CN1175281A - 立体特异性硫代磷酸寡核苷酸的合成 - Google Patents

立体特异性硫代磷酸寡核苷酸的合成 Download PDF

Info

Publication number
CN1175281A
CN1175281A CN 95197690 CN95197690A CN1175281A CN 1175281 A CN1175281 A CN 1175281A CN 95197690 CN95197690 CN 95197690 CN 95197690 A CN95197690 A CN 95197690A CN 1175281 A CN1175281 A CN 1175281A
Authority
CN
China
Prior art keywords
oligonucleotide
primer
rnase
template
ribonucleotide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN 95197690
Other languages
English (en)
Inventor
汤锦炎
阿利森·M·罗斯基
苏迪尔·阿格雷瓦尔
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Aceragen Inc
Original Assignee
Hybridon Inc
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Hybridon Inc filed Critical Hybridon Inc
Publication of CN1175281A publication Critical patent/CN1175281A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Images

Classifications

    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09Recombinant DNA-technology
    • C12N15/11DNA or RNA fragments; Modified forms thereof; Non-coding nucleic acids having a biological activity
    • C12N15/113Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing
    • C12N15/1131Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses
    • C12N15/1132Non-coding nucleic acids modulating the expression of genes, e.g. antisense oligonucleotides; Antisense DNA or RNA; Triplex- forming oligonucleotides; Catalytic nucleic acids, e.g. ribozymes; Nucleic acids used in co-suppression or gene silencing against viruses against retroviridae, e.g. HIV
    • CCHEMISTRY; METALLURGY
    • C12BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12NMICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2310/00Structure or type of the nucleic acid
    • C12N2310/30Chemical structure
    • C12N2310/31Chemical structure of the backbone
    • C12N2310/315Phosphorothioates

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Virology (AREA)
  • AIDS & HIV (AREA)
  • Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种立体特异性(Rp)硫代磷酸寡核苷酸的合成方法。在该方法中,一种包括多个脱氧核糖核苷酸和在5′末端或5′倒数第二位的一个核糖核苷酸的引物与模板退火。该结构与脱氧核苷α-三磷酸Sp非对映异构体和DNA聚合酶的混合物接触,形成一种PS-Rp寡脱氧核苷酸延伸物,该延伸物通过在引物中的核糖核苷酸之后裂解而作为单链PS-Rp寡核苷酸释出。本发明也揭示了依据本方法制备的PS-Rp寡核苷酸和寡核苷酸。

