CN1580278A

CN1580278A - NF－κB检测双链DNA微阵列芯片及制备

Info

Publication number: CN1580278A
Application number: CN 03132206
Authority: CN
Inventors: 王进科; 李同祥; 陆祖宏
Original assignee: Nanjing Xinyihua Group Co Ltd
Current assignee: Nanjing Xinyihua Group Co Ltd
Priority date: 2003-07-31
Filing date: 2003-07-31
Publication date: 2005-02-16

Abstract

本发明在固相支持物(solid substrates)表面制备一种双链脱氧核糖核酸(double－strandedDNA，dsDNA)微阵列(microarray)，使其dsDNA探针(probes)上嵌合核因子κB(nuclear factorκB，NF－κB)的序列特异性DNA结合位点(sequence－specific DNA－binding sites)，用以高通量检测(high－throughput detecting)细胞核内NF－κB的含量及筛选dsDNA/NF－κB相互作用干扰性分子(molecules interfering dsDNA/NF－κB interaction)。本发明首先依靠专利技术(中国专利02112780.8及02137945.9)及其它本发明提出的方法，在固相支持物表面制备dsDNA微阵列，使该dsDNA微阵列上的大量dsDNA探针上含有NF－κB的序列特异性DNA结合位点，再将该dsDNA微阵列与特定细胞核蛋白或NF－κB纯蛋白杂交结合，通过NF－κ、B与微阵列靶点dsDNA的相互作用，实现对特定细胞核中NF－κB蛋白的定性或定量测定，或通过检测在外源分子，如组合化学分子、天然生物分子的存在下，NF－κB与微阵列靶点dsDNA相互作用特征的改变，筛选能够干扰NF－κB与其靶点dsDNA的相互作用的分子，特别是能够降低NF－κB与其靶点dsDNA结合亲合性(binding affinity)的组合化学或天然生物小分子。本发明制备的NF－κB检测dsDNA微阵列芯片，在基础分子生物学研究，特别是NF－κB相关基因表达调控和生物医学研究，如NF－κB相关疾病药物作用机理研究和药物性分子筛选中有广泛而重要的应用价值。

Description

NF-κB检测双链DNA微阵列芯片及制备

一、技术领域

本发明是在基础分子生物学及生物医学领域中，提出了一种新的高通量检测重要转录因子NF-κB的技术手段，即NF-κB检测dsDNA微阵列芯片，并阐明了其各种制备方法；运用本发明提出的各种制备方法所制备的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片，在研究基因表达调控中转录因子NF-κB与其DNA结合靶点的相互作用规律、高通量检测细胞核内各种NF-κB的表达及活化、筛选NF-κB DNA靶点结合药物性小分子及NF-κB/DNA相互作用干扰性药物性小分子等重要基础分子生物学及生物医学领域中，具有重要的应用价值。

二、背景技术

核因子κB(Nuclear Factor kappaB，NF-κB)是一类序列特异性转录因子，当细胞受到炎症介质、病毒感染、氧化应激等多种物质刺激后，NF-κB在胞质内被激活，进入细胞核与病毒(HIV，Adenovirus，HSV，SIV，SV-40，EBV)、细胞因子(IFN，TNF，IL-1，IL-2，IL-6，IL-8，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13)、生长因子(G-CSF，GM-CSF，EPO，M-CSF，VEGF C)、细胞粘附分子(ELAM-1，ICAM-1，VCAM-1，MadCAM-1，Endoglin)、急性相反应蛋白(Angiotensinogen，beta-defensin-2，Tissue factor-1，Pentraxin PTX3，Complement factor C4)、酶(ADH，Lysozyme，PIM-1，Serpin 2A，Gelatinase B，GD3-synthase)等基因增强子序列结合，增强基因转录；因而在一系列由细胞因子、炎症介质及蛋白酶类参与的疾病的发病过程中发挥重要作用。大量研究表明NF-κB过度活化与炎症、血管疾病、肿瘤、病毒感染、脑血管疾病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、过敏性脑炎、感染性休克、风湿性关节炎、支气管哮喘、动脉粥样硬化、溃疡性结肠炎等病理过程存在非常密切的关系。目前，NF-κB已成为新药开发的重要靶点，许多生物和生化抑制剂能够阻断NF-κB信号通路或抑制NF-κB/DNA结合，从而有助于NF-κB相关疾病的治疗。NF-κB是一类序列特异性转录因子，其生理作用的发挥依赖于在细胞质内活化的NF-κB进入细胞核，与其调控的靶基因调控区NF-κB特异性结合增强子DNA序列结合，从而启动或增强NF-κB调控靶基因的表达。因此，筛选抑制NF-κB作用的最佳部位是NF-κB与DNA的相互结合作用，只要能够封闭或干扰NF-κB与DNA的相互结合作用，就能够有效地抑制NF-κB作用。要实现对NF-κB与DNA的相互作用干扰性药物性分子的筛选，建立高通量NF-κB与DNA相互作用分析技术是必须的。

NF-κB与DNA的相互作用是发生在基因表达调控中的生物大分子特异性识别、结合反应，这种生物大分子反应是介于生物大分子dsDNA(double-stranded DNA，dsDNA)与序列特异性DNA结合蛋白(sequence-specific DNA-binding protein)之间，是通过NF-κB蛋白质上特定的氨基酸和DNA上特定的碱基间形成氢键、范德华力等化学键而产生的。在传统分子生物学中，用来研究DNA与NF-κB等序列特异性DNA结合蛋白相互作用的常规方法主要有硝酸纤维素结合分析(Nitrocellulose-binding Assays)、凝胶迁移实验(Gel Mobility-shift Analysis)、酶联免疫吸附分析(ELISA)、Southwestern印记(Southwestern blotting)、报告构体(ReporterConstruct)，染色体免疫沉淀(Chromatin Immunoprecipitation，ChIP)，噬菌体展示(PhageDisplay)，结合位点签名(Binding-site Signatures)，体外选择(in-vitro selection)，紫外交联(UV Crosslinking)，甲基化干扰分析(Methylization Interfenng Assay)，X-射线晶体衍射(X-ray Crystallography)，原子力显微镜(Atomic Force microscopy，AFM)，表面激元共振(Surface Plasmon Resonance，SPR)，毛细管电泳(Capillary Electrophoresis，CE)，扫描力显微镜(Scanning Force Microscopy，SFM)，脱氧核糖核酸酶足迹法(DNaseI footprinting)，荧光足迹法(Fluorescence Footprinting)，荧光各向异性(Fluorescence Anisotropy)，荧光共振能量传递(Fluorescence Resonance Energy Transfer，FRET)等，这些技术方法能够非常有效地反应DNA/NF-κB等序列特异性DNA结合蛋白相互作用的某一方面的特征，至今在实验研究中发挥重要作用；但这些方法都存在对实验样品消耗多、实验耗时长、分析效率低或存在放射性标记对实验人员及环境的危害等缺点，而且难以高通量获取DNA/NF-κB相互作用的信息。因此建立一种高通量的序列特异性DNA/NF-κB相互作用的研究方法是非常重要的。目前还没有非常有效的技术工具进行NF-κB与DNA的相互结合作用分析，以及NF-κB与DNA的相互作用干扰性分子筛选，特别是高通量的技术手段，但NF-κB与DNA的相互作用干扰性分子筛选在基础分子生物学研究，特别是发现和寻找NF-κB相关疾病生物医药候选药物方面具有重要价值。要实现高通量NF-κB与DNA的相互结合作用分析及NF-κB与DNA的相互作用干扰性分子筛选，就必须进行研究技术的创新，我们长期从事研究的生物芯片技术为解决这一问题提供了契机。

生物芯片是指在固相支持物上组装的核酸、蛋白质、细胞、微小组织等生物活性物质构成的微阵列。应用生物芯片可实现对待检样品中目标核酸分子、蛋白质分子、细胞、微小组织等物质的有无及多少进行准确、快速、大信息量检测。具有微型化、高通量和自动化的检测特征。生物芯片在生物检测、医学检测及疾病诊断、药物筛选和基因序列分析上有着极其重要的应用价值意义，因此受到广泛关注和投资，使其已经成为一个全球性的新型产业，即生物芯片产业。目前，从构成上来说，基因芯片和蛋白质芯片分别由单链DNA寡核苷酸分子和蛋白质分子构成，因此基因芯片只能依靠核酸分子之间的杂交检测经核酸扩增后的样品中目标单链DNA分子的有无及多少，蛋白质芯片主要通过蛋白质与样品中靶蛋白分子的识别及结合检测靶蛋白分子的有无及多少。因此基因芯片不能检测蛋白质，蛋白质芯片也难于检测DNA，这限制了运用DNA芯片直接对DNA结合蛋白质的检测，而DNA与DNA结合蛋白质的识别及相互作用在基因组稳定性维持及基因的表达调节中发挥极其重要的作用，如序列特异性转录因子NF-κB在基因表达调控中与其受控基因调节区DNA位点间的相互作用。因此要使用生物芯片实现对DNA与DNA结合蛋白质，如NF-κB的相互作用分析和DNA/NF-κB相互作用干扰性分子的筛选，就必须突破基因芯片和蛋白质芯片在制备上的思想束缚，基于DNA与DNA结合蛋白相互作用的生物学原理进行高通量生物芯片的研制。

双链核酸微阵列芯片是一种生物芯片。双链核酸微阵列芯片能够克服单链核酸微阵列不能检测蛋白质的缺陷，因为DNA结合蛋白常常识别和结合的是dsDNA，籍此在基因的表达调控中发挥重要作用。双链核酸微阵列芯片的制备是这种芯片应用的关键。Lockhart等最早在1996年就提出在固相介质上制备dsDNA探针分子的方法(US patent No.5,556,752)，其基本方法是将两段碱基互补的寡核苷酸运用连接分子连接在一起，将一段固定到固相介质上，通过退火使两段碱基互补的寡核苷酸复性，形成带有突环的双链核酸单分子，用于检测DNA结合生物分子；Lockhart在这一研究中的重要贡献是最早将DNA微阵列技术引入到高通量检测DNA/蛋白质相互作用的研究领域，但他提出的dsDNA阵列制备方法在应用中却存在严重的技术和经济问题，其dsDNA阵列制备技术若借助光导向原位DNA微阵列合成技术，则不仅合成的全长dsDNA数量极少，使大部分合成寡核苷酸为残缺(truncated molecules)分子，严重干扰检测反应，而且生产成本非常高昂；若借助基因芯片点样法完成，则生产成本更加高昂。Bulyk等在1999年提出了用核酸聚合酶引物延伸的办法将ssDNA微阵列转变为dsDNA微阵列方法，并申报了美国专利(US.Pat.6326489)。这一方法首先在玻片上通过Affymetrix光导向原位合成ssDNA微阵列，该微阵列的每条寡核苷酸靠近玻片的3′端含有长16个碱基的通用(constant)引物退火序列，ssDNA微阵列与通用引物退火后，进行聚合酶引物延伸反应，合成第二链核酸，从而形成dsDNA微阵列。这一方法的优点是能利用DNA微阵列原位合成技术制备高密度dsDNA微阵列；但这一方法同样存在严重的经济和技术问题，在技术上它依赖于光刻掩膜原位DNA微阵列合成专利技术，但固相基质表面的单链寡核苷酸合成的效率不高，每个核苷酸的合成效率在92～96％，这样合成一个40碱基长的寡核苷酸，则只有4～20％的寡核苷酸达到要求的40碱基长度，因此，以光刻掩膜原位合成技术制备的ssDNA及dsDNA微阵列严重地受到残缺截短分子(truncated molecules)的污染。众多竞争性残缺截短分子将可能强烈抑制和误导蛋白质结合实验；并且没有理由相信光刻掩膜原位合成的单链寡核苷酸微阵列上的每个寡核苷酸都可以被引物寡核苷酸结合，这样就会使一部分40碱基全长寡核苷酸不能被转换双链核酸，这不但进一步降低了芯片上理想双链核酸探针的数量，而且那些未被转换为双链的单链寡核苷酸同样会抑制和误导蛋白质结合实验。另外，这一方法制备的dsDNA微阵列是双分子(bimolecular)dsDNA微阵列，存在探针稳定性问题，即双分子dsDNA受到结合、洗片等实验环节的影响，会发生双链解链而丧失探针功能；而且这种双分子dsDNA微阵列只能使用一次，因此其使用效率极低。由于这一方法制备的dsDNA微阵列依赖目前非常昂贵的光刻掩膜原位DNA微阵列合成专利技术，加之这一方法本身的专利保护，使其不仅应用成本非常昂贵，而且不能在我国进行商业开发应用。

dsDNA微阵列芯片是进行高通量DNA/蛋白质相互作用研究的重要技术，这种芯片已经证明能够非常有效地用于序列特异性DNA/蛋白质相互作用的研究，可高效分析生物分子结合相互作用(binding interaction)。我们在2000年就认识到dsDNA微阵列芯片研究的重要价值，并开始着手研发能够高通量检测序列特异性DNA/蛋白质相互作用的dsDNA微阵列芯片。在中国博士后科学基金(2001)和国家自然科学基金(60201005)的资助下，至今已经建立了两种高效制备高性能dsDNA微阵列芯片的专利技术(中国专利申请号：02112780.8；02137945.9)。我们的研究成果已经受到国内外学者的关注，有关论文发表在国际刊物Nanotechnology、Molecules、Analytical Biochemistry、Journal of Biochemical and BiophysicalMethods上；研究成果在2002年参加三次国际学术会议，并在清华大学、北京生物芯片技术国家工程研究中心、科技部、教育部和国家自然科学基金委员会主办的“2002年国际生物芯片论坛”会议上获得唯一的Poster奖励。我们的研究表明运用我们的两项专利技术，不仅可以高效地制备性能良好的单分子(unimolecular)dsDNA微阵列芯片，而且制备的可检测多种疾病相关转录因子NF-κB(Nuclear Factor κB)的“点突变单分子dsDNA微阵列芯片”，可以灵敏地定量检测细胞核抽提物中NF-κB蛋白的数量、测定DNA/NF-κ3相互作用的序列特异性和亲合性、确定DNA/NF-κB相互作用中碱基和氨基酸的键合(base-amino acid contacting)。我们设计的“单分子dsDNA微阵列芯片”制备方法与国内外基因芯片点样制备技术完全兼容，而且在应用中与基因表达芯片的反应、检测设备完全兼容，提高了芯片使用的简便性。我们的方法尤其适宜制备最具应用价值的“点突变单分子dsDNA微阵列芯片”，这种芯片在研究DNA/蛋白质相互作用中碱基和氨基酸的接触规律、预测基因组中蛋白质结合位点和构建基因表达调控网络非常有效。我们已经研究了“单分子dsDNA微阵列芯片”在筛选组合化学分子和天然药物分子的应用，这一研究在生物医学上具有重要应用价值。

