CN1688693A - 使用结合mRNA的探针筛选和分离活细胞 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及可靠地和有效地检测活细胞中mRNA以及其它RNA的方法，以及基于它们的需要的特征在鉴别并在必要时分离细胞中的用途。这些方法极大地简化了和减少了进行以前已知的方法所必需的时间，并且还提供了一些新方法，例如筛选能生成特定蛋白或反义寡核苷酸的细胞，产生能表达多种蛋白的细胞系，产生被敲除了一种或多种蛋白的细胞系，等。

Description

使用结合mRNA的探针筛选和分离活细胞
相关申请的交叉参考
本申请要求享有1999年11月23日提交的美国临时申请号60/166,987的优先权，其整体在这里引作参考。
背景技术
分子信标(beacon)是一种核酸探针，它能识别并报告特定核酸序列的存在。该探针是发夹形序列，其中央区是与靶序列互补的核苷酸，且其末端包含短的相互互补的序列。一个末端共价地结合到荧光团上，另一个则结合到猝灭基团上。当处于它们的带有杂交的末端的天然状态时，荧光团和猝灭剂的临近造成不会产生荧光。信标在与其靶核酸相杂交时，会发生自发的产生荧光的构象变化。参见，例如，美国专利5,925,517。
该性质已经帮助了研究人员检测特异性的核酸，这主要是在体外反应中，且在有些情况下甚至在活细胞中。使用在脂质体中输送到活细胞中的分子信标，已经实现了信使RNA的原位可视化(Matsuo，1998，Biochim.Biophys.Acta 1379：178-184)。迄今为止，涉及细胞的研究都采用了用非常微弱的荧光团EDANS产生的信标，因为这是仅有的已知能用猝灭剂EDAC猝灭的一种。由于其结果仅仅刚能辨别，将该系研究应用到体内检测是没有前途的。
发明内容
在一个方面，本发明涉及一种产生能表达至少一种预选蛋白的细胞系的方法，其包括下述步骤：
a)用至少一种DNA构建体转染细胞系，所述的至少一种DNA构建体编码至少一种预选蛋白和至少一种抗药性标记；
b)筛选对药物有抗性的细胞，对该药物的抗性由所述的标记赋予，所述的细胞转录所述至少一种抗药性标记；
c)将选出的细胞暴露于第一分子信标，该信标在与所述至少一种预选蛋白的RNA转录产物杂交后会发出荧光；
d)分离出发荧光的细胞；
e)通过培养分离出的细胞，产生表达所述至少一种预选蛋白的细胞系。
可以使用荧光激活细胞分选器技术完成前述方法。另一方面，可以使细胞系表达第二预选蛋白，这可以通过进行其它步骤来完成，包括：用编码第二预选蛋白和第二抗药性标记的第二DNA构建体转染细胞系；筛选表达第二标记的细胞；将细胞暴露于第二分子信标，该信标在与第二预选蛋白的RNA转录产物杂交后会发出荧光；和分离表现出所述至少一种和第二种mRNA转录产物中每一种的荧光的细胞。通过重复该步骤可以得到表达超过2种蛋白的细胞系。导入第二种蛋白的方法可以同时地或依次地进行。如果第一种和第二种抗药性标记是相同的，通过提高药物水平可以实现同时筛选。
在本发明的另一方面，提供了一种产生能表达至少一种预选蛋白的细胞系的方法，其包括下述步骤：
a)用至少一种DNA构建体转染细胞系，所述的DNA构建体编码所述至少一种预选蛋白、至少一种抗药性标记和至少一种第一表位标签(tag)；
b)筛选对药物有抗性的细胞，对该药物的抗性由所述的标记赋予，所述的细胞转录所述至少一种抗药性标记；
c)将所述的细胞暴露于第一分子信标，该信标在与所述第一表位标签的RNA转录产物杂交后会发出荧光；
d)分离出发荧光的细胞；
e)通过培养分离出的细胞，产生表达所述至少一种预选蛋白的细胞系。
可以使用荧光激活细胞分选器技术完成前述方法。编码表位标签的构建体DNA部分可以与编码所述至少一种蛋白的DNA构建体部分在相同或不同的读框内。在另外的实施方案中，可以使细胞系表达至少一种第二预选蛋白，其步骤还包括：用编码第二预选蛋白、第二种抗药性标记和第二种表位标签的第二种DNA构建体转染细胞系；筛选转录第二种标记的细胞；将细胞暴露于第二种分子信标，该信标在与第二种表位标签的RNA转录产物杂交后会发出荧光；和分离表现出第一种和第二种表位标签中的每一种的荧光的细胞。在两种蛋白的情况下，编码第二种表位标签的DNA序列部分可以与编码第二种蛋白的DNA序列部分在相同或不同的读框内。可以将第二预选蛋白与第一预选蛋白同时地或依次地转染。如果同时进行该方法，且用于两种构建体的抗药性标记相同，则可以使用更高水平的药物来筛选表达两种构建体的细胞。而且，通过重复前述步骤可以使细胞系表达超过2种蛋白。
在本发明的另一方面，提供了一种产生能表达至少一种预选反义RNA分子的细胞系的方法，其包括下述步骤：
a)用DNA构建体转染细胞系，所述的DNA构建体编码所述至少一种预选反义RNA分子和至少一种抗药性基因；
b)筛选对药物有抗性的细胞，对该药物的抗性由所述的标记赋予，所述的细胞转录所述至少一种抗药性标记；
c)将所述细胞暴露于分子信标，该信标在与反义RNA分子杂交后会发出荧光；
d)分离出发荧光的细胞；和
e)通过培养分离出的细胞，产生表达所述预选反义RNA序列的细胞系。
可以使用荧光激活细胞分选器技术完成对发荧光的细胞的分离。可以使细胞系表达至少一种第二预选反义RNA分子，其步骤还包括：用编码第二预选反义RNA分子和第二种抗药性标记的第二种DNA构建体同时地或依次地转染细胞系；筛选表达第二种标记的细胞；将细胞暴露于第二种分子信标，该信标在与第二反义RNA分子杂交后会发出荧光；和分离表现出所述至少一种和第二种mRNA转录产物中每一种的荧光的细胞。如果同时进行该方法，且用于两种构建体的抗药性标记相同，则可以使用更高水平的药物进行筛选。而且，通过用另一个构建体重复前述步骤可以提供超过2种反义RNA分子。
在本发明的另一方面，提供了一种产生能表达至少一种预选反义RNA分子的细胞系的方法，其包括下述步骤：
a)用DNA构建体转染细胞系，所述的DNA构建体编码所述至少一种预选反义RNA分子、至少一种抗药性标记和第一表位标签核苷酸序列；
b)筛选对药物有抗性的细胞，对该药物的抗性由所述的标记赋予，所述的细胞转录所述至少一种抗药性标记；
c)将选出的细胞暴露于第一分子信标，该信标在与第一表位标签的mRNA转录产物杂交后会发出荧光；
d)分离出发荧光的细胞；和
e)通过培养分离出的细胞，产生表达所述至少一种预选反义RNA分子的细胞系。
可以使细胞系表达至少一种第二预选表位标签的反义RNA分子，其步骤还包括：用编码第二预选表位标签的反义RNA分子和第二种抗药性标记的第二种DNA构建体转染细胞系；筛选表达第二种标记的细胞；将细胞暴露于第二种分子信标，该信标在与第二表位标签的RNA转录产物杂交后会发出荧光；和分离表现出所述至少一种和第二种mRNA转录产物两者的荧光的细胞。这些步骤可以与最初的步骤同时地或依次地进行。如果同时进行转染且两种构建体具有相同的抗药性标记，则可以使用更高水平的药物进行筛选。可以通过进行其它步骤来导入超过2种的表位标签的反义分子。
前述方法可以用于制备表达反义RNA分子或任何其它类型的RNA分子(包括但不限于结构性RNA，包括rRNA以及hnRNA和snRNA)的细胞。而且，应当指出，所有的方法中的表位标签用于通过分子信标检测转染的构建体，该表位标签与编码的蛋白位于相同的或不同的读框并不重要，只要该表位标签序列能被分子信标检测出即可。