Description

立体特异性硫代磷酸寡核苷酸的合成
发明背景
本发明涉及反义寡核苷酸,尤其涉及的是制备立体特异性硫代磷酸寡核苷酸的方法。
寡脱氧核苷酸的硫代磷酸酯类似物(PS寡核苷酸)已知可用作反义工具(见Agrawal等,(1989),美国国家科学进展86:7990-7794)。这些类似物至少有一个非桥连氧原子在每个核苷酸间磷酸酯连键中的磷酸酯基团上被硫原子所取代。如此修饰是一种可在不显著影响反义分子与靶mRNA杂交的情况下提高核酸酶抗性的保守取代。
PS寡核苷酸可利用亚磷酰胺或H-膦酸酯途径化学合成(综述见:分子生物学方法(Agrawal编辑),卷20,Humana出版社,(1993)Totowa,NJ)。这些制备方法在每个核苷酸间连键中引入了一个手性中心,其能导致每n个核苷酸间连键形成2n个非对映异构体,且通常产生大约40%Rp和大约60%Sp非对映异构体的混合物。
尽管硫代磷酸酯具有许多有用特征,如在杂交时能引发RNase H活性及抑制逆转录酶,且可提高核酸酶抗性,但在硫代磷酸酯产物中Rp和Sp非对映异构体的存在由于一些原因还是有问题的。Rp和Sp非对映异构体具有不同的生物物理性质,如与单链及双链核酸的不同亲和性(见:Cossick等,(1985)生物化学24:3630-3638;Kim等,(1992)FEBS Lett 314:29-32)。因此,在某些情况下只希望制备一种非对映异构体。另外,混合物中两种非对映异构体的存在使PS-寡核苷酸难以通过聚丙烯酰胺凝胶电泳及HPLC互相分开以及与其它无用的反应产物分开,因为,从这些层析方法中所产生的峰比与其相对的磷酸二酯键合的对应物更宽。另外,由于立体性原因,缺少立体特异性部分地导致与磷酸二酯键合的DNA-RNA双链体相比,PS DNA/RNA双链体的解链温度(Tm)较低。(La Planche等,(1986)核酸研究14:9081)。据此,在新药开发中,如此类似物的制备需着手解决立体化学纯度的问题。
这样就需要一种合成硫代磷酸寡核苷酸的立体特异性(Rp或Sp)非对映异构体。
发明概述
一方面,本发明提供了一种硫代磷酸寡核苷酸的立体特异性Rp非对映异构体或异构体的合成方法。本文使用的术语“硫代磷酸寡核苷酸”或“PS-寡核苷酸”是指包括至少5个通过硫代磷酸核苷酸间连键而3′至5′共价键合的核苷酸,且包括Sp和Rp异构体。“PS-Rp寡核苷酸”仅指PS寡核苷酸的立体特异性(Rp)异构体。
根据本发明的方法生产PS-Rp寡核苷酸,是将核苷酸引物与具有5′和3′末端的互补寡脱氧核苷酸模板退火,从而形成部分双链/部分单链结构。引物也具有3′和5′末端并包括互补于模板3′部分的核苷酸序列。引物包括多个脱氧核糖核苷酸和在其3′末端或3′倒数第二位的一个核糖核苷酸。
将部分双链/部分单链结构与脱氧核糖核苷α-三磷酸Sp异构体和DNA聚合酶的混合物接触足够时间,并使其处于有利于互补于模板5′部分的PS-Rp寡脱氧核苷酸的酶促合成的条件下,从而形成一双链产物。在某些实施方案中,脱氧核苷α-三磷酸Sp异构体选自由脱氧鸟苷5′-(α-硫代)三磷酸,脱氧腺苷5′-(α-硫代)三磷酸及脱氧胞苷5′-(α-硫代)三磷酸,胸苷5′-(α-硫代)三磷酸组成的一组。术语“DNA聚合酶”指的是能使一种脱氧核糖核苷的3′末端与另一种脱氧核糖核苷的5′末端共价键合从而合成DNA的任何酶。在一些特殊实施方案中,用DNA聚合酶I,T4 DNA聚合酶,Taq DNA聚合酶或逆转录酶进行合成。
随后,在RNA/DNA交界处之后的核糖核苷酸位置裂解双链产物,这样PS-Rp寡脱氧核苷酸从其引物及模板中释出。在一些实施方案中,当引物中的核糖核苷酸在引物的3′末端位时,裂解发生在引物与新合成的PS-Rp寡核苷酸之间。在其它实施方案中,裂解发生在已延伸为PS-Rp寡核苷酸的引物的3′倒数第二位与3′末端核苷酸之间。
在本发明的某些实施方案中,使用一种内切核酸酶如RNaseA,RNase T1,RNase T2,RNase U2,RNaseN1和RNaseN2进行裂解;而在其它实施方案中,用碱进行裂解。在一些具体实施方案中用于此目的的强碱或碱如卤化物氢氧化物(halide hydroxide)选自氢氧化钠、氢氧化铵、氢氧化锂或氢氧化钾。
本发明的另一方面是根据本发明的方法制备的立体特异性Rp寡核苷酸。
再一方面,本发明包括一种寡核苷酸,其包括多个由至少一个立体特异性Rp硫代磷酸酯核苷酸间连键共价键合的脱氧核糖核苷酸。据信与Sp硫代磷酸酯或Rp与Sp硫代磷酸酯混合物相比,这种立体特异性Rp硫代磷酸寡核苷酸具有较小的促裂原性(mitogenic)。在一实施方案中,所有的脱氧核糖核苷酸都由立体特异性Rp硫代磷酸核苷酸间连键键合。
附图简述
通过参照附图的以下描述,可更加了解本发明的上述和其他目的、特征及发明本身。
图1A是合成立体特异性PS寡核苷酸方案的一个实施方案的图解;
图1B是合成立体特异性PS寡核苷酸方案的另一实施方案的图解;
图2A是表明在牛血清中磷酸二酯(PO),立体特异性硫代磷酸(PS-Rp)寡核苷酸,及合成硫代磷酸(PS)寡核苷酸的核酸酶抗性的放射自显影图;
图2B是表明在人血清中PO,PS-Rp,及PS寡核苷酸的核酸酶抗性的放射自显影图;
图3A是表明在DNA聚合酶I存在下,PO,PS-Rp及PS寡核苷酸的核酸酶抗性的放射自显影图;
图3B是表明在T4 DNA聚合酶存在下,PO,PS-Rp及PS寡核苷酸的核酸酶抗性的放射自显影图;
图4A是表示PS-Rp和PS寡核苷酸与互补DNA和RNA靶经解链温度(Tm)测定的杂交亲和性图解;
图4B是表示PS-Rp和PS寡核苷酸与互补DNA和RNA靶经圆二色性测定的杂交亲和性图解;
图5是表示PS-Rp(◆)和PS寡核苷酸(□)抑制rHIV逆转录酶的能力的图解;
图6是表明PS-Rp和PS寡核苷酸对RNaseH消化作用的敏感性的放射自显影图。
优选实施方案详述
本发明提供了合成立体特异性PS-寡核苷酸的程序,尤其提供了利用酶促法制备立体特异性(全部Rp)硫代磷酸寡核苷酸的程序。这些Rp寡核苷酸呈与蛋白质结合的较弱的亲和性,并据信比其非立体特异性相对物具有较小的促分裂原性。
合成立体特异性PS-寡核苷酸(全部Rp)的程序见图1A和1B。已证实DNA聚合酶在通过单个硫代磷酸酯产生Rp键合进行延伸期间仅使用2′-脱氧核苷酸5′(α-硫代)三磷酸的Sp非对映异构体(Eckstein(1985),生物化学年度综述54:367-402)。但这种延伸仅限于掺入单个硫代磷酸键合。