基于我们已经进行的深入研究，我们提出本专利申请的“NF-κB检测dsDNA微阵列芯片及制备”专利芯片产品及芯片产品生产技术。

三、发明内容

(1)发明目的

本发明的目的是提供一种检测转录因子NF-κB蛋白的生物芯片，即NF-κB检测dsDNA微阵列芯片，便于充分利用生物芯片能够高通量检测目标分子、高效获取生物信息的特点，依靠目前已经商业化应用的微阵列芯片(如基因芯片、蛋白质芯片、DNA芯片等)微点样制备仪器(如arrayer)及荧光标记检测仪器(如scanner)，建立一种高通量检测转录因子NF-κB蛋白的技术平台，实现对多种疾病相关转录因子NF-κB在特定细胞或组织中表达及活化水平的测定、各种NF-κB蛋白与其受控基因调节区DNA靶点相互作用规律的分析、基因组中潜在NF-κB蛋白结合位点的筛选鉴定、NF-κB蛋白基因表达调控网络构建、NF-κB蛋白DNA靶点特异性结合小分子筛选和NF-κB/DNA相互作用干扰性小分子筛选等，这些研究将对NF-κB蛋白相关分子生物学及生物医学研究产生重要影响。

(2)技术方案

本发明采用多种技术方法在固相支持物表面制备NF-κB检测DNA微阵列，并将其用于多种NF-κB蛋白相关的分子生物学及生物医学研究。

(2.1)NF-κB检测DNA微阵列芯片的制备包括如下9种技术方法：

①双分子寡核苷酸复性点样法

步骤1：固相化学合成两条碱基序列完全互补的寡核苷酸(如图2：1-1c，2-2c，3-3c，4-4c)，其中寡核苷酸上嵌合NF-κB结合位点；

步骤2：两寡核苷酸液相复性(图2A，A：annealing)；

步骤3：双链寡核苷酸点样连接到固相基质表面(图2I，I：immobilizing)。

②双分子寡核苷酸点样复性法

步骤1：固相化学合成两条碱基序列完全互补的寡核苷酸(如图3：1-1c，2-2c，3-3c，4-4c)，其中寡核苷酸上嵌合NF-κB结合位点；

步骤2：将化学修饰的寡核苷酸点样连接到固相基质表面(图3I)；

步骤3：互补寡核苷酸杂交复性(图3A)。

③双分子寡核苷酸通用引物点样复性延伸法

步骤1：固相化学合成两条寡核苷酸，其中一条较长寡核苷酸上嵌合NF-κB结合位点(如图4：1，2，3，4)，另一条较短的寡核苷酸作为通用引物(图4 CP，CP：constantprimer)；

步骤2：将化学修饰的较长的寡核苷酸点样连接到固相基质表面(图4I)；

步骤3：通用引物寡核苷酸杂交复性(图4A)；

步骤4：DNA聚合酶在片延伸反应(图2E，E：elongating)。

④双分子寡核苷酸通用引物复性点样延伸法

步骤1：固相化学合成两条寡核苷酸，其中一条较长寡核苷酸上嵌合NF-κB结合位点(如图5：1，2，3，4)，另一条较短的寡核苷酸作为通用引物(图5 CP)；

步骤2：化学修饰的寡核苷酸与通用引物寡核苷酸在液相杂交复性(图5A)；

步骤3：复性产物点样连接到固相基质表面(图5I)；

步骤4：DNA聚合酶在片延伸反应(图5E)。

⑤双分子寡核苷酸通用引物复性延伸点样法

步骤1：固相化学合成两条寡核苷酸，其中一条较长寡核苷酸上嵌合NF-κB结合位点(如图6：1，2，3，4)，另一条较短的寡核苷酸作为通用引物(图6 CP)；

步骤2：化学修饰的寡核苷酸与通用引物寡核苷酸在液相杂交复性(图6A)；

步骤3：DNA聚合酶延伸反应(图6E)；

步骤4：延伸反应点样连接到固相基质表面(图2I)。

⑥单分子链内互补法

步骤1：固相化学合成一条长寡核苷酸，使寡核苷酸含有两段链内反向互补序列，且反向互补序列内含有NF-κB结合位点(如图7：1，2，3，4)；

步骤2：寡核苷酸点样连接固定到固相基质表面(或寡核苷酸变性再复性)(图7I)；

步骤3：寡核苷酸微阵列变性再复性(寡核苷酸点样连接固定到固相基质表面)(图7A)。

⑦单分子点样复性发卡引物延伸法

步骤1：固相化学合成一条较短的寡核苷酸，使寡核苷酸含有NF-κB结合位点，并且在其3′端(羟基)含有两段链内反向互补序列(如图8：1，2，3，4)；

步骤2：寡核苷酸点样连接固定(5′端)到固相基质表面(图8I)；

步骤3：寡核苷酸微阵列变性再复性(图8A)；

步骤4：DNA聚合酶在片延伸反应(图8E)。

⑧单分子复性连接点样发卡引物延伸法

步骤1：固相化学合成两条寡核苷酸，使其中寡核苷酸1含有NF-κB结合位点，并且在其磷酸化的3′端含一段核苷酸序列，该段核苷酸能够与寡核苷酸2的3′端一段核苷酸序列互补(如图9：1，2，3，4)；寡核苷酸2在5′端含有两段链内反向互补序列，且两段链内反向互补序列间有一个或多个C3dT氨基或其他化学修饰基团(图9 CP)；

步骤2：两条寡核苷酸在液相内复性(图9A)；

步骤3：复性产物进行DNA连接酶连接反应(图9L，L：ligating)；

步骤4：复性产物点样连接(C3dT氨基或其他化学修饰基团)到固相基质表面(图9I)；

步骤5：DNA聚合酶在片延伸反应(图9E)。

⑨C6dT单分子点样复性发卡引物延伸法

步骤1：固相化学合成一条较长寡核苷酸，使寡核苷酸含有NF-κB结合位点，并且在其3′端(羟基)含两段链内反向互补序列，且两段链内反向互补序列间有一个或多个C3dT氨基或其他化学修饰基团(图10：1，2，3，4)；

步骤2：寡核苷酸点样连接固定(C6dT氨基或其他化学修饰基团)到固相基质表面(图10I)；

步骤3：寡核苷酸微阵列变性再复性(图10A)；

步骤4：DNA聚合酶在片延伸反应(图10E)。

上述方法①～⑨中，为了实现寡核苷酸在固相支持物上的固定而进行的末端或中间化学修饰，仅仅是针对通过在寡核苷酸与固相支持物间形成稳定的化学键而制备NF-κB检测dsDNA微阵列芯片的方法，而对其他不需要进行寡核苷酸化学修饰就可以将寡核苷酸固定在固相支持物上的方法，则不需进行寡核苷酸化学修饰，按照相似操作就可以制备NF-κB检测dsDNA微阵列芯片。

上述方法中，用于进行DNA聚合反应的核酸聚合酶包括一切可以完成DNA聚合功能的酶，如核糖核酸聚合酶、脱氧核糖核酸聚合酶及反转录酶等；用于进行核苷酸聚合反应的核苷酸包括所有核糖核苷酸、脱氧核糖核苷酸、稀有核苷酸及化学修饰核苷酸；用于固定单链寡核苷酸的固相支持物包括可用于表面化学研究的拥有刚性和半刚性表面的材料。

(2.2)NF-κB检测DNA微阵列芯片定量检测特定细胞或组织中NF-κB蛋白表达及活化水平的技术操作方案

步骤1：NF-κB检测DNA微阵列芯片与标准NF-κB蛋白样品杂交并检测(荧光标记的NF-κB蛋白抗体或荧光标记的NF-κB蛋白抗体的抗体即二抗)，绘制“荧光强度/NF-κB蛋白浓度”标准曲线；

步骤2：培养特定细胞(如HeLa细胞)，培养基中加不同剂量的NF-κB蛋白表达诱导剂(如TNF-α)诱导不同的时间，收集培养细胞，制备全细胞抽提物(cell extract)或细胞核抽提物(cell nuclear extract)；或制备特定组织(tissue)全细胞抽提物(cellextract)或细胞核抽提物(cell nuclear extract)；

步骤3：NF-κB检测DNA微阵列芯片用适当封闭剂(blocking reagents)(如牛血清白蛋BSA；脱脂奶粉；Denharts溶液等)封闭；

步骤4：全细胞抽提物或细胞核抽提物与NF-κB检测DNA微阵列芯片在适宜温度杂交适当时间；杂交液中应含有适量两性电解质(如HEPES，Tris-HCl)、担体(如dI-dC)、阳离子(如Na⁺，K⁺)、去污剂(如NP-40)、抗氧化剂(如DTT)等，提供NF-κB与DNA结合的环境条件；

步骤5：除去杂交液，芯片用洗涤缓冲液洗涤(如含有适量Tween-20或Triton-100的PBS溶液)；

步骤6：芯片与荧光标记NF-κB蛋白抗体杂交(或先与NF-κB蛋白抗体杂交，再与荧光标记NF-κB蛋白抗体的抗体即二抗杂交)；

步骤7：芯片在微阵列芯片扫描仪或荧光显微镜上观察，记录荧光信号强度；

步骤8：将荧光信号强度输入标准曲线，获得NF-κB蛋白定量数据。

(2.3)NF-κB检测DNA微阵列芯片定性检测特定细胞或组织中NF-κB蛋白种类的技术操作方案

步骤1：NF-κB检测DNA微阵列芯片与各种标准NF-κB蛋白(RelA/p65、RelB、c-Rel、NF-κB1/p50、NF-κB2/p52)同二聚体(homodimer)(如p50·p50，p52·p52等)和异二聚体(heterodimer)(如p50·p65等)样品杂交并检测[荧光标记的NF-κB蛋白单克隆抗体(monoclonal antibody)(如mono-anti-p65，mono-anti-p50等)或荧光标记的NF-κB蛋白单克隆抗体的抗体即二抗)，确定不同种类NF-κB蛋白特异性检测DNA探针(这一工作在NF-κB检测DNA微阵列芯片性能测试研究中已经确定，并将此类DNA探针固定在NF-κB检测DNA微阵列芯片的特定区域，专门NF-κB蛋白定性检测)；

步骤2：培养不同种类的细胞(如HeLa细胞等)，培养基中加不同种类的NF-κB蛋白表达诱导剂(如TNF-α)诱导适当时间，收集培养细胞，制备全细胞抽提物(cell extract)或细胞核抽提物(cell nuclear extract)；或制备特定组织(tissue)全细胞抽提物(cell extract)或细胞核抽提物(cell nuclear extract)；

步骤3：NF-κB检测DNA微阵列芯片杂交用适当封闭剂(blocking reagents)(如牛血清白蛋BSA；脱脂奶粉；Denharts溶液等)封闭；

步骤6：芯片与荧光标记NF-κB蛋白单克隆抗体杂交(或先与NF-κB蛋白单克隆抗体杂交，再与荧光标记NF-κB蛋白单克隆抗体的抗体即二抗杂交)；

步骤7：芯片在微阵列芯片扫描仪或荧光显微镜上观察，记录荧光信号；

步骤8：依据芯片上NF-κB蛋白定性检测DNA探针系统的荧光信号，判别NF-κB蛋白定性种类。

(2.4)NF-κB检测DNA微阵列芯片分析NF-κB/DNA相互作用规律技术操作方案

步骤1：培养特定细胞(如HeLa细胞)，培养基中加不同种类的NF-κB蛋白表达诱导剂(如TNF-α)诱导适当时间，收集培养细胞，抽提制备不同种类NF-κB纯蛋白；或构建不同NF-κB蛋白原核或真核表达载体，将载体引物原核或真核表达系统(细胞或无细胞表达系统)，制备不同种类NF-κB纯蛋白；

