, Inc. | Reagents for detecting and assaying nucleic acid sequences |
CA2039517C (en) * | 1990-04-03 | 2006-11-07 | David Segev | Dna probe signal amplification |
US5424413A (en) * | 1992-01-22 | 1995-06-13 | Gen-Probe Incorporated | Branched nucleic acid probes |
JP3267576B2 (ja) * | 1998-11-09 | 2002-03-18 | 三光純薬株式会社 | プローブ高分子の形成方法 |
AU1824500A (en) * | 1998-11-19 | 2000-06-05 | Cygene, Inc. | Methods and compositions for detection of nucleic acid sequences and signal amplification |
PT1188841E (pt) * | 2000-03-31 | 2009-03-24 | Eisai R&D Man Co Ltd | Sonda para construir um polímero sonda, método de construção do polímero sonda e a sua utilização |
CA2389310A1 (en) * | 2000-08-30 | 2002-03-07 | Sanko Junyaku Co., Ltd. | Method of detecting gene |
-
2002
- 2002-09-27 KR KR10-2003-7003875A patent/KR20040041529A/ko not_active Application Discontinuation
- 2002-09-27 JP JP2003532659A patent/JPWO2003029441A1/ja not_active Withdrawn
- 2002-09-27 CN CN02802653A patent/CN1464910A/zh active Pending
- 2002-09-27 CA CA002447332A patent/CA2447332A1/en not_active Abandoned
- 2002-09-27 EP EP02775248A patent/EP1431386A1/en not_active Withdrawn
- 2002-09-27 US US10/478,186 patent/US20050130139A1/en not_active Abandoned
- 2002-09-27 WO PCT/JP2002/010034 patent/WO2003029441A1/ja not_active Application Discontinuation
Cited By (1)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102010911A (zh) * | 2010-11-29 | 2011-04-13 | 深圳博睿祥晖生物技术有限公司 | 检测靶dna序列的方法和采用该方法的基因芯片及应用 |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
EP1431386A1 (en) | 2004-06-23 |
JPWO2003029441A1 (ja) | 2005-01-13 |
CA2447332A1 (en) | 2003-04-10 |
US20050130139A1 (en) | 2005-06-16 |
KR20040041529A (ko) | 2004-05-17 |
WO2003029441A1 (fr) | 2003-04-10 |
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