为进行完整立体特异性分子合成,设计一种具有互补于立体特异性分子合适序列的互补核酸序列的适当模板及一种具有互补于模板3′部分的核酸序列的引物。模板的合成可通过本领域熟知的生产磷酸二酯键合寡核苷酸的任何方法进行,一种如此的方法是应用β-氰乙基亚磷酰胺化学法(Beaucage,寡核苷酸及类似物实用程序,分子生物学方法,卷20(Agrawal编辑)Humana出版社,Totowa,NJ(1993)pp.33-61)。为合成引物,使用核糖核苷亚磷酰胺作为“合成子”或结构单元,掺入如图1所示位置的多个脱氧核苷亚磷酰胺和一个3′-核糖核苷酸,该合成子的引入能使合成的立体特异性寡核苷酸从引物中裂解出。合成后,使用如去硅烷化等的RNA方案进行脱保护。(Damha等,寡核苷酸及类似物实用程序,分子生物学方法,卷20(Agrawal编辑)Humana出版社,Totowa,NJ(1993)pp.81-114)。
根据本发明的方法,引物经本领域熟知的方法如在90℃下加热3分钟,然后在室温下冷却一小时与模板退火,然后延伸引物以形成带有用互补于模板的核酸序列的寡核苷酸。引物的延伸可用任何能进行这种合成的酶,如Taq DNA聚合酶,DNA聚合酶I(Pol I聚合酶),T4 DNA聚合酶及逆转录酶,使用所有四种2’-脱氧核苷5′-(α-硫代)三磷酸或2’-脱氧核苷5′-(α-硫代)三磷酸的类似物来进行,如Eckstein所述(生物化学年度综述(1985)54:367-402)。
延伸后,新合成的立体特异性PS-Rp寡核苷酸经裂解从引物中释出且脱离模板。释出过程的完成是经过以下步骤:在核糖核苷酸处从引物中裂解出PS-Rp寡核苷酸,并使PS-Rp寡核苷酸与其模板解离,该核糖核苷酸可以位于延伸前引物的3′-倒数第2位(图1A)或3′-末端(图1B)。有用的处理包括用能消化RNA的强碱裂解,或用内切核酸酶或其它能在RNA/DNA交界处切割的酶进行裂解。优选的碱包括卤化物氢氧化物如氢氧化钠,氢氧化锂,氢氧化铵、氢氧化钾,最优选的是氢氧化铵或氢氧化钾。有用的酶包括RNase A,RNase T1,RNase T2,RNase U2,RNase N1,RNase N2,这些都是可商购的。
裂解后,通过层析、凝胶电泳、超离心或本领域已知的任何从单链寡核苷酸和双链分子中分离单链寡核苷酸的其它方法将产物提纯,例如在含8M尿素的20%聚丙烯酰胺凝胶上进行的PAGE可用于此目的。含PS-Rp寡核苷酸的条带经例如UV照射定位并切下及脱盐而被提纯。通常如果使用约8纳摩尔引物和2.5纳摩尔模板进行合成,可得到大约1纳摩尔PS-Rp寡核苷酸产物。
本发明的寡核苷酸可用作基因表达的调节剂,例如,为确定一特定基因的功能,本发明的寡核苷酸可在一组织培养系统中靶向该基因并研究这一调节作用的效果。如果目的是测定一特定蛋白质在某生物过程中起的作用,本发明的寡核苷酸可用作一种工具通过靶向编码该蛋白质的核酸抑制该蛋白质的产生,然后观察蛋白被抑制所引起的生物学效应。在此情况下,不是研究的完整的寡核苷酸而是研究抑制蛋白质生产的效应。本发明的寡核苷酸的这种方式的应用提供了一种简易的替代使靶基因突变从而产生一缺失突变体的繁琐方法。
另外,本发明的PS-Rp寡核苷酸,与其手性的Sp对应物一样,可用作磷酸和核苷酸转移酶(phospho and nucleotidyltransferase)的立体化学探针,因为这些寡核苷酸可识别掺入到生长链的一个寡脱氧核苷酸,当生长链的3’-羟基替换焦磷酸酯时识别是通过在核苷酸三磷酸酯的磷上的单键裂解进行,或者如果涉及共价核苷酸酶可通过两键裂解进行(综述见Brody等,(1981)Biochem.20:1245-1252)。
根据本发明的方法制备的PS-Rp寡核苷酸,其相对稳定性可通过将其以及序列可比的PO-及PS-键合的寡核苷酸与核酸酶源如人或牛血清接触进行测定,结果见图2A,示出PS-Rp寡核苷酸在牛血清中温育6小时后甚至24小时后仍存在,而PO寡核苷酸不存在。在人血清中(如图2B所示)温育120分钟后,PS-Rp和PS寡核苷酸仍存在,而PO-键合的寡核苷酸在温育60分钟后就被消化。
当将PO,PS和PS-Rp寡核苷酸与T4 DNA聚合酶I(图3A所示)或DNA聚合酶(图3B所示)温育时,可获得一致的结果。如图3B所示,在DNA聚合酶I存在下温育4小时后,PS和PS-Rp寡核苷酸仍存在,而PO寡核苷酸在1小时后就不存在了。
这些结果表明:PS-Rp寡核苷酸比磷酸二酯键合的寡核苷酸稳定,且与PS寡核苷酸在牛和人血清中及在有DNA聚合酶和T4 DNA聚合酶存在下有类似的稳定性。
对PS-Rp寡核苷酸及合成PS-寡核苷酸与互补DNA和RNA靶的亲和性也进行了比较,用解链温度(Tm)和圆二色性测定。如图4A所示,PS-Rp和PS寡核苷酸对DNA靶呈相同Tm(51.8°和51.9°)。但PS-Rp寡核苷酸与合成PS-寡核苷酸(64.8°)相比对RNA靶具有较高的Tm(68.9°),表明其对其靶有较高的结合亲合性。图4B表明RNA双链体的CD光谱的差异比DNA双链体更明显,这表明RNA靶比DNA靶在杂交时对PS-Rp对PS寡核苷酸的构型变化较为敏感。
作为Rp和Sp非对映异构体混合物存在的PS寡核苷酸的一种已知非序列特异性作用是抑制逆转录酶的酶活性。为检测PS-Rp异构体是否具有与非对映异构体混合物相同的抑制活性,将逆转录酶分别与PS-Rp寡核苷酸和PS寡核苷酸温育,如图5所示,发现PS-Rp寡核苷酸比合成PS寡核苷酸混合物具有更强的抑制逆转录酶的活性。
还将PS-Rp寡核苷酸进行了RNaseH消化作用分析以检测其引发该降解反应的能力是否类似于PS非对映异构体混合物。图6示出PS-Rp寡核苷酸与合成PS-寡核苷酸混合物相比是更好的RNaseH底物。
进一步地,这些寡核苷酸能与互补核酸序列杂交并被细胞吸收。这样,立体特异性PS-Rp寡核苷酸具有与PS寡核苷酸的非对映异构体的Rp+Sp混合物相比即使是未改善的但也是相同的反义特性。
以下实施例示出制备和实施本发明的优选模式,但由于也可利用其它方法获得相似结果因而并不是限制本发明的范围。
实施例
1、PS-Rp寡核苷酸的合成