步骤2：NF-κB检测DNA微阵列芯片杂交用适当封闭剂(blocking reagents)(如牛血清白蛋BSA；脱脂奶粉；Denharts溶液等)封闭；

步骤3：不同种类NF-κB纯蛋白与NF-κB检测DNA微阵列芯片在适宜温度杂交适当时间；杂交液中应含有适量两性电解质(如HEPES，Tris-HCl)、担体(如dI-dC)、阳离子(如Na⁺，K⁺)、去污剂(如NP-40)、抗氧化剂(如DTT)等，提供NF-κB与DNA结合的环境条件；

步骤4：除去杂交液，芯片用洗涤缓冲液洗涤(如含有适量Tween-20或Triton-100的PBS溶液)；

步骤5：芯片与荧光标记NF-κB蛋白抗体杂交(或先与NF-κB蛋白抗体杂交，再与荧光标记NF-κB蛋白抗体的抗体即二抗杂交)；

步骤3-5也可以直接用荧光标记的不同种类NF-κB纯蛋白与芯片的杂交代替。

步骤6：芯片在微阵列芯片扫描仪或荧光显微镜上观察，记录荧光信号；

步骤7：依据芯片上野生和突变(特别是点突变)DNA探针系统的荧光信号，分析不同种类NF-κB蛋白与DNA相互作用的规律，包括：

①不同种类NF-κB蛋白与不同野生和突变DNA靶点结合的特异性；

②不同种类NF-κB蛋白与不同野生和突变DNA靶点结合的亲合性；

③不同种类NF-κB蛋白特异性识别结合的DNA靶点(用于NF-κB蛋白定性分析)；

④NF-κB蛋白结合DNA靶点碱基组成矩阵；

⑤NF-κB蛋白结合DNA靶点预测；

⑥预测的NF-κB蛋白结合DNA靶点基因组检索分析；

⑦预测的NF-κB蛋白结合DNA靶点调控基因鉴定；

⑧构建基因组水平(genomic scale)NF-κB蛋白调控基因网络。

(2.5)NF-κB检测DNA微阵列芯片筛选NF-κB蛋白DNA靶点特异性结合小分子技术操作方案

步骤1：NF-κB检测DNA微阵列芯片杂交用适当封闭剂(blocking reagents)(如牛血清白蛋BSA；脱脂奶粉；Denharts溶液等)封闭；

步骤2：NF-κB检测DNA微阵列芯片再与含有组合化学分子或天然生物分子(如中药)的杂交液杂交；杂交液中应含有适量两性电解质(如HEPES，Tris-HCl)、担体(如dI-dC)、阳离子(如Na⁺，K⁺)、去污剂(如NP-40)、抗氧化剂(如DTT)等，提供NF-κB与DNA结合的环境条件；

步骤3：除去杂交液，芯片用洗涤缓冲液洗涤(如含有适量Tween-20或Triton-100的PBS溶液)；

步骤4：NF-κB纯蛋白再与NF-κB检测DNA微阵列芯片在适宜温度杂交；杂交液中应含有适量两性电解质(如HEPES，Tris-HCl)、担体(如dI-dC)、阳离子(如Na⁺，K⁺)、去污剂(如NP-40)、抗氧化剂(如DTT)等，提供NF-κB与DNA结合的环境条件；

步骤7：将芯片上DNA探针系统呈现的荧光信号和芯片直接与NF-κB蛋白杂交呈现的荧光信号(对照)进行比较，寻找那些荧光信号出现变化的DNA探针，用这些探针进行亲合分离NF-κB蛋白DNA位点结合性分子的捕获分离，并对分离纯化的分子进行化学性质鉴定及生理、药理作用分析研究，进而开发成为新的NF-κB相关疾病候选药物。

(2.6)NF-κB检测DNA微阵列芯片筛选NF-κB/DNA相互作用干扰性小分子技术操作方案

步骤2：NF-κB检测DNA微阵列芯片再与含有组合化学分子或天然生物分子(如中药)及NF-κB蛋白的杂交液杂交；杂交液中应含有适量两性电解质(如HEPES，Tris-HCl)、担体(如dI-dC)、阳离子(如Na⁺，K⁺)、去污剂(如NP-40)、抗氧化剂(如DTT)等，提供NF-κB与DNA结合的环境条件；

步骤4：芯片与荧光标记NF-κB蛋白抗体杂交(或先与NF-κB蛋白抗体杂交，再与荧光标记NF-κB蛋白抗体的抗体即二抗杂交)；

步骤2-4也可以直接用荧光标记的不同种类NF-κB纯蛋白与芯片的杂交代替。

步骤7：将芯片上DNA探针系统呈现的荧光信号和芯片直接与NF-κB蛋白杂交呈现的荧光信号(对照)进行比较，寻找那些荧光信号出现变化的DNA探针，用这些探针及相应的NF-κB蛋白进行亲合分离NF-κB/DNA相互作用干扰性分子的捕获分离，并对分离纯化的分子进行化学性质鉴定及生理、药理作用分析研究，进而开发成为新的NF-κB相关疾病候选药物。

上述方法(2.2)-(2.6)中，为了实现NF-κB蛋白与芯片杂交结果的检测，所进行的NF-κB蛋白、NF-κB蛋白抗体、NF-κB蛋白二抗的荧光标记，可以用放射性同位素(如³²P等)、酶(如HRP)、金属(如Ag)等标记代替，而采用放射性同位素检测(如X光膜感光、磷成像phosphoimaging等)、化学发光(如CSPD等)、化学生色(如NTP)及金标等检测方法代替；甚至NF-κB蛋白、NF-κB蛋白抗体、NF-κB蛋白二抗等不进行任何标记，而采用物理学方法如原子力显微镜(AFM)等手段进行检测；其他非标记的DNA/蛋白质相互作用检测方法同样可以用于NF-κB检测芯片的检测。

(3)技术效果

本发明提出的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片为多种疾病相关转录因子NF-κB蛋白的高通量检测建立了新的技术平台，这一技术将在两个领域发挥重要作用，一是为NF-κB相关基础分子生物学中基因表达调控和信号传导提供新的高通量研究手段，二是为生物医学中NF-κB相关多种疾病候选药物分子的高通量筛选及病理、药理学研究提供新的技术手段。

本发明提出的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片为NF-κB相关基础分子生物学中基因表达调控和信号传导提供新的高通量研究手段。为了确证NF-κB检测dsDNA微阵列芯片在检测序列特异性转录因子NF-κB与其靶DNA序列的结合特异性和亲合性的可行性。我们在国家自然科学基金项目(60201005)的资助下，运用我们的dsDNA微阵列芯片专利制备技术(02137945.9)，制备了单核苷酸突变的NF-κB靶DNA序列Ig-κB对应的dsDNA微阵列芯片，检测了NF-κB家族蛋白p50同二聚体与野生Ig-κB(5′-GGGACTTTCC-3′)及单核苷酸突变的Ig-κB DNA位点的结合亲合性，我们发现待检溶液中的p50同二聚体蛋白能够以不同的亲合性与野生Ig-κB及单核苷酸突变的Ig-κB DNA位点结合(如附图17)，通过传统凝胶迁移实验(Electrophoresis Mobility Shift Assay，EMSA)验证，以及与其他方法如X光晶体衍射等取得的实验结果相比较，证明单核苷酸突变的NF-κB靶DNA序列Ig-κB对应的dsDNA微阵列芯片能够通过一次实验，高通量确定NF-κB家族蛋白p50同二聚体与众多DNA靶点(野生Ig-κB及及单核苷酸突变的Ig-κB DNA位点)结合的亲合性，有力地分析出Ig-κB位点中各个核苷酸在p50同二聚体蛋白与Ig-κB位点相互作用中发挥的不同作用，从而确定NF-κB与其DNA靶点结合时，发生在蛋白质氨基酸和DNA碱基之间的相互作用，并预测出基因组可能存在在其他NF-κB结合DNA靶点，如通过过我们的实验，我们发现NF-κB结合的DNA靶点不仅仅体现为5′-GGGRNYYYCC-3′，基因组中存在的其他一些序列如5′-GGNRNYYYCC-3′可能与NF-κB也结合，比如序列5′-GGTACTTTCC-3′位点在我们的阵列上与p50同二聚体蛋白有高结合亲合性，序列5′-GGAACTTTCC-3′与p50同二聚体蛋白也有显著的结合亲合性。我们对人类基因组进行了搜索，发现在人22号染色体上存在20个5′-GGTACTTTCC-3′位点和29个5′-GGAACTTTCC-3′位点，而在全基因组中存在966个5′-GGTACTTTCC-3′位点和942个5′-GGAACTTTCC-3′位点，这些位点可能是。NF-κB尚未发现的新的结合靶点，通过对这些位点性质的考察，可望鉴定那些受NF-κB调控的新基因，从而构建出全基因组NF-κB调控的基因网络，这一NF-κB调控的基因网络的完成，将为NF-κB调控基因表达的分子生物学基础研究、NF-κB相关疾病的机理研究以及NF-κB药物筛选全基因组靶点系统的确立产生极为重要的影响(Jin K.Wang，Tong X.Li，Yun F.Bai，Zu H.Lu.2002，Analyticai Biochemistry，316：192-201)。

为了进一步确证NF-κB检测dsDNA微阵列芯片在检测序列特异性转录因子NF-κB与其靶DNA序列的结合特异性和亲合性的可靠性。我们在国家自然科学基金项目(60121101)的资助下，运用我们的dsDNA微阵列芯片专利制备技术(02112780.8)，制备了含有30个野生型NF-κB靶DNA序列(表2)的dsDNA微阵列芯片，检测了NF-κB家族蛋白p50同二聚体与30个野生型NF-κB靶DNA序列的结合亲合性，我们发现待检溶液中的p50同二聚体蛋白能够以非常不同的亲合性与各DNA位点结合(如附图18)，通过传统凝胶迁移实验(Electrophoresis Mobility Shift Assay，EMSA)验证，与上面单碱基突变Ig-κBdsDNA微阵列芯片取得的结果相比较，以及和其他方法如X光晶体衍射等取得的实验结果相比较，证明含有30个野生型NF-κB靶DNA序列的dsDNA微阵列芯片完全能够通过一次实验，高通量测定NF-κB家族蛋白p50同二聚体与众多野生型DNA靶点结合的亲合性；通过与单碱基突变Ig-κBdsDNA微阵列芯片取得的结果相比较，我们发现两个芯片揭示的NF-κB家族蛋白p50同二聚体与众多DNA靶点结合时，发生在蛋白质氨基酸和DNA碱基之间的相互作用规律非常一致，这一结果很有力地说明NF-κB检测dsDNA微阵列芯片在检测序列特异性转录因子NF-κB与其靶DNA序列的结合特异性和亲合性时非常高效可靠，是一种基于生物芯片技术思想的高通量检测序列特异性DNA结合蛋白与其基因组中靶dsDNA位点相互作用规律的新技术。

表1 30个野生型NF-κB靶DNA位点

Ly1	IL-2-α1	TNF-1	MHC1	IFNβ-κB-1	κB-33	Ig-κB	p50-p1
Ly1	IL-2-α1	TNF-1	MHC1	IFNβ-κB-1	κB-33	Ig-κB	p50-p1	Ly2	IL-2-α2	TNF-2	MHC2	IFNβ-κB-2	κB-55	uPA-κB	p50-p2
Ly3	IL2-κB	TNF-α1	MHC3	IFN-MHC		HuκB-m1	p50-p3	Ly2	IL-2-α2	TNF-2	MHC2	IFNβ-κB-2	κB-55	uPA-κB	p50-p2
Ly3	IL2-κB	TNF-α1	MHC3	IFN-MHC		HuκB-m1	p50-p3	Ly4-V63	IL6-κB	TNF-α2				GM-CSF	P65-p1
Ly5-Hm2	IL8-κB					Ang	P65-p2	Ly4-V63	IL6-κB	TNF-α2				GM-CSF	P65-p1
Ly5-Hm2	IL8-κB					Ang	P65-p2							VCAM-77	P65-p3
						In-Chain II	P65-p4							VCAM-77	P65-p3

