CN1195070C - 一种检测多种传染病的检测型基因芯片及应用 - Google Patents
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Abstract
本发明一种检测多种传染病的检测型基因芯片及应用涉及的技术领域是医学检验和基因芯片技术。是一种用于传染病检测的基因芯片,对流行性出血热、恙虫病、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、霍乱、0157∶H7引起的出血性肠炎等7种主要传染病进行检测、分型或鉴定毒株。分别从流行性出血热病毒的S基因、东方立克次体的56KD蛋白基因、钩端螺旋体的23SRNA基因、血吸虫的5D抗原基因、疟原虫的SSrRNA基因、大肠杆菌0157∶H7的0157抗原基因、H7抗原基因及毒素基因、霍乱孤菌的外膜OWP蛋白基因及毒素基因内选择特异性的基因探针和PCR引物。其特征在于芯片包括:(1)多种传染病的多种检测寡核苷酸探针和质量控制寡核苷酸探针;(2)寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列。
Description
技术领域
本发明一种检测多种传染病的检测型基因芯片及应用涉及的技术领域是医学检验和基因芯片技术。是一种用于传染病检测的基因芯片,对流行性出血热、恙虫病、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、霍乱、O157∶H7出血性肠炎7种主要传染病进行检测并分型或鉴定毒株。
背景技术
流行性出血热、恙虫病、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、霍乱、出血性肠炎(大肠杆菌O157∶H7)仍然是我国易发生流行的主要传染病,对人类健康具有很大的威胁,另外,这些病原体易用于生物战剂。
因此,对这些病原体快速检测并确定型别不仅有重要的临床价值,为及时有效地预防、治疗和控制传染病提供依据,而且对保障群众身体健康和确保部队的生存力和战斗力,以及反生物恐怖等均有重要意义。
目前对上述7种重要传染病的检测方法主要基于对病原体的培养、毒素检测、血清学(抗原或抗体)检测,但这些检测方法均不适合早期快速检测,难于适应军事斗争的需要,并且不易分型。如细菌的培养需要数天甚至数周的时间,疟原虫和钉螺的镜检费时费力,漏检率高。酶联免疫技术、免疫胶体金法、免疫荧光技术、放射免疫技术等免疫学方法具有快速、特异等优点,但大多要求在感染一定时间后才能侦检,以及操作仍然比较复杂,或敏感性较低,或应用范围狭窄,也不能分型等,往往只适合于流行病学调查。虽然近年来也发展了PCR技术及DNA探针杂交技术,但仍存在特异性和敏感性等方面的问题。常规PCR技术大多数限于单一病原体型别的临床诊断,同时存在易被污染和特异性问题,也难于适应大规模、高通量和平行检测的要求。DNA探针杂交技术,在检测的特异性方面有所提高,但操作步骤繁琐,所需时间较长。
基因芯片(Gene Chip)是将大量的寡核苷酸分子固定于固相载体上形成DNA微点阵,借助核酸分子杂交配对的特性对DNA样品的序列信息进行高效解读和分析。DNA芯片的制备方法主要有两种:一种是在直接在固定面上原位化学合成一系列寡核苷酸,另一种将预先合成好的不同寡核苷酸按照一定的排列方式点样、固定在固相面上。制备好的芯片通过化学处理后即可进行杂交反应,利用激光共聚集显微扫描技术判定杂交结果。病原微生物,包括细菌、病毒的基因组序列已经逐步测出,为其分析提供了一个很好的切入点,而基因芯片又为检测和平行研究病原微生物提供了有力的工具。将基因芯片技术用于疾病的诊断已成为全球研究的热点,并已研制成功检测部分病毒等微生物的基因芯片。基因芯片技术用于疾病诊断的优点有以下几个方面:一是高度的灵敏和准确性,用样本极少;二是快速简便、时间短;三是可同时检测多人的多种疾病。鉴于生物芯片技术具有巨大的理论意义和实际应用价值,我国一些科研实力较雄厚的单位已开展了这方面的研究工作。然而,国内实用性芯片研究多刚刚起步,截至目前,国内外尚未见用于针对我国这7种重要传染病(流行性出血热、霍乱、大肠杆菌O157∶H7、疟疾、恙虫病、钩端螺旋体、血吸虫)的快速检测的基因芯片。
发明内容
本发明是建立一种检测多种传染病的检测型基因芯片,这种芯片能对流行性出血热、恙虫病、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、霍乱、出血性肠炎(大肠杆菌O157∶H7)等7种传染病快速侦检及分型。本研究主要针对这7种主要传染病,通过分析筛选这7种疾病病原体的DNA序列,分别设计不同的寡核苷酸片段,建立了包括检测及鉴定基因芯片技术在内的综合分析检测方法,以期达到快速、准确、特异的检测目的,并进行应用。
流行性出血热、恙虫病、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、霍乱、出血性肠炎(大肠杆菌O157∶H7)仍然是我国易发生流行的主要传染病,尤其是在自然灾害(如水灾)后、大部队集结以及其它突发情况下,严重威胁人类健康,常常危及生命和造成社会恐慌。如血吸虫和疟疾等虽然防治工作取得很大进展,但近年来有回潮现象。建立一种快速检测这7种传染病的基因芯片,对于传染病的控制、预防和治疗,有着重大的社会应用前景和军事意义。