在30μl 50mM Tris,pH9.0,10mM MgCl2中,将8nmole引物(d-GGTGGCTAGCGTAGr UC,(SEQID No:2)和2.5nmole模板(d-AGAAGGAGAGAGATGGGTGCGAGAGACTACGCTAGCCACC(SEQ ID NO:3))通过在90℃加热3分钟然后在室温下冷却1小时而预退火。将反应体积增加至1.5ml,其含有50mM Tris,pH9.0,10mM MgCl2,5mM DTT,100mM脱氧鸟苷5’-(α-硫代)三磷酸,100mM脱氧腺苷5’-(α-硫代)三磷酸,200mM脱氧胞苷5’-(α-硫代)三磷酸和200mM胸苷5’-(α-硫代)三磷酸。(DuPont-NEN,Boston,MA)。通过加入2500单位的序列级Taq DNA聚合酶(Promega Corp.,Madison,WI)开始反应。将反应混合物在37℃下温育4小时。将反应混合物脱盐并用氢氧化铵溶液(28-30%)在55℃下处理24小时,或用0.3MKOH在37℃下处理1小时。在其它试验中,脱盐后的反应混合物用得自Sigma Chemical Co.(St.Louis,Mo)的RNase A,RNase T1,RNase T2,RNase U2,RNaseN1或RNase N2中的一种在95℃下处理约3分钟。将产物干燥并在20%变性聚丙烯酰胺凝胶中经PAGE提纯。在UV照射下将产物从凝胶中切下并用50mM乙酸铵洗脱并经透析脱盐。如图1所述。
2、PS-Rp寡核苷酸的核酸酶抗性。
如下测试在牛和人血清中磷酸二酯键合的(PO)、有规立构的(PS-Rp),及合成的PS-寡核苷酸(PS)的稳定性。将60pmole的[32P]5’末端标记的寡核苷酸在100μl人血清(Sigma Chemical Co.,St,Louis.Mo)中于37℃温育。在0,30,60及120分钟取20μl等份样品,然后与20μl的20mM Tris,pH7.8,10mM NaCl,10mM EDTA,0.5%SDS及100μg蛋白酶K在65℃下温育1小时。样品用苯酚/氯仿抽提,用乙醇沉淀然后在含20%丙烯酰胺,8.3M尿素的凝胶中用PAGE分析。将凝胶在乙酸/甲醇/水(10∶10∶80,v/v/v)溶液中固定,并在进行放射自显影前干燥3小时。放射自显影图见图2A(牛血清)和2B(人血清)。
进一步的核酸酶抗性比较分析是使用T4 DNA聚合酶和DNA聚合酶(Pol I)。DNA聚合酶I分析是在20μl的含30pmole[32P]-5’末端标记的PO,PS,或PS-Rp寡核苷酸,50mM Tris,pH8.0,5mM MgCl2,5mMDTT,0.05%牛血清白蛋白及5单位DNA聚合酶I(Worthington Biochemical Corp.,Freehold,NJ)的溶液中进行的。在0时间取份样品,其余在37℃下温育,在1、2、4小时取5μl等份样品。在每个时间点的样品中加入6μl终止溶液(95%甲酰胺,10mM EDTA,0.05%溴酚兰,0.05%二甲苯胺)。然后在20%丙烯酰胺,8.3%尿素凝胶中进行PAGE分析样品。结果见图3A。
T4 DNA聚合酶分析是在30μl的含45pmole[32-P]-5’末端标记的PO,PS,或PS-Rp寡核苷酸,50mM Tris,pH8.0,5mMMgCl2,5mM DTT,0.05%牛血清白蛋白及7.5单位T4 DNA聚合酶(Promega,Madison,WI)的溶液中进行的。在0时间取份样品,其余在37℃下温育。在5,15,30及60分钟取郸蹋斓确样品。在每个时间点的样品中加入6μl终止溶液(95%甲酰胺,10mMEDTA,0.05%溴酚兰,0.05%二甲苯胺)。然后在20%丙烯酰胺,8.3%尿素凝胶中进行PAGE分析样品。结果见图3B。
3、解链温度分析
如下进行解链温度(Tm)分析。将1.06×10-6M PS-Rp或PS寡核苷酸置于10mM磷酸盐、100mM NaCl,pH7中,温度范围为30-75℃,用分光光度计(GBC 920,GBC,Victoria,Australia)测量在A260的吸收值。结果见图4A。
4、圆二色性分析
进行圆二色性分析以检测PS-Rp和PS寡核苷酸与互补RNA或DNA序列的相对结合亲合性。将1.06×10-6M的PS-Rp或PS寡核苷酸置于10mM磷酸盐、10mM NaCl,pH7.0中,置于200-320nmUV光下,用分光旋光计(J-710,Jasco,Easton,MD)测量,结果见图4B。
5、rHIV逆转录酶的抑制
为检测PS-Rp寡核苷酸对逆转录酶的相对抑制能力,进行了以下分析。制备10μl反应混合物,其含1mM预退火的[32-P]5’末端标记的引物(d-GATTCAGCTAGTCCA(SEQ ID NO:51))和模板(d-CCAACTGTGATACGATGGACTAGCTGAATC(SEQ ID NO:6)),50mM Tris,pH8.3,10mM MgCl2,50mM KCl,5mM DTT,0.25mM脱氧核苷5’-三磷酸(dNTPs)和各种浓度的寡核苷酸。在加入0.8单位的rHIV逆转录酶(Worthington Biochemical Corp.,Freehold,NJ)后,在37℃下将该混合物温育1小时。用10ml甲酰胺抑制反应然后用20%变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分析。测定延伸产物及剩余引物带的CPMs,计算抑制百分率,结果见图5。
6RNaseH活性分析
将1pmole[32P]-3’末端标记的3 9聚体HIV-I gag RNA(AGAAGGAGAGAGAUGGGUGCGAGAGCGUCAGUAUUAAGC(SEQ ID NO:3)),与10pmole  PS-Rp或PS寡核苷酸在10ml缓冲液(20mM Tris,pH7.5,10mM MgCl2,100mM KCl,0.1mM DTT,5%甘油)中预退火。将反应物用相同缓冲液和40单位RNase H(Boehringer Mannheim Corp.,Indianapolis,IN)增至30ml体积。在0时间取7ml样品。在余下的混合物中加入0.5单位RNase H在37℃下温育15分钟。在1,5,15分钟取7μl等份样品并用10μl甲酰胺猝灭。用20%变性聚丙烯酰胺凝胶进行PAGE分析混合物并放射自显影,结果见图6。
7、活性分析