本发明提出的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片为生物医学中NF-κB相关多种疾病候选药物分子的高通量筛选及病理、药理学研究提供了新的技术手段。NF-κB是一类序列特异性转录因子，参与众多基因的表达调控；如当细胞受到炎症介质、病毒感染、氧化应激等多种物质刺激后，NF-κB在胞质内被激活，进入细胞核与病毒(HIV，Adenovirus，HSV，SIV，SV-40，EBV)、细胞因子(IFN，TNF，IL-1，IL-2，IL-6，IL-8，IL-10，IL-11，IL-12，IL-13)、生长因子(G-CSF，GM-CSF，EPO，M-CSF，VEGF C)、细胞粘附分子(ELAM-1，ICAM-1，VCAM-1，MadCAM-1，Endoglin)、急性相反应蛋白(Angiotensinogen，beta-defensin-2，Tissue factor-1，Pentraxin PTX3，Complement factor C4)、酶(ADH，Lysozyme，PIM-1，Serpin 2A，Gelatinase B，GD3-synthase)、免疫球蛋白(Igκlight chain)等基因增强子序列结合，增强这些基因的转录；因而在一系列由细胞因子、炎症介质及蛋白酶类参与的疾病的发病过程中发挥重要作用。大量的研究表明NF-κB过度活化与炎症、血管疾病、肿瘤、病毒感染、脑血管疾病、阿尔茨海默病、帕金森氏病、过敏性脑炎、感染性休克、风湿性关节炎、支气管哮喘、动脉粥样硬化、溃疡性结肠炎等病理过程存在非常密切的关系。因此目前NF-κB已成为新药开发的重要靶点，许多生物和生化抑制剂能够阻断NF-κB信号通路或抑制NF-κB/DNA结合，从而有助于NF-κB相关疾病的治疗。NF-κB是一类序列特异性转录因子，其生理作用的发挥依赖于在细胞质内活化的NF-κB进入细胞核，与其调控的靶基因调控区NF-κB特异性结合增强子DNA序列结合，从而启动或增强NF-κB调控靶基因的表达。因此，筛选抑制NF-κB作用的最佳部位是NF-κB与DNA的相互结合作用，只要能够封闭或干扰NF-κB与DNA的相互结合作用，就能够有效地抑制NF-κB作用。大量的实验已经证明许多小分子能够与NF-κB的DNA靶点直接结合，封闭或干扰NF-κB与DNA的相互结合，有效地抑制NF-κB对DNA靶点调控的下游基因的表达增强作用，如己酮可可碱[Pentoxifylline(1-(5′-oxohexyl)3，7-dimetylxanthine，PTX)]、1，25-二羟胆骨化醇[Calcitriol(1，25-dihydroxyvitamine D3)]、羟基吡啶硫酮(Pyrithione)、甲基红霉素(Clarithromycin)、Quinadril(ACE inhibitor)、阱(Diamide)、三(氮)唑核苷，病毒唑(抗病毒药)(ribavirin)、醌衍生物[E3330(quinone derivative)]、血液复合胺衍生物[Serotonin derivative(N-(p-coumaroyl)serotonin，SC)]、除锈霉素A(Herbimycin A)、水杨酸偶氮磺胺吡啶(Sulfasalazine)、对苯二酚(Hydroquinone(HQ))、洛凡司丁(Mevinolin)，5′-甲硫腺苷[5′-methylthioadenosine(MTA)]、吗啡合成衍生[KT-90(morphine synthetic derivative)]、N-乙基-顺丁烯二酰亚胺[N-ethyl-maleimide(NEM)]、烟碱(Nicotine)、Kamebakaurin、ADP ribosylationinhibitors(nicotinamide，3-aminobenzamide)、Atrial Natriuretic Peptide(ANP)、Phenyl-N-tert-butylnitrone(PBN)、Atrovastat(HMG-CoA reductase inhibitor)、Pituitary adenylatecyclase-activating polypeptide(PACAP)、Secretory leukocyte protease inhibitor(SLPI)、Vascularendothelial growth factor(VEGF)、IL-4、Vasoactive intestinal peptide(VIP)、IkB-like proteins(encoded by ASFV)、Metals(chromium，cadmium，gold，mercury，zinc，arsenic)。特别是研究表明，中药中存在一些小分子，能够直接与NF-κB的DNA靶点直接结合，封闭或干扰NF-κB与DNA的相互结合，有效地抑制NF-κB对DNA靶点调控的下游基因的表达增强作用，如甘草酸(Glycyrrhizin)(抗病毒)、金丝桃素(Hypericin)(抗病毒、肿瘤)、水飞蓟(黄酮)(Silymarin)(保肝)。我们运用甘草酸(甘草皂苷、甘草甜素)研究了运用NF-κB检测dsDNA微阵列芯片高通量筛选NF-κB相关多种疾病候选药物分子的可行性，我们观察到随着NF-κB蛋白体系中存在的甘草酸分子浓度的逐步提高，NF-κB蛋白与DNA靶点结合的亲合性越低，即证明甘草酸分子竞争性占据了芯片DNA探针上的NF-κB蛋白结合位点，导致芯片上可供NF-κB蛋白结合的DNA位点减少(如附图19)。这一实验证明运用NF-κB检测dsDNA微阵列芯片可以高通量筛选中药或组合化学药物中潜在的NF-κB/DNA相互作用干扰性分子，开发新的NF-κB相关疾病候选药物。

四、附图说明

图1是固相支持物表面合成的NF-κ5检测dsDNA微阵列芯片

图2是固相支持物表面制备NF-κB检测dsDNA微阵列的方法①

图3是固相支持物表面制备NF-κB检测dsDNA微阵列的方法②

图4是固相支持物表面制备NF-κB检测dsDNA微阵列的方法③

图5是固相支持物表面制备NF-κB检测dsDNA微阵列的方法④

图6是固相支持物表面制备NF-κB检测dsDNA微阵列的方法⑤

图7是固相支持物表面制备NF-κB检测dsDNA微阵列的方法⑥

图8是固相支持物表面制备NF-κB检测dsDNA微阵列的方法⑦

图9是固相支持物表面制备NF-κB检测dsDNA微阵列的方法⑧

图10是固相支持物表面制备NF-κB检测dsDNA微阵列的方法⑨

图11是NF-κB检测dsDNA微阵列芯片定量检测NF-κB蛋白示意图

图12是NF-κB检测dsDNA微阵列芯片定性检测NF-κB蛋白示意图

图13是NF-κB检测dsDNA微阵列芯片筛选NF-κB蛋白DNA靶点结合分子示意图

图14是NF-κB检测dsDNA微阵列芯片筛选NF-κB/DNA相互作用干扰性分子示意图

图15是Cy3-标记dUTP渗入在片延伸反应合成的dsDNA微阵列芯片荧光信号图

图16是Cy3标记NF-κB蛋白与dsDNA微阵列芯片杂交荧光信号图

图17是NF-κB p50蛋白与野生及单碱基突变的Ig-κBdsDNA微阵列芯片杂交信号图

图18是NF-κB p50蛋白与含有30个野生型NF-κB DNA靶点的dsDNA微阵列芯片杂交信号图

图19是含甘草酸的NF-κB p50蛋白与dsDNA微阵列芯片杂交信号图

五、具体实施方式

1、固相支持物准备

用于本发明制备双链核酸的固相支持物可以是硝酸纤维素膜、尼龙膜、LB膜、(聚)四氟乙烯膜，(聚)偏二氟乙烯膜，聚苯乙烯膜，聚碳酸酯等化学膜、琼脂糖凝胶体、聚丙烯酰胺凝胶体、表面化学修饰的玻璃、硅、金等固相化学所用材料；固相支持物表面含有活性基团如羧基、醛基、氨基、羟基、硫醇基等类似基团。

下面NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备技术操作实施方式中，仅用表面以硅烷处理的玻片为固相支持物和在芯片上制备一个DNA探针为例，对NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备及应用加以说明。

玻片的准备及硅烷化及醛基修饰：

若使用商业化提供的基因芯片专用玻片如Telechem公司的SuperAldehyde Slides等，则此步不需要再执行；若从普通制备组织切片的玻片开始，则不许对玻片进行处理。首先对玻片进行常规清洗，再用硅烷化试剂如Sigma公司的aminopropyltriethoxysilane(三乙氧基氨基硅烷)进行硅烷化处理5-10分钟(含2％aminopropyltriethoxysilane的95％丙酮，acetone)。硅烷化处理后用去离子水洗涤两次，在75℃烘烤45分钟。将硅烷化处理好的玻片浸泡在含5％戊二醛(glutaraldehyde)的磷酸缓冲液(0.01M PB，pH7.0)中30分钟，之后用去离子水洗涤两次，氮气吹干，保存在4℃，半月内使用。

2.单链寡核苷酸的设计及化学合成

设计并用固相化学合成技术合成探针单链寡核苷酸及通用单链寡核苷酸。仅在芯片上制备一个dsDNA探针为例，对NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备及应用加以说明。

表2：在醛基修饰玻片上制备一个NF-κB检测探针所使用的固相化学合成的单链寡核苷酸：

3.点样DNA准备及在玻片表面固定及芯片制备

用表2中合成的寡核苷酸，按上面说明书中的技术方案进行NF-κB检测dsDNA微阵列芯片的制备，各种方法的具体操作如下。

①双分子寡核苷酸复性点样法

步骤1：固相化学合成两条碱基序列完全互补的寡核苷酸(如表2：①1，①2)，其中寡核苷酸上嵌合NF-κB结合位点(红色碱基GGGACTTTCC)；

步骤2：两寡核苷酸以80μM溶解在TE缓冲液中，混合并在60℃复性1小时；复性产物中加入等体积碳酸缓冲液(0.1M carbonate buffer，pH9.0)；

步骤3：双链寡核苷酸用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)点样(湿度80％)到醛基修饰玻片表面，点样后置于湿盒内0.1M碳酸缓冲液(pH9.0)浸湿的滤纸上，密封湿盒，在37℃温育1小时，再用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗涤5分钟，用灭菌双蒸水简单淋洗，氮气吹干，4℃保存备用。

②双分子寡核苷酸点样复性法

步骤1：固相化学合成两条碱基序列完全互补的寡核苷酸(如表2：②1，②2)，其中寡核苷酸上嵌合NF-κB结合位点(红色碱基GGGACTTTCC)；

步骤2：将氨基寡核苷酸②1以40μM溶解在碳酸缓冲液(0.1M carbonate buffer，pH9.0)中，用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)点样(湿度80％)到醛基修饰玻片表面，点样后置于湿盒内0.1M碳酸缓冲液(pH9.0)浸湿的滤纸上，密封湿盒，在37℃温育1小时，再用0.1％SDS溶液洗涤2分钟；玻片用灭菌双蒸水简单淋洗后，转入硼氢化钠溶液[0.28％(w/v)NaBH₄，76％(v/v)PBS，24％(v/v)alcohol]中，浸泡3分钟，再用灭菌双蒸水淋洗两次，氮气吹干，4℃保存备用；

步骤3：将寡核苷酸②2以40nM溶解在杂交液中，加10μL到步骤2制备的单链寡核苷酸②1的微阵列上，用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％ w/v in octamethylcyclotetra-sixane)，Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列，放置于密封湿盒内60℃复性1小时；复性后玻片用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗涤5分钟，用灭菌双蒸水简单淋洗，氮气吹干，4℃保存备用。

③双分子寡核苷酸通用引物点样复性延伸法

步骤1：固相化学合成两条寡核苷酸，其中一条较长寡核苷酸上嵌合NF-κB结合位点(如表2：③1)(红色碱基GGGACTTTCC)，另一条较短的寡核苷酸作为通用引物(constant primer)(表2：③2)；

步骤2：将3′端氨基修饰的寡核苷酸③1以40μM溶解在0.1M碳酸缓冲液(pH9.0)中，用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)点样(湿度80％)到醛基修饰玻片表面，点样后置于湿盒内0.1M碳酸缓冲液(pH9.0)浸湿的滤纸上，密封湿盒，在37℃温育1小时，再用0.1％SDS溶液洗涤2分钟；玻片用灭菌双蒸水简单淋洗后，转入硼氢化钠溶液[0.28％(w/v)NaBH₄，76％(v/v)PBS，24％(v/v)alcohol]中，浸泡3分钟，再用灭菌双蒸水淋洗两次，氮气吹干，4℃保存备用；

步骤3：将通用引物寡核苷酸③2以40nM溶解在杂交液中，加10μL到步骤2制备的单链寡核苷酸③1的微阵列上，用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％ w/v in octamethylcyclotetra-sixane)，Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列，放置于密封湿盒内60℃复性1小时；复性后玻片用2×SSC/0.1％SDS溶液洗涤2分钟，用灭菌双蒸水简单淋洗，氮气吹干，4℃保存备用；

步骤4：将10μL DNA聚合酶反应缓冲液[Polymerase Reaction：50mM Tris-HCl(pH7.2)，10mM MgSO4，0.1mM DTT，40μM of each dNTP，20μg/ml acetylated BSA，2U/μlDNA polymerase I large(Klenow)fragment(3′to 5′exo-；Promega，Madison，WI)]加到步骤3制备的寡核苷酸微阵列上，用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％ w/v in octamethylcyclotetra-sixane)，Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列，放置于密封湿盒内37℃延伸反应1小时；反应后玻片用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗涤5分钟，用灭菌双蒸水简单淋洗，氮气吹干，4℃保存备用。

④双分子寡核苷酸通用引物复性点样延伸法

步骤1：固相化学合成两条寡核苷酸，其中一条较长寡核苷酸上嵌合NF-κB结合位点(如表2：④1)(红色碱基GGGACTTTCC)，另一条较短的寡核苷酸作为通用引物(constant primer)(表2：④2)；

步骤2：两寡核苷酸以80μM溶解在TE缓冲液中，混合并在50℃复性1小时；复性产物中加入等体积0.1M碳酸缓冲液(pH9.0)；

步骤3：步骤2寡核苷酸产物用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)点样(湿度80％)到醛基修饰玻片表面，点样后置于湿盒内0.1M碳酸缓冲液(pH9.0)浸湿的滤纸上，密封湿盒，在37℃温育1小时，再用2×SSC/0.1％SDS溶液洗涤2分钟，用灭菌双蒸水简单淋洗，氮气吹干，4℃保存备用；

步骤4：将10μL DNA聚合酶反应缓冲液[Polymerase Reaction：50mM Tris-HCl(pH7.2)，10mM MgSO4，0.1mM DTT，40μM of each dNTP，20μg/ml acetylated BSA，2U/μl DNA polymerase I large(Klenow)fragment(3′to 5′exo-；Promega，Madison，WI)]加到步骤3制备的寡核苷酸微阵列上，用憎水硅烷[PlusoneRepel-SilaneES(Dimethyldichlorosilance solution 2％ w/v in octamethylcyclotetrasixane)，Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列，放置于密封湿盒内37℃延伸反应1小时；反应后玻片用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗涤5分钟，用灭菌双蒸水简单淋洗，氮气吹干，4℃保存备用。