本发明主要针对东南沿海存在的7种主要传染病(流行性出血热、霍乱、大肠杆菌O157∶H7、疟疾、恙虫病、钩端螺旋体、血吸虫),通过分析筛选这7种疾病病原体的DNA序列,分别设计不同的寡核苷酸片段,建立了包括检测及鉴定基因芯片技术在内的综合分析检测方法,以期达到快速、准确、特异的检测目的,并进行了应用。同时,根据传染病流行和爆发的特点,研究制订了这7种主要传染病的有效、实用的紧急预防和处理措施。除研制出7种主要疫病检测及分型基因芯片和建立了突发情况下传染性疫病的紧急预防和处理措施,还为更多的传染性疾病的分子生物学检测和鉴定以及防制建立了理论和技术基础。
一种检测多种传染病的检测型基因芯片,其特征在于芯片包括(1)多种传染病的多种检测寡核苷酸探针和质量控制寡核苷酸探针;(2)寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列;
所谓的多种传染病的检测型基因芯片是指检测流行性出血热、恙虫病、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、霍乱、出血性肠炎(大肠杆菌O157∶H7)七种病的寡核苷酸阵列;
所谓的寡核苷酸探针是指能与目的基因杂交的多聚核苷酸,长度在十到五十个碱基;
所谓的检测寡核苷酸探针是指化学合成的多种重要传染病病原体的基因保守区、毒力因子序列、基因型及亚型的互补的寡聚核苷酸,毒力因子序列探针包括了病原体致病所必须的多种基因序列的探针,基因型及亚型决定区的探针包括多种基因型和和多种亚型探针;
所谓的质量控制探针至少包括二种探针,即阳性对照,阴性对照;阴性对照用于检测杂交信号错误或污染,阳性对照用于检测是否正常杂交和准确定位;
所谓的手臂分子指具有双活性基团的长链有机化合物;
所谓的寡核苷酸探针固定为寡聚核苷酸的末端有一特定基团,固化在载体材料基质表面时,与表面修饰的手臂分子的末端基团形成共价键。
该检测型基因芯片特征在于流行性出血热、恙虫病、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、霍乱、出血性肠炎(大肠杆菌O157∶H7)七种病每种病原体靶基因选择有1-4个毒力序列探针或亚型特异性探针,并且根据需要添加其它突变探针和其它相关病原体的探针,探针包括了寡核苷酸探针和肽核酸探针。
设计了多组对多种传染病病原体靶基因进行诊断、检测、分型和流行病学调查的高特异性的扩增引物,其设计原则为每一个引物必须在对应病原体靶基因的高度特异性部位,每对引物的扩增区域为病原体靶基因特征序列或毒力必须序列,尽可能包括分型所需的亚型特异性序列;引物包括了针对芯片检测所需的逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)、多重聚合酶链反应(PCR)、常规PCR、不对称PCR等的特异性引物,每一对特异性引物能够扩增出基因库GeneBank中所有同种病原体的基因片断。
这些探针的固相载体材料包括多种方法处理的玻片、金属片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纤维膜、尼龙膜和其它高分子聚合物制成的膜及片等。
这些固相载体表面以具有双活性基团的长链有机化合物进行修饰,常用的具有双活性基团的长链有机化合物试剂有:戊二醛、三羟甲基氨基硅烷(APTES)、N,N-二乙氧基氨基丙基三乙氧基硅烷、多聚赖氨酸,可采用其中的一种或其中的两种的组合。
扩增的PCR产物可通过标记荧光素Cy3、荧光素Cy5、生物素的引物进行标记等,也可在基因扩增过程中加入荧光素Cy3、荧光素Cy5、生物素等标记的dUTP或dCTP。
该检测型基因芯片,能在流行性出血热、恙虫病、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、霍乱、出血性肠炎(大肠杆菌O157∶H7)的检测、分型、诊断、传染病监测、流行病学调查、查明传染病病原体种类及鉴定中应用。
该检测型基因芯片可用于一种或多种传染病病原体的检测,包括流行性出血热、恙虫病、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、霍乱、出血性肠炎(大肠杆菌O157∶H7)及它们的任意组合。
我们在查阅历年来大量文献的基础上,并参考了国内外关于这7种传染病检测的最新进展,检索并研究了7种病病原体的基因序列(包括不同亚型和突变型),确定了分别要扩增的靶基因,用Clustal W软件找出特定病原体靶基因序列的各亚型间共同的高度保守区和不同亚型的各自特异性序列,结合了Primer Primers5.0等专业用于PCR测序引物设计和评估的分析软件,再应用NCBI的BLAST程序进行筛选,根据结合扩增要求和引物筛选要求,进行了PCR引物设计。