测定PS-Rp寡核苷酸的活性是通过分析其在H9,MOLT-3或其它细胞中抑制HIV-1表达的能力来进行的。在该分析中,将5×105个细胞/ml用HIV-1毒株HTLV-IIIB或HTLV-IIIC的2.5~5×108个病毒颗粒感染。每个细胞用500-1000个病毒颗粒感染表示感染复数(MOI)为0.5-1。细胞感染的进行是向在含RPMI1640(每毫升含10%(v/v)胎牛血清,2mM谷氨酰胺和250μl庆大霉素)的培养基中在含5%CO2增湿环境下于37℃培养的细胞中同时加入病毒和反义寡聚体。4天后,通过测定合胞体(MOLT-3细胞)和病毒抗原表达及细胞活力检查细胞和上清液以确定HIV-1的表达水平。将细胞研碎后计数MOLT-3细胞中形成的合胞体数目以获得培养物中合胞体的均匀分布。合胞体平均数目通过计数双份培养物中几个区域得到。细胞活力的测定是加入台盼兰,排出染料的细胞计数为存活细胞。HIV-1抗原表达是在甲醇/丙酮固定的细胞中测定的,概括地说,将细胞沉淀,然后以106个细胞/ml的浓度悬浮于磷酸盐缓冲盐水(PBS)中,然后将细胞点到toxoplasmosis玻片上,在空气中干燥并在室温下在甲醇/丙酮(1∶1,v/v)中固定15分钟。接着用10%正常山羊血清在室温下将玻片温育30分钟并用PBS洗四次。在每孔中加入HIV-1p24或p17单克隆抗体及将玻片在37℃增湿环境中温育30分钟。用PBS将玻片洗四次,并在37℃用荧光素异硫氰酸酯标记的山羊抗鼠IgG(Cappel Laboratories,Cochranville,PA)温育30分钟,然后用PBS冲洗过夜。将玻片用Evan′s蓝复染,用PBS冲洗,用50%甘油固定并用Zeiss荧光显微镜检测。比较经寡聚体处理的和未经处理的培养物的细胞荧光百分率。
8、细胞的吸收
将分别在Dulbecco改良的Eagle’s培养基(DMEM)中培养24小时的人293,HeLaS3及NIH3T3亚铺满的细胞或在DMEM/Earle’s平衡盐溶液培养基中生长的MDCK或HEp-2细胞(5×105细胞/ml;共2ml)的培养皿与35S-标记的PS-Rp寡核苷酸温育16小时。如下进行细胞分级分离:将细胞用胰蛋白酶从培养皿中移出并收集(1,500rpm,5min,4℃),用4ml冷磷酸盐缓冲盐水(PBS)洗二次,将细胞在450μl的缓冲液A(10mM Tris-HCl,pH7.4,150mM NaCl,1.5mM MgCl2)和50μl的5%Nonidet P-40(NP-40)中在4℃溶胞10分钟。在2000rpm离心5分钟后,移出上层细胞质部分(结合的胞质溶胶和细胞膜)并将沉淀(核)溶于500μl缓冲液A中并测其放射活性。
本领域技术人员应理解或用常规实验能确定本文所述的具体物质和程序的各种等价物。该等价物被认为包括在本发明范围内且被以下权利要求覆盖。
                   序列表(1)一般信息
(i)申请人:海布里登公司
(ii)发明名称:立体特异性硫代磷酸寡核苷酸的合成
(iii)序列数:6
(iv)通信地址:
    (A)收信人:Lappin & Kusmer
    (B)街道:200 State Street
    (C)城市:Boston
    (D)州:MA
    (E)国家:美国
    (F)邮码:02109
(v)计算机可读形式
    (A)媒介类型:软盘
    (B)计算机:IBM PC兼容机
    (C)操作系统:PC-DOS/MS-DOS
    (D)软件:PatentIn Release#1.0,Version#1.25
(vi)本申请资料
    (A)申请号
    (B)申请日
    (C)分类
(viii)律师/代理人信息
    (A)姓名:Kerner,Ann-Louise
    (B)注册号:33,523
    (C)案号/文档号:HYZ-028PCT
(ix)电讯信息
    (A)电话:617-330-1300
    (B)传真:617-330-1311(2)SEQ ID NO:1信息:
(i)序列特征:
    (A)长度:25碱基对
    (B)类型:核酸
    (C)链性:单链
    (D)拓朴结构:线性
(ii)分子类型;cDNA
(iii)假设:无
(iv)反义:是
(xi)序列描述:SEQ ID NO:1CTCTCGCACC CATCTCTCTC CTTCT                               25(2)SEQ ID NO:2信息
(i)序列特征
    (A)长度:16碱基对
    (B)类型:核酸
    (C)链性:单链
    (D)拓朴结构:线性
(ii)分子类型:cDNA/RNA
(iii)假设:无
(iv)反义:是
(xi)序列描述:SEQ ID NO:2GGTGGCTAGC GTAGUC                                       16(2)SEQ ID NO:3信息
(i)序列特征
    (A)长度:40碱基对
    (B)类型:核酸
    (C)链:单链
    (D)拓朴结构:线性
(ii)分子类型:cDNA
(iii)假设:无
(iv)反义:是
(xi)序列描述:SEQ ID NO:3
AGAAGGAGAG AGATGGGTGC GAGAGACTAC GCTAGCCACC           40(2)SEQ ID NO:4信息
(i)序列特征
    (A)长度:39碱基对
    (B)类型:核酸
    (C)链性:单链
    (D)拓朴结构:线性
(ii)分子类型:RNA
(iii)假设:无
(iv)反义:是
(xi)序列描述:SEQ ID NO:4AGAAGGAGAG AGAUGGGUGC GAGAGCGUCA GUAUUAAGC                39(2)SEQ ID NO:5信息
(i)序列特征
    (A)长度:15碱基对
    (B)类型:核酸
    (C)链性:单链
    (D)拓朴结构:线性
(ii)分子类型:cDNA
(iii)假设:无
(iv)反义:是
(xi)序列描述:SEQ ID NO:5GATTCAGCTA GTCCA                                         15(2)SEQ ID NO:6信息
(i)序列特征
    (A)长度:30碱基对
    (B)类型:核酸
    (C)链性:单链
    (D)拓朴结构:线性
(ii)分子类型:cDNA
(iii)假设:无
(iv)反义:是
(xi)序列描述:SEQ ID NO:6CCAACTGTGA TACGATGGAC TAGCTGAATC                          30