在本发明的另一方面，提供了一种分离能表达至少一种蛋白或RNA的细胞的方法，其包含下述步骤：
a)提供怀疑表达该至少一种蛋白的细胞；
b)将细胞暴露于至少一种分子信标，该信标在与编码所述至少一种蛋白的mRNA转录产物杂交后会发出荧光；
c)分离出发荧光的细胞。
可以使用荧光激活细胞分选器技术来分离发荧光的细胞。该蛋白可以是(以非限制性的实例方式)位于细胞表面的蛋白或胞内蛋白。还可以检测任何其它RNA。通过将与其靶RNA杂交后能发荧光的第二种分子信标暴露给细胞，然后分离具有第一种和第二种分子信标中每一种的荧光的细胞，还可以用该方法鉴别还表达第二种蛋白或RNA的细胞。还可以实现同时表达超过两种蛋白。
本发明还涉及定量至少一种RNA转录产物在生物样品中的表达水平的方法，其包括下述步骤：
a)将生物样品暴露于第一分子信标，该信标在与该RNA转录产物杂交后会发出荧光；
b)定量该生物样品中的荧光水平；和
c)将荧光水平与所述至少一种RNA转录产物的水平相关联。
该生物样品可以是细胞样品或组织样品。样品可以是固定的。RNA转录产物可以是(但不限于)编码蛋白的RNA、结构性RNA或反义RNA。通过荧光显微术或荧光激活细胞分选器技术可以定量荧光。使用与第二种RNA转录产物杂交后能发荧光的第二分子信标，还可以在该生物样品中定量至少一种第二RNA转录产物的表达水平。
在本发明的另一方面，提供了一种产生过量表达至少一种蛋白的细胞系的方法，其包括下述步骤：
a)用至少两种DNA序列转染细胞，一个序列具有编码该蛋白、至少一种表位标签和至少一种抗药性标记的部分；且第二个序列具有编码该蛋白、至少一种第二表位标签和至少一种第二抗药性标记的部分；
b)通过表达第一和第二抗药性标记，筛选用所述至少两种DNA序列转染的细胞；
c)将选出的细胞暴露于第一和第二分子信标，每个信标在分别与第一和第二表位标签的RNA转录产物的核苷酸序列杂交后会发出荧光；
d)分离表现出第一和第二分子信标中每一种的荧光的细胞；和
e)通过培养分离出的细胞，产生过量表达所述至少一种预选蛋白的细胞系。
在本发明的前述方面中，所述至少两种DNA序列可以位于同一个构建体中。第一和第二表位标签可以每一个独立地与所述蛋白位于相同的或不同的读框内。通过分离表达最强荧光的细胞，FACS可以用于分离表达两种构建体的细胞。如在本文前述的方法中一样，转染可以同时地或依次地进行。当两种构建体中存在相同的抗药性标记且同时进行转染时，可以通过提高药物水平进行筛选。
在另一方面，提供了一种产生过量表达至少一种反义RNA分子的细胞系的方法，其包括下述步骤：
a)用至少两种DNA序列转染细胞，一个序列具有编码该蛋白、至少一种表位标签和至少一种抗药性标记的部分；且第二个序列具有编码该蛋白、至少一种第二表位标签和至少一种第二抗药性标记的部分；
b)通过表达第一和第二抗药性标记，筛选用所述至少两种DNA序列转染的细胞；
c)将选出的细胞暴露于第一和第二分子信标，每个信标在分别与第一和第二表位标签的RNA转录产物的核苷酸序列杂交后会发出荧光；
d)分离表现出第一和第二分子信标中每一种的荧光的细胞；和
e)通过培养分离出的细胞，产生过量表达所述至少一种预选反义RNA分子的细胞系。
所述至少两种DNA序列可以位于同一个构建体中。第一和第二表位标签可以每一个独立地与反义RNA分子位于相同的或不同的读框内。用于得到需要的产品的条件和替换方法如上所述。而且，可以提供任何形式的RNA。
在本发明的另一方面，提供了一种产生功能上不表达至少一种预选蛋白或RNA的细胞系的方法，其包括在细胞中提供多种针对预选蛋白或RNA的反义RNA的步骤，其中针对所述至少一种预选蛋白或RNA的所述多种反义RNA基本上能结合要消除的mRNA或其它RNA的所有RNA转录产物。在制备没有预选蛋白的细胞的情况下，预选蛋白可以特异性地仅仅为一种基因产物，或基因产物的可替代拼接形式的子集。
在本发明的另一方面，提供了一种产生是功能上不表达至少一种预选蛋白的突变体的转基因动物的方法，其包括：使用胚胎干细胞进行前述的步骤，检测功能上不表达预选蛋白的干细胞的生活力，和使用存活的胚胎干细胞生产转基因动物。
而且，提供一种产生功能上不表达至少一种蛋白且过量表达至少一种其它蛋白的细胞系的方法，包括：在相同细胞上进行本文所述的方法。另外，通过进行前述方法可以提供一种产生能表达在可诱导的启动子控制下的致死反义RNA的细胞系的方法，其中步骤(a)是在存在最小量的诱导剂的情况下进行的。
一种用于鉴别活细胞中的遗传重组事件的方法，其包括下述步骤：
a)将细胞暴露于分子信标，该信标在与从由重组序列转录的和由非重组序列转录的RNA序列中选择的RNA序列杂交后会发出荧光；
b)检测或分选所述的细胞。
所述细胞的检测和/或分选可以通过FACS或显微镜进行。
另一方面，本发明涉及一种能产生蛋白水解活性的单式杂交探针(unitary hybridization probe)(本文中称作探针蛋白酶)。  这样的探针蛋白酶以与分子信标相似的方式运作，但不是信标与其靶核酸序列的相互作用时的荧光变化，而是探针蛋白酶在有靶存在的情况下会变成蛋白水解性的。探针蛋白酶组合物在分子信标型的寡核苷酸的一端提供了蛋白酶，在另一端提供了互补的蛋白酶抑制剂。当寡核苷酸未与靶序列杂交时，寡核苷酸两端的靠近会造成蛋白酶和蛋白酶抑制剂相互作用，从而抑制蛋白酶的蛋白水解活性。但是，当寡核苷酸的靶序列与靶杂交时，蛋白酶与其抑制剂分离，从而激活蛋白酶。可以容易地检测蛋白酶的活性，而且，在存在特定核酸靶序列的情况下的有活性的蛋白酶不但可以用于检测目的，而且可以用于治疗目的，例如，如果特定基因(例如与细胞转化、肿瘤发生、增殖障碍等相关的)被转录，其中输送有探针蛋白酶的细胞就会被裂解且不能存活。
前述探针可以具有蛋白水解酶抑制剂，它是能可逆地灭活该酶的肽或其它分子。酶和抑制剂的非限制性的实例包括氨肽酶和抑氨肽酶肽、胰蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶和抗蛋白酶、氨肽酶和佳制酶素、胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抑制剂、氨肽酶和diprotin A或B、羧肽酶A和EDTA、弹性蛋白酶样丝氨酸蛋白酶和elastinal、和嗜热菌蛋白酶或氨肽酶M和1，10-菲咯啉。
从下面的详细说明中会明白本发明的这些方面和其它方面。
具体实施方式
本发明在这里是基于分子探针鉴定活细胞中的RNA序列的能力和荧光细胞分选器或相关技术在鉴定和/或分离在一个或多个波长能表现出特定荧光水平的细胞中的应用。目前已知EDAC能淬灭多种最强的常用荧光团的发射。由于能够可靠地和有效地检测活细胞中的mRNA以及其它RNA，它们可以用于基于希望的特征，鉴定并且在需要时分离细胞，例如通过使用荧光激活细胞分选器(FACS)。该应用提供了许多能极大地简化和减少进行以前已知的方法所必需的时间，并提供了一些新方法。迄今为止，所进行的涉及信标和活细胞的研究尚未表现出相对于对照组的显著性差异。首先通过使用更强的荧光团，再通过修饰信标使形成茎-环分子的茎部分的核苷酸数目比5或6个核苷酸的经典长度更长，消除了该问题。这使分子更有可能在没有靶序列存在时维持在其茎-环、无荧光状态，从而减少背景。