基因芯片中应用的探针为核酸分子探针,是已知的特定序列的核酸片断,能与互补的核酸序列发生分子杂交,因此可以利用探针杂交技术来检测样品中特定基因地的特征片断和或测定未知基因的序列。针对病原微生物基因组的特征性片断、染色体DNA的序列多态性、基因变异的位点及特征等,设计和选择合适的核酸探针并制成芯片。通过与样品中提取的核酸(DNA或RNA)杂交,一步检测就可以获得病原微生物种属、分型、致病、毒力、相对数量甚至同源性、多态性、变异、表达等相关信息。
根据核酸分子探针的来源及其性质可以分为基因组DNA探针、cDNA探针,RNA探针、肽核酸探针和寡核苷酸探针等。寡核苷酸探针的优点是可以根据需要来随心所欲地调整和合成相应的序列,避免了天然核酸探针中存在的高度重复序列所带来的不利影响。寡核苷酸探针具有以下特点:探针长度一般为10~50bp,并且由于序列的复杂性低,杂交所需的时间较短。寡核苷酸探针还可用于检测个别碱基的变异,用于单核苷酸多态性(SNP)分析。
我们采用了合成寡核苷酸探针的方法。探针选择的正确与否,将会直接影响杂交结果的分析。选择探针最基本的原则是应具有高度特异性,同时考虑Tm值、碱基数目和制作的方便等因素。
探针设计的原则如下:
(1)高度的特异性和敏感性
筛选出的探针应该位于特异性引物扩增序列中的高保守区(相对亚型而言),以保证探针的特异性和敏感性;同时,筛选的探针应该与人基因组序列、其它细菌和微生物、相关动物的基因组序列、环境中常见植物基因序列尽可能同源性低,以避免假阳性结果;分型探针无交叉反应。寻找和筛选出高度特异性的探针,这是至关重要的。
(2)7种病探针的Tm值尽可能一致
因为在一张芯片上要同时进行多个探针的杂交反应,在一定的温度下,此时各探针Tm值至关重要,如果Tm值不一致,差距过大,杂交后的荧光信号强弱会受到相当的影响。一般Tm值相差小于三度比较适宜。
(3)各种探针有近似的碱基长度
芯片探针的长度,对检测的敏感性和特异性有一定的影响。病原体检测芯片的寡核苷酸探针碱基长度多在15~60bp。各探针碱基长度一致,在一定程度上可消除杂交后芯片扫描仪扫描焦距定位所带来的差异。我们设计的探针碱基数目在28nt左右。
(4)筛选的探针尽可能避免二级结构
探针应该最好没有发夹结构,自身二聚体、错配等。否则容易形成错误的结果。
(5)避免选取G、C富集区域的序列作探针
(6)7种病的各探针的互补序列之间不形成二聚体和错配等
探针筛选的方法:
从Gene Bank调出所有这7种病病原体的基因序列,比较同一病原体的基因序列有无存在变异的情况。确定要扩增的靶基因片断及引物后,根据上述探针设计的原则,用Primer Primers5.0等生物学软件在7种病病原体基因的碱基对齐图上PCR扩增区域内寻找出所有可能的探针,结合Clustal W等同源性分析软件找出特定病原体靶基因序列扩增区域内各亚型间共同的高度保守区和不同亚型的各自特异性序列,在特定病原体扩增片断内的高度保守区,并且具有属、种特异性结构的序列作为分型探针。登陆美国生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)主页(http://www.ncbi.nlm.nih.gov),选择核酸序列的BLAST,进行数据库类似检索(同时检索GenBank+EMBL+DDBJ+PDB数据库),在核酸扩增区域内筛选的探针与已知的人基因组序列、其它常见细菌和微生物、相关动物的基因组序列、环境中常见植物基因序列尽可能同源性低,碱基数28nt左右,Tm值平均近似69,G+C含量约为50%,根据Blast结果,再结合需求和经验,手工对筛出的探针进行微调和修整。然后对这7种病病原体基因序列筛出和修改得到的全部探针,同时考虑其互补序列,用RNA Structure软件进行分析,以排除不同探针互补序列间形成影响和干扰杂交的二级结构。阳性内参照探针采用的是根据非洲植物基因序列的片断略加改造而来的DNA序列。在后面实际的芯片杂交检测中,根据总体的需要和检测的结果,调整了部分使用的探针。
选择载玻片为芯片的载体,玻片购自CEL公司或国产优质载玻片,用铬酸洗液浸泡过夜,然后用双蒸水清洗,再浸入25%的氨水中过夜,用双蒸水清洗。晾干后浸入含有氨丙基三甲氧基硅烷的95%乙醇(pH4.5)中20分钟,再用95%乙醇超声清洗,换蒸馏水超声清洗,115℃烘干。将已经硅烷化的玻片浸泡在5%的戊二醛溶液中50min,超声10min,水洗两次,晾干备用。
将合成的探针溶于3×SSC溶液内,采用芯片点样仪机点和人工手点两种方式。条件摸索时用手工点样,0.1-0.2μl/点。机点时在Cartesian PixSys5500点样仪用Chipmaker Pin3点样针,Pixsys 5500 Workstation点样软件编程。将7种病原体的14个探针、2个阴性对照探针和一个阳性内参探针设计形成一个点样阵列,每个玻片点4个相同的点样阵列。每个探针点4个点,在4个点的右侧点一个阳性探针对照点(植物基因探针)。点样完毕,雾化保湿2h后37℃水化1h,4℃保存备用。
为了封闭芯片上未与寡核苷酸结合的醛基,将芯片按下述步骤进行处理:依次用洗液A、B、C冲洗后再用ddH2O洗2min。甩去水珠,将芯片放入封闭(还原)液内15min。再次用洗脱液和ddH2O冲洗,芯片自然干燥后即可投入使用。