Claims (12)

1、一种合成带有立体特异性Rp硫代磷酸酯(PS)核苷酸间连键的寡核苷酸的方法,包括以下步骤:
(a)将引物与模板退火,从而形成一部分双链/部分单链结构,
   模板具有5’末端和3’末端且包括多个脱氧核糖核苷酸,以及
   引物具有3’末端和5’末端且包括多个脱氧核糖核苷酸和在5’末
   端或5’倒数第二位的一个核糖核苷酸,引物具有互补于模板5’部分的
   核酸序列;
(b)将所述结构与脱氧核糖核苷α-三磷酸Sp非对映异构体和DNA聚
   合酶的混合物接触足够时间,并使其处于有利于互补于模板5′部分的PS
   -Rp寡脱氧核苷酸的酶促合成的条件下,从而形成一双链产物;
(c)在核糖核苷酸之后裂解双链产物,以便PS-Rp寡脱氧核苷酸从模
   板和引物中释出。
2、如权利要求1所述的方法,其中DNA聚合酶选自由T4 DNA聚合酶,DNA聚合酶I,Taq DNA聚合酶,和逆转录酶组成的一组。
3、如权利要求1所述的方法,其中PS-Rp寡脱氧核苷酸是通过用碱或核酸内切酶在核糖核苷酸之后进行裂解而从模板和引物中释出。
4、如权利要求3所述的方法,其中碱是选自氢氧化铵、氢氧化钠,氢氧化锂和氢氧化钾的卤化物氢氧化物盐。
5、如权利要求3所述的方法,其中碱是一种选自RNase A,RNase T1,RNase T2,RNase U2,RNase N1和RNase N2的酶。
6、如权利要求1所述的方法,其中脱氧核糖核苷α-三磷酸Sp非对映异构体选自脱氧鸟苷5’-(α-硫代)三磷酸,脱氧腺苷5’-(α-硫代)三磷酸,脱氧胞苷5’-(α-硫代)三磷酸和胸苷5’-(α-硫代)三磷酸。
7、如权利要求1所述的方法,其中引物中的核糖核苷酸在3’末端。
8、如权利要求1所述的方法,其中引物中的核糖核苷酸在3’倒数第二位。
9、根据权利要求1所述的方法制备的一种PS-Rp寡核苷酸。
10、一种包括至少2个立体特异性Rp硫代磷酸酯的寡核苷酸。
11、一种包括多个由至少一个立体特异性Rp硫代磷酸酯核苷酸间连键共价键合的脱氧核糖核苷酸的寡核苷酸。
12、如权利要求11所述的寡核苷酸,其中所有的脱氧核糖核苷酸都由立体特异性Rp硫代磷酸酯核苷酸间连键键合。
CN 95197690 1994-12-22 1995-12-12 立体特异性硫代磷酸寡核苷酸的合成 Pending CN1175281A (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
US36263194A 1994-12-22 1994-12-22
US08/362,631 1994-12-22