⑤双分子寡核苷酸通用引物复性延伸点样法

步骤1：固相化学合成两条寡核苷酸，其中一条较长寡核苷酸上嵌合NF-κB结合位点(如表2：⑤1)(红色碱基GGGACTTTCC)，另一条较短的寡核苷酸作为通用引物(constant primer)(表2：⑤2)；

步骤2：两寡核苷酸以80μM溶解在TE缓冲液中，混合并在50℃复性1小时；

步骤3：将步骤2寡核苷酸产物以适宜浓度加入DNA聚合酶反应液[Polymerase Reaction：50mM Tris-HCl(pH7.2)，10mM MgSO4，0.1mM DTT，40μM of each dNTP，20μg/ml acetylated BSA，2U/μl DNA polymerase I large(Klenow)fragment(3′to5′exo-；Promega，Madison，WI)]中，37℃延伸反应1小时；纯化反应产物，并以80μM溶解在0.1M碳酸缓冲液(pH9.0)；

步骤4：步骤3寡核苷酸产物用Pixsys5500(Cartesian Technology Inc.)点样(湿度80％)到醛基修饰玻片表面，点样后置于湿盒内0.1M碳酸缓冲液(pH9.0)浸湿的滤纸上，密封湿盒，在37℃温育1小时，再用2×SSC/0.1％SDS溶液洗涤2分钟，用灭菌双蒸水简单淋洗，氮气吹干，4℃保存备用。

⑥单分子链内互补法

步骤1：固相化学合成一条长寡核苷酸(如表2：⑥1)，使寡核苷酸含有两段链内反向互补序列，且反向互补序列内含有NF-κB结合位点(红色碱基GGGACTTTCC)；

步骤2：将氨基寡核苷酸⑥1以40μM溶解在碳酸缓冲液(0.1M carbonate buffer，pH9.0)中，用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)点样(湿度80％)到醛基修饰玻片表面，点样后置于湿盒内0.1M碳酸缓冲液(pH9.0)浸湿的滤纸上，密封湿盒，在37℃温育1小时，再用0.1％SDS溶液洗涤2分钟；玻片用灭菌双蒸水简单淋洗后，转入硼氢化钠溶液[0.28％(w/v)NaBH₄，76％(v/v)PBS，24％(v/v)alcohol]中，浸泡3分钟，再用灭菌双蒸水淋洗两次，氮气吹干，4℃保存备用；

步骤3：将10μL杂交液加到步骤2制备的寡核苷酸⑥1的微阵列上，用憎水硅烷PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％ w/v inoctamethylcyclotetrasixane)，Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列，放置于密封湿盒内60℃复性1小时；复性后玻片用2×SSC/0.1％SDS溶液洗涤2分钟，用灭菌双蒸水简单淋洗，氮气吹干，4℃保存备用。

⑦单分子点样复性发卡引物延伸法

步骤1：固相化学合成一条较短的寡核苷酸(如表2：⑦1)，使寡核苷酸含有NF-κB结合位点(红色碱基GGGACTTTCC)，并且在其3′端(羟基)含有两段链内反向互补序列(黄色碱基)；

步骤2：将氨基寡核苷酸⑦1以40μM溶解在碳酸缓冲液(0.1M carbonate buffer，pH9.0)中，用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)点样(湿度80％)到醛基修饰玻片表面，点样后置于湿盒内0.1M碳酸缓冲液(pH9.0)浸湿的滤纸上，密封湿盒，在37℃温育1小时，再用0.1％SDS溶液洗涤2分钟；玻片用灭菌双蒸水简单淋洗后，转入硼氢化钠溶液[0.28％(w/v)NaBH₄，76％(v/v)PBS，24％(v/v)alcohol]中，浸泡3分钟，再用灭菌双蒸水淋洗两次，氮气吹干，4℃保存备用；

步骤3：将10μL杂交液加到步骤2制备的寡核苷酸⑥1的微阵列上，用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％ w/v inoctamethylcyclotetrasixane)，Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列，放置于密封湿盒内60℃复性1小时；复性后玻片用2×SSC/0.1％SDS溶液洗涤2分钟，用灭菌双蒸水简单淋洗，氮气吹干，4℃保存备用；

步骤4：将10μL DNA聚合酶反应缓冲液[Polymerase Reaction：50mM Tris-HCl(pH7.2)，10mM MgSO₄，0.1mM DTT，40μM dNTP，20μg/ml acetylated BSA，2U/μl DNApolymerase I large(Klenow)fragment(3′to 5′exo-；Promega，Madison，WI)]加到

步骤3制备的寡核苷酸微阵列上，用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％ w/v in octamethylcyclotetra-sixane)，Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列，放置于密封湿盒内37℃延伸反应1小时；反应后玻片用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗涤5分钟，用灭菌双蒸水简单淋洗，氮气吹干，4℃保存备用。

⑧单分子复性连接点样发卡引物延伸法

步骤1：固相化学合成两条寡核苷酸，使其中寡核苷酸1含有NF-κB结合位点(红色碱基GGGACTTTCC)，并且在其磷酸化的3′端含一段核苷酸序列，该段核苷酸能够与寡核苷酸2的3′端一段核苷酸序列互补(如表2：⑧1)(紫红碱基CGTACGC)；寡核苷酸2在5′端含有两段链内反向互补序列(黄色碱基)，在3′端含有一段与寡核苷酸1的3′端核苷酸序列互补的序列(紫红碱基GCGTACG)，且两段链内反向互补序列间有一个C3dT氨基修饰基团(红色T)，；

步骤2：两寡核苷酸以80μM溶解在TE缓冲液中，混合并在60℃复性1小时；

步骤3：将步骤2寡核苷酸产物以适宜浓度加入DNA连接酶反应液[Ligation Reaction：40mM Tris-HCl(pH7.8)，10mM MgCl₄，10mM DTT，0.5mM ATP and 0.5U/μlT4 DNA ligase(MBI fermentas)]中，37℃连接反应1小时；反应产物用离心柱[CentriSpin-10 spin column(Princeton Separations，Adelphia，NJ)]转移到0.1M碳酸缓冲液(pH9.0)中，DNA浓度为40μM，纯化反应产物，并以80μM溶解在0.1M碳酸缓冲液(pH9.0)；

步骤4：将步骤3寡核苷酸产物用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)点样(湿度80％)到醛基修饰玻片表面，点样后置于湿盒内0.1M碳酸缓冲液(pH9.0)浸湿的滤纸上，密封湿盒，在37℃温育1小时，再用0.1％SDS溶液洗涤2分钟；玻片用灭菌双蒸水简单淋洗后，转入硼氢化钠溶液[0.28％(w/v)NaBH₄，76％(v/v)PBS，24％(v/v)alcohol]中，浸泡3分钟，再用灭菌双蒸水淋洗两次，氮气吹干，4℃保存备用；(图9I)；

步骤5：将10μL DNA聚合酶反应缓冲液[Polymerase Reaction：50mM Tris-HCl(pH7.2)，10mM MgSO₄，0.1mM DTT，40μM dNTP，20μg/ml acetylated BSA，2U/μl DNApolymerase I large(Klenow)fragment(3′to 5′exo-；Promega，Madison，WI)]加到

步骤4制备的寡核苷酸微阵列上，用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％ w/v in octamethylcyclotetra- sixane)，Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列，放置于密封湿盒内37℃延伸反应1小时；反应后玻片用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗涤5分钟，用灭菌双蒸水简单淋洗，氮气吹干，4℃保存备用。

⑨C6dT单分子点样复性发卡引物延伸法

步骤1：固相化学合成一条较长寡核苷酸(如表2：⑨1)，使寡核苷酸含有NF-κB结合位点(红色碱基GGGACTTTCC)，并且在其3′端(羟基)含两段链内反向互补序列(黄色碱基)，且两段链内反向互补序列间有一个C3dT氨基修饰基团(红色T)：

步骤2：将氨基寡核苷酸⑨1以40μM溶解在碳酸缓冲液(0.1M carbonate buffer，pH9.0)中，用PixSys5500(Cartesian Technology Inc.)点样(湿度80％)到醛基修饰玻片表面，点样后置于湿盒内0.1M碳酸缓冲液(pH9.0)浸湿的滤纸上，密封湿盒，在37℃温育1小时，再用0.1％SDS溶液洗涤2分钟；玻片用灭菌双蒸水简单淋洗后，转入硼氢化钠溶液[0.28％(w/v)NaBH₄，76％(v/v)PBS，24％(v/v)alcohol]中，浸泡3分钟，再用灭菌双蒸水淋洗两次，氮气吹干，4℃保存备用；

步骤3：将10μL杂交液加到步骤2制备的寡核苷酸⑥1的微阵列上，用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％ w/v inoctamethylcyclotetrasixane)，Pharmacia Biotech]处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列，放置于密封湿盒内60℃复性1小时；复性后玻片用2×SSC/0.1％SDS溶液洗涤2分钟，用灭菌双蒸水简单淋洗，氮气吹干，4℃保存备用；

步骤3制备的寡核苷酸微阵列上，用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％w/v in octamethylcyclotetra- sixane)，Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列，放置于密封湿盒内37℃延伸反应1小时；反应后玻片用2×SSC/0.1％SDS和0.2×SSC/0.1％SDS溶液各洗涤5分钟，用灭菌双蒸水简单淋洗，氮气吹干，4℃保存备用。

图15是用上述方法之一制备的寡核苷酸微阵列，为了反映制备效果，在DNA聚合酶延伸反应中，用荧光素Cy3-dUTP代替了正常的dTTP，延伸反应后，在微阵列芯片扫描仪(如ScanArrayLite，Packard Biochip Technologies)上扫描(Cy3channel、80％laser power，80％PMT gain，5μm resolution.)，记录荧光信号；结果反映运用上述方法能够成功地制备dsDNA寡核苷酸微阵列。

3.NF-κB检测DNA微阵列芯片检测待检测物中NF-κB蛋白的技术操作

步骤1：转录因子NF-κB p50蛋白用人p50全长cDNA(编码453氨基酸)表达载体在细菌中表达提取(Promega，Madison，WI)；

步骤2：NF-κB检测DNA微阵列芯片用5％BSA/PBS溶液封闭室温封闭1小时

步骤3：适量NF-κB蛋白溶解于DNA结合缓冲液中(DNA-binding buffer：10mM HEPESpH7.9，50mM KCl，2.5mM DTT，0.1mM EDTA，0.05％ NP-40，10％Glycerol，5％BSA)，室温保育30分钟；取10μL DNA结合缓冲液滴加到NF-κB检测DNA微阵列上，用憎水硅烷[Plusone Repel-Silane ES(Dimethyldichlorosilancesolution 2％ w/v in octamethylcyclotetrasixane)，Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列，放置于密封湿盒内37℃或室温保育1小时；

步骤4：反应后玻片在室温下分别用PBS/0.05％Tween 20，PBS/0.01％Triton 100及PBS(141mM NaCl，7.2mM Na₂HPO₄，2.8mM NaH₂PO₄，pH7.4)洗涤15min；

步骤5：氮气吹干玻片，取10μL含有适量荧光素Cy3(FluoroLink^TM Cy3 monofunctionaldye，Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)标记的NF-κB蛋白抗体[NE-κBp50(E-10)：sc-8414，Santa Cruz Biotechnology，Inc.]的PBS(141mM NaCl，7.2mM Na₂HPO₄，2.8mM NaH₂PO₄，pH7.4)溶液，滴加到NF-κB检测DNA微阵列上，用憎水硅烷[PlusoneRepel-Silane ES(Dimethyldichlorosilance solution 2％w/v in octamethylcyclotetrasixane)，Pharmacia Biotech)处理的盖玻片覆盖溶液及微阵列，放置于密封湿盒内37℃或室温保育1小时；

步骤6：抗体反应后，玻片用PBS(141mM NaCl，7.2mM Na₂HPO₄，2.8mM NaH₂PO₄，pH7.4)溶液室温洗涤30分钟，再用用灭菌双蒸水简单淋洗，氮气吹干。

步骤7：芯片在微阵列芯片扫描仪(如ScanArrayLite，Packard Biochip Technologies)上扫描(适当参数：channel、laser power，PMT gain，resolution.)，记录荧光信号；

步骤8：用芯片芯片荧光信号分析软件(如QuantArraymicroarray analysis software，Packard Biochip Technologies)进行数据分析。

图16是用上述NF-κB检测DNA微阵列芯片制备方法之一制备的寡核苷酸微阵列，为了反映所制备的dsDNA寡核苷酸微阵列能够和检测溶液中的NF-κB蛋白发生结合作用，芯片制备中使用四种正常dNTP进行DNA聚合酶延伸反应，芯片制备好后，用Cy3(FluoroLink^TM Cy3 monofunctional dye，Amersham PharmaciaBiotech，Piscataway，NJ)标记的NF-κB p50蛋白直接与微阵列芯片杂交，杂交后经PBS/0.05％Tween 20，PBS/0.01％Triton 100及PBS(141mM NaCl，7.2mMNa₂HPO₄，2.8mM NaH₂PO₄，pH7.4)各洗涤15min，氮气吹干，在扫描仪ScanArrayLite，Packard Biochip Tecmologies上扫描(Cy3 channel、80％laserpower，80％PMT gain，5μm resolution.)，记录荧光信号；结果反映运用上述方法制备的dsDNA寡核苷酸微阵列能够与检测无中的NF-κB蛋白良好地结合。