我们收集样本,测试比较并优化了各种被检样本的处理方法,建立了快速抽提高质量的各种病原体目的DNA片段的标准操作程序。相同的样本尽量采取相同的处理方法。对于7种主要传染性疾病病原体,建立了扩增特征基因的标准PCR扩增方法,均有较好的特异性。应用不对称PCR制备Cy3荧光标记引物掺入模板。第一轮PCR按常规进行,然后将第一次PCR产物纯化(TaKaRa DNA片段纯化试剂盒),以此为PCR的模板,采用以下两种方法制备荧光靶序列:(1)用P2引物进行不对称PCR,dNTPs内加0.02mM Cy3-dUTP(Amersham Pharmacia公司)掺入;(2)用0.2μM Cy3-P2进行不对称PCR;除PCR退火温度改为45℃,其他与第一次PCR相同。
第二轮扩增的Cy3荧光标记产物在98℃变性5min,速置冰浴,取出7μl,与3μl杂交液(掺入阳性内参照植物基因探针)充分混合,取出点在探针陈列区域,盖上大小合适的经硅化的盖玻片,将芯片放入杂交盒(盒内有适当的2×SSC以保持湿度),55℃杂交1小时。取出芯片,依次用预温至55℃的洗液A、B、C冲洗后再用ddH2O洗,晾干(以上过程均要求尽量避光),然后在芯片扫描仪上进行荧光信号扫描及图象分析(QuantArraysoftware version 3.0.0.0)。
实验结果表明,制备的7种传染病检测芯片未见有非特异性的交叉反应,而且可以鉴定混合感染并对疟疾、恙虫病等进行分型。对多份样品进行检测,均显示了较好的特异性和敏感性。当水中同时存在霍乱、大肠杆菌O157∶H7、钩端螺旋体时,经过统一的样本处理和多重PCR扩增,能够用芯片同时侦检出来。基因芯片检测这7种传染病的灵敏度是由制备模板的PCR灵敏度所限制的。实验结果还表明,芯片检测时的灵敏度要比常规PCR后琼脂糖凝胶电泳的灵敏性略高,这可能是因为扩增的特异性条带过于微弱,电泳后的结果不清楚甚至无法显示时,少量的标记荧光的PCR产物也能和芯片上的特异性探针杂交并被生物芯片扫描仪检测出来。
模拟检测和现场初步应用的结果表明,建立的芯片检测系统在7种病的检测和鉴定分型方面,与传统的经典检测及酶联免疫和仪器的检测结果基本一致。和传统的方法相比较,芯片的优越性体现明显。
本发明的优点
(1)高特异性:芯片检测的特异性是经过双重筛选的,与普通的PCR结合探针杂交检测的特异性相同;
(2)对样品的高通量检测和多样品的平行检测:能同时检测7种主要传染病;
(3)可以在检出7种主要传染病病原体的同时给予分型或鉴定毒株;
(4)高灵敏度和可靠性:检测芯片是分子杂交技术和荧光标记技术相结合的新型分子诊断方法,并且在模板和探针杂交时,反应条件和反应体积完全一致,消除了实验过程中人为的和其它误差;
(5)检测时间短,耗样量少,反应体积小,适合于重要传染病防治的需要;
(6)定量准确,重现性好,并可以根据实际需要设计和添加新的病原体探针;(7)为实现全自动化及快速检测奠定基础。
附图说明
以下将结合附图对本发明做进一步说明。
图1是整个芯片制作和检测过程。
图2是间日疟原虫不同模板处理方法的PCR结果。
图3是芯片探针点样矩阵示意图。
图4是疟原虫的基因芯片检测结果。4a:P.v.阳性; 4b:P.f.阳性; 4c:P.v.和P.f.混合感染。箭头所示阵列为阳性内参照植物基因,1~14为6种对照病原体基因探针。
图5是PCR和基因芯片检测的敏感性实验。5a:P.f.PCR敏感性试验,M为mark(DL2000),1~4的P.f.密度依次为1000虫/μl、100虫/μl、10虫/μl和5虫/μl;5b:5虫/μl的P.f.芯片检测结果,1~14为6种对照病原体探针。
图6是血吸虫不同阶段样本处理后的PCR结果。M:Marker(DL2000)、1-4:依次为阳性钉螺、成虫、尾蚴和虫卵5:阴性钉螺对照。
图7是血吸虫不同阶段样本的芯片检测结果。3a、3b、7c、7d:依次为钉螺、成虫、尾蚴和虫卵。
图8是单个尾蚴DNA稀释10倍芯片检测结果。
图9是恙虫病东方体阳性检测结果。9a:karp株芯片扫描结果;9b:Gilliam株芯片扫描结果;9c:Kato株芯片扫描结果;9d:稀释后的karp株芯片扫描结果。
具体实施方式
一种检测多种传染病的检测型基因芯片,包括了模板的处理和扩增;载体如玻片、硅片等;载体表面手臂分子的修饰;寡核苷酸探针(包括检测寡核苷酸探针和质量控制探针)及其固化;检测和分析等。
实施例一.疟原虫检测及分型基因芯片的研制及初步应用
疟疾是严重危害人体健康的寄生虫病,尤其在发生水灾和人群大规模集结以及生物恐怖等情况下,疫情威胁还比较突出。高效、敏感、快速的监测疟原虫方法是疟疾防治的首要前提。我们建立了检测间日疟原虫和恶性疟原虫并且分型的基因芯片,优化确定了芯片检测条件,并对部分样本进行了测试比较。
1.引物和探针的设计