利用本文上述的方法学，可以产生稳定地转染的能表达具有不同作用的RNA(也就是说，有些既不编码蛋白也不起反义RNA的作用，尽管如此它们还是被细胞表达；另外的起信使RNA的作用，另外的是针对已经列出的两类的反义RNA)的细胞系。这样的另外的RNA包括结构性RNA(例如核糖体RNA)、hnRNA、snRNA等。
1.产生表达蛋白的细胞系
通过应用本文所述的分子信标，消除了在产生细胞系中的一些最冗长的步骤。药物筛选用编码目的基因和抗药性的DNA构建体转染的细胞后，向这些细胞中导入分子信标，它们被设计用来识别目的基因的信号。那些转录该基因的细胞将会发出荧光。随后的FACS分析会分离出发荧光的细胞，它们再被培养，生成能表达目的基因的细胞系。
如果用来识别目的信号的信标能够检测到内源性现有的靶序列，则它们的比例与转染的细胞所生成的靶序列的比例相比，使得分选器能区别开两种细胞类型。或者，通过给目的基因附加表位标签并将信标设计成能识别出编码该标签的核苷酸序列，可以消除内源性荧光的问题。这些核苷酸可以与基因信号位于相同的或不同的读框内，这取决于是否希望标记生成的蛋白。
另外，目的基因在任何给定的细胞中的表达水平都可能变化。在这里用FACS评价表达水平；它用于有差异地选择表达相同基因的各细胞。
2.产生表达反义分子的细胞系
有几篇文献记载了不表达编码蛋白的RNA而表达是基因或基因一部分的反义分子的RNA的细胞系的产生。这样的方法有助于减少给定细胞中的特定蛋白的量。上面所述的产生表达蛋白的细胞系的方法同样适用于这里并且实质上等同，只是这里的信标被设计用于检测RNA(它是反义RNA)。
并非制作稳定地转染的表达反义分子的细胞系的所有尝试都能生成其中打靶蛋白的表达受到足够程度影响的细胞系。该困难已经降低了追求生产这样的细胞系的价值。但是，鉴于这里所述方法的简易性，人们可以容易地检测许多不同遗传序列生成表达有活性的反义分子的细胞系的有效性。
3.基于位于细胞表面的抗原区分细胞
免疫学家以及其它人已经长期地使用FACS来分选细胞。根据本发明，为了检测位于细胞表面的蛋白的存在，制作的信标将编码目的蛋白的mRNA作为其靶。通过转染将信标导入到细胞中，然后用细胞分选器分离正得分的细胞。
另外，目前FACS还用于分选细胞，其基础是它们表达至多3种位于细胞表面的蛋白。FACS的该特征是通过使用这里所述的分子信标来实现的，如果使用信标组合，则每一个以目的蛋白中的一个的mRNA为靶，并且每一个进行不同的标记。如果要基于超过3种表达的RNA来分选细胞，可进行多次分选。
4.检测细胞中特定RNA的表达和定量细胞中RNA的表达水平
如果导入到细胞中的分子信标的靶RNA是存在的，则该细胞会发出荧光。该信息可以通过使用荧光显微镜或FACS来定性检测，还可以通过这些中的任一种来定量。例如，不在组织切片上进行原位反转录聚合酶链式反应(RT-PCT)来检测特定RNA的表达模式，而是用信标进行相同的实验。而且，使用不同荧光信标的组合(每一个均以特定RNA为靶)，人们可以在一步操作中检测出几种目的RNA的存在或对其定量。
5.抗原的定位与检测细胞和组织中的RNA相结合
使用固定的细胞或组织切片，人们可以使用免疫细胞化学来描述识别出的蛋白抗原的定位；使用以特定RNA为靶的分子信标，人们可以在同一样品中对目的RNA进行共定位。已经证实，以RNA为靶的分子信标能在固定细胞中起作用。
6.产生表达多种蛋白的细胞系
使用本发明的方法，人们能非常迅速地生成稳定地转染的能表达任意数量蛋白的细胞系，无需在有多种选择性药物混合物存在的情况下维持这些细胞。在基因转染和药物筛选之后，将分子信标组合(每一个对应一个蛋白信号)导入到细胞中。通过设计每一个信标的环序列，以杂交仅一个基因的mRNA或仅一个表位标签(见上)的核苷酸序列(所述信号可与之相关)，每一个信标被设计成用于识别仅由一个基因编码的mRNA。然后通过FACS分选细胞。通过选择一种、两种或所有三种荧光信号，在一次操作中生成了多种细胞系。
人们可能会需要生产能表达超过3种目的RNA的细胞系。例如，非常提供信息的是具有这样的细胞系，其中被认为参与形成特定复合物的所有蛋白和RNA序列都过量表达。为了实现这一目标，使用已经表达RNA组合的细胞作为宿主细胞(将用编码其它RNA的其它构建体来转染它)重复上述步骤。
如果要表达的多种RNA都被克隆进能赋予细胞针对相同药物的抗性的构建体中，则用FACS来分离表达所有目的RNA的细胞。因为序列已经稳定地整合进基因组中，细胞不会丢失任何序列的表达。但是，可能会丢失一种或多种序列。如果是这种情况，人们可以提高这些细胞在其中生长的培养基中的选择性药物的浓度，使这种可能性更少地发生。或者，人们可以使用多个构建体，其中的每一个会赋予针对不同药物的抗性，并将细胞维持在合适药物的混合物中。也可以选择要稳定地转染进细胞中的构建体的子集来编码针对一种药物的抗性基因，而另一个子集编码针对另一种药物的抗性基因。
而且，如果细胞系中的一些细胞丢失了目的RNA，那么作为补救手段，重复进行上述分离细胞系的第一个实验，得到新细胞。或者，通过FACS分析所述细胞的混合物，其目的是重新分离出能表达所有目的RNA的细胞。这是一种非常有用的方法，因为它再次生成的细胞所产生细胞系具有与选定的原始细胞系相同的遗传组成。
上述方法能无限制地供给表达蛋白和RNA序列的任意组合的细胞，可用于实际上无限制的分析方法。过量表达的蛋白还可以对细胞是有毒性的，如下面将会讨论到的，这种可能性能容易地解决。
应当指出，由于能从细胞系克隆(其中的细胞群体包括一些不再表达所有RNA的细胞)中容易地重新分离出表达所有目的RNA的细胞，也就可能在没有药物或存在最小药物浓度的情况下维持细胞系。
7.产生能显著地过量表达一种或多种蛋白的细胞系
对于每一种要非常过量表达的基因，例如，将同一基因的两个或多个序列首先克隆进能赋予抗药性的DNA构建体中。每一个基因的多个序列中的每一个都设计成包括了编码不同表位标签的序列。将DNA构建体转染进细胞中并接着进行药物筛选之后，将分子信标(其中的每一个仅以一个表位标签为靶，且进行不同荧光标记)导入到细胞中，用细胞分选器分离对它们的信号呈阳性的细胞。这样的细胞已经将不同的表位序列标记的基因中的每一种的至少一个拷贝整合进它们的基因组中，因此增加了拷贝数量的基本上相同的目的序列会造成目的序列的表达。该方法还可以与FACS一起使用，用FACS挑选出对每一种荧光团的信号得分最多的那些细胞。
8.产生表达多种反义RNA的细胞系
如下建立稳定地转染的能生产多种反义信号的细胞系。这样的反义信号以mRNA或其它RNA为靶。可筛选能以不同水平表达任何一个转染的反义序列的细胞。通过重复多轮的稳定转染，人们可以容易地筛选出能够生成稳定转染的细胞系(其表达无限制数量的RNA的反义信号)的细胞。
当然，通过本文所述的方法还可以制备出能表达反义RNA之外的其它RNA的细胞。这样的RNA包括但不限于mRNA、rRNA、其它结构性RNA、hnRNA或snRNA。
9.产生功能上敲除(Knock-Out)了一种或多种蛋白的细胞系