图17为了反映所制备的NF-κB检测DNA微阵列芯片能够用于高通量研究NF-κB蛋白与众多DNA靶点相互作用的规律，用NF-κB检测DNA微阵列芯片中单核苷酸突变Ig-κB DNA靶点阵列与Cy3(FluoroLink^TM Cy3 monofunctional dye，Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)标记的NF-κB p50蛋白杂交，杂交后经PBS/0.05％Tween 20，PBS/0.01％Triton 100及PBS(141mM NaCl，7.2mM Na₂HPO₄，2.8mM NaH₂PO₄，pH7.4)各洗涤15min，氮气吹干，在扫描仪ScanArrayLite，Packard Biochip Technologies上扫描(Cy3 channel、80％laserpower，80％PMT gain，5μm resolution.)，记录荧光信号：结果反映NF-κB检测DNA微阵列芯片能够高通量检测NF-κB蛋白与众多DNA靶点相互作用的特异性及亲合性特征。其中芯片上DNA探针的序列如表3：

表3 NF-κB检测DNA微阵列芯片上单核苷酸突变Ig-κB DNA位点

Single-nucleotide mutant Ig-κB sites(Target oligonueleotides)Sequences(5′→3′)
										base	##.	Distalflanking sequence	Target sequence	Proximalflanking sequence	base	##	Distalflanking sequence	Target sequence	Proximalflanking sequence
base 1	C₁	AGTTGAG	CGGACTTTCC	CGTACGC	Base 6	G₆	AGTTGAG	GGGACGTTCC	CGTACGC	base	##.	Distalflanking sequence	Target sequence	Proximalflanking sequence	base	##	Distalflanking sequence	Target sequence	Proximalflanking sequence
	C₁	AGTTGAG	CGGACTTTCC	CGTACGC		G₆	AGTTGAG	GGGACGTTCC	CGTACGC	A₁	AGTTGAG	AGGACTTTCC	CGTACGC	C₆	AGTTGAG	GGGACCTTCC	CGTACGC
	T₁	AGTTGAG	TGGACTTTCC	CGTACGC		A₆	AGTTGAG	GGGACATTCC	CGTACGC	A₁	AGTTGAG	AGGACTTTCC	CGTACGC	C₆	AGTTGAG	GGGACCTTCC	CGTACGC
	T₁	AGTTGAG	TGGACTTTCC	CGTACGC		A₆	AGTTGAG	GGGACATTCC	CGTACGC	base 2	C₂	AGTTGAG	GCGACTTTCC	CGTACGC	base 7	G₇	AGTTGAG	GGGACTGTCC	CGTACGC
A₂	AGTTGAG	GAGACTTTCC	CGTACGC	C₇	AGTTGAG	GGGACTCTCC	CGTACGC				C₂	AGTTGAG	GCGACTTTCC	CGTACGC		G₇	AGTTGAG	GGGACTGTCC	CGTACGC
A₂	AGTTGAG	GAGACTTTCC	CGTACGC	C₇	AGTTGAG	GGGACTCTCC	CGTACGC	T₂	AGTTGAG		GTGACTTTCC	CGTACGC	A₇	AGTTGAG		GGGACTATCC	CGTACGC
base 3	C₃	AGTTGAG	GGCACTTTCC	CGTACGc	base 8	G₈	AGTTGAG	T₂	AGTTGAG		GTGACTTTCC	CGTACGC	A₇	AGTTGAG		GGGACTATCC	CGTACGC	GGGACTTGCC	CGTACGC
	C₃	AGTTGAG	GGCACTTTCC	CGTACGc		G₈	AGTTGAG	A₃	AGTTGAG	GGAACTTTCC	CGTACGC	C_a	AGTTGAG	GGGACTTCCC	CGTACGC			GGGACTTGCC	CGTACGC
	T₃	AGTTGAG	GGTACTTTCC	CGTACGC		A₈	AGTTGAG	A₃	AGTTGAG	GGAACTTTCC	CGTACGC	C_a	AGTTGAG	GGGACTTCCC	CGTACGC	GGGACTTACC	CGTACGC
	T₃	AGTTGAG	GGTACTTTCC	CGTACGC		A₈	AGTTGAG	Base 4	T₄	AGTTGAG	GGGTCTTTCC	CGTACGC	base 9	G₉	AGTTGAG	GGGACTTACC	CGTACGC	GGGACTTTGC	CGTACGC
G₄	AGTTGAG	GGGGCTTTCC	CGTACGC	A₉	AGTTGAG	GGGACTTTAC	CGTACGC		T₄	AGTTGAG	GGGTCTTTCC	CGTACGC		G₉	AGTTGAG			GGGACTTTGC	CGTACGC
G₄	AGTTGAG	GGGGCTTTCC	CGTACGC	A₉	AGTTGAG	GGGACTTTAC	CGTACGC		C₄	AGTTGAG	GGGCCTTTCC	CGTACGC		T₉	AGTTGAG	GGGACTTTTC	CGTACGC
Base 5	G₅	AGTTGAG	GGGAGTTTCC	CGTACGC	base10	G₁₀	AGTTGAG		C₄	AGTTGAG	GGGCCTTTCC	CGTACGC		T₉	AGTTGAG	GGGACTTTTC	CGTACGC	GGGACTTTCG	CGTACGC
	G₅	AGTTGAG	GGGAGTTTCC	CGTACGC		G₁₀	AGTTGAG	A₅	AGTTGAG	GGGAATTTCC	CGTACGC	A₁₀	AGTTGAG	GGGACTTTCA	CGTACGC			GGGACTTTCG	CGTACGC
	T₅	AGTTGAG	GGGATTTTCC	CGTACGC		T₁₀	AGTTGAG	A₅	AGTTGAG	GGGAATTTCC	CGTACGC	A₁₀	AGTTGAG	GGGACTTTCA	CGTACGC	GGGACTTTCT	CGTACGC
	T₅	AGTTGAG	GGGATTTTCC	CGTACGC		T₁₀	AGTTGAG	Wild，typeIg-κB site	wild	AGTTGAG	GGGACTTTCC	CGTACGC	Base number		5′-G₁G₂G₃A₄C₅T₆T₇T₈C₉C₁₀-3′
Constantoligonucleotide	P-GGAATCCCCC T GGGGGGATTCC GCGTACG-OH(Aminated dT for immobilization is in bold)									AGTTGAG	GGGACTTTCC	CGTACGC	Base number		5′-G₁G₂G₃A₄C₅T₆T₇T₈C₉C₁₀-3′
Constantoligonucleotide										note	Both 5′and 3′ends of target oligonucleoyides are hydroxyl.

图18为了反映所制备的NF-κB检测DNA微阵列芯片能够用于高通量研究NF-κB蛋白与众多DNA靶点相互作用的规律，用NF-κB检测DNA微阵列芯片中30个野生型dsDNA靶点阵列与Cy3(FluoroLink^TM Cy3 monofunctional dye，AmershamPharmacia Biotech，Piscataway，NJ)标记的NF-κB p50蛋白杂交，杂交后经PBS/0.05％Tween 20，PBS/0.01％Triton 100及PBS(141mM NaCl，7.2mMNa₂HPO₄，2.8mM NaH₂PO₄，pH7.4)各洗涤15min，氮气吹干，在扫描仪ScanArrayLite，Packard Biochip Technologies上扫描(Cy3 channel、80％laserpower，80％PMT gain，5μm resolution.)，记录荧光信号；结果反映NF-κB检测DNA微阵列芯片能够高通量检测NF-κB蛋白与众多不同野生型dsDNA靶点相互作用的特异性及亲合性特征。其中芯片上DNA探针的序列如表4：

表4 NF-κB检测DNA微阵列芯片上30个野生型位点

No.	DNA aequence(5′→3′)	No.	DNA sequence(5′→3′)
No.	DNA aequence(5′→3′)	No.	DNA sequence(5′→3′)	Ly1	5′NH2-AGTTGAGGGGGGCTTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	GM-CSF	5′NH2-AGTTGAGGGGAACTACC CGTACGCGCGTACG-OH3′
Ly2	5′NH2-AGTTGAGGGGGAAGCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	uPA-κB	5′NH2-AGTTGAGGGGAAAGTAC CGTACGCGCGTACG-OH3′	Ly1	5′NH2-AGTTGAGGGGGGCTTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	GM-CSF	5′NH2-AGTTGAGGGGAACTACC CGTACGCGCGTACG-OH3′
Ly2	5′NH2-AGTTGAGGGGGAAGCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	uPA-κB	5′NH2-AGTTGAGGGGAAAGTAC CGTACGCGCGTACG-OH3′	Ly3	5′NH2-AGTTGAGGGGAAGCCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	IFNβ-κB-1	5′NH2-AGTTGAGGGGAAATTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′
Ly4-V63	5′NH2-AGTTGAGGGGATTTCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	IFNβ-κB-2	5′NH2-AGTTGAGAGGAAATTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	Ly3	5′NH2-AGTTGAGGGGAAGCCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	IFNβ-κB-1	5′NH2-AGTTGAGGGGAAATTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′
Ly4-V63	5′NH2-AGTTGAGGGGATTTCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	IFNβ-κB-2	5′NH2-AGTTGAGAGGAAATTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	Ly5-Hm2	5′NH2-AGTTGAGGGGGATTTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	IFN-MHC	5′NH2-AGTTGAGGGGATTCCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′
HuκB-m1	5′NH2-AGTTGAGGGGGAATTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	κB-33	5′NH2-AGTTGATGGAAATTTC CGTACGCGCGTACG-OH3′	Ly5-Hm2	5′NH2-AGTTGAGGGGGATTTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	IFN-MHC	5′NH2-AGTTGAGGGGATTCCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′
HuκB-m1	5′NH2-AGTTGAGGGGGAATTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	κB-33	5′NH2-AGTTGATGGAAATTTC CGTACGCGCGTACG-OH3′	MHCl	5′NH2-AGTTGAGGGGGAATCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	κB-55	5′NH2-AGTTGAGGGGAATTCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′
MHC2	5′NH2-AGTTGAGGGGGATTCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	ln-Chain II	5′NH2-AGTTGAGGGGAATTTTC CGTACGCGCGTACG-OH3′	MHCl	5′NH2-AGTTGAGGGGGAATCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	κB-55	5′NH2-AGTTGAGGGGAATTCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′
MHC2	5′NH2-AGTTGAGGGGGATTCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	ln-Chain II	5′NH2-AGTTGAGGGGAATTTTC CGTACGCGCGTACG-OH3′	MHC3	5′NH2-AGTTGAGGGGAATCCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	Ang	5′NH2-AGTTGAGTGGGAAATCC CGTACGCGCGTACG-OH3′
IL-2-α1	5′NH2-AGTTGAGGGGAGATTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	VCAM-77	5′NH2-AGTTGAGGGGTTTCCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	MHC3	5′NH2-AGTTGAGGGGAATCCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	Ang	5′NH2-AGTTGAGTGGGAAATCC CGTACGCGCGTACG-OH3′
IL-2-α1	5′NH2-AGTTGAGGGGAGATTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	VCAM-77	5′NH2-AGTTGAGGGGTTTCCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	IL-2-α2	5′NN2-AGTTGAGGGGAATCTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	TNF-1	5′NH2-AGTTGAGGGGACCCCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′
IL2-κB	5′NH2-AGTTGATAGAAATTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	TNF-2	5′NH2-AGTTGAGGGGACCCCCA CGTACGCGCGTACG-OH3′	IL-2-α2	5′NN2-AGTTGAGGGGAATCTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	TNF-1	5′NH2-AGTTGAGGGGACCCCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′
IL2-κB	5′NH2-AGTTGATAGAAATTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	TNF-2	5′NH2-AGTTGAGGGGACCCCCA CGTACGCGCGTACG-OH3′	IL6-κB	5′NH2-AGTTGAGGGGATTTCAC CGTACGCGCGTACG-OH3′	TNF-α1	5′NH2-AGTTGAGGGGAAAGCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′
IL8-κB	5′NH2-AGTTGATGGAATTTCC CGTACGCGGCGTACG-OH3′	TNF-α2	5′NH2-AGTTGAGGGGAATTCAC CGTACGCGCGTACG-OH3′	IL6-κB	5′NH2-AGTTGAGGGGATTTCAC CGTACGCGCGTACG-OH3′	TNF-α1	5′NH2-AGTTGAGGGGAAAGCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′
IL8-κB	5′NH2-AGTTGATGGAATTTCC CGTACGCGGCGTACG-OH3′	TNF-α2	5′NH2-AGTTGAGGGGAATTCAC CGTACGCGCGTACG-OH3′	P65-p1	5′NH2-AGTTGAGGGGGTTTTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	p50-p1	5′NH2-AGTTGAGGGGGATGCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′
P65-p2	5′NH2-AGTTGAGGGGGATTTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	p50-p2	5′NH2-AGTTGAGGGGGATACCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	P65-p1	5′NH2-AGTTGAGGGGGTTTTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	p50-p1	5′NH2-AGTTGAGGGGGATGCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′
P65-p2	5′NH2-AGTTGAGGGGGATTTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	p50-p2	5′NH2-AGTTGAGGGGGATACCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	P65-p3	5′NH2-AGTTGAGGGGGGTTTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	p50-p3	5′NH2-AGTTGAGGGGGATCCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′
P65-p4	5′NH2-AGTTGAGGGAAAGTTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′			P65-p3	5′NH2-AGTTGAGGGGGGTTTCC CGTACGCGCGTACG-OH3′	p50-p3	5′NH2-AGTTGAGGGGGATCCCC CGTACGCGCGTACG-OH3′

图19为了反映所制备的NF-κB检测DNA微阵列芯片能够用于高通量shaixuan筛选NF-κB/dsDNA相互作用干预性组合化学及天然生物分子，用NF-κB检测DNA微阵列芯片中的重复Ig-κB靶点阵列与Cy3(FluoroLink^TM Cy3 monofunctionaldye，Amersham Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)标记的NF-κB p50蛋白及甘草酸分子杂交，杂交后经PBS/0.05％Tween 20，PBS/0.01％Triton 100及PBS(141mM NaCl，7.2mM Na₂HPO₄，2.8mM NaH₂PO₄，pH7.4)各洗涤15min，氮气吹干，在扫描仪ScanArrayLite，Packard Biochip Technologies上扫描(Cy3 channel、80％laser power，80％PMT gain，5μm resolution.)，记录荧光信号；结果反映随着杂交体系中甘草酸分子浓度的逐步提高，NF-κB蛋白与微阵列芯片上Ig-κB靶点结合的数量不断下降，证明NF-κB检测DNA微阵列芯片能够用于高通量shaixuan筛选NF-κB/dsDNA相互作用干预性组合化学及天然生物分子。

Claims

1、一种检测核因子-κB(Nuclear Factor-κB，NF-κB)的双链DNA微阵列芯片(double-stranded DNA microarray chip，dsDNA microarray chip)及其制备(Fabrication)方法，其特征在于该微阵列芯片具有如下结构、功能及制备特征：

(a)NF-κB检测dsDNA微阵列芯片的结构特征：NF-κB检测dsDNA微阵列芯片由固相支持物及固定在固相支持物表面的dsDNA微阵列构成，该dsDNA微阵列由大量固定在固相支持物表面的dsDNA探针分子文库(library)组成，文库中不同的dsDNA探针分子上有DNA序列不同的NF-κB转录因子结合位点(DNA-binding sites)。

(b)NF-κB检测dsDNA微阵列芯片的功能特征：NF-κB检测dsDNA微阵列芯片可以依靠序列特异性DNA结合蛋白NF-κB转录因子与芯片dsDNA探针分子上NF-κB的DNA结合位点发生结合反应，实现对被检测物中NF-κB蛋白的高通量检测，发挥多项生物功能，包括：

①确定特定细胞核抽提物或溶液中不同NF-κB/Re1家族蛋白包括Re1A/p65、Re1B、c-Re1、NF-κB1/p50和NF-κB2/p52的表达种类；

②确定特定细胞核抽提物或溶液中不同NF-κB/Re1家族蛋白如Re1A/p65、Re1B、c-Re1、NF-κB1/p50和NF-κB2/p52的表达水平和活化程度；

③确定不同NF-κB/Re1家族蛋白与大量突变型及野生型dsDNA靶点的相互作用的特异性与亲合性特征；

④确定NF-κB/Re1蛋白与大量突变型及野生型dsDNA靶点相互作用的碱基和氨基酸键合规律；

⑤确定NF-κB/Re1蛋白dsDNA结合靶点的碱基组成矩阵(matrix)，预测新的NF-κB/Re1蛋白dsDNA结合靶点，并从全基因组DNA序列中搜索预测的新的NF-κB/Re1蛋白dsDNA结合靶点，寻找这些dsDNA结合靶点的上、下游基因，研究这些基因是否受到NF-κB/Re1蛋白的表达调控，从而鉴定新的NF-κB/Re1蛋白调控基因；

⑥通过鉴定新的NF-κB/Re1蛋白调控基因，并结合已知的NF-κB/Re1蛋白调控基因，构建全基因组NF-κB/Re1蛋白基因表达调控网络；

⑦筛选NF-κB/Re1蛋白dsDNA靶点序列特异性结合组合化学分子及天然生物分子；

⑧筛选NF-κB/Re1蛋白与dsDNA靶点相互作用干预性组合化学分子及天然生物分子。

(c)NF-κB检测dsDNA微阵列芯片的制备方法：NF-κB检测dsDNA微阵列芯片的制备方法包括如下9种：

①固相化学合成两条碱基序列完全互补的寡核苷酸，其中寡核苷酸上嵌合NF-κB结合位点，通过液相复性成为双分子(bimolecular)双链寡核苷酸，再点样连接固定到固相基质表面，形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片(双分子寡核苷酸复性点样法)；

②固相化学合成两条碱基序列完全互补的寡核苷酸，其中寡核苷酸上嵌合NF-κB结合位点，先将其中化学修饰的一条寡核苷酸点样连接固定到固相基质表面，形成单链DNA微阵列芯片，再用互补的另一条寡核苷酸杂交复性成为双分子(bimolecular)双链寡核苷酸，形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片(双分子寡核苷酸点样复性法)；

③固相化学合成两条寡核苷酸，其中一条较长寡核苷酸上嵌合NF-κB结合位点，另一条较短的寡核苷酸作为通用引物，先将化学修饰的较长寡核苷酸点样连接固定到固相基质表面，形成单链DNA微阵列芯片，再与通用引物寡核苷酸杂交复性成为部分双分子(partialbimolecular)双链寡核苷酸，再用DNA聚合酶进行在片延伸反应，使部分双分子双链寡核苷酸成为完整双分子(complete bimolecular)双链寡核苷酸，形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片(双分子寡核苷酸通用引物点样复性延伸法)；

④固相化学合成两条寡核苷酸，其中一条较长寡核苷酸上嵌合NF-κB结合位点，另一条较短的寡核苷酸作为通用引物，先将化学修饰的较长寡核苷酸与通用引物寡核苷酸在液相杂交复性成为部分双分子(partial bimolecular)双链寡核苷酸，将复性产物点样连接固定到固相基质表面，形成部分双分子双链寡核苷酸微阵列芯片，再用DNA聚合酶进行在片延伸反应，使部分双分子双链寡核苷酸成为完整双分子(complete bimolecular)双链寡核苷酸，形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片(双分子寡核苷酸通用引物复性点样延伸法)；

⑤固相化学合成两条寡核苷酸，其中一条较长寡核苷酸上嵌合NF-κB结合位点，另一条较短的寡核苷酸作为通用引物，先将化学修饰的较长寡核苷酸与通用引物寡核苷酸在液相杂交复性成为部分双分子(partial bimolecular)双链寡核苷酸，再用DNA聚合酶进行延伸反应，使部分双分子双链寡核苷酸成为完整双分子(complete bimolecular)双链寡核苷酸，将延伸产物点样连接固定到固相基质表面，形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片(双分子寡核苷酸通用引物复性延伸点样法)；

⑥合成一条长寡核苷酸，使寡核苷酸含有两段链内反向互补序列，且反向互补序列内含有NF-κB结合位点，将复性寡核苷酸点样连接固定到固相基质表面，形成寡核苷酸微阵列芯片，通过变性再复性成为单分子(unimolecular)双链寡核苷酸微阵列芯片，形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片；此法也可以先在液相进行变性再复性，然后点样连接固定到固相基质表面，形成寡核苷酸微阵列芯片(单分子链内互补法)；

⑦合成一条较短的寡核苷酸，使寡核苷酸含有NF-κB结合位点，并且在其3′端(羟基)含有两段链内反向互补序列，将寡核苷酸点样连接固定(5′端)到固相基质表面，形成寡核苷酸微阵列芯片，再通过变性、再复性和DNA聚合酶进行在片延伸反应，制备单分子(unimolecular)双链寡核苷酸微阵列芯片，形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片(单分子点样复性发卡引物延伸法)；

⑧合成两条寡核苷酸，使其中寡核苷酸1含有NF-κB结合位点，并且在其磷酸化的3′端含一段核苷酸序列，该段核苷酸能够与寡核苷酸2的3′端一段核苷酸序列互补；寡核苷酸2在5′端含有两段链内反向互补序列，且两段链内反向互补序列间有一个或多个C3dT氨基或其他化学修饰基团；在液相内将两条寡核苷酸复性后点样连接固定(C3dT氨基或其他化学修饰基团)到固相基质表面，形成寡核苷酸微阵列芯片；再通过DNA聚合酶进行在片延伸反应，制备单分子(unimolecular)双链寡核苷酸微阵列芯片，形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片(单分子复性连接点样发卡引物延伸法)；

⑨合成一条较长寡核苷酸，使寡核苷酸含有NF-κB结合位点，并且在其3′端(羟基)含两段链内反向互补序列，且两段链内反向互补序列间有一个或多个C3dT氨基或其他化学修饰基团；将寡核苷酸复性后点样连接固定(C3dT氨基或其他化学修饰基团)到固相基质表面，形成寡核苷酸微阵列芯片；再通过变性、再复性和DNA聚合酶进行在片延伸反应，制备单分子(unimolecular)双链寡核苷酸微阵列芯片，形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片形成NF-κB检测dsDNA微阵列芯片(C6dT单分子点样复性发卡引物延伸法)。

2、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片，其结构特征在于(a)中固定或承载dsDNA探针分子的固相支持物包括刚性和半刚性的材料，如硝酸纤维素膜、尼龙膜、LB膜、(聚)四氟乙烯膜、(聚)偏二氟乙烯膜，聚苯乙烯膜，聚碳酸酯、琼脂糖及聚丙烯酰胺等凝胶、玻璃珠、玻璃管、硅颗粒、玻片、硅片等；固相支持物具有光学平整的表面或孔状表面，dsDNA探针分子可以固定在固相支持物光学平整的表面上，如玻片、硅片等，也可以固定在固相支持物孔状表面的孔内，如琼脂糖及聚丙烯酰胺等凝胶。

3、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片，其结构特征在于(a)中固相支持物表面dsDNA探针分子的固定方式多样，包括借助化学反应在DNA分子末端(3′或5′端)的化学修饰基团(如氨基)与固相支持物表面的化学基团(如醛基)间形成化学键(如Schiff base)，将dsDNA探针分子固定到固相支持物表面；或借助物理反应，如电荷作用(DNA分子的负电荷与固相支持物表面的正电荷相互吸引)，将dsDNA探针分子固定到固相支持物表面，如带正电荷的尼龙膜等。

4、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片，其结构特征在于(a)中固相支持物表面固定的dsDNA探针分子文库(library)是由大量不同的dsDNA探针分子组成，不同的dsDNA探针分子上有DNA序列组成不同的NF-κB转录因子结合位点(DNA-binding sites)，这些结合位点可以被检测物中存在的NF-κB转录因子识别结合。

5、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片，其结构特征在于(a)中不同的dsDNA探针分子上嵌合的DNA序列组成NF-κB转录因子的不同结合位点(DNA-binding sites)包括生物基因组DNA序列自然(或野生，natural or wildtype)存在的NF-κB结合位点，如存在于人免疫球蛋白κ轻链基因增强子DNA序列和人免疫缺陷病病毒(HIV)基因组DNA长末端(LTR)中的Ig-κB位点(GGGACTTTCC)，以及人工设计的突变NF-κB结合位点，如对野生型NF-κB结合位点进行单碱基突变(single nucleotide mutants)或多碱基突变(multiple nucleotide mutants)后形成的NF-κB结合位点，这些可以用来揭示NF-κB与其DNA结合位点相互作用中的重要生物学规律。

6、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片，其功能特征在于(b)被检测物中存在的NF-κB转录因子与芯片dsDNA上嵌合的NF-κB结合位点发生的结合反应是一种生物大分子间的识别性结合反应。

7、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片，其功能特征在于(b)中被检测物中存在的NF-κB转录因子与芯片dsDNA上NF-κB结合位点发生的结合反应，是依靠蛋白质分子上特定氨基酸和dsDNA分子上特定核苷酸间形成氢键、范德华力等化学键以及电荷作用而实现的。

8、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片，其功能特征在于(b)中被检测物中存在的NF-κB转录因子与芯片dsDNA上NF-κB结合位点的结合反应，不同的dsDNA结合位点能够与不同的NF-κB蛋白以不同的亲合性和特异性进行结合作用。

9、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片，其功能特征在于(b)中NF-κB检测dsDNA微阵列芯片反应的被检测物形式多样，包括特定培养细胞如HeLa的全细胞抽提物(whole cell extract)、特定培养细胞的细胞核抽提物(cell nuclear extract)、特定组织的蛋白抽提物(tissue extract)、特定培养原核或真核细胞中NF-κB表达载体表达产物、人工体外表达系统中NF-κB表达载体表达产物、自然细胞或人工体外表达系统纯化的NF-κB蛋白等。

10、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片，其功能特征在于(b)中NF-κB检测dsDNA微阵列芯片反应的被检测物中存在的NF-κB蛋白包括所有野生型NF-κB蛋白如Re1A/p65、Re1B、c-Re1、NF-κB1/p50、NF-κB2/p52，以及通过如定点突变等构建的表达载体表达制备的突变型NF-κB蛋白。