在充分查阅各类文献的基础上,根据间日疟原虫和恶性疟原虫小亚单位核糖体核糖核酸(SSrRNA),分析比较其它的人类疟原虫属如三日疟原虫等和人SSrRNA相应序列,先用计算机软件分析,再结合手工在NCBI BLAST上筛选特异性相对更好的序列。设计和筛选出的一对引物,可特异扩增人类疟原虫属的SSrRNA序列。同样方法,在这对引物相应扩增片段内设计出四条探针,设计的探针同时尽量要求有近似的退火温度和碱基长度,避免选取可能形成二级结构或自身二聚体的区域。其中两条为间日疟原虫特异性探针,另外两条为恶性疟原虫特异性探针。探针均为5’端加T臂和氨基化修饰。
引物1:5’-TTAAAATTGTTGCAGTTAAAACG-3’
引物2:5’-CTACTCCTATTAATCGTAAC-3’
间日疟原虫正链探针:5’-TTAAGCAACGCTTCTAGCTTAATCCACA-3’
负链探针:5’-TAGCAAAATGCGCACAAAGTCGATACG-3’
恶性疟原虫正链探针:5’-GTAGTTGAATATTAAAGAATCCGATGTTTC-3’
负链探针:5’-ATGAACTCAATCATGACTACCCGTCTG-3’
为了标记PCR产物,另外合成5’端标记Cy3的引物1和引物2。
2.样本的处理
根据文献和本实验室的摸索,试验了几种耗样本(血)量少,快速简便的高纯度疟原虫DNA模板制备方法。
(1)Tritonx-100法:取10~20μl血样于1.5ml的Eppendorf管内,加400μlTritonx-100裂解液,混匀,静置10min,12000r/min离心5min,弃上清,再加300μl 1×PCR buffer,混匀,静置5min,同上离心,弃上清,加20μl ddH2O,沸水浴5min,离心片刻,上清即可作模板。
(2)快速煮沸法、全血PCR仪法、碱裂解法、磷酸三钠法等参照文献进行。
2.3PCR扩增及荧光标记
应用不对称PCR制备Cy3荧光标记引物掺入模板。第一轮常规PCR按文献进行,扩增结果见图2。第二轮PCR反应体系见下表:
成分 浓度 加样量 终浓度
ddH2O - 31.5μl -
10×PCR buffer - 5.0μl -
MgCl2 25mmol/l 5.0μl 2.5mmol/l
dNTP 2.5mmol/l 4.0μl 0.2mmol/l
Cy3-P2 5poml/μl 2.0μl 0.2poml/μl
ExTaq 5U/μl 0.5μl 2.5U每50μl
第一轮扩增产物 - 2.0μl -
反应条件为:94℃,45s;50℃,40s;72℃,60s,共40个循环
3.芯片制备
(1)芯片载体的醛基化
将已经硅烷化的玻片浸泡在5%的戊二醛溶液中50min,超声10min,水洗两次,晾干备用。
(2)点样
将合成的探针溶于3×SSC溶液内,采用芯片点样仪机点和人工手点两种方式。条件摸索时用手工点样,0.1-0.2μl/点。机点时在Cartesian PixSys5500点样仪用ChipmakerPin3点样针,Pixsys 5500 Workstation点样软件编程。根据图4的矩阵进行点样,每个探针点4个点,在4个点的右侧点一个阳性探针对照点(植物基因探针)。点样的基因探针见下表。
EHFV HantProbe2:5’-NH2-TTTTTTTTTTACCAAGGAGGCTAACTGCTGCTGTAT(-)
EHFV R22Probe1:5’-NH2-TTTTTTTTTTCATGATCGGGAGAGTGTCGCAGCTT(+)
恙虫病东方体OrientProbe:5’-NH2-TTTTTTTTTTTTCAGCTAGTGCGATAGAATTGGGTGA(+)
钩端螺旋体LepProbe1:5-NH2-TTTTTTTTTTCATGAACTTTGGGGCCTTAAACGACG(-)
间日疟原虫PvProbe2:5’-NH2-TTTTTTTTTTTAGCAAAATGCGCACAAAGTCGATACG(-)
恶性疟原虫PfProbe2:5-NH2-TTTTTTTTTTATGAACTCAATCATGACTACCCGTCTG(-)
血吸虫SchiProbe1:5’-NH2-TTTTTTTTTTAGTCATCTCAACAGGTCAGCATATTG(+)
霍乱弧菌外膜ompWprobe1:5’-NH2-TTTTTTTTTTTTGCCTCGGTAGTACCTAATGACAGTA(+)
霍乱弧菌外膜ompWprobe2 5’-NH2-TTTTTTTTTTAGTTTTGAAGTCCTCGCTCGTACGCCA(+)
霍乱弧菌毒素CtxProbe2:5’-NH2-TTTTTTTTTTTATATTTGGGAGTATGGAATCCCACCT(-)
O157 probe1:5’-NH2-TTTTTTTTTTGGTGGAATGGTTGTCACGAATGACAAA(+)
H7 Probe1:5’-NH2-TTTTTTTTTTGACGATGCAGGCAACTTGACGACTAA(+)
Vt2 Probe2:5’-NH2-TTTTTTTTTTAGATGGTCAAAACGCGCCTGATAGAC(-)
Vt1 Probe:5’-NH2-TTTTTTTTTTGGATGACGTAACCATTAAAACTAATGCC(+)
Control(+):5’-NH2-TTTTTTTTTTCAGATGTTAGTGTCGATCTCTATGTAAC