本发明的方法提供了在培养的细胞中制备功能上的敲除的手段。这使得无需尝试通过研究人蛋白在酵母或小鼠中的敲除特征来破译它们的功能。通过产生能从多基因座表达针对独特RNA序列的实质上相同的反义RNA的细胞，人们可以生成功能上敲除了任何一种目的蛋白的细胞系。例如，人们将多个构建体(它们中的每一个能编码特定基因的反义RNA)稳定地转染进细胞中。这里的每一种反义RNA序列的差别仅在于，每一种都用独特的表位标签的核苷酸序列作出标记。人们可以筛选出能表达所有不同地标记的反义RNA的那些细胞。因为FACS如前所述用于定量荧光，该特征使人们可以筛选出能最强地表达任何一种或多种反义序列的那些细胞。
重要的是，在该方法中使用了靶向相同基因的不同反义序列。例如，设计一些反义RNA(使用分子信标和FACS可以筛选出它们的表达)来以基因的信使RNA特定区域为靶，而其它的则设计成以相同信使的可另外部分为靶。为了产生功能上敲除了目的蛋白的细胞系，人们可以将生成细胞系(它不表现出可检测水平的目的蛋白的表达，或者，表现出可接受的低水平的表达)所必需量的遗传序列(其编码相似或不同的针对相同目的基因的反义RNA)稳定地转染进细胞中。
而且，人们可以通过重复上述方法，以任意数量的要在功能上反义敲除的序列为靶，生成在功能上敲除了多种蛋白的细胞系。例如，为了研究蛋白复合物的功能，人们可以敲除形成复合物的蛋白的所有或任意组合。
10.产生在功能上仅敲除了一个或多个基因的选定的可替换地拼接形式的细胞系
同一基因的不同地拼接的形式经常翻译成具有不同功能的蛋白。使用本发明的方法，可以生成在功能上仅敲除了一种或多种蛋白的选定的可替换地拼接形式的细胞系。例如，通过设计仅以要从细胞中消除的基因的信使RNA的那些可替换地拼接形式为靶的反义分子，可以在功能上敲除目的基因的所有该可替换地拼接的RNA，除了那些可替换地拼接的感兴趣的信号外。
11.产生能表达一种或多种蛋白同时在功能上敲除了一种或多种其它蛋白的细胞系
利用上述的方法可以生成稳定地转染的细胞系，其表达具有不同作用的RNA；也就是说，有些既不编码蛋白也不起反义RNA的作用，尽管如此它们还是在细胞中表达，有些起信使RNA的作用，还有些是针对已经列出的两类的反义RNA。这包括但不限于结构性RNA(例如核糖体RNA)、hnRNA、snRNA和其它非信使RNA。
例如，对于给定的认为能彼此相互作用的蛋白组，可以通过生成稳定地转染的细胞系来研究它们的相互作用，其中，通过反义RNA的细胞表达在该细胞系中功能上敲除了一种或多种目的蛋白。然后可以研究细胞中的剩余蛋白的功能，但是也许更感兴趣的是，可以通过进一步的操作使其现在过量表达一种或多种剩余目的蛋白来进一步改变这样的细胞。这样，可以无限制地进一步推导出一系列思想，使得能够过量表达或消除其它蛋白在细胞中的表达。
上述方法改变了可在组织培养中维持的哺乳动物细胞和其它细胞的科学，能进行许多以前根本不可能的遗传操作。首次可以产生功能上敲除的人细胞，还可使它们具有这些过量表达的蛋白。另外，某些蛋白的过量表达或某些蛋白的功能上的敲除可能使细胞致死。下面将会解决该问题。
12.产生转基因小鼠
对于许多目的，仅研究培养的细胞是不够的。但是，上述的方法学还将其自身导向胚胎干细胞的操作。通过上述方法可以得到这样的胚胎干细胞，它能表达多种蛋白或功能上敲除了多种蛋白或多种蛋白的可替换地拼接形式的子集等。这样的胚胎干细胞然后可以用作产生敲除的动物的基础。使用这些方法，在尝试产生敲除的动物之前，可确定是否该实验会导致致死表型。例如，如果将必不可少的蛋白从胚胎干细胞中功能上地敲除，那么这样的细胞在通过FACS分离后不可能存活。
13.产生可诱导的稳定地转染的细胞系
某些蛋白或RNA在细胞中的过量表达或缺乏表达可能是致死的。然而研究细胞过量表达毒性蛋白或RNA或功能上敲除蛋白或RNA(没有它们细胞不能存活)的细胞仍然可能是至关重要的。为此目的，人们可以产生稳定地转染的细胞，其中选定的具有这样的对细胞有害效应的RNA在可诱导的启动子的控制下。为了分离这样的细胞系，首先最小地诱导转染的和药物筛选的细胞，以实现可诱导基因的转录，然后，在将用于识别合适RNA的分子信标转染进细胞中后，对细胞进行FACS分析。维持得到的细胞，使毒性RNA不被诱导，且只有在必要时才转录。
可诱导的系统除了对于表达毒性RNA外、对于其应用也是有利的。例如，在同步化的细胞系的细胞周期的特定点，人们可以诱导稳定地转染进细胞中的遗传序列的表达。或者，如果认为一个或多个稳定地转染的遗传序列的集合的表达产物会作用于另一个集合的表达产物，那么有益的是将第一个集合的遗传序列克隆到一个可诱导的启动子的控制下，且将第二个集合的遗传序列克隆到第二个可诱导的启动子的控制下。通过改变的诱导，人们可以在没有或有一个遗传序列集合编码的表达产物存在的情况下研究另一个集合的表达产物。
14.检测活细胞中的遗传重组事件和随后分离未重组的或不同地重组的细胞
在使用分子信标检测导致稳定的细胞系的重组事件的同时，可使用信标从活细胞混合物中检测和分离已经发生过其它特异性重组事件的细胞。相同的原理可以用于例如VDJ重组、易位和病毒基因组整合的实验。
在细胞重组事件中，例如，基因组DNA的一个序列被换成另一个。如果编码发生重组事件的区域的DNA序列被转录成RNA，那么该事件的存在可以由分子信标检测出，该分子信标被设计成用于识别从未重组的DNA序列转录出的RNA或从重组序列转录出的RNA。这样的实验还可以通过荧光显微镜来实现。如果要将已经重组的细胞与未重组的细胞彼此分离，那么就可以对细胞进行FACS并分选它们。另外，FACS可以用于基于它们中是否存在多个重组事件挑选细胞。
15.基于表达的RNA分选细胞
使用本文所述的分子信标可以基于位于内部的蛋白和人们不能产生抗体的蛋白的表达分选细胞。例如，通过设计能识别mRNA(它们产生目的蛋白)的分子信标，可以从混合的细胞群体中分离出能表达位于内部的目的蛋白的那些细胞。将这些分子信标转染进细胞混合物中，并合适地用FACS分选它们。可以进行多个回合的分选。
另外，研究人员可能感兴趣的是，例如，将能由细胞因子的刺激诱导表达一种或多种特定蛋白的mRNA的细胞从不能被类似地诱导的细胞中分离出。为此目的，首先用细胞因子诱导细胞混合物，然后用信标转染，每一种所述的信标被设计成用于识别能产生一种目的蛋白的mRNA。然后使用FACS分离那些目的mRNA阳性的细胞。在一个替代实施方案中，还可以检测感染了病毒的细胞，例如，它们对特定基因的表达。
用上述的方法学可以检测对具有不同作用的RNA(也就是说，有些既不编码蛋白也不起反义RNA的作用，尽管如此它们还是被细胞表达；有些起信使RNA的作用，有些是针对已经列出的两类的反义RNA)的存在呈阳性的细胞。这包括但不限于结构性RNA(例如核糖体RNA)、hnRNA、snRNA和其它非信使RNA。
16.体内检测核酸并随后选择细胞