11、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片，其功能特征在于(b)中NF-κB检测dsDNA微阵列芯片能够实现对被检测物中存在的NF-κB蛋白的高通量检测(high-throughput detection)，即NF-κB检测dsDNA微阵列芯片与被检测物的一次结合反应，可以获得大量的生物信息。

12、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片，其功能特征在于(b)中NF-κB检测dsDNA微阵列芯片能够定性检测(qualitative detection)被检测物中的NF-κB蛋白，即不同NF-κB/Re1家族蛋白，包括Re1A/p65、Re1B、c-Re1、NF-κB1/p50和NF-κB2/p52，确定细胞内NF-κB/Re1家族蛋白的表达种类。

13、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片，其功能特征在于(b)中NF-κB检测dsDNA微阵列芯片能够定量检测(quantitative detection)被检测物中的NF-κB蛋白，即不同NF-κB/Re1家族蛋白，包括Re1A/p65、Re1B、c-Re1、NF-κB1/p50和NF-κB2/p52在特定细胞或组织中的表达量和活化水平。

14、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片，其功能特征在于(b)中NF-κB检测dsDNA微阵列芯片上不同的dsDNA结合位点能够与不同的NF-κB蛋白以不同的特异性(specificity)进行结合作用，即不同的dsDNA结合位点能够识别并结合特定的NF-κB蛋白。

15、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片，其功能特征在于(b)中NF-κB检测dsDNA微阵列芯片上不同的dsDNA结合位点能够与不同的NF-κB蛋白以不同的亲合性(affinity)进行结合作用，即不同的dsDNA结合位点能够以不同的结合强度识别并结合特定的NF-κB蛋白。

16、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片，其功能特征在于(b)中运用NF-κB检测dsDNA微阵列芯片实验构建的全基因组NF-κB/Re1蛋白基因表达调控网络，是指将通过NF-κB检测dsDNA微阵列芯片实验预测和鉴定的新的NF-κB结合位点调控的基因整合到已知的NF-κB调控的基因网络中，建立全基因组中受NF-κB/Re1蛋白调控的所有基因的关系网络，这一全基因组NF-κB/Re1蛋白基因表达调控网络对于NF-κB相关基础分子学、生物医学研究至管重要，同时这一调控网络能够确定针对NF-κB/Re1蛋白的药物筛选的所有靶点。

17、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片，其功能特征在于(b)中NF-κB检测dsDNA微阵列芯片筛选的dsDNA靶点序列特异性结合组合化学分子及天然生物分子，是指那些能够和NF-κB蛋白的不同dsDNA位点直接结合，但不与NF-κB蛋白发生结合作用，而干扰NF-κB蛋白与dsDNA位点正常结合的组合化学分子及天然生物分子。

18、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片，其功能特征在于(b)中NF-κB检测dsDNA微阵列芯片筛选的NF-κB/Re1蛋白与dsDNA靶点相互作用干预性组合化学分子及天然生物分子，是指那些能够通过与NF-κB蛋白的结合影响NF-κB蛋白与dsDNA靶点结合的组合化学分子及天然生物分子；或同时与NF-κB蛋白和dsDNA靶点发生作用影响NF-κB蛋白与dsDNA靶点结合的组合化学分子及天然生物分子；或不与NF-κB蛋白和dsDNA靶点直接发生作用，但可以插入(嵌入)NF-κB蛋白和dsDNA靶点的作用界面空间，从而影响NF-κB蛋白与dsDNA靶点结合的组合化学分子及天然生物分子。

19、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法①、②中化学合成的两条碱基序列完全互补的寡核苷酸，为了便于将寡核苷酸固定到化学修饰的固相基质表面，可以在其中任一条链的任一端(3′或5′端)连接化学基团(如氨基等)，寡核苷酸修饰的化学基团与固相基质表面修饰的化学基团可以发生化学反应，形成共价键，从而将寡核苷酸连接固定在固相基质表面。

20、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法①、②中化学合成的两条碱基序列完全互补的寡核苷酸，寡核苷酸上嵌合的NF-κB结合位点两端都有一定长的碱基作为旁侧序列(最好大于5个碱基)，避免将NF-κB结合位点暴露的寡核苷酸端部，而且连接到固相基质表面一侧的旁侧序列应较长(最好大于10个碱基)，避免寡核苷酸上NF-κB结合位点离固相基质表面太近，妨碍NF-κB与DNA的结合。

21、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法③中化学合成的两条寡核苷酸，其中嵌合NF-κB结合位点的寡核苷酸最好进行末端(3′或5′端)化学基团(如氨基等)修饰，修饰化学基团与固相基质表面修饰的化学基团可以发生化学反应，形成共价键，从而将寡核苷酸连接固定在固相基质表面；并且嵌合NF-κB结合位点的寡核苷酸两端都有一定长的碱基作为旁侧序列，避免将NF-κB结合位点暴露的寡核苷酸端部。

22、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法③中嵌合NF-κB结合位点的寡核苷酸若进行3′端化学基团(如氨基等)修饰，则3′端旁侧序列应较长(最好大于10个碱基)，并且3′端旁侧序列中含有与通用引物碱基完全配对互补的序列，以便通用引物复性该处，进行后面的聚合酶延伸反应。

23、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法③中嵌合NF-κB结合位点的寡核苷酸若进行5′端化学基团(如氨基等)修饰，则5′端和5′端旁侧序列都应较长(最好大于10个碱基)，并且3′端旁侧序列中含有与通用引物碱基完全配对互补的序列，以便通用引物复性该处，进行后面的聚合酶延伸反应；5′端旁侧序列较长(最好大于10个碱基)，避免寡核苷酸上NF-κB结合位点离固相基质表面太近，妨碍NF-κB与DNA的结合。

24、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法④、⑤固相化学合成的嵌合NF-κB结合位点的寡核苷酸两端旁侧序列中，其中之一应含有与通用引物碱基完全配对互补的序列，以便通用引物复性该处，进行后面的聚合酶延伸反应。

25、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法④、⑤固相化学合成的两条寡核苷酸，可以对两条寡核苷酸的任一条进行末端化学修饰，以便将寡核苷酸固定到固相基质表面。

26、根据权利要求22所述的寡核苷酸的末端化学修饰，其特征在于若化学修饰嵌合NF-κB结合位点的寡核苷酸，则其化学修饰端旁侧序列应较长(最好大于10个碱基)；这种情况下，若化学修饰端为3′端，则位于3′端的旁侧序列最好含有通用引物结合序列，而寡核苷酸5′端为较短的旁侧序列，以便缩短合成的寡核苷酸，降低合成成本；若化学修饰端为5′端，则位于3′端的旁侧序列必须含有通用引物结合序列，此时，寡核苷酸的NF-κB结合位点两端都为较长的旁侧序列。

27、根据权利要求22所述的寡核苷酸的末端化学修饰，其特征在于若化学修饰通用引物寡核苷酸，则其化学修饰端必须是其5′端，相应嵌合NF-κB结合位点的寡核苷酸3′端旁侧序列较长(最好大于10个碱基)，并含有通用引物结合序列，其5′端可为较短的旁侧序列，以便缩短合成的寡核苷酸，降低合成成本。

28、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法⑥固相化学合成的长寡核苷酸，其任一端可以进行末端化学修饰，以便将寡核苷酸固定到固相基质表面。

29、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法⑥固相化学合成的长寡核苷酸，其两端链内反向互补序列中应嵌合NF-κB结合位点，NF-κB结合位点间的序列应较长，这些序列应在紧接NF-κB结合位点的部分能够复性后形成一段互补双链(最好大于5个碱基)，以便保护NF-κB结合位点，有利于NF-κB蛋白结合，其余碱基可有可无，若有，可以反向配对互补(复性后形成双链)，也可以不配对互补(复性后形成环(loop))。以进行末端化学修饰，以便将寡核苷酸固定到固相基质表面。应含有与通用引物碱基完全配对互补的序列，以便通用引物复性该处，进行后面的聚合酶延伸反应。

30、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法⑥固相化学合成的长寡核苷酸，其与固相基质表面连接的一端，应含有较长的旁侧序列(最好大于10个碱基)，另一端可以较短一些，但在复性后紧接NF-κB结合位点处应形成5个碱基以上的双链，以便保护NF-κB结合位点，有利于NF-κB蛋白结合。

31、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法⑦固相化学合成的寡核苷酸，其与固相基质表面连接的5′端应含有较长的旁侧序列(最好大于10个碱基)；3′端两反向互补序列长度应大于5个碱基，并且GC含量较高，以便复性时易于形成稳定的发卡引物；3′端两反向互补序列间碱基可有可无，若有，应较少，有利于两反向互补序列复性；寡核苷酸复性、延伸反应后在NF-κB结合位点远离固相支持物表面的一侧应形成至少5个碱基以上的双链旁侧序列，以便保护NF-κB结合位点，有利于NF-κB蛋白结合。

32、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法⑧固相化学合成的寡核苷酸，其与固相基质表面连接的寡核苷酸2(通用单链寡核苷酸片段)5′端两反向碱基互补序列间插入的C6胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸，可以被其他化学修饰的核苷酸或化学分子代替，但代替分子必须与固相支持物表面相应的化学基团发生化学反应，形成稳定牢固的化学键，从而将寡核苷酸连接到固相支持物表面。

33、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法⑧固相化学合成的寡核苷酸，其与固相基质表面连接的寡核苷酸2(通用单链寡核苷酸片段)5′端两反向碱基互补序列间插入的C6胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸，其数目可变，可以有一个，可以有多个，但数目太多不利寡核苷酸2链内复性。

34、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法⑧固相化学合成的寡核苷酸，其与固相基质表面连接的寡核苷酸2(通用单链寡核苷酸片段)5′端两反向碱基互补序列最好不要低于10个碱基，且GC含量较高，以利于链内复性。

35、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法⑧固相化学合成的寡核苷酸，其与固相基质表面连接的寡核苷酸2(通用单链寡核苷酸片段)3′端突出序列(overhang sequence)最好不要低于10个碱基，且GC含量较高，以利于其与寡核苷酸1(靶寡核苷酸)的复性。

36、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法⑧固相化学合成的嵌合NF-κB结合位点的寡核苷酸1(靶寡核苷酸)，其3′最末端必须是与寡核苷酸23′端突出序列(overhang sequence)严格配对的碱基序列，其碱基数与寡核苷酸23′端突出序列碱基数必须相等；寡核苷酸15′端NF-κB结合位点旁侧序列最好不要少于5个碱基。

37、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法⑧固相化学合成的寡核苷酸1(靶寡核苷酸)3′最末端与寡核苷酸23′端突出序列(overhang sequence)互补配对序列、寡核苷酸23′端突出序列(overhang sequence)、寡核苷酸2(通用单链寡核苷酸片段)5′端两反向碱基互补的Tm值(复性温度)最好相同，以便两寡核苷酸的杂交复性。

38、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法⑧固相化学合成的寡核苷酸1(靶寡核苷酸)和寡核苷酸2(通用单链寡核苷酸片段)，在液相反应体系中只经过退火和核酸连接酶连接两个反应就形成3′端带发卡结构的单分子寡核苷酸，而不需要其他更多反应。

39、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法⑧固相化学合成的寡核苷酸1(靶寡核苷酸)和寡核苷酸2(通用单链寡核苷酸片段)，在芯片制备中可以在液相反应体系中经过退火和核酸连接酶连接两个反应形成3′端带发卡结构的单分子寡核苷酸后再点样；也可以在液相反应体系中先退火形成3′端带发卡结构的、含有一切刻(nick)的双分子寡核苷酸再点样，而点样后再进行在片核酸连接酶连接反应，形成形成3′端带发卡结构的单分子寡核苷酸。

40、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法⑨固相化学合成的寡核苷酸，其3′端两反向碱基互补序列最好不要低于10个碱基，且GC含量较高，以利于链内复性；其5′端NF-κB结合位点旁侧序列最好不要少于5个碱基。

41、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法⑨固相化学合成的寡核苷酸，其3′端两反向碱基互补序列间插入的C6胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸，可以被其他化学修饰的核苷酸或化学分子代替，但代替分子必须与固相支持物表面相应的化学基团发生化学反应，形成稳定牢固的化学键，从而将寡核苷酸连接到固相支持物表面。

42、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法⑨固相化学合成的寡核苷酸，其3′端两反向碱基互补序列间插入的C6胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸，其数目可变，可以有一个，可以有多个，但数目太多不利寡核苷酸2链内复性。

43、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法⑨固相化学合成的寡核苷酸，其3′端两反向碱基互补序列间除插入C6胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸外，在C6胺化的脱氧胸腺嘧啶核苷酸两边，可以含有其它数目不等的碱基，这些碱基复性时，可以互补配对，形成双链，也可以不配对，形成环(loop)，但这些碱基数目最好少一些，避免影响3′端两反向碱基互补序列复性。

44、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于方法⑨中使用的核酸连接酶包括核糖核酸连接酶和脱氧核糖核酸连接酶，如大肠杆菌DNA连接酶、T4连接酶。

45、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于制备芯片所化学合成的寡核苷酸，在NF-κB结合位点中的正常核苷酸可以用其它修饰核苷酸替代，用以研究NF-κB与DNA相互作用的特征，如使用甲基化核苷酸。

46、根据权利要求1所述的NF-κB检测dsDNA微阵列芯片制备方法(c)，其特征在于制备芯片所使用的核酸聚合酶包括核糖核酸聚合酶、脱氧核糖核酸聚合酶及反转录酶。