点样完毕,雾化保湿2h后37℃水化1h,4℃保存备用。
(3)芯片的封闭
为了封闭芯片上未与寡核苷酸结合的醛基,将芯片按下述步骤进行处理:依次用洗液A、B、C冲洗后再用ddH2O洗2min。甩去水珠,将芯片放入封闭(还原)液内15min。再次用洗脱液和ddH2O冲洗,芯片自然干燥后即可投入使用。
4.杂交检测
第二轮扩增的Cy3荧光标记产物在98℃变性5min,速置冰浴,取出7μl,与3μl杂交液(掺入阳性内参照植物基因探针)充分混合,取出点在探针陈列区域,盖上大小合适的经硅化的盖玻片,将芯片放入杂交盒(盒内有适当的2×SSC以保持湿度),55℃杂交1小时。取出芯片,依次用预温至55℃的洗液A、B、C冲洗后再用ddH2O洗,晾干(以上过程均要求尽量避光),然后在芯片扫描仪上进行荧光信号扫描及图象分析(QuantArraysoftware version 3.0.0.0)。整个芯片制作和检测过程见图1。
5.特异性和敏感性试验
对间日疟原虫、恶性疟原虫感染以及混合感染的芯片检测结果见图4。结果显示,本文制备的芯片能特异地侦检间日疟原虫、恶性疟原虫和混合感染,对照的6种病原体标本和随机选取的健康人血样均未发生非特异性结合,而且两型疟原虫间无交叉反应。用健康人全血对适当密度的间日疟原虫和恶性疟原虫血样分别进行梯度稀释,Tritonx-100法快速制备DNA模板后PCR平行扩增后进行Agarose电泳,凝胶成像系统下可见阳性条带的间日疟原虫最大稀释度为10虫/μl,恶性疟原虫也为10虫/μl。用上述标本制备模板,进行芯片的模拟检测,发现间日疟原虫密度在10虫/μl时,恶性疟原虫在5虫/μl可检测出来。见图5。
实施例二.日本血吸虫基因芯片的制备及检测研究
血吸虫病是一种人兽共患的寄生虫病,在全世界范围内广泛分布,我国某些地区现流行仍很严重。在防治过程中,人群再感染和控制地区血吸虫病的再度流行,一直是防治实践中的难题。由于钉螺是日本血吸虫的唯一中间宿主,钉螺的扩散和重新分布是造成血吸虫病再度流行的基本因素。因此,高效、正确地监测血吸虫和钉螺在血吸虫病防治工作中显得极为重要。基因芯片技术,适应于大规模、高通量的检测要求,尤其适用于血吸虫病流行区现场的检测及监测,具有广泛的应用前景。本研究初步建立了检测日本血吸虫尾蚴、阳性钉螺及动物模型标本中血吸虫的基因芯片。
1.芯片的制备
选用经硅烷化处理的玻片为芯片载体,用5%戊二醛浸泡50min,ddH2O超声清洗2次,置干燥处备用。点样采用Cartesian Pix Sys 7500点样仪,Chipmaker Pin40点样针及Pixsys 5500 Workstation点样软件编程,将探针(TakaRa公司合成)溶于3×SSC溶液内,终浓度为100μmol/L,每个点直径0.15mm。点样后雾化保温2h后37℃水浴1h。室温依次用洗脱液A(1×SSC,0.2%SDS)、B(0.5×SSC,0.2%SDS)、C(0.1×SSC)和ddH2O各冲洗5min,甩去水珠后,将芯片放入封闭液30min,再次依次用洗脱液A、B、C和ddH2O冲洗,超净台内吹干后待用。
2.DNA模板制备
虫卵和尾蚴在显微镜下计数后,分装于Eppendrof管中,6000rpm离心5min,弃上清加入100μl Triton X-100裂解液,60℃水浴2h,100℃隔水加热10min后,10000rpm离心5min,取上清即为模板DNA。成虫或阳性钉螺的DNA采用经典的酚-氯仿抽提法,即成虫或钉螺压碎后置适量生理盐水,加蛋白酶K(终浓度为200μg/ml)、Triton X-100,60℃水浴3h后加氯仿、异戊醇抽提一次,然后用无水乙醇沉淀,经12000rpm离心,80%乙醇洗涤一次,弃上清,沉淀溶于TE或ddH2O中,即为模板DNA。
3.PCR扩增及荧光标记
根据日本血吸虫5D基因的DNA序列,设计并合成了引物P1:5’TCA CAC ATT CAAACA CAG TAC 3’,引物P2:5’AAG TAC CAC CAC CAT AAT GTC 3’(TaKaRa公司合成),同时在这对引物相应扩增片段内设计出1个负链探针5’CCA GTC ATC TCA ACA CGT CAGCAT ATT GAT3’,经BLAST基因检索,与曼氏、埃及血吸虫及GenBank内的其他所有基因均无显著同源性。
第一轮常规PCR反应制备虫卵、尾蚴、成虫、阳性钉螺双链DNA模板:反应体积50μl,包括10×Buffer 5μl、25mmol/L MgCl2 4μl、2.5mmol/LdNTP2μl、5U/μl Taq酶0.3μl及模板5μl。反应程序为94℃变性4min,按94℃30 Sec、57℃45 Sec、72℃45 Sec扩增35个循环,然后72℃延伸7min。PCR产物经纯化(TakaRa DNA片段纯化试剂盒)作为第二轮PCR反应模板,并经ABI377测序仪测序,证实为5D基因序列后,采用Cy3荧光标记引物掺入模板进行不对称PCR扩增,即加10mmol/L Cy3-dUTP(AmershamPharmacia公司合成)1μl掺入,退火温度降为50℃,PCR产物用琼脂糖凝胶电泳检测。
4.杂交及芯片检测
第二轮扩增的Cy3荧光标记产物于98℃变性5min后迅速冰浴。取荧光靶序列7μl,与3μl杂交液(掺入阳性内参照植物基因探针)混匀后点入探针阵列区域,盖上硅化的盖玻片,置湿杂交盒(内有2×SSC)避光50℃水浴1h。取出后依次用洗液A、B、C及ddH2O洗涤,吹干后用ScanArray 3000扫描仪检测。整个芯片制作和检测过程见图1。
5.检测结果
阳性钉螺、尾蚴、成虫、虫卵抽提的DNA模板,常规扩增经纯化后进行1%的琼脂糖电泳检测,结果显示,除对照阴性钉螺未见特异性条带外,四种样本均扩增出大小为262bp的特异性条带(见图6)。通过杂交后芯片检测,日本血吸虫探针处均出现较强的阳性信号(见图7);对照6种病原体标本相应的探针处皆无杂交阳性信号。日本血吸虫尾蚴经梯度稀释后,单个尾蚴DNA经稀释10倍后在芯片上仍可检测到较弱阳性信号(见图8)。
实施例三.基因芯片技术检测恙虫病东方体DNA的方法建立
恙虫病是由恙虫病东方体引起的虫媒自然疫源性疾病,近年来,我国的疫区有不断扩大的趋势。由于该病易引起误诊,导致治疗不当,甚至发生死亡。因此,快速、准确的诊断极为重要。我们选用恙虫病东方体三个标准株56kD蛋白基因既保守又特异区序列,合成了寡核苷酸探针,初步建立了用芯片技术检测恙虫病东方体特异性DNA的诊断方法
1.引物和探针的设计与合成
根据恙虫病东方体标准株Karp Gilliam和Kato的主要表面抗原56kD蛋白的序列[2,3],结合计算机软件分析及NCBI BLAST上筛选设计了群特异性引物及探针。
引物1:5′-tta att gct agt gca atg tc-3′分别位于Gilliam、Karp和Kato株56kD蛋白571~590,15~34bp和87~106位点。引物2:5′-ctt ata ggc att atagta gg-3′分别位于Gilliam、Karp和Kato株56kD蛋白967~87,406~431,468~487位点。负链探针:ttc agc tag tgc a(g)at aga att g gg tga,分别位于Gilliam、Karp和Kato株的606~632,44~70,125~151位点,5′端加臂和氨基化修饰。为标记PCR产物,另合成5′端标记Cy3的引物2。
2.恙虫病东方体标准株DNA的提取
取Karp、Kato和Gilliam株组织细胞培养物2μl至1.5ml Eppendorf管中,加ddH2O至0.5ml,加入10%SDS 50μl,6.5mg/ml蛋白酶K 20μl,62mg/ml溶菌酶20μl,55℃水浴2h,按苯酚-酚∶氯仿-酚∶氯仿∶异戊醇常规法抽提DNA,最后一次抽提取水相,加1/10体积的3mol/L NaAc,混匀后加2倍体积-20℃预冷无水乙醇,静置10min,10000rpm离心10min,70%乙醇洗涤,溶于ddH2O或1×TE中备用。
3.PCR扩增及特异性鉴定
PCR反应体系为50ul,包括标准株模板DNA 2μl,25mmol/LMgCl2 5μl,2.5mmol/LdNTP4μl,10×反应缓冲液5μl,50pmol引物P1、P2各1μl,5u/μl Taq聚合酶0.5μl。反应条件为94℃变性5min,94℃ 1min,57℃ 1min,72℃ 1min,35个循环后,于72℃延伸7min,再至4℃。为判断所设计的东方体群特异性引物的特异性,用所设计的引物,按上述反应条件,对黑龙江立克次体株、立氏立克次体R株、普氏立克次体、加拿大立克次体、斑点热立克次体、Q热立克次体六株立克次体进行PCR扩增。用2%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。
4.荧光标记PCR产物
用Cy3荧光标记的引物进行不对称PCR反应制备荧光标记的PCR产物,反应体系如下:上述PCR纯化产物1μl,25mmol/L MgCl2 5μl,2.5mmol/LdNTP 4μl,10×反应缓冲液5μl,10pmol/L Cy3-标记P2 2μl,5U/μl Taq聚合酶0.5μl,反应条件同上。2.0%琼脂糖凝胶电泳检测得到的荧光标记产物可用于杂交试验。
5.芯片制备
5.1芯片载体的醛基化
将已经硅烷化的玻片浸泡在5%的醛溶液中50min,超声10min,水洗两次,晾干备用。
5.2点样
将合成的探针(六种病原体共16种探针分别溶于3×SSC溶液内,采用芯片点样仪机点和人工手点两种方式。条件摸索用手工点样,0.1-0.2μl/点,机点用Chipmaker Pin40点样针,分别把不同探针溶液逐点分配在玻璃表面的不同位点上,通过化学的共价结合使之固定于相应位点,每个探针点样4点,在每个探针点样的一端均设有一个植物阳性内参探针。点样完毕,雾化保温2h后37℃水浴1h,室温放置。
5.3芯片的封闭
为了封闭芯片上未与寡核苷酸结合的醛基,将芯片按下述步骤进行处理:依次用洗液A、B、C冲洗后再用ddH2O洗2min,甩去水珠,将芯片放入封闭(还原)液内15min。再次用洗脱液和ddH2O冲洗,芯片自然干燥后即可用于杂交。
6.杂交和检测
Cy3荧光标记PCR产物在98℃变性5min,速置冰浴,取出7μl约200ng DNA,与3μl杂交液(掺入Cy3标记的阳性内参照植物基因探针)充分混合,取出点在探针阵列区域,盖上大小合适的经硅化的盖玻片,注意避免气泡,将芯片放入杂交盒(盒内有适当的2×SSC以保持湿度),50℃杂交1h。取出芯片,依次用预温至55℃的洗液A、B、C冲洗后再用ddH2O洗,晾干后用芯片扫描仪读片。整个芯片制作和检测过程见图1。
7.荧光数据的获取和定量分析:杂交后的玻璃片用Scan Array Lite 3000,扫描,5mm分辩率。每个点的荧光强度用Quant Array软件分析,荧光信号强度与背景信号强度统计学上显著性差异(P<0.01)为阳性点。阳性检测结果见图9。
Claims (4)
1.一种检测多种传染病的检测型基因芯片,其特征在于芯片包括(1)多种传染病的多种检测寡核苷酸探针和质量控制寡核苷酸探针;(2)寡核苷酸探针通过手臂分子固化在载体材料上形成的探针阵列;
所谓的多种传染病的检测型基因芯片是指检测流行性出血热、恙虫病、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、霍乱、大肠杆菌0157:H7引起的出血性肠炎七种病的寡核苷酸阵列;
所谓的寡核苷酸探针是指能与目的基因杂交的多聚核苷酸,长度在十到五十个碱基;
所谓的检测寡核苷酸探针是指化学合成的多种重要传染病病原体的基因保守区、毒力因子序列、基因型及亚型的互补的寡聚核苷酸,毒力因子序列探针包括了病原体致病所必须的多种基因序列的探针,基因型及亚型决定区的探针包括多种基因型和和多种亚型探针;
所谓的质量控制探针至少包括二种探针,即阳性对照,阴性对照;阴性对照用于检测杂交信号错误或污染,阳性对照用于检测是否正常杂交和准确定位;
所谓的手臂分子指具有双活性基团的长链有机化合物;
所谓的寡核苷酸探针固定为寡聚核苷酸的末端有一特定基团,固化在载体材料基质表面时,与表面修饰的手臂分子的末端基团形成共价键;
7种病原体的14个特异性基因探针如下:流行性出血热病毒S基因探针2个:
HantProbe2:5’NH2-TTTTTTTTTTACCAAGGAGGCTAACTGCTGCTGTAT 3’负链
R22Probe1:5’NH2-TTTTTTTTTTCATGATCGGGAGAGTGTCGCAGCTT 3’正链
恙虫病立克次体56KD蛋白基因探针1个:
OrientProbe:5’NH2-TTTTTTTTTTTTCAGCTAGTGCGATAGAATTGGGTGA 3’正链
钩端螺旋体23S rDNA基因探针1个:
LepProbe1:5’NH2-TTTTTTTTTTCATGAACTTTGGGGCCTTAAACGACG 3’负链
血吸虫5D抗原基因探针1个:
SchiProbe1:5’NH2-TTTTTTTTTTAGTCATCTCAACAGGTCAGCATATTG 3’正链
疟原虫ss rRNA基因探针2个:
间日疟原虫PvProbe2:5’NH2-TTTTTTTTTTTAGCAAAATGCGCACAAAGTCGATACG 3’负链
恶型疟原虫PfProbe2:5’NH2-TTTTTTTTTTATGAACTCAATCATGACTACCCGTCTG 3’负链
霍乱弧菌基因探针3个:
外膜蛋白ompWprobe1:5’NH2-TTTTTTTTTTTTGCCTCGGTAGTACCTAATGACAGTA 3’正链
外膜蛋白ompWprobe2:5’NH2-TTTTTTTTTTTTAGTTTTGAAGTCCTCGCTCGTACGCCA 3’正链
霍乱毒素基因CtxProbe2:5’NH2-TTTTTTTTTTTATATTTGGGAGTATGGAATCCCACCT 3’负链
大肠杆菌0157:H7基因探针4个:
0157 Probe1:5’NH2-TTTTTTTTTTGGTGGAATGGTTGTCACGAATGACAAA 3’正链
H7 Probe1:5’NH2-TTTTTTTTTTGACGATGCAGGCAACTTGACGACTAA 3’正链
Vt2 Probe2:5’NH2-TTTTTTTTTTAGATGGTCAAAACGCGCCTGATAGAC 3’负链
Vt1 Probe:5’NH2-TTTTTTTTTTGGATGACGTAACCATTAAAACTAATGCC 3’正链
2.根据权利要求1所述的一种检测多种传染病的检测型基因芯片,其特征在于固相载体材料包括玻片、金属片、硅片、陶瓷片、塑料片、硝酸纤维膜、尼龙膜。
3.根据权利要求1所述的一种检测多种传染病的检测型基因芯片,其特征在于固相载体表面以具有双活性基团的长链有机化合物进行修饰,常用的具有双活性基团的长链有机化合物试剂有:戊二醛、三羟甲基氨基硅烷、N,N-二乙氧基氨基丙基三乙氧基硅烷、多聚赖氨酸,可采用其中的一种或其中的两种的组合。
4.权利要求1所述的一种检测多种传染病的检测型基因芯片在流行性出血热、恙虫病、钩端螺旋体病、血吸虫病、疟疾、霍乱、大肠杆菌0157:H7引起的出血性肠炎的检测、分型、传染病监测、流行病学调查,查明传染病病原体种类及鉴定中的应用。
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