由于需要的化学被较好地表征，人们可以以任何方式修饰分子信标，生成新的可能性。例如，选择性地破坏表达特定mRNA(其表达会导致细胞的恶性转化)的细胞，而未表达该mRNA的细胞则或多或少地未受影响，如下所述。选择的分子信标由设计用于识别并杂交包含在目的基因(其在细胞混合物的一些细胞中转录)中的特定核酸序列的寡核苷酸组成。该寡核苷酸的一端已经共价地连接到蛋白酶，其另一端连接到一个或多个蛋白酶抑制剂(例如肽抑制剂)分子。应当注意，对于用于合成这样的信标的寡核苷酸而言重要的是，具有能彼此杂交的末端，正如分子信标一样。只要所述的分子维持其茎-环结构，在分子一端上的肽抑制剂会足够地接近位于另一端的蛋白酶，从而造成抑制。为了便于讨论，刚才描述的这样的分子将被称作探针蛋白酶。
探针蛋白酶在被转染进表达RNA(它能被探针蛋白酶识别)的细胞中以后，探针蛋白酶与其靶杂交。这会激活蛋白酶(处于杂交状态时蛋白酶会被激活)，蛋白酶不再临近其肽抑制剂。其中存在这样的探针蛋白酶的靶并且其被识别的细胞受到破坏，从而针对地选择出。
另外，探针蛋白酶可以用于多种其它用途。例如，在给定的细胞混合物中，其中有些细胞感染了特定病毒，可以向细胞中导入能特异性地以病毒mRNA为靶的探针蛋白酶。携带这样的mRNA的细胞会激活它们含有的探针蛋白酶的水解活性，这会破坏这些细胞。
用上述的方法学可以产生稳定地转染的表达具有不同作用的RNA(也就是说，有些既不编码蛋白也不起反义RNA的作用，尽管如此它们还是被细胞表达；有些起信使RNA的作用，有些是针对已经列出的两类的反义RNA)的细胞系。
基于前面的说明，可以实现下面的方法。
提供了一种产生表达至少一种预选蛋白的细胞系的方法，其包括下述步骤：
a)用至少一种DNA构建体转染细胞系，所述的DNA构建体编码至少一种预选蛋白和至少一种抗药性标记；
b)筛选对药物有抗性的细胞，对该药物的抗性由所述的标记赋予，所述的细胞转录该至少一种DNA构建体和该至少一种抗药性标记；
c)将所述的选出的细胞暴露于第一分子信标，该信标在与所述的至少一种预选蛋白的RNA转录产物杂交后会发出荧光；
d)分离所述的发荧光的细胞；
e)通过培养所述的分离出的细胞，产生表达所述的至少一种预选蛋白的细胞系。
在该方法中，可以使用荧光激活细胞分选器技术分离所述的发荧光的细胞。还可以使该细胞系以同时的或依次的方式表达第二预选蛋白，其它的步骤包括：用编码第二预选蛋白和第二种抗药性标记的第二种DNA构建体转染该细胞系；筛选表达所述的第二种标记的细胞；将所述的细胞暴露于第二种分子信标，该信标在与所述的第二预选蛋白的RNA转录产物杂交后会发出荧光；和分离表现出所述的至少一种和所述的第二种mRNA转录产物中每一种的荧光的细胞。目前，现有技术可以在分选过程中检测多达3种不同的荧光团，现在，可以同时地重复上述方法来表达多达3种不同的蛋白。如果需要，按照该方法还可以再将表达3种不同蛋白的细胞系用作起点以导入更多蛋白。
用于转染的DNA构建体可以编码一个基因和抗药性标记，或者带有相应标记的其它基因。通过用相应的药物进行筛选，可以实现每一个基因的成功转染。如上所指出的，其它基因的导入是同时地还是依次地、一次可以检测出的表达的信号的数量都会受到荧光技术的限制，但是可以重复该方法来加入更多的基因。如果多达3个荧光团可以被检测出，那么可以一次导入3种基因。
还公开了一个相关方案，其中将与转染的基因相关的表位标签用作分子信标的靶，从而允许筛选表达蛋白的细胞，所述蛋白的mRNA可能会难以与背景区别开，例如，在分子信标检测密切相关的RNA种类时。因此，提供了一种产生表达至少一种预选蛋白的细胞系的方法，其包括下述步骤：
a)用至少一种DNA构建体转染细胞系，所述的DNA构建体编码所述至少一种预选蛋白、至少一种抗药性标记和至少一种第一表位标签；
b)筛选对药物有抗性的细胞，对该药物的抗性由所述的标记赋予，所述的细胞转录该至少一种DNA构建体和该至少一种抗药性标记；
c)将所述的细胞暴露于第一分子信标，该信标在与所述的第一表位标签的RNA转录产物杂交后会发出荧光；
d)分离出所述的发荧光的细胞；
e)通过培养所述的分离出的细胞，产生表达所述至少一种预选蛋白的细胞系。
该方法基本上与前述的方法相同，只是使用的分子信标被设置成用于识别表位标签，而不是想要导入的蛋白的RNA转录产物。该方法与前一方法相比的优点是，仅仅需要较少数量(与不同的表位标签的数量相对应)的分子信标就能制备出较大数量的表达一种或多种蛋白的不同细胞系。由于荧光分选器技术目前限于3种荧光团，该方法仅仅需要3种不同的信标。如果该技术将来能增加可以同时检测出的荧光团的数量，这也可以增加。但是，可以一次加入多达3种导入的蛋白，然后可以将成功地转染了这3种基因的细胞用作加入其它基因的起点。
在本发明中可以使用的表位标签(可以制作针对它的信标)的实例包括但不限于HA(流感血凝素蛋白)、myc、his、蛋白C、VSV-G、FLAG或FLU。这些和其它的表位标签是本领域的技术人员已知的。如这里所使用的，表位标签会提供独特的用于被分子信标识别的核酸序列。核酸序列与编码的蛋白是否位于构建体的一个阅读框架中并不重要；无论怎样分子信标都可以识别。这样，用分子信标检测转录产物时不需要翻译转录出的携带有表位标签的核酸序列的RNA。
当然，前述方法可以用于将不止一种蛋白导入进细胞，同时地或依次地进行的其它步骤还包括：用编码第二预选蛋白、第二种抗药性标记和第二种表位标签的第二种DNA构建体转染细胞系；筛选表达所述的第二种标记的细胞；将所述的细胞暴露于第二种分子信标，该信标在与所述的第二种表位标签的RNA转录产物杂交后会发出荧光；和分离所述的表现出所述的第一种和第二种表位标签中的每一种的荧光的细胞。第二种表位标签可以与编码所述的第二种蛋白的DNA序列部分在相同或不同的读框内。
在存在药物(提供了针对它的抗药性标记)的情况下，通过培养细胞的标准方法筛选成功地转染了的细胞。如果是筛选两种抗药性标记，它们可以同时地或依次地进行筛选。如果在两种不同的转染的构建体上使用相同的抗药性标记，则可能需要使用更高水平的药物来筛选转染有两种构建体的细胞，其原因是剂量效应。
前面的用于制备表达一种或多种蛋白的细胞系的方法可以同样容易地用于产生表达一种或多种反义RNA分子的细胞系。该方法包括：
a)用DNA构建体转染细胞系，所述的DNA构建体编码所述至少一种预选反义RNA分子和至少一种抗药性基因；
b)筛选对药物有抗性的细胞，对该药物的抗性由所述的标记赋予，所述的细胞转录所述至少一种DNA构建体和所述至少一种抗药性标记；
c)将所述的细胞暴露于分子信标，该信标在与所述的反义RNA分子杂交后会发出荧光；
d)分离出所述的发荧光的细胞；和
e)通过培养所述的分离出的细胞，产生表达所述的预选反义RNA序列的细胞系。
这些方法的所有细节如上所述。在信标不能检测出特定mRNA的情况下，可以使用表位标签方法，即：
a)用DNA构建体转染细胞系，所述的DNA构建体编码所述至少一种预选反义RNA分子、至少一种抗药性基因和第一表位标签核苷酸序列；
b)筛选对药物有抗性的细胞，对该药物的抗性由所述的标记赋予，所述的细胞转录所述至少一种DNA构建体和至少一种抗药性标记；
c)将所述的选出的细胞暴露于第一分子信标，该信标在与所述的第一表位标签的mRNA转录产物杂交后会发出荧光；
d)分离出所述的发荧光的细胞；和
e)通过培养所述的分离出的细胞，产生表达所述的至少一种预选反义RNA分子的细胞系。
如上面所指出的，表位标签检测方法的优点是，不必制备针对每一种反义RNA的分开的信标；仅需要针对少数表位标签的信标，它们可以在连续步骤中用来导入大量的反义分子，或者在细胞系中过量表达一个分子。自然地，可以同时地或依次地重复前述方法来将两种或多种反义RNA分子导入到给定的细胞系中。
另外，制成表达特定蛋白的细胞还可以用作创建能表达蛋白和反义RNA分子的细胞的起点。当然，使用本文的方法，也可以将能表达反义分子的细胞用作加入表达蛋白的起点。还可以同时转染蛋白和反义分子，以及相应的信标，如果需要时还有表位标签。前述方法的各种组合都包括在本文的范围内。
类似地，提供了分离能表达至少一种蛋白的细胞的方法，其包含下述步骤：
a)提供怀疑表达所述的至少一种蛋白的细胞；
b)将所述的细胞暴露于至少一种分子信标，该信标在与编码所述的至少一种蛋白的mRNA转录产物杂交后会发出荧光；
c)分离出所述的发荧光的细胞。
这些方法特别适用于位于细胞表面的蛋白或胞内蛋白。它们不需要使用蛋白自身的探针，使用这些探针可能会更困难或者影响细胞使其难以进行其它实验。使用多个分子信标可以鉴别出不止一种蛋白，多达通过用于分离的技术能同时检测出的数量。
自然地，前述方法可以用于定量至少一种RNA转录产物在生物样品中的表达水平，其包括下述步骤：
a)将生物样品暴露于第一分子信标，该信标在与所述的RNA转录产物杂交后会发出荧光；
b)定量该生物样品中的荧光水平；和
c)将荧光水平与所述的至少一种RNA转录产物的水平相关联。
该生物样品可以是细胞样品或组织样品；它们可以是固定的，例如用甲醛、戊二醛或任意数量的已知细胞固定液(它们不会干扰用分子信标检测RNA)固定的。
检测的RNA转录产物可以是编码蛋白的RNA、结构性RNA和反义RNA。通过荧光显微术或荧光激活细胞分选器技术可以定量荧光。使用与第二种RNA转录产物杂交后能发荧光的第二分子信标，还可以同时地定量其它RNA种类。
在前述方法的另一个应用中，提供了一种产生能过量表达至少一种蛋白的细胞系的方法。这是通过用两种或更多种编码相同蛋白的序列转染细胞、筛选和鉴别与转录产物的各拷贝相关的表位标签的表达来实现的。其步骤包括：
a)用至少两种DNA序列转染细胞，所述序列每一个具有编码该蛋白、至少一种表位标签和至少一种抗药性标记的部分；和编码相同蛋白、至少一种第二表位标签和至少一种第二抗药性标记的部分；
b)通过表达第一和第二抗药性标记，筛选用至少两种DNA序列转染的细胞；
c)将选出的细胞暴露于第一和第二分子信标，每个信标在分别与所述的第一和第二表位标签的RNA转录产物的核苷酸序列杂交后会发出荧光；
d)分离表现出所述的第一和第二分子信标中的每一种的荧光的细胞；和
e)通过培养分离出的细胞，产生过量表达所述的至少一种预选蛋白的细胞系。
如上面所指出的，如果相同的抗药性标记用于基因的每一个拷贝，可能需要更高水平的药物来筛选转染有两种序列的细胞。如在前面的方法中，所述至少两种DNA序列可以存在于相同的构建体中。第一和所述的第二表位标签可以每一个独立地在所述蛋白的读框内或之外。
前述方法可以容易地用于产生能过量表达至少一种反义RNA分子的细胞。该方法包括下述步骤：
a)用至少两种DNA序列转染细胞，所述序列每一个具有编码所述的反义RNA分子、至少一种表位标签和至少一种抗药性标记的部分；和编码所述的反义RNA分子、至少一种第二表位标签和至少一种第二抗药性标记的部分；
b)通过表达所述的第一和第二抗药性标记，筛选用所述的至少两种DNA序列转染的细胞；
c)将所述的选出的细胞暴露于第一和第二分子信标，每个信标在分别与所述第一和所述第二表位标签的RNA转录产物的核苷酸序列杂交后会发出荧光；
d)分离所述的表现出所述的第一和第二分子信标中的每一种的荧光的细胞；和
e)通过培养所述的分离出的细胞，产生过量表达所述的至少一种预选反义RNA分子的细胞系。
细节与上面所述的那些相同。
向细胞中导入反义RNA分子可以用于从细胞中在功能上消除一种或多种蛋白。按照上述方法，提供了一种产生功能上不表达至少一种预选蛋白的细胞的方法，其包括下述步骤：在所述的细胞中提供多种针对所述的预选蛋白的反义RNA，每一种都根据前述方法提供，其中针对所述的至少一种预选蛋白的所述多种反义RNA基本上能结合所述的至少一种预选蛋白的所有mRNA转录产物。预选蛋白可以是基因产物的可替代拼接形式。以类似的路线，提供了一种产生是功能上不表达至少一种预选蛋白的突变体的转基因动物的方法，其包括：使用胚胎干细胞进行前述的步骤，检测所述的功能上不表达所述预选蛋白的干细胞的生命力，使用存活的胚胎干细胞生产所述的转基因动物。
类似地，提供了一种产生功能上不表达至少一种蛋白且过量表达至少一种其它蛋白的细胞系的方法，其包括在相同细胞上进行本文的方法。以类似的方式，提供了一种通过进行本文的方法产生能表达在可诱导的启动子控制下的致死反义RNA的细胞系的方法，其中在所述本文的方法中转染步骤是在存在最小量的诱导剂的情况下进行的。
本文提供了一种用于鉴定活细胞中的遗传重组事件的方法，其包括下述步骤：
a)将细胞暴露于分子信标，该信标在与从由重组序列转录的和由非重组序列转录的RNA序列中选择的RNA序列杂交后会发出荧光；
b)检测所述的表达所述RNA序列的细胞。
本发明还涉及分子信标的新形式，与现有技术的分子信标结合到它们的靶核酸上后表现出荧光性质不同，本发明的新形式分子信标会在这样结合后表现出蛋白水解活性。这样的蛋白水解活性可以用于检测目的，而且还可以用于降解细胞中的特定蛋白序列(如果编码该蛋白的mRNA存在于该细胞中的话)。例如，如果病毒的转录被激活(例如在潜伏感染中)，则可激活能特异性地剪切该病毒的蛋白的蛋白酶。
优选地，蛋白水解酶抑制剂是肽，尽管还可以使用其它的分子(包括金属和金属螯合剂)来可逆地抑制酶与抑制剂的相互作用。可以使用的蛋白水解酶和蛋白水解酶的抑制剂的配对的实例包括但不限于氨肽酶和抑氨肽酶肽、胰蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶和抗蛋白酶、氨肽酶和佳制酶素、胰凝乳蛋白酶类半胱氨酸蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抑制剂、氨肽酶和diprotin A或B、羧肽酶A和EDTA、弹性蛋白酶类丝氨酸蛋白酶和elastinal、嗜热菌蛋白酶或氨肽酶M和1，10-菲咯啉。
参考下面的作为本发明的示例的非限制性实施例可以更好地理解本发明。下面提供的实施例是为了更充分地举例说明本发明的优选实施方案。但是，它们不得以任何方式理解为限制本发明的大范围。
实施例1一般方法
原料：可以将分子信标导入不表达任何来自质粒的RNA的细胞中，或可用它们检测从质粒编码的RNA信息。将信标导入这两种类型的细胞中的方法是相同的。下面的方法只要求要分析的细胞是相互可分离的，并且适合进行FACS分析。
1)如本发明的说明书中更透彻地描述的，信标可以与FACS配合使用来基于细胞中是否表达特定的RNA挑选出组织的细胞。为此目的，必须首先通过标准的且较好地建立起的方法(例如匀浆和另外的化学处理)将细胞彼此分离。然后可以根据下面的方法将合适的信标导入到这样的细胞中。
2)其次，可以用信标来筛选表达特定RNA的细胞，所述的RNA由已经转染进细胞群体中的质粒编码。为此目的，必须首先将编码目的RNA的质粒转染进细胞培养物中。然后可以生成信标来识别这些RNA，如本发明的说明书中更详细地描述的。使用操作者自备的试剂或从生物技术公司(Qiagen、Promega、Geneporter、Invitrogen、Stratagene等)得到的试剂盒，根据厂商的说明书，可以通过非常多样的方法将质粒转染进细胞中。每一种选择出的质粒都应当能赋予对抗生素的抗性。将这些质粒转染进细胞中并经过短时间(通常24小时)的细胞恢复后，用合适的抗生素处理细胞，使得只有那些已经由质粒赋予了抗生素抗性的细胞能够存活。这通常需要3-4天，取决于细胞类型和使用的抗生素。
结果是，一群细胞存活下来，它们都有抗生素抗性，但是仅仅它们中的一小部分能表达靶RNA。为了筛选出能表达目的RNA的细胞，可以进行下面的方法。
实施例2使用信标筛选细胞
1)将信标转染进细胞中：必须将信标设计成能够通过与RNA的内源序列杂交或通过与添加到天然RNA序列上的标签杂交识别目的RNA。本发明的说明书中详细阐述了信标的设计。
通过非常多样的与将质粒转染进细胞类似的方法，可以实现转染。要根据使用的细胞类型选择所采用的方法，因为有些细胞对一些转染方法的反应比对其它方法的反应更好。应当根据使用的转染试剂的生产商的说明书进行转染。
根据使用的转染试剂，可以在悬浮液中的细胞或生长在固体表面的细胞上将信标转染进细胞中。
2)将信标转染进细胞中以后，然后可以对细胞进行FACS分析。可以用FACS挑选出对任何一种或多种使用的信标呈阳性的细胞。还可以用它根据信标信号的强度挑选出细胞，由此研究人员可以筛选出以不同的程度表达RNA的细胞。
实施例3产生表达一种或多种RNA的细胞系
FACS筛选以后，可以将正分数的细胞维持在合适的培养基中，如本发明的说明书中更详细地描述的。这些细胞会生成能表达目的RNA的细胞系。
信标浓度：要使用的信标浓度取决于多个因素。例如，必须考虑要检测的RNA在细胞中的丰度和该RNA向该信标的可达性。例如，如果要检测的RNA以非常低的量存在，或者发现一部分RNA不能容易地接近(基于RNA的三维折叠)，那么这时应当比要检测的RNA具有较高的丰度和信标要识别的位点能充分地接近的情况使用更多的信标。要使用的信标的确切量必须针对每个用途经验地确定。
这可以通过下述方法实现：将不同量的信标导入到不同的细胞组中，选择背景荧光弱且信号强的条件(在该条件下，不是所有的、但是有一些细胞对信标呈正分数)。

Claims (43)

1.一种产生表达至少一种预选蛋白的细胞系的方法，其包括下述步骤：
a)用至少一种DNA构建体转染细胞系，所述的DNA构建体编码所述的至少一种预选蛋白和至少一种抗药性标记；
b)筛选对药物有抗性的细胞，对该药物的抗性由所述的标记赋予，所述的细胞转录该至少一种DNA构建体和该至少一种抗药性标记；
c)将所述的选出的细胞暴露于第一分子信标，该信标在与所述的至少一种预选蛋白的RNA转录产物杂交后会发出荧光；
d)分离所述的发荧光的细胞；
e)通过培养所述的分离出的细胞，产生表达所述的至少一种预选蛋白的细胞系。
2.如权利要求1的方法，其中分离所述的发荧光的细胞是使用荧光激活细胞分选器技术实现的。
3.如权利要求1的方法，其中所述的细胞系表达第二预选蛋白，所述的步骤还包括：用编码第二预选蛋白和抗药性标记的第二种DNA构建体转染所述细胞系；筛选表达所述的第二种标记的细胞；将所述的细胞暴露于第二种分子信标，该信标在与所述的第二预选蛋白的RNA转录产物杂交后会发出荧光；和分离表现出所述的至少一种和所述的第二种mRNA转录产物中每一种的荧光的细胞。
4.如权利要求3的方法，其中所述的步骤是同时地或依次地进行的。
5.一种产生表达至少一种预选蛋白的细胞系的方法，其包括下述步骤：
a)用至少一种DNA构建体转染细胞系，所述的DNA构建体编码至少一种预选蛋白、至少一种抗药性标记和至少一种第一表位标签；
b)筛选对药物有抗性的细胞，对该药物的抗性由所述的标记赋予，所述的细胞转录该至少一种DNA构建体和该至少一种抗药性标记；
c)将所述的细胞暴露于第一分子信标，该信标在与所述的第一表位标签的RNA转录产物杂交后会发出荧光；
d)分离出所述的发荧光的细胞；
e)通过培养所述的分离出的细胞，产生表达所述至少一种预选蛋白的细胞系。
6.如权利要求5的方法，其中所述的分离所述的发荧光的细胞是使用荧光激活细胞分选器技术实现的。
7.如权利要求5的方法，其中编码所述的表位标签的构建体DNA部分与编码所述的至少一种蛋白的DNA构建体部分在相同读框内。
8.如权利要求5的方法，其中编码所述的表位标签的DNA序列部分与编码所述的至少一种蛋白的DNA序列部分在不同读框内。
9.如权利要求5的方法，其中所述的细胞系表达至少第二预选蛋白，所述的步骤还包括：用编码第二预选蛋白、第二种抗药性标记和第二种表位标签的第二种DNA构建体转染所述细胞系；筛选表达所述第二种标记的细胞；将所述细胞暴露于第二种分子信标，该信标在与第二种表位标签的RNA转录产物杂交后会发出荧光；和分离表现出所述第一种和所述第二种表位标签中每一种的荧光的所述细胞。
10.如权利要求9的方法，其中编码所述的第二种表位标签的DNA序列部分与编码所述的第二种蛋白的DNA序列部分在相同读框内。
11.如权利要求9的方法，其中编码所述的第二种表位标签的DNA序列部分与编码所述的第二种蛋白的DNA序列部分在不同读框内。
12.一种产生表达至少一种预选反义RNA分子的细胞系的方法，其包括下述步骤：
a)用DNA构建体转染细胞系，所述的DNA构建体编码所述至少一种预选反义RNA分子和至少一种抗药性基因；
b)筛选对药物有抗性的细胞，对该药物的抗性由所述的标记赋予，所述的细胞转录所述至少一种DNA构建体和所述至少一种抗药性标记；
c)将所述的细胞暴露于分子信标，该信标在与所述的反义RNA分子杂交后会发出荧光；
d)分离出所述的发荧光的细胞；和
e)通过培养所述的分离出的细胞，产生表达所述的预选反义RNA序列的细胞系。
13.如权利要求12的方法，其中分离所述的发荧光的细胞是使用荧光激活细胞分选器技术实现的。
14.如权利要求12的方法，其中所述的细胞系表达至少一种第二预选反义RNA分子，所述的步骤还包括：用编码第二预选反义RNA分子和第二种抗药性标记的第二种DNA构建体转染所述细胞系；筛选表达所述的第二种标记的细胞；将所述的细胞暴露于第二种分子信标，该信标在与所述的第二反义RNA分子杂交后会发出荧光；和分离表现出所述至少一种和所述第二种mRNA转录产物中每一种的荧光的细胞。
15.一种产生表达至少一种预选反义RNA分子的细胞系的方法，其包括下述步骤：
a)用DNA构建体转染细胞系，所述的DNA构建体编码所述的至少一种预选反义RNA分子、至少一种抗药性标记和第一表位标签核苷酸序列；
b)筛选对药物有抗性的细胞，对该药物的抗性由所述的标记赋予，所述的细胞转录该至少一种DNA构建体和该至少一种抗药性标记；
c)将所述的选出的细胞暴露于第一分子信标，该信标在与所述的第一表位标签的mRNA转录产物杂交后会发出荧光；
d)分离出所述的发荧光的细胞；和
e)通过培养所述的分离出的细胞，产生表达所述的至少一种预选反义RNA分子的细胞系。
16.如权利要求15的方法，其中所述的细胞系表达至少一种第二预选蛋白，所述的步骤还包括：用编码第二预选反义RNA分子和第二种抗药性标记的第二种DNA构建体转染所述的细胞系；筛选表达所述的第二种标记的细胞；将所述的细胞暴露于第二种分子信标，该信标在与所述的第二表位标签的RNA转录产物杂交后会发出荧光；和分离表现出所述的至少一种和所述的第二种mRNA转录产物两者的荧光的细胞。
17.如权利要求16的方法，其中涉及所述的第二种预选蛋白的所述步骤在所述的表达所述第一种反义RNA分子的细胞上进行。
18.分离能表达至少一种蛋白的细胞的方法，其包含下述步骤：
a)提供怀疑表达所述的至少一种蛋白的细胞；
b)将所述的细胞暴露于至少一种分子信标，该信标在与编码所述的至少一种蛋白的mRNA转录产物杂交后会发出荧光；
c)分离出所述的发荧光的细胞。
19.如权利要求18的方法，其中所述的分离发荧光的细胞是使用荧光激活细胞分选器技术实现的。
20.如权利要求18的方法，其中所述的蛋白选自位于细胞表面的蛋白和胞内蛋白。
21.如权利要求18的方法，其中所述的细胞表达第二种蛋白；将所述的细胞暴露于第二分子信标，该信标在与编码所述的第二种蛋白的mRNA转录产物杂交后会发出荧光；分离出具有所述的第一和第二分子信标中每一种的荧光的细胞。
22.定量至少一种RNA转录产物在生物样品中的表达水平的方法，其包括下述步骤：
a)将所述的生物样品暴露于第一分子信标，该信标在与所述的RNA转录产物杂交后会发出荧光；
b)定量所述的生物样品中的荧光水平；和
c)将所述的荧光水平与所述的至少一种mRNA转录产物的所述水平相关联。
23.如权利要求22的方法，其中所述的生物样品选自细胞样品或组织样品。
24.如权利要求22的方法，其中所述的RNA转录产物选自编码蛋白的RNA、结构性RNA和反义RNA。
25.如权利要求22的方法，其中所述的生物样品是固定的。
26.如权利要求22的方法，其中所述的荧光是通过荧光显微术或荧光激活细胞分选器技术定量的。
27.如权利要求21的方法，其中使用在与第二种RNA转录产物杂交后能发荧光的第二分子信标来定量所述生物样品中的至少一种第二RNA转录产物的表达水平。
28.如权利要求21或22的方法，其中所述的表达所述RNA的细胞是使用荧光细胞分选器技术分离的。
29.一种产生过量表达至少一种蛋白的细胞系的方法，其包括下述步骤：
a)用至少两种DNA序列转染细胞，所述序列每一个具有编码所述蛋白、至少一种表位标签和至少一种抗药性标记的部分；和编码所述蛋白、至少一种第二表位标签和至少一种第二抗药性标记的部分；
b)通过表达所述第一和所述第二抗药性标记，筛选用所述至少两种DNA序列转染的细胞；
c)将所述选出的细胞暴露于第一和第二分子信标，每个信标在分别与所述第一和所述第二表位标签的RNA转录产物的核苷酸序列杂交后会发出荧光；
d)分离表现出所述的第一和第二分子信标中每一种的荧光的所述细胞；和
e)通过培养所述分离出的细胞，产生过量表达所述的至少一种预选蛋白的细胞系。
30.如权利要求29的方法，其中所述的至少两种DNA序列位于同一个构建体中。
31.如权利要求29的方法，其中所述第一和所述第二表位标签每一个独立地与所述的蛋白位于相同的或不同的读框内。
32.一种产生过量表达至少一种反义RNA分子的细胞系的方法，其包括下述步骤：
a)用至少两种DNA序列转染细胞，所述序列每种具有编码所述的反义RNA分子、至少一种表位标签和至少一种抗药性标记的部分；和编码所述的反义RNA分子、至少一种第二表位标签和至少一种第二抗药性标记的部分；
b)通过表达所述第一和所述第二抗药性标记，筛选用所述的至少两种DNA序列转染的细胞；
c)将所述的选出的细胞暴露于第一和第二分子信标，每个信标在分别与所述第一和所述第二表位标签的RNA转录产物的核苷酸序列杂交后会发出荧光；
d)分离所述的表现出所述的第一和第二分子信标中每一种的荧光的细胞；和
e)通过培养所述的分离出的细胞，产生过量表达所述的至少一种预选反义RNA分子的细胞系。
33.如权利要求32的方法，其中所述的至少两种DNA序列位于同一个构建体中。
34.如权利要求32的方法，其中所述第一和所述第二表位标签每一个独立地与所述的反义RNA分子位于相同的或不同的读框内。
35.一种产生功能上不表达至少一种预选蛋白的细胞的方法，其包括在所述细胞中提供多种针对所述预选蛋白的反义RNA的步骤，每一种RNA都是根据权利要求12或15提供的，其中所述的多种针对所述至少一种预选蛋白的反义RNA基本上能结合所述的至少一种预选蛋白的全部mRNA转录产物。
36.如权利要求35的方法，其中所述的预选蛋白是基因产物的可替代拼接形式。
37.一种产生转基因动物的方法，所述转基因动物是功能上不表达至少一种预选蛋白的突变体，所述方法包括：使用胚胎干细胞进行权利要求32或35的步骤，确定功能上不表达所述预选蛋白的所述干细胞的生命力，和使用存活的胚胎干细胞生产所述转基因动物。
38.一种产生功能上不表达至少一种蛋白且过量表达至少一种其它蛋白的细胞系的方法，其包括在相同细胞上进行权利要求1或5和权利要求12或15所述的方法。
39.一种通过实施权利要求12或15所述的方法产生在可诱导的启动子控制下表达致死反义RNA的细胞系的方法，其中步骤(a)是在存在最小量的诱导剂的情况下进行的。
40.一种用于鉴定活细胞中的遗传重组事件的方法，其包括下述步骤：
a)将细胞暴露于分子信标，该信标在与从由重组序列转录的RNA序列和由非重组序列转录的RNA序列中选择的RNA序列杂交后会发出荧光；
b)检测所述的表达所述RNA序列的细胞。
41.一种能产生蛋白水解活性的单式杂交探针，它在具有包括检测温度的条件的实验中有用，该温度用于检测至少一种含有预选核酸靶序列的核酸链，所述的探针包含：
单链的靶互补序列，它与靶序列互补；
在靶互补序列侧翼，由共价地连接到所述5′末端的5′臂序列和共价地连接到所述3′末端的3′臂序列组成的寡核苷酸臂对，所述的寡核苷酸臂对形成茎双链体，
包含蛋白水解酶和所述蛋白水解酶的抑制剂的相互作用对，每一对的一个成员连接到5′臂序列且另一个成员连接到3′臂序列，其中所述的抑制剂能够在与所述蛋白水解酶相互作用时灭活所述蛋白水解酶的蛋白水解活性；
在没有所述靶序列存在的所述实验条件下，所述的探针具有特征性的蛋白水解活性，其水平是所述的第一和第二标记部分的相互作用程度的函数，
其中在存在过量的所述靶序列的条件下，靶互补序列与靶序列的杂交会提高所述的特征性蛋白水解活性的水平。
42.如权利要求41的探针，其中所述的蛋白水解酶抑制剂是肽。
43.如权利要求41的探针，其中所述的蛋白水解酶和所述的蛋白水解酶抑制剂选自氨肽酶和抑氨肽酶肽、胰蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶和抗蛋白酶、氨肽酶和佳制酶素、胰凝乳蛋白酶样半胱氨酸蛋白酶和胰凝乳蛋白酶抑制剂、氨肽酶和diprotin A或B、羧肽酶A和EDTA、弹性蛋白酶样丝氨酸蛋白酶和elastinal、和嗜热菌蛋白酶或氨肽酶M和1，10-菲咯啉。
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