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN1175281A true CN1175281A (zh) 1998-03-04

Family

ID=23426885

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN 95197690 Pending CN1175281A (zh) 1994-12-22 1995-12-12 立体特异性硫代磷酸寡核苷酸的合成

Country Status (6)

Country Link
EP (1) EP0807171A1 (zh)
JP (1) JPH10511267A (zh)
CN (1) CN1175281A (zh)
AU (1) AU4514696A (zh)
CA (1) CA2208528A1 (zh)
WO (1) WO1996019572A1 (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100412085C (zh) * 2002-11-19 2008-08-20 吕联煌 一种Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸抗癌药物及其制备方法与用途
CN107058361A (zh) * 2016-12-28 2017-08-18 苏州旷世骏弛生物科技有限公司 基于核糖核苷酸修饰引物的连接酶非依赖性基因克隆方法
CN112063642A (zh) * 2020-09-04 2020-12-11 湖北大学 一种依赖t5核酸外切酶构建重组质粒的预混液及其应用

Families Citing this family (30)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5932450A (en) * 1995-06-07 1999-08-03 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of oligonucleotides using digestible templates
US5652126A (en) * 1995-06-07 1997-07-29 Gen-Probe Incorporated Use of restriction endonuclease sequences for cleaving phosphorothioate oligonucleotides
US5916777A (en) * 1995-06-07 1999-06-29 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of oligonucleotides using 3'-ribonucleotide primers
CA2222510A1 (en) * 1995-06-07 1996-12-19 Gen-Probe Incorporated Template and primer based synthesis of enzymatically cleavable oligonucleotides
US5739311A (en) * 1995-06-07 1998-04-14 Gen-Probe Incorporated Enzymatic synthesis of phosphorothioate oligonucleotides using restriction endonucleases
US5856462A (en) * 1996-09-10 1999-01-05 Hybridon Incorporated Oligonucleotides having modified CpG dinucleosides
AU8512598A (en) * 1997-07-25 1999-02-16 Hybridon, Inc. Oligonuclotides having 3' terminal stereospecific phosphorothioates
CA2323929C (en) 1998-04-03 2004-03-09 University Of Iowa Research Foundation Methods and products for stimulating the immune system using immunotherapeutic oligonucleotides and cytokines
DE19815864A1 (de) * 1998-04-08 1999-10-14 Europ Lab Molekularbiolog 5'-modifizierte Nukleotide und ihre Anwendung in der Molekularbiologie und Medizin
WO2000006588A1 (en) * 1998-07-27 2000-02-10 University Of Iowa Research Foundation STEREOISOMERS OF CpG OLIGONUCLEOTIDES AND RELATED METHODS
US6867289B1 (en) 1998-10-26 2005-03-15 Board Of Regents, The University Of Texas Systems Thio-modified aptamer synthetic methods and compositions
US6951722B2 (en) 1999-03-19 2005-10-04 Takara Bio Inc. Method for amplifying nucleic acid sequence
US20030162190A1 (en) * 2001-11-15 2003-08-28 Gorenstein David G. Phosphoromonothioate and phosphorodithioate oligonucleotide aptamer chip for functional proteomics
CA2502610A1 (en) 2002-10-16 2005-01-13 Board Of Regents Of The University Of Texas System Bead bound combinatorial oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer libraries
EP1635765B1 (en) 2003-05-23 2013-07-17 Board Of Regents, The University Of Texas System Structure based and combinatorially selected oligonucleoside phosphorothioate and phosphorodithioate aptamer targeting ap-1 transcription factors
CA2660232C (en) 2006-08-08 2019-05-21 Gunther Hartmann Structure and use of 5' phosphate oligonucleotides
JP5689413B2 (ja) 2008-05-21 2015-03-25 ライニッシュ フリードリッヒ−ウィルヘルムズ−ユニバーシタット ボン 平滑末端を有する5’三リン酸オリゴヌクレオチドおよびその使用
BRPI0923225A2 (pt) 2008-12-02 2016-10-04 Chiralgen Ltd metodo para sintese de acidos nucleicos modificados no atomo de fosforo
KR101885383B1 (ko) 2009-07-06 2018-08-03 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 신규한 핵산 프로드러그 및 그의 사용 방법
JP5868324B2 (ja) 2010-09-24 2016-02-24 株式会社Wave Life Sciences Japan 不斉補助基
EP2508530A1 (en) 2011-03-28 2012-10-10 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Purification of triphosphorylated oligonucleotides using capture tags
CN103796657B (zh) 2011-07-19 2017-07-11 波涛生命科学有限公司 合成官能化核酸的方法
SG11201500239VA (en) 2012-07-13 2015-03-30 Wave Life Sciences Japan Asymmetric auxiliary group
EP2873674B1 (en) 2012-07-13 2020-05-06 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant
EP4219516A3 (en) 2012-07-13 2024-01-10 Wave Life Sciences Ltd. Chiral control
EP2712870A1 (en) 2012-09-27 2014-04-02 Rheinische Friedrich-Wilhelms-Universität Bonn Novel RIG-I ligands and methods for producing them
JPWO2015108048A1 (ja) 2014-01-15 2017-03-23 株式会社新日本科学 抗腫瘍作用を有するキラル核酸アジュバンド及び抗腫瘍剤
WO2015108047A1 (ja) 2014-01-15 2015-07-23 株式会社新日本科学 免疫誘導活性を有するキラル核酸アジュバンド及び免疫誘導活性剤
US10322173B2 (en) 2014-01-15 2019-06-18 Shin Nippon Biomedical Laboratories, Ltd. Chiral nucleic acid adjuvant having anti-allergic activity, and anti-allergic agent
KR102423317B1 (ko) 2014-01-16 2022-07-22 웨이브 라이프 사이언시스 리미티드 키랄 디자인

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2121144C (en) * 1991-10-15 2001-07-31 Phillip Dan Cook Oligonucleotides having chiral phosphorus linkages

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN100412085C (zh) * 2002-11-19 2008-08-20 吕联煌 一种Bcl-2反义硫代磷酸寡脱氧核苷酸抗癌药物及其制备方法与用途
CN107058361A (zh) * 2016-12-28 2017-08-18 苏州旷世骏弛生物科技有限公司 基于核糖核苷酸修饰引物的连接酶非依赖性基因克隆方法
CN112063642A (zh) * 2020-09-04 2020-12-11 湖北大学 一种依赖t5核酸外切酶构建重组质粒的预混液及其应用

Also Published As

Publication number Publication date
EP0807171A1 (en) 1997-11-19
JPH10511267A (ja) 1998-11-04
AU4514696A (en) 1996-07-10
WO1996019572A1 (en) 1996-06-27
CA2208528A1 (en) 1996-06-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN1175281A (zh) 立体特异性硫代磷酸寡核苷酸的合成
US11768200B2 (en) Methods for maintaining the integrity and identification of a nucleic acid template in a multiplex sequencing reaction
US20190284613A1 (en) Plurality of transposase adapters for dna manipulations
CN1269959C (zh) 用于从福尔马林固定的石蜡包埋的组织样品中分离rna的方法
CN1073160C (zh) 灵敏检测核酸的方法
EP3904514A1 (en) Single cell whole genome libraries and combinatorial indexing methods of making thereof
CN1128884C (zh) 有效进行核酸测序的方法和组合物
JP2021166514A5 (zh)
CN1309717A (zh) 无细胞嵌合体制备技术和异源双螺旋突变载体的真核应用
CN1232509A (zh) 催化性核酸及其医学用途
CN1580283A (zh) 一种检测核酸分子的方法
JPH07500735A (ja) メッセンジャーrnaの同定、単離およびクローニング
CN1319142A (zh) 酶原性核酸的检测方法,以及相关分子和试剂盒
JP2006523465A5 (zh)
US20210301329A1 (en) Single Cell Genetic Analysis
CN1688693A (zh) 使用结合mRNA的探针筛选和分离活细胞
EP3902922A1 (en) Method and kit for preparing complementary dna
US20170051342A1 (en) Chemically-enhanced primer compositions, methods and kits
CN107488655B (zh) 测序文库构建中5’和3’接头连接副产物的去除方法
CN1620503A (zh) 细胞内制备单链dna
CN1154141A (zh) Dna片断和含有该dna片断的重组载体以及应用其之后外源基因的表达方法
JP2023542976A (ja) カーゴヌクレオチド配列を転位させるための系および方法
CN116497019A (zh) 一种可提高体外合成rna产量的转录缓冲液及转录反应体系
CN113817778B (zh) 一种利用核仁素增强mRNA稳定表达的方法
CN1325456A (zh) 分析dna修复的方法和测定试剂盒

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C01 Deemed withdrawal of patent application (patent law 1993)
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication