KR19990022596A - 효소적으로 절단 가능한 주형 및 시발체 기제 올리고뉴클레오티드의 합성 - Google Patents

효소적으로 절단 가능한 주형 및 시발체 기제 올리고뉴클레오티드의 합성 Download PDF

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나니브후산 다타굽타
다니엘 루이스 캐시앙
데이빗 브루스 락키
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다니엘 엘. 캐시앙, 헨리 엘. 노르호프
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Abstract

본 발명은 키랄 순수한 올리고뉴클레오티드를 효소적으로 합성하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 임의로 두 개 이상의 개개 올리고뉴클레오티드로 절단될 수 있는 올리고뉴클레오티드 산물의 합성을 지시할 수 있는 임의로 분해 가능한 주형과, 임의로 3'-리보뉴클레오티드 시발체를 사용하여 올리고뉴클레오티드를 효소적으로 합성하는 방법에 관한 것이다. 이 방법에서, 동일 또는 상이한 길이 및/또는 서열을 갖는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드가 동시에 합성될 수 있다. 상기 올리고뉴클레오티드는 임의로 하나 이상의 포스포로티오에이트 결합을 가지며, 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드내에서 절단 가능한 것으로 본 발명에서 확인된 어떤 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위를 함유하므로, 합성후 올리고뉴클레오티드의 분리 및 정제를 용이하게 한다.

Description

효소적으로 절단가능한 주형 및 시발체 기제 올리고뉴클레오티드의 합성
핵산은 포스포디에스테르 결합에 의해 서로 공유결합된 개개 뉴클레오티드 하부단위로 이루어진 선형 중합체이다. 현재 올리고뉴클레오티드는 핵산 서열 분석 시발체, 진단 프로브 및 유전자 기능의 조절인자로서 생의학 분야에서 널리 사용되고 있다. 올리고뉴클레오티드의 가장 유망한 용도 중 하나는 안티센스(antisence) 치료분야에 있다.
올리고뉴클레오티드는 효소적 또는 화학적 방법을 사용하여 합성할 수 있는데, 후자는 전자보다 일반적으로 대규모 생산에 사용된다. 가장 널리 사용되는 올리고뉴클레오티드의 화학적 합성 방법 중 하나는 포스포라미디트 고상(固狀) 화학에 기초한다[Method in Molecular Biology, 제20권: Protocols for Oligonucleotides and Analogs, S. Agrawal editor, Humana Press Inc., Totowa, N.J., 제437-463면 (1993) 참조]. 이 방법은 현재 완전히 자동화되어 화학적으로 상업적인 양의 올리고뉴클레오티드를 생산하는데 사용될 수 있다 [Oligonucleotides and Analogues: A Practical Approach. Edited by F. Eckstein, I.R.L. Press, Oxford, England, 1-24 (1991) 참조].
화학적 합성의 편리성에도 불구하고, 단계들의 수 및 관여되는 화학물질의 거칠음으로 인하여 손상된 뉴클레오티드 염기와 같은 독성이 있는 화학적 불순물이 함유될 수 있다. 대개, 불순물의 수준은 비교적 낮기 때문에, 아직도 화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드가 많은 상이한 용도에 적합하다. 그러나, 어떤 용도에서는 실질적으로 화학적 불순물이 없는 생성물을 요한다. 특히, 상기 용도가 생물학적 시스템과 관련이 있을 때, 화학적 불순물의 존재는 유해한 효과를 가질 수 있다. 더욱이, 상기 용도가 생체내 치료제와 관련이 있을 때, 화학적 순도는 필수적이다. 효소적 합성은 독성 화학 불순물 및 위험한 부산물이 전혀 없는 수용액에서 올리고뉴클레오티드 제품을 생산하기 위하여 사용될 수 있는 것이므로 이들 용도에 바람직하다.
생물학적 시스템에서 올리고뉴클레오티드의 사용은 또한 포스포디에스테르 결합을 가수분해하여 핵산의 분해를 촉매하는 뉴클레아제의 존재하에 행해진다[The Biochemistry of the Nucleic Acids: 제4장, Degradation and Modification of Nucleic Acids, Roger L.P. Adams et al., Chapman Hall, London, England, 97-108 (1992) 참조]. 이와 같은 분해로 인하여 생체내에서 올리고뉴클레오티드의 생물학적 활성이 상당히 감소할 수 있고, 따라서, 치료 효과가 감소된다. 이 분해는 포스포디에스테르 결합을 포스포트리에스테르, 포스포로티오에이트 또는 메틸포스포네이트와 같은 좀더 뉴클레아제-내성 유사체로 개질하거나 치환함으로써 조절될 수 있다.
포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드는 많은 뉴클레아제에 의한 분해에 효율적인 내성을 가지므로 일부 생물학적 시스템에 사용하기에 바람직하다. 포스포로티오에이트 결합은, 인과 결합하는 다리를 형성하지 않는 원자들 중 하나로서 산소 대신에 황을 갖는다. 이 치환이 인에서 키랄성을 형성하며, 이것은 Rp 또는 Sp의 어느 하나의 디아스테레오머 배향을 갖는 것으로 표시된다. 키랄성 배향은 이중 구조, 효소 인식, 배열 상태 및 또는 혼성화 반응과정에 영향을 미치는 중요한 요소이기 때문에, 키랄성으로 순수한 포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드를 사용하는 것이 바람직하다. 포스포트리에스테르 및 메틸포스포네이트 결합을 함유하는 것들과 같은 다른 개질된 올리고뉴클레오티드도 또한 인과 결합하는 산소 원자 중 하나를 치환시키므로 디아스테레오머로 존재한다.
포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드의 화학 합성은 입체 선택성을 결하고 있으므로 2 종의 상이한 키랄성의 이질 혼합물을 생성한다. 키랄성으로 순수한 올리고뉴클레오티드의 합성을 입체화학적으로 조절하려는 시도는 부분적으로는 성공하였다[Stec, et al., Nucleic Acids Research, 19(21): 제5883-5888면 (1991) 참조]. 쿡크 (미합중국 특허 제5,212,295호)는 75% 보다 높은 키랄성 순도를 갖는 개질된 올리고뉴클레오티드의 화학 합성을 기술하고 있다. 대조적으로, 포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드의 효소적 합성은 여러 중합효소가 Rp 배향을 갖는 포스포로티오에이트 결합만을 형성하기 때문에 키랄성으로 순수한 물질을 생산하는데 사용할 수 있다[Eckstein, Ann. Rev. Biochem. 54: 제367-402면 (1985) 참조].
다른 개질된 올리고뉴클레오티드의 효소적 합성은 또한 당업계에 잘 알려져 있다. 메틸포스포네이트-함유 올리고뉴클레오티드는 사람의 췌장으로부터 얻은 DNA 중합효소 α 및 ε, 쥐의 간으로부터 얻은 DNA 중합효소 β, 및 HIV 및 아비안 미엘로블라스토시스(avian myeloblastosis) 바이러스로부터 얻은 역전사효소를 사용하여 효소적으로 제조할 수 있다[Dyatkina, et al., Nucleic Acids Research Symposium Series 24: 제238면 (1991) 참조].
개질된 여부에 관계없이, 임의의 올리고뉴클레오티드의 경제적인 효소적 합성은 목적하는 용도상 충분히 순수한 생성물을 제조하기 위한 합성 반응의 성분을 효율적으로 이용하는 능력에 달려있다. 어떤 예에서는, 반복적으로 작용할 수 있는, 따라서 재사용 가능한 합성 성분을 사용하는 것이 바람직하다. 예를 들면, 리차드 등(국제 특허 출원 공개 제92/05287호)은 동일한 합성 반응에서 반복적으로 작용하는 재사용가능한 합성 주형의 사용을 개시하고 있다. 다른 예에서는, 합성 반응에서 단지 한번만 작용하고 그후에는 분해되거나 또는 작용하지 않게 되는 합성 성분을 사용하는 것이 바람직하다. 발더 등(유럽 특허 출원 제496,483A2호)은 이후의 합성 반응에서 원치않는 물질의 증폭 형성을 방지하기 위하여, 분해되는 RNA-함유 시발체의 사용을 기술하고 있다.
비록 많은 선행 방법들이 올리고뉴클레오티드의 효소적 합성에 사용하기에 적합하다 할지라도, 키랄성으로 순수한 올리고뉴클레오티드의 대량 생산은 여전히 최적화되어야만 한다. 그러므로, 본 발명의 목적은 키랄성으로 순수한 올리고뉴클레오티드의 경제적인 합성을 제공하는 것이다.
본 발명은 간편하고 경제적인 올리고뉴클레오티드의 효소적 합성 방법에 관한 것이다. 3'-리보뉴클레오티드 시발체를 사용함으로써, 시발체로부터 효소적으로 합성한 올리고뉴클레오티드의 분리가 크게 용이해지고 기능적인 시발체가 재생가능하여 이후의 합성 반응에 사용할 수 있다.
포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드를 화학적으로 또는 효소적으로 합성하는 가에 관계없이, 그들은 가수분해에 대한 내성을 가지므로 용이하게 절단되지 않아서, 합성 및/또는 정제하는 동안에 때때로 바람직하다. 포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드 및 제한 엔도뉴클레아제에 관한 대부분의 연구는 분해로부터 보호되는 올리고뉴클레오티드의 설계에 집중되어 있다[Nakamaye, et al., Nucleic Acids Research 14 (24): 제9679-9699면 (1986); Richards et al., (상술); 및 Vosberg, et al., Journal of Biol. Chem, 257 (11): 제6595-6599면 (1982) 참조].
따라서, 본 발명은 합성후 임의로 절단가능한 반복적인 서열을 갖는 주형 즉, 분해가능한 주형을 이용하여, 간편하고 경제적인 키랄성으로 순수한 올리고뉴클레오티드의 효소적 합성 방법에 관한 것이다. 이들 주형 각각은 주어진 올리고뉴클레오티드를 다수 합성하도록 지시할 수 있다. 나아가, 제한 엔도뉴클레아제 인식 영역을 합성된 산물내로 도입할 수 있다. 목적하는 올리고뉴클레오티드 산물을 효소적으로 합성한 후, 주형 분해 및/또는 생성물 분해는 합성된 올리고뉴클레오티드의 단리 및 정제를 훨씬 용이하게 하였다.
별법으로, 3'-리보뉴클레오티드 시발체는 올리고뉴클레오티드의 합성에 이용할 수 있다. 이는 효소적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 시발체로부터 분리하는 것을 훨씬 용이하게 하였고, 이후의 합성 반응에서 사용할 수 있는 기능적인 시발체를 재생가능하게 하였다.
부가적으로, 본 발명은 완전히 포스포로티오화된 올리고뉴클레오티드로 존재하는 경우조차도, 제한 엔도뉴클레아제에 의해 인식되어 절단될 수 있는 여러 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열 (제한 서열)의 동정에 관한 것이다. 이는 부분적으로 또는 완전히 포스포로티오화된 올리고뉴클레오티드의 효소적 합성을 가능하게 하여 주며, 상기 올리고뉴클레오티드는 이들 제한 서열이 혼입되었을 때, 단리 및 정제에 있어서 상기 확인된 이점을 갖는다. 그밖에, 본 발명은 다른 기본적인 분자생물학 방법에 유용한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 일반적인 분해 방법을 제공한다.
본 명세서에 기재된 참조 문헌중 어느 것도 선행 기술로 인정되지 않는다.
발명의 요약
본 발명은 임의로 두 개 이상의 개개 올리고뉴클레오티드로 절단될 수 있는 올리고뉴클레오티드 산물의 합성을 지시할 수 있는 임의로 분해 가능한 주형을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법에 관한 것이다. 나아가, 이 주형은 임의로 절단될 수 있으며 이후 합성 반응에서 재사용할 수 있다. 본 발명의 방법은 일반적으로 (a) 시발체 결합 영역, 및 임의로 하나 이상의 하부지역을 함유하여 동일 또는 상이한 길이 및/또는 서열을 갖는 2 이상의 올리고뉴클레오티드의 합성을 지시하도록, 올리고뉴클레오티드와 상보적인 영역을 함유하는 핵산 주형을 제공하고, (b) 상기 주형 및 이와 혼성화할 수 있는 핵산 시발체를 접촉시켜 주형-시발체 혼성체를 제조하고, (c) 상기 주형-시발체 혼성체를 DNA 합성이 일어나 시발체의 연장 산물이 제조되는 조건하에서 하나 이상의 DNA 중합효소의 존재하에 배양하고, (d) 시발체 신장 산물을 분해하여 올리고뉴클레오티드로부터 시발체 및 올리고뉴클레오티드들을 서로 분리하고, (e) 임의로는 단계 (d)로부터 회수한 시발체로 단계 (b) 및 (c)를 1회 이상 반복하고, (f) 단계 (d) 또는 (e)에 앞서, 동시에 또는 후에 임의로 상기 주형을 분해하는 단계를 포함한다.
주형은 DNA 또는 RNA일수 있으나, 바람직하게는 RNA이다. 각 주형은 2가지 영역 즉, 시발체 결합 영역 (또는 자가-시발 주형의 경우는 자가-상보적인 영역) 및 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역을 함유한다. 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역은 개별적으로 올리고뉴클레오티드의 합성을 지시하도록 2 개 이상의 하부영역(subregion)를 가지며 이들 각각은 동일 또는 상이한 핵산 서열을 가져도 좋다. 이 방법에 있어서, 동일 또는 상이한 길이 및/또는 서열을 갖는 올리고뉴클레오티드가 동일한 주형으로부터 제조될 수 있다.
시발체는 주형과 결합할 때 주형-시발체 혼성체를 형성한다. 별법으로는, 자가-시발 주형을 사용하는 경우는 별도의 시발체를 공급할 필요는 없고, 자가-시발 주형의 3'-말단이 시발체로서 작용한다.
특히 유용한 시발체는, 시발체 신장 산물에 혼입되었을 때 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들(즉, 올리고뉴클레오티드 산물)로부터 시발체를 분리하기 위한 간편한 절단 부위로서 작용할 수 있는 하나 이상의 절단가능한 뉴클레오티드 결합을 함유하거나 형성한다.
주형-시발체 혼성체, 또는 자가-시발 주형은 뉴클레오티드 또는 개질된 뉴클레오티드를 순차적으로 첨가함으로써 시발체 신장 산물의 합성을 지시한다. 개질된 뉴클레오티드의 사용은 핵산분해 효소에 내성인 개질된 올리고뉴클레오티드를 제조하는데 바람직하다.
올리고뉴클레오티드 산물로부터 시발체를 분리하기 위한 시발체 신장 산물의 절단은 하나 이상의 절단가능한 뉴클레오티드간 결합을 함유하거나 형성하는 시발체를 사용함으로써 용이해질 수 있다. 그와 같은 시발체는 예를 들면, 알칼리 가수분해 및/또는 RNA 분해효소 분해에 민감한 절단 가능한 결합을 형성하는 3'-리보뉴클레오티드 시발체이다.
3'-리보뉴클레오티드 시발체는 그들의 3'-말단에 또는 그에 가까운 곳에 하나 이상의 리보뉴클레오티드를 갖는 DNA로 구성된다. 올리고뉴클레오티드의 효소적 합성에서 시발체로서 사용되었을 때, 그들은 시발체와 합성된 산물 사이에 합성 산물로부터 시발체를 분리하기 위한 간편한 절단 부위로서 작용하는 적어도 하나의 절단가능한 뉴클레오티드 결합을 형성한다. 바람직하게는, 3'-리보뉴클레오티드 시발체는 3'-말단에 하나의 리보뉴클레오티드를 함유한다. 절단 후, 시발체의 3'-OH 말단은 포스파타제를 사용하여 재생될 수 있고, 시발체는 이후의 합성 반응에서 사용될 수 있다.
별법으로는, 그 3'-말단에 디옥시우리딘 잔기를 갖는 DNA가 시발체로 사용되었을 때, 시발체 신장 산물은 DNA 글리코실라제, AP-엔도뉴클레아제 및 엑소뉴클레아제의 조합을 사용하여 디옥시우리딘 잔기를 제거함으로써 절단될 수 있다. 절단은 또한 적어도 하나의 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열(즉, 제한 서열)을 함유하는 시발체 신장 산물의 합성을 지시하는 주형을 사용함으로써 용이해질 수 있다.
부가적으로, 올리고뉴클레오티드에 상보적인 주형 영역이 각각 개개 올리고뉴클레오티드의 합성을 지시하도록 고안된 2 이상의 하부영역을 함유하는 경우, 시발체 신장 산물에 제한 서열을 혼입하는 것은 절단부위를 올리고뉴클레오티드 산물내로 위치시켜 개개 올리고뉴클레오티드의 분리를 용이하게 하기 위한 것이다. 이어서, 개개 올리고뉴클레오티드를 서로 분리하기 위하여 적절한 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 절단을 행한다.
본 발명의 올리고뉴클레오티드는 포스포로티오에이트 결합을 사용하여 합성할 수 있다. 본발명의 다른 면은 어떤 제한 엔도뉴클레아제에 의해서 완전히 포스포로티오화된 올리고뉴클레오티드(포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드)로 존재하는 경우 조차도 인식되어 절단될 수 있는 여러 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열(제한 서열)의 발견에 기초한 것이다. 따라서, 본 발명은 특정 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 미리 정해진 절단부위에 제한 서열을 함유하는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 절단하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 다음의 제한 서열 및 제한 엔도뉴클레아제 조합 즉, 5'-GGCC-3' 및 Hae III, 5'-GCGC-3' 및 HinP I, 5'-CCNGG-3' 및 ScrF I, 및 5'-TCGA-3' 및 TaqαI을 사용하는 것에 관한 것이다.
시발체 신장 산물이 부분적으로 또는 완전히 포스포로티오화된 올리고뉴클레오티드일 때, 이들 제한 서열들 중 적어도 하나는 절단부위를 형성하기 위하여 연장 산물내로 혼입된다. 주형의 분해가 주형으로부터 시발체 신장 산물을 분리하기 위하여 사용될 때, 올리고뉴클레오티드 산물로부터 시발체 및, 필요한 경우, 개개 올리고뉴클레오티드를 서로 분리하기 위한 절단은 주형 분해전, 중 또는 후에 일어날 수 있다. RNA 주형의 분해는 알칼리 분해 및/또는 적절한 RNA 분해효소로 수행될 수 있다. DNA 주형의 분해는 적절한 DNA 분해효소를 사용하여 수행될 수 있다.
본 발명은 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법에 관한 것이다. 특히, 본 발명은 주형 및/또는 3'-리보뉴클레오티드 시발체를 이용하여 효소적으로 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법에 관한 것이다. 부가적으로, 본 발명은 제한 엔도뉴클레아제에 의한 포스포로티오에이트-함유 핵산의 효소적 분해에 관한 것이다.
하기 도면에서 사용된 것처럼, 약어는 다음의 의미를 가질 것이다.
pbr = 시발체 결합 영역
ocr = 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역
sr = 하부영역
cs = 절단 부위
scr = 자가 상보적인 영역
R = 리보뉴클레오티드
도1은 각각 시발체 결합 영역 및 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역을 함유하는 여러 상이한 주형 구조를 예시한다.
도2는 각각 시발체 결합 영역 및 3 개의 분리된 하부영역으로 구성된 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역을 함유하는 여러 상이한 주형 구조를 예시한다.
도3은 절단되어 2개의 분리된 주형을 형성하는 주형 전구체의 사용을 예시하고 있다.
도4는 자가-시발 주형을 사용하는 올리고뉴클레오티드의 효소적 합성을 예시한다.
도5는 시발체/주형의 조합을 사용하는 올리고뉴클레오티드의 효소적 합성을 예시한다.
도6은 3'-리보뉴클레오티드 시발체를 사용하는 올리고뉴클레오티드의 효소적 합성을 예시한다.
도7은 1종 이상의 절단 부위를 함유하는 시발체 신장 산물을 사용하는 단일 주형으로부터 2 이상의 올리고뉴클레오티드의 효소적 합성을 예시한다. 상기 절단부위 중 하나는 3'-리보뉴클레오티드 시발체를 사용함으로써 시발체 신장 산물내로 도입된 리보뉴클레오티드 잔기의 3'에 있는 인산 결합이고 다른 하나는 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열이다.
본 발명의 대상을 좀더 명확히 기술하기 위하여, 본 명세서에 사용된 임의의 용어를 달리 표시하지 않는 한 다음과 같이 정의한다.
키랄성 순수: 포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드를 언급할 때 사용되는 키랄성 순수란 용어는 올리고뉴클레오티드가 단지 Rp 또는 Sp 디아스테레오머만을 함유하는 것을 의미한다.
절단 부위: 절단 부위란 핵산의 당-인산 골격에 있는 하나 이상의 천연 또는 개질된 포스포디에스테르 결합 중 가수분해에 민감한 핵산중의 위치를 의미한다. 제한 엔도뉴클레아제 인식 부위와 관련하여 사용될 때, 절단 부위라는 용어는 절단하고자하는 서열에 결합하는 제한 엔도뉴클레아제가 특이적으로 인식하는 뉴의 서열 중에서 절단 가능한 결합(/로 표시)을 의미한다. 예를 들면, 서열 GGCC는 Hae III가 인식하고절단은 GG/CC에서 일어난다. 본 명세서에서 사용된 것처럼, 절단 부위는 또한 RNA 분해효소 또는 알칼리와 같은 물질에 의한 절단에 민감한 리보뉴클레오티드의 3'에 있는 결합을 의미한다.
절단: 절단이란 엔도뉴클레아제 또는 다른 절단제를 사용하여 올리고뉴클레오티드의 당-인산 골격을 파괴하는 것을 의미한다.
상보적: 핵산과 관련하여 사용될 때, 상보적이란 용어는 그 염기들이 반대의 극성을 갖는 또다른 핵산의 뉴클레오티드 염기들과 결합하는[즉, 아데닌(A)은 티민(T) 또는 우라실(U)과 결합하고 구아닌(G)은 시토신(C)과 결합] 뉴클레오티드 서열을 함유하는 한방향의 극성을 갖는 핵산을 의미한다. 예를들면, 5'에서 3' 방향으로 서열 GCAU를 갖는 핵산은 3'에서 5' 방향으로 서열 CGTA를 갖는 핵산과 상보적이다. 본 명세서에서, 상보적이라는 용어는 실질적으로 상보적인 핵산들을 포함하는 것으로 사용된다. 상보적인 핵산은 또한 하나는 플러스((+)) 또는 센스 사슬이고 다른 하나는 마이너스((-)) 또는 안티센스 사슬로서 언급될 수 있다.
디아스테레오머: 디아스테레오머란 포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드의 경우에 있어서, 키랄 인에 대한 황의 배향에 따라 2 가지 상이한 키랄종으로서 존재할 수 있는 키랄 화합물을 의미한다. 두가지 가능한 배향은 Rp 및 Sp이므로 키랄종은 Rp 또는 Sp 디아스테레오머로서 언급된다.
분해: 분해란 핵산을 그의 개개 뉴클레오티드로 분해(완전 분해)하거나 또는 짧은 단편으로 분해(부분 분해)하는 것을 의미한다.
dNTP: dNTP란 디옥시리보뉴클레오시드 삼인산을 의미하는 것으로, N은 뉴클레오티드 염기를 말한다. 즉, dATP는 디옥시아데노신 삼인산을, dCTP는 디옥시시토신 삼이산을 의미한다. dNTP 또는 뉴클레오티드라는 용어는 디옥시뉴클레오시드 트리포스포로티오에이트 및 디옥시뉴클레오시드 메틸포스포네이트와 같은 개질된 α 결합을 갖는 디옥시뉴클레오시드 삼인산뿐만 아니라 비개질된 디옥시뉴클레오시드 삼인산을 포함하는 것을 뜻한다.
dNTPαS: dNTPαS란 α-위치의 인에 있는 산소가 황 원자로 치환된 디옥시뉴클레오시드 삼인산을 의미하며, N은 dNTP에서 정의한 바와 같다.
헤어핀: 헤어핀이란 사슬내의 상보적인 두 영역이 루프가 되도록 비상보적인 영역에 의하여 분리된 채 이중구조를 형성할 때, 자가-시발 주형이 취하는 루프형의 자가 혼성화된 구조를 의미한다. 도4 참조.
혼성화: 혼성화란 실질적으로 상보적인 뉴클레오티드 서열간에 안정한 이중 구조의 형성을 의미한다.
개질된: 핵산과 관련하여 사용될 때, 개질된이란 임의의 천연 구조가 변형된 핵산을 의미한다. 이들은 천연의 포스포디에스테르 결합(본 명세서에서는 간단히 포스포디에스테르 결합이라고도 함), 당(RNA의 경우는 리보오스 또는 DNA의 경우는 디옥시리보오스) 및/또는 퓨린 또는 피리미딘을 포함한다. 개질된 포스포디에스테르 결합은 포스포로티오에이트, 포스포트리에스테르, 메틸포스포네이트 및 포스포로디티오에이트를 포함한다.
핵산 서열: 핵산 서열 또는 서열이란 특정 뉴클레오티드 서열을 갖는 핵산 및 특정 핵산에 존재하는 뉴클레오티드의 서열 또는 순서 모두를 의미한다. 이들 두가지 의미중 어느것이 적용되는 가는 이 용어가 사용된 문맥으로부터 명백할 것이다.
올리고뉴클레오티드: 올리고뉴클레오티드란 핵산 중합체의 비교적 짧은 단편이다. 어떤 정확한 길이에 대한 제한은 없다할지라도, 올리고뉴클레오티드는 일반적으로길이가 8 내지 100 사이인 뉴클레오티드이다.
극성: 극성이란 하나의 디옥시리보오스(또는 리보오스) 부위의 C3 위치가 이웃한 디옥시리보오스(또는 리보오스) 부위의 C5 위치와 함께 천연 또는 개질된 포스포디에스테르 결합을 통하여 연결되었을 때 형성된 핵산 중합체의 배향을 의미한다. 극성은 5' 및 3' 말단에 관련된 염기들의 서열에 의해 형성된다. 한 사슬의 염기서열을 5' 로부터 3' 방향으로 읽고 다른 사슬의 염기서열을 3' 로부터 5' 방향으로 읽어서 각 위치에서 상응하는 와트슨 및 크릭 염기쌍을 얻을 때, 두 개의 상보적인 사슬은 반대 극성을 갖는다.
포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드: 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드란 포스포로티오에이트 결합을 모두 갖는 올리고뉴클레오티드(또한 완전히 포스포로티오화된 올리고뉴클레오티드라고도 함)를 의미한다.
포스포로티오에이트 함유 올리고뉴클레오티드: 포스포로티오에이트 함유 올리고뉴클레오티드란 포스포로티오에이트 결합을 하나 이상 그러나 전부 미만으로 갖는 올리고뉴클레오티드(또한, 부분적으로 포스포로티오화된 올리고뉴클레오티드를 말하기도 함)를 의미한다.
중합 효소: 중합효소란 핵산 주형의 상보적인 사본의 합성을 촉매할 수 있는 효소를 의미하는 것으로, DNA 중합효소의 경우 합성은 시발체에 디옥시뉴클레오티드를 순차적으로 첨가함으로써 수행된다.
시발체: 시발체란 주형에 상보적이고 주형과 결합하여 역전사효소 또는 박테리아파아지 T4 DNA 중합효소와 같은 DNA 중합효소에 의한 합성의 개시에 필요한 주형-시발체 혼성체를 형성하는 올리고뉴클레오티드를 의미한다. 시발체는 주형에 상보적이고 그의 3'-말단에 공유결합으로 연결된 뉴클레오티드를 순차적으로 첨가함으로써 신장된다. 그 결과는 시발체 신장 산물의 형성이다.
RNA 분해효소 H: RNA 분해효소 H란 RNA:DNA 이중구조 중에서 RNA 사슬을 분해하는 효소를 의미한다.
자가-시발 주형: 자가-시발 주형이란 별도의 시발체를 첨가하지 않고도 중합효소가 합성을 개시할 수 있는 주형을 의미한다. 자가-시발 주형의 3'-말단이 시발체로서 작용한다.
자가-시발 주형 연장 산물 : 자가-시발 주형 연장 산물이란 자가-시발 주형을 사용하여 올리고뉴클레오티드를 합성하는 동안에 생성된 산물을 의미한다. 본 명세서에서 사용된 것처럼, 자가-시발 주형 연장 산물은 합성후 주형이 공유결합에 의해 붙어 있는 시발체 신장 산물의 한 형태이다.
실질적으로 상보적: 핵산과 관련하여 사용될 때, 실질적으로 상보적이란 모든 뉴클레오티드가 또다른 핵산의 뉴클레오티드와 염기쌍을 이루지는 않지만 그럼에도 불구하고 두 핵산이 특정 조건하에서 안정한 혼성체를 형성할 수 있는 서열을 갖는 것을 의미한다.
주형: 주형이란 중합효소에 의해 복사될 수 있는 핵산 분자를 의미하는 것으로, 주형은 목적하는 올리고뉴클레오티드를 제조하기 위한 양상을 제공하고 기질로서 작용하는 뉴클레오티드 서열을 갖는다. 이와 같이 작용하기 위해서, 주형은 시발체와 혼성화할 수 있는 서열 (시발체 결합 영역)을 함유하여야 한다. 자가-시발 주형은 헤어핀 구조(자가-상보적인 영역)를 형성할 수 있는 서열을 함유하여야 한다.
주형 전구체: 주형 전구체란 적어도 하나의 주형 핵산 서열의 사본을 함유하며, 절단되어 적어도 하나의 주형 핵산을 형성할 수 있는 올리고뉴클레오티드를 의미한다.
주형 전구체 혼성체: 주형 전구체 혼성체란 주형과 시발체가 혼성화되었을 때 형성되는 부분적으로 이중 사슬형의 핵산을 의미한다.
올리고뉴클레오티드는 생의학 과학분야에서 많은 상이한 용도를 갖는다. 그 일부를 지명하면, 그들은 진단 분석에 있어서특정 핵산 서열의 검출을 위한 표지된 프로브로서 사용될 수 있고 (Kohne et al., 미합중국 특허 제4,851,330호 및 제5,288,611호 참조), 그들은 RNA 표적물질 중에 표지된 프로브와 혼성화하기 쉬운 영역의 형성을 촉진시키기 위하여 사용될 수 있고 (Hogan et al., 미합중국 특허 제5,030,557호 참조), 그들은 DNA 서열 분석을 위한 연구 도구로서 사용될 수 있으며 (Biggin et al., P.N.A.S. 80: 3936-3965 (1983)), 특히 개질된 올리고뉴클레오티드의 경우에 있어서, 그들은 생물학적 시스템에 사용될 수 있다. 핵산 분해효소에 의한 분해에 내성을 갖는 임의의 개질된 핵산의 능력 때문에, 그들은 이와 같은 시스템에서 비개질된(천연의) 포스포디에스테르 대응물보다 훨씬 더 안정하다. 이로 인해 그들은 안티센스 치료제로서 생체내 사용상 이상적이다.
안티센스란 유전자 기능 조절제로서의 올리고뉴클레오티드의 용도를 말한다. 안티센스 올리고뉴클레오티드 즉, 표적 센스 핵산의 서열과 상보적인 핵산서열을 갖는 올리고뉴클레오티드는 많은 상이한 방법으로 작용하여 유전자 기능을 조절할 수 있다. 표적 핵산이 전달 RNA (mRNA)일 때, 안티센스 올리고뉴클레오티드는 mRNA가 단백질로 번역되는 것을 방지하거나 리보소옴의 결합을 저해하는 작용을 할 수도 있다. 표적 핵산이 DNA일 때, 이는 mRNA로의 전사를 방지할 수 있다.
안티센스 치료분야에서 포스포로티오에이트 함유 올리고뉴클레오티드의 사용은 현재 널리 퍼져있다. 몇몇 사용예를 들면, 급성 골수아구성 백혈병의 치료(Bergot, et al., Nucleic Acids Symposium Series 제29호, 제57면 (1993)), HIV 복제의 억제 (Matsukura, et al., Gene 제72호, 제343-347면 (1988)) 및 유행성 감기 바이러스 복제의 억제(Leiter, et al., P.N.A.S. 제87호, 제3430-3434면 (1990) 및 Cohen et al., 미합중국 특허 제5,264,423호, 제5,276,019호 및 제5,286,717호 참조)가 있다.
특정 목적에 유용한 올리고뉴클레오티드를 표적 서열의 선택된 영역과 혼성화되도록 고안할 수 있으며, 길이 및 표적 결합 영역과 같은 것을 변화시킴으로서 어떤 목적에 대한 그들의 적합성을 최대화할 수 있다. 예를 들면, 목적하는 올리고뉴클레오티드 산물이 mRNA 중 단백질 암호영역을 표적하는데 사용되는 안티센스 치료제라면, 상기 mRNA서열의 결합영역에 상보적인, 즉 2차 구조를 함유하지 않는 것으로 기대되고, 비표적 핵산과 상호 반응성을 나타내지 않도록 충분한 길이와 특정 서열에 상보성을 갖는 올리고뉴클레오티드를 선택하여도 좋다.
비록 적절한 올리고뉴클레오티드 길이는 이 올리고뉴클레오티드기 고안된 특정 용도에 전적으로 좌우된다 할지라도, 어떤 일반화가 가능하다. 올리고뉴클레오티드가 클로닝에서의 링커(linker)로서 사용되는 것이라면, 길이가 약 6과 60 사이인 뉴클레오티드가 바람직할 것이다. 만일 서열-특이적 혼성화 프로브로서 사용되는 것이라면, 길이가 약 12와 60 사이인 뉴클레오티드가 바람직할 것이다. 만일 중합효소 사슬 반응 (PCR) 시발체로서 사용되는 것이라면, 길이가 약 8과 35 염기 사이가 바람직할 것이다. 만일 리가제 사슬 반응 (LCR) 시발체로서 사용되는 것이라면, 길이가 약 8과 35 사이인 뉴클레오티드가 바람직할 것이다. 만일 안티센스 치료제로서 사용되는 것이라면, 길이가 약 12와 50 사이, 더 바람직하게는 약 15와 30 사이인 뉴클레오티드가 바람직할 것이다.
본 발명은 특히 키랄 순수한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 효소적 합성에 사용하기에 아주 적합하다. 본 발명은 일반적으로 주형-시발체 혼성체를 형성하기 위한 주형 및 시발체의 사용(또는 헤어핀을 형성하기 위한 자가-시발 주형의 사용), 시발체 신장 산물의 합성, 및 목적하는 개개 올리고뉴클레오티드의 절단 및 분리를 포함한다. 이들 측면 각각을 더 충분히 후술한다.
주형
주형은 DNA 또는 RNA중 어느하나, 또는 개질된 DNA 또는 개질된 RNA중 어느하나이어도 좋으나 바람직하게는 분해를 용이하게 하기 위해서 비개질된 RNA가 좋다. 특이한 핵산 서열을 갖는 주형은 임의의 공지된 화학적 또는 효소적 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 그밖에, 주형은 플라스미드, M13 DNA등과 같은 것을 사용하여 임의의 공지된 재조합 또는 클로닝 방법으로 제조할 수 있다. 화학적 합성은 포스포로아미디트 방법 및 모델 380-B와 같은 자동화 합성기(Applied Biosystems, Inc., Foster City, California)를 사용하여 스텍 등(Stec et al.)(J. Am. Chem.Soc. 제106호: 제6077-6079면 (1984))이 기술한 방법에 따라 간편하게 수행할 수 있다.
주형 합성에 특히 유용한 방법은 단일 사본 만큼 적은 핵산수로부터 다수의 사본을 생산하는 효소 증폭 기술에 기초한다. 본 명세서에 그들 전체가 혼입된 하기 참고 문헌들은 주형 생산에 사용될 수 있는 여러 상이한 증폭 방법을 나타낸다. DNA 생산을 위한 PCR법은 물리스 등(Mullis et al.) (미합중국 특허 제4,683,195호, 제4,683,202호 및 제4,800,159호, 및 Methods in Enzymology, 제155권, 제335-350면 (1987) 참조)이 기술하였다. RNA 생산을 위한 Qβ 복제효소-기제 증폭 시스템은 크라머 등(Kramer et al.)이 미합중국 특허 제4,786,600호에서 기술하였다.
상보적인 서열을 결하고 있는 단일쇄 주형의 제조가 이상적이므로, 바람직한 증폭 방법은 전사-기제 증폭 시스템을 이용하여 이중쇄 DNA로부터 단일쇄 RNA 의 다수의 사본을 제조하는 것이다 (Burg et al., 국제공개 제89/01050호 및 Gingeras, et al., 국제공개 제88/10315호 참조). 또다른 전사-기제 증폭 증폭 방법은 카시안 등(Kacian et al.) (국제공개 제91/01384호 및 국제공개 제93/22461호) 및 맥도노우 등(McDonough, et al.) (국제공개 제94/03472호)이 기술하고 있다. PCR 또한 DNA-지시 RNA 중합효소를 사용하여 생체외에서 RNA를 합성할 이중쇄 DNA로부터 단일쇄 RNA를 제조하기 위하여 사용되었다 (Murakawa, et al., DNA 7: 제287-295면 (1988) 참조).
주형의 핵산 서열은 반드시 2 이상의 핵산 하부서열을 갖는데, 그중 하나는 시발체에 상보적인 즉, 시발체 결합 영역이고 다른 하나는 합성될 올리고뉴클레오티드에 상보적인 즉, 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역이다. 그밖에, 주형은 플라스미드, PCR 산물(변성 및 사슬 분리 후) 또는 제한 단편의 형태, 또는 그들의 선형화된 형태로 존재할 수 있다. 상이한 주형 구조의 예로는 도1을 참조.
하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 생산함에 있어서 하나의 주형을 사용하기 위해서는, 하나 이상의 하부영역을 갖는 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역을 함유하는 주형을 합성하여, 각 하부영역이 개개 올리고뉴클레오티드에 상보적이고 이들의 합성을 지시할 수 있도록 한다. 도2 참조. 이와 같은 주형을 사용하면, 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역은 올리고뉴클레오티드 산물에 상보적이고 이들의 합성을 지시한다. 상기 올리고뉴클레오티드 산물은 합성 후, 절단되어 개개 올리고뉴클레오티드로 분리될 수 있다.
하나 이상의 하부영역을 갖는 이와 같은 주형은 또한 합성후 개개 올리고뉴클레오티드가 서로 용이하게 분리되도록 고안되어야 한다. 이는 절단되어 개개 올리고뉴클레오티드로 분리되도록 특별히 배치된 제한 서열을 시발체 신장 산물에 도입함으로서 수행될 수 있다. (개개 올리고뉴클레오티드를 분리하기 위한 절단에 관한 더 자세한 설명은 하기 시발체 신장 산물의 절단을 참조.)
이 방식으로 합성된 개개 올리고뉴클레오티드는 동일 또는 상이한 길이 뿐만 아니라 동일 또는 상이한 서열을 가져도 좋다. 이 방법은 더 이상의 분리를 요하지 않는 올리고뉴클레오티드쌍을 특정한 용도에 사용하고자 할 때 매우 유용하다.
주형은 올리고뉴클레오티드의 합성에 사용되도록 제조되거나, 또는 엔도뉴클레아제 또는 이와 같은 다른 절단 기구로 절단되어 유용한 주형으로 전환될 수 있는 주형 전구체로서 제조될 수 있다. (절단기구에 관한 자세한 설명은 하기 시발체 신장 산물의 절단을 참조.) 도3 참조.
부가적으로, 주형은 자가-시발체 즉, 시발체를 분리할 필요없이 합성을 개시할 수 있는 것이어도 좋다. 시발체 결합영역 대신에 자가-시발 주형은 자가-시발 영역를 갖는다. 이 자가-시발 영역은 여러, 대개는 3 내지 5의 뉴클레오티드만큼 떨어진 사슬내 상보적인 2 영역을 함유한다. 이 사슬내 상보적인 영역은 이중구조를 형성하며, 사슬내 상보적인 영역을 분리시키는 여러 뉴클레오티드는 루프를 형성한다. 3'-말단 염기는 쌍을 이뤄야 하고, 상보적인 영역은 시발이 일어날 수 있도록 충분하여야 한다. 얻어지는 구조는 헤어핀으로 언급된다. (Dattagupta, 유럽특허 출원 제427,073A2) 도4 참조. 보는 바와 같이, 자가-시발 주형의 3'-말단은 시발체로서 작용한다.
하나의 주형 분자중 시발체 상보적 영역이 다른 주형 분자의 시발체 상보적 영역과 결합하여 이중으로된 시발체 상보적 영역이 형성될 수 있도록, 시발체 상보적 영역들을 갖는 주형을 고안하는 것도 또한 가능하다. 이 방식에서, 하나의 주형은 또다른 주형을 위한 시발체로서 작용하므로 별도의 시발체가 필요없다. 이들 주형들은 두가지 기능 모두로 작용하므로, 시발체/주형으로 불리울 수 있다. 도5 참조. 보는 바와 같이, 단일 3'-리보뉴클레오티드를 갖는 DNA 시발체/주형을 사용하므로써, 시발체/주형을 알칼리 가수분해 및/또는 RNA 분해효소를 통하여 올리고뉴클레오티드 산물로부터 분리할 수 있다.
시발체
주형을 합성하기 위한 시발체는 전술한 임의의 방법을 사용하여 합성될 수 있다. 시발체는 DNA 또는 RNA중 어느 하나, 또는 개질된 DNA 또는 RNA중 어느 하나일 수 있다. 특히 유용한 시발체는 3'-말단에 또는 그 근처(즉, 1 내지 3 뉴클레오티드내에)에 여러, 바람직하게는 1 내지 4개의 리보뉴클레오티드를 갖는 DNA로 구성된 3'-리보뉴클레오티드 시발체이다. 바람직하게는, 시발체는 그의 3'-말단에 하나의 리보뉴클레오티드 잔기를 갖는 DNA로 구성된 3'-리보뉴클레오티드 시발체이다. 이 형태의 시발체가 PCR 동안에 오염을 방지하기 위하여 이용되어 왔다 (Walder et al., 유럽 특허 출원 제496,483A2호). 본 명세서에서 사용된 것처럼, 3'-리보뉴클레오티드 시발체는 리보뉴클레오티드의 3'에 있는 뉴간 결합이 화학적 또는 효소적 수단에 의해 절단될 수 있기 때문에 시발체를 올리고뉴클레오티드 산물로부터 분리하기 위한 간편한 절단 부위를 제공한다.
3'-리보뉴클레오티드 시발체는 시발체 신장 산물을 절단하여 시발체를 올리고뉴클레오티드 산물로부터 분리한 후에도 그 기능을 보유할 수 있으므로 바람직하다. 절단후 그 기능을 보유하는 시발체는 동일 주형에 혼성화된 채로 남아있거나 다른 주형과 혼성화할 수 있어 이후의 합성반응을 개시할 수 있는 것이다.
리보뉴클레오티드-함유 시발체는 공지된 올리고뉴클레오티드 합성 방법을 사용하여 제조할 수 있다. 예를 들면, 전술한 발더 등(Walder, et al.) 참조. 리보뉴클레오티드-함유 시발체를 RNA 주형에 사용할 때, 시발체 신장 산물의 절단 및 주형의 분해는 동시에 이루어질 수 있다. 도6 참조. 시발체 신장 산물 절단 및 주형 분해에 관한 보다 상세한 설명은 하기 참조.
또다른 유용한 시발체는 3'-말단에 하나 이상의 디옥시우리딘을 함유하는 올리고뉴클레오티드로 구성된다. 시발체 신장 산물을 합성한 후, 디옥시우리딘 잔기는 DNA 글리코실라제의 작용과, 뒤이은 비퓨린/비피리미딘 엔도뉴클레아제 (AP-엔도뉴클레아제)에 의한 인산 결합 절단, 및 그결과 생성된 염기없는 당의 엑소뉴클레아제에 의한 제거의 조합에 의하여 제거될 수 있다. (McGilvery, et al., Biochemistry: A functional Approach, W.B. Saunders Co., Philadelphia, Pensylvania, 제125-126면 (1983)).
주형-시발체 혼성체의 제조
올리고뉴클레오티드 합성에 앞서서, 시발체는 주형에 혼성화되어야 한다. 주형 및 시발체 조합은 시발체가 시발체 결합 영역에 결합되고 주형의 임의의 다른 영역에는 결합되지 않도록 사용되어야 한다. 따라서, 시발체가 주형과 안정한 이중구조를 형성하기 위해서는 충분히 길고, 시발체 상보적 영역과 충분히 상보적이어야 한다. 이렇게 생성된 이중구조에 의해 시발체의 3'-OH 말단이 합성 개시 부위로 작용할 수 있다.
시발체와 주형은 사용되기 전에 미리 혼성화될 수 있는데, 바람직하게는 중합효소의 첨가 전에 합성 반응 혼합물에 차례로 또는 동시에 첨가된다. 시발체와 주형 사이에 특정 이중구조를 형성시키기 위하여 필요한 혼성화 조건은 주형의 시발체 결합 영역에 대한 시발체의 특이성에 가장 크게 좌우될 것이지만, 존재하는 핵산의 이질성에도 어느 정도 좌우될 것이다. 혼성화 조건은 또한 효율적이고 정확한 합성을 수행할 수 있도록 중합효소와도 적합성이 있어야 한다. 만일 화학적으로 제조된 주형이 외래 핵산의 오염이 최소가 될 것으로 기대되는 경우에 사용된다면, 주형에 시발체를 선택적으로 혼성화시키기 위한 광범위한 혼성화 조건이 사용될 수 있다. 주형이 핵산을 오염시키는 조건하에서 효소에 의해 제조된다면, 시발체와 주형의 선택적인 혼성화가 일어나기 위해서는 혼성화 조건은 더욱 엄격해져야 한다. 엄격성은 이온 강도를 낮추고, 세척 온도를 높이며, 그리고/또는 변성제를 사용하는 것과 같은 임의의 공지 방법을 사용하여 향상될 수 있다.
시발체 신장 산물의 제조
시발체-주형 혼성체 중의 시발체의 3'-OH 말단은 5' 에서 3' 방향으로 dNTPs의 순차적 첨가를 통한 합성의 개시 영역으로서 작용한다. 별법으로, 자가-시발 주형이 활용될 경우, 주형의 자가-상보 영역의 3'-OH 말단이 합성 개시 부위로서 기능한다. 합성에 사용될 뉴클레오티드의 혼합물은 원하는 양의 개질된 dNPTs가 혼입되도록 적절한 비율로 모두 비개질된, 모두 개질된, 또는 비개질 및 개질된 dNTPs 모두중 어느 하나를 함유하여도 좋다. 만일 완전히 포스포로티오에이트된 올리고뉴클레오티드가 합성된다면, dNTPαSs만이 사용될 것이다. 개질 dNTPS는 동일하거나 상이할 수 있는데, 바람직하게는 동일하다. (즉, 모두 메틸포스포네이트, 모두 포스포로티오에이트 등) 또한, 합성 가능한 dNTPs의 혼합물은 시발체 신장 산물의 생성에 필요한 모든 뉴클레오티드를 함유하고 있어야 한다.
중합효소의 선택은 사용된 주형 및 기질, 그리고 특정 반응 조건을 위한 요건에 좌우될 것이다 (예를 들면, 고온 반응을 위한 열안정성 중합효소). 다양한 주형 및 기질에의 사용상 적합한 중합효소는 당업계에 잘 알려져 있다.
DNA-의존 DNA 중합효소는 DNA 주형에 상보적인 DNA 사본을 합성한다. 적합한 DNA-의존 DNA 중합효소의 예로는 다음을 포함하지만, 이에 한정되는 것은 아니다.: DNA 중합효소 I (Burgess, et al., Journal of Biol. Chem. 254: 6889-6893 (1979)); T4 중합효소 (Romaniuk, et al., Journal of Biol. Chem. 257: 7684-7688 (1982)); 및 T7 중합효소 (Brody, et al., Biochemistry 21: 2570 (1982)).
이러한 각각의 중합효소는 또한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 함성하는데 사용될 수 있다. 모든 공지의 DNA-의존 DNA 중합효소는 합성을 개시하기 위하여 상보적인 시발체를 필요로 한다. 일반적으로 시발체는 합성을 개시하기 위하여 RNA, DNA 또는 RNA와 DNA의 공중합체일 수 있다. 적합한 조건하에서 DNA-의존 DNA 중합효소가 RNA 주형에 상보적인 DNA 사본을 합성할 수 있다는 것이 공지되어 있다.
역전사효소라고도 불리는 RNA-의존 DNA 중합효소는 RNA 주형에 상보적인 DNA 사본을 합성한다. 적합한 RNA-의존 DNA 중합효소의 예에는 아비안 미엘로플라스토시스 바이러스 역전사효소 (Bartlett, et al., Journal of Biol. Chem 257 (15): 8879-8854 (1982))가 있지만, 이에 한정되는 것은 아니다.
당업계에 공지된 다른 역전사효소뿐만 아니라, 이 효소도 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 합성하는데 사용될 수 있다. 모든 공지의 역전사효소도 또한 DNA 주형에 상보적인 DNA 사본을 만들 수 있는 능력을 갖고 있고, 따라서 RNA- 의존 DNA 중합효소이며 DNA-의존 DNA 중합효소이기도 하다.
시발체 신장 산물의 절단
시발체 신장 산물은 적어도 하나의 절단 부위를 필수적으로 갖게 되며, 여러 동등한 또는 상이한 절단 부위를 가질 수도 있다. 시발체로부터 올리고뉴클레오티드 산물을 분리하는데 하나의 절단 부위가 필요하고, 만일 주형의 올리고뉴클레오티드 상보 영역이 개개 올리고뉴클레오티드에 상보적인 서열을 각각 갖는 2 이상의 하부 구역으로 구성되어 있다면 올리고뉴클레오티드 산물은 개개 올리고뉴클레오티드의 분리를 위한 절단 부위를 반드시 갖고 있어야 한다.
1개 이상의 개개 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위하여 주형을 사용하는 경우, 1종 이상의 절단 부위를 갖는 시발체 신장 산물을 제조하는 것이 바람직할 수 있고, 이들 절단 부위중 하나는 3'-리보뉴클레오티드 시발체를 사용하여 생성된 리보뉴클레오티드 잔기에 인접한 인산 결합이고, 다른 것은 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열일 수 있다.
이러한 방식에 있어서, 시발체 신장 산물은 한번 절단되어 시발체를 분리시키고, 다시 절단되어 개개 올리고뉴클레오티드를 서로 분리시킨다 (정제 전 또는 후). 도7 참조.
시발체 신장 산물에 하기 실시예 2에서 확인된 것과 같은 상이한 제한 엔도뉴클레아제로 인식되는 상이한 제한 부위가 시발체 신장 산물내로 혼입될 수 있다. 본 발명의 중요한 면 중 하나는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 절단하는 종전에 공지되지 않은 제한 엔도뉴클레아제/제한 서열 조합의 발견이다.
포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드내의 이러한 제한 서열이 인식될 수 있고 절단될 수 있다는 것은 예상치 못한 발견이었다. 테일러 등 (Nucleoc Acids Research, 13(24): 8749-8764 (1985))는 Alu I와 같은 몇몇 제한 엔도뉴클레아제가 포스포로티오에이트된 엔도뉴클레아제를 부분적으로 절단시킬 수 있다고 보고하였다. 제한 엔도뉴클레아제가 부분적으로 포스포로티오에이트된 올리고뉴클레오티드를 절단시키는 능력과 완전히 포스포로티오에이트된 올리고뉴클레오티드를 절단시키는 능력사이에는 어떤 상관 관계가 있을 것으로 기대되었었다. 하지만, 이는 모든 경우에 있어서 모두 그러한 것은 아니였으며, 제한 엔도뉴클레아제가 완전히 포스포로티오에이트된 올리고뉴클레오티드를 절단시키는 효율성은 부분적으로 포스포로티오에이트된 올리고뉴클레오티드에 따른 종전의 결과에 기초하여 예측할 수 없었다. 실시예 I 내지 III 참조.
부위-특이성 제한 엔도뉴클레아제의 사용에 이외에도, 만일 3'-리보뉴클레오티드 시발체가 DNA 주형과 함께 사용된 경우, 시발체와 올리고뉴클레오티드 산물을 분리시키는 절단은 알칼리 가수분해, 또는 RNA 분해효소와 같은 엔도뉴클레아제의 사용으로 달성될 수 있다.
RNA 분해효소 H는 엔도뉴클레아제 또는 엑소뉴클레아제 활성 중 어느 하나 또는 이들 둘 모두를 함유할 수 있다. 아비안 미엘로블라스토시스 바이러스 및 몰로니 무린 백혈병 바이러스 역전사효소는 그들의 중합효소 활성과 더불어 RNA 분해효소 H 활성을 가진다. 하지만, 어떤 클로닝된 역전사효소는 RNA 분해효소 H 활성이 결여되어 있다. 또한 관련된 중합효소 활성이 없는 RNA 분해효소 H도 있다. 대부분의 RNA 분해효소 H의 절단 부위가 하나 이상의 리보뉴클레오티드 잔기의 존재를 필요로 하지만, 내부에 하나의 리보뉴클레오티드 잔기를 함유하는 DNA 사슬을 절단시킬 수 있는 RNA 분해효소 H가 보고되었다. (Walder, et al., supra 참조)
3'-리보뉴클레오티드 시발체를 사용하여 생성된 시발체 신장 산물의 절단은 리보뉴클레오티드 잔기의 3'-방향에 있는 인산 결합(들)에서 일어난다. 알칼리에 의한 절단은 2'-, 3'- 및 2', 3'-환 인산 리보뉴클레오티드의 혼합물을 생성시키는데, 이는 이후 알칼리 포스파타제에 의해 다시 전환되어 재생될 수 있다. 바람직하게는, 3'-OH 말단을 갖는 시발체를 재생시키는 RNA 분해효소가 사용된다. 3'-리보뉴클레오티드 시발체가 3'-말단에 단일 리보뉴클레오티드 잔기를 갖는 DNA로 구성된 경우, 재생된 또는 재형성된 시발체는 본래의 시발체와 동일할 것이다. 이 때문에 이러한 시발체가 특히 바람직하다.
만일 데옥시우리딘-함유 시발체가 사용되는 경우, 절단은 DNA 글리코실라제에 의한 가수 분해, 이어서 비퓨린/비피리미딘-엔도뉴클레아제에 의한 인산 결합의 절단 (AP-엔도뉴클레아제) 및 엑소뉴클레아제에 의한 염기없는 당의 제거에 의해달성된다. (McGilvery, et al., Biochemistry: A functional Approach, supra. 참조).
시발체 및 합성될 올리고뉴클레오티드가 모두 같은 형태의 핵산, 예를 들면, 모두 비개질된 RNA 또는 DNA인 경우에는, 시발체의 뉴클레오티드중 일부가 시발체 신장 산물의 절단 후에 올리고뉴클레오티드 산물내로 혼입될 가능성도 있다. 이러한 상황에서, 시발체 신장 산물의 절단은 시발체의 원래의 3'-말단에서 5' 방향으로 일어나고, 하나 이상의 시발체의 뉴클레오티드가 올리고뉴클레오티드의 5' 말단으로 혼입된다. 별법으로, 시발체 신장 산물의 절단이 시발체의 원래의 3'-말단으로부터 3' 방향으로 일어나는 것도 가능하다. 하지만, 이러한 두 경우 모두, 시발체는 이후의 합성 반응에는 사용되지 못할 것이다.
단일 3'-리보뉴클레오티드를 갖는 DNA 시발체/주형이 사용되는 경우, 전술한 것처럼 리보뉴클레오티드 잔기에서 절단된 후, 올리고뉴클레오티드 산물이 분리 및 정제되어 완전히 재생된 그리고 재사용가능한 시발체/주형을 얻을 수 있다.
주형의 분해
주형은 바람직하게는 시발체 신장 산물의 생성 후에 분해될 수 있어야 한다. 올리고뉴클레오티드의 합성 후에 생성된 이중 사슬 산물만을 인식하는 뉴클레아제를 사용하면, 시발체 신장 산물의 합성을 아직 지시하지 않은 주형을 분해하지 않으면서 시발체 신장 산물이 생성된 후에만 주형을 분해시키는 것이 가능하다. 주형의 분해는 시발체 신장 산물의 절단과 같이 또는 동시에 또는 후에 일어날 수 있다. 주형의 분해는 두가지 유용한 목적을 제공할 수 있다; (1) 합성 반응 성분이 쉽게 회수되어 재사용될 수 있고; (2) 분해가 올리고뉴클레오티드 및 단일 사슬형의 시발체(절단전 분해인 경우에는 시발체-신장 산물)를 남기므로 합성 반응 혼합물로부터 정제 및(또는) 분리를 용이하게 한다.
만일 주형이 DNA이면, 분해는 DNA 분해효소를 사용하여 달성될 수 있다. 올리고뉴클레오티드 산물은 합성 중에 도입된 개질 결합 덕분에 뉴클레아제 분해로부터 보호될 수 있다. 만일 DNA 분해효소에 의해 분해되지 않는 개질된 시발체가 사용되는 경우, 주형은 시발체, 올리고뉴클레오티드 및/또는 시발체-신장 산물의 존재하에 선택적으로 분해될 수 있다.
바람직하게는, 주형은 RNA이고, 이 경우 분해는 알칼리 가수분해 및/또는 적합한 RNA 분해효소를 사용하여 쉽게 달성될 수 있다.
실시예 I
제한 엔도뉴클레아제 유효성의 결정
주형이 효소에 의해 인식될 수 있는 서열을 함유하는 시발체 신장 산물의 합성을 지시하도록 설계되었다면 시발체 신장 산물은 제한 엔도뉴클레아제로 절단될 수 있다. 당업계에서 많은 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열이 공지되어 있다. (The Biochemistry of the Nucleic Acids: Chapter 4. Degradation and Modification of Nucleic Acids, supra. 참조)
제한 엔도뉴클레아제에 의해 인식되어 절단되는 개질된 많은 올리고뉴클레오티드의 내성때문에, 제한 엔도뉴클레아제를 올리고뉴클레오티드 합성에 사용하기 전에 시발체 신장 산물내로 혼입시키려는 동일한 개질체를 함유하는 핵산을 절단시킬 수 있는가에 대하여 사전에 스크리닝하는 것이 필요하다. 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드의 스크리닝 방법은 아래와 같다.
제한 엔도뉴클레아제 활성의 스크리닝은 테일러 등이 설명된 방법에 따라서 수행되었다. (Nucleic Acids Research, 13(24): 8749-8764 (1985)). 사용된 기질은 완전한 천연 포스포디에스테르 결합 (+) 사슬 및 완전한 포스포로티오에이트 결합 (-) 사슬을 가진 이중 사슬 M13 DNA였다. 두 사슬 모두에 천연 포스포디에스테르 결합을 가진 DNA를 함유하는 대조군을 제조하였다. 제한 엔도뉴클레아제 각각에 대해서 각각 제한 엔도뉴클레아제 20 단위를 0.5 μg M13 DNA와 함께, 천연 포스포디에스테르 DNA를 위해서 위 효소 제조업자가 설명한 온도 및 조건 하에서 1 시간 동안 배양하여 기질을 분해하는 능력을 시험하였다.
분석될 기질을 사용하여 얻어진 제한 단편들을 대조군을 사용하여 얻어진 것들과 비교하였고, 그 결과를 기재하였다. 이들 결과는 표 1에 나타나 있다. ++로 보고된 결과는 특정된 반응 조건을 사용하여 대조군 및 시험 기질 모두 완전히 절단되었음을 의미한다. +로 보고된 결과는 제한 엔도뉴클레아제가 기질을 절단시키기는 하였으나, 완전한 절단이 일어나지는 않았음을 의미한다. (즉, 부분 절단). 이 분석 방법을 사용하여 얻은 부분 절단이라는 결과는 절단 반응이 쉽게 더욱 최적화될 수 있으므로 제한 엔도뉴클레아제가 포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드의 합성에 사용함에 적합하다는 것을 나타낸다. 제한 엔도뉴클레아제의 유효량은 특정된 조건하에서 절단을 얻기 위해 필요한 양이다.
이중 사슬 기질을 사용한 제한 엔도뉴클레아제 연구
효소* 결과 인식 서열
ALwN I + 5'-CAGNN/CTG-3'
BsaJ I ++ 5'-C/CNNGG-3'
Bsr I ++ 5'-ACTGGN/-3'
BstN I ++ 5'-CC/(A,T)GG-3'
Cla I ++ 5'-AT/CGAT-3'
Hae III ++ 5'-GG/CC-3'
HinP I ++ 5'-G/CGC-3'
Msp I + 5'-C/CGG-3'
Mva I ++ 5'-CC/(A,T)GG-3'
ScrF I ++ 5'-CC/(N)GG-3'
Taqα I ++ 5'-T/CGA-3'
* Mva I을 제외한 모든 엔도뉴클레아제는 메사츄세트주, 비버리 소재 뉴 잉글랜드 바이오랩으로부터 구입하였다. Mva I은 인디애나주, 인디애나폴리스의 붸링거 만하임사로부터 구입하였다.
N = A, T, C 또는 G
/ = 절단 위치
(A,T) = 어느 한쪽의 뉴클레오티드
실시예 II
제한 엔도뉴클레아제 조건의 최적화
실시예 1에 기술된 방법을 사용하여 몇 가지 엔도뉴클레아제의 절단 유효성에 대한 반응 조건의 영향을 연구하였다. 특히, 절단이 유리한 조건을 발견하기 위하여 초산 나트륨을 NaCl로, MnCl2를 MgCl2로 치환하는 것에 의한 효과를 연구하였다. 효소 제조업자에 의해 보고된 최적 조건을 사용하거나 양이온, 음이온, 완충제 등의 종류 및 양을 변화시킴으로써 유사하게 최적화가 수행될 수 있다.
다른 물질의 농도는 변화시켰지만 각각의 NaCl 및 MgCl2농도는 표준 농도로 유지시켰다. 아래의 표 2에 최적 조건이 기재되어 있다. 이어서, NaCl의 최적 농도를 사용하면서, MnCl2를 양을 변화시켜가며 MgCl2의 대체 물질로서 첨가시켰다. MgCl2및 초산 나트륨의 MgCl2및 NaCl를 치환시킬 수 있는 능력은 각각 표 2에 보고되었다.
상이한 반응 조건의 효과
효소 조건 NaCl, mM (0 내지 400) 초산 나트륨, mM (0 내지 400) MgCl2, mM (0.1 내지 20) MgCl2,mM (0.1 내지 20)
Hae III 표준최적 50 mM0 mM 효과 없음 10 mM2-5 mM 효과 없음
TaqαI 표준최적 100 mM50 mM 효과 없음 10 mM1-2 mM 0.5-2 mM
HinP I 표준최적 50 mM50 mM 효과 없음 10 mM10 mM 2 mM
BstN I 표준최적 50 mM0 mM 효과 없음 10 mM효과 없음 효과 없음
Mva I 표준최적 25 mM100 mM 효과 없음 10 mM효과 없음 효과 없음
ScrF I 표준최적 100 mM0-50 mM 효과 없음 10 mM5-10 mM 1 mM
이러한 결과는 대부분의 경우 염화나트륨의 농도를 낮추는 것이 포스포로티오에이트 DNA 절단 속도를 증가시키는 경향이 있다는 것을 보여준다. 이와 유사하게, 염화마그네슘 농도를 낮추는 것은 절단을 증가시켰다. 매우 적은 경우에 MgCl2대신 MnCl2또는 NaCl 대신 초산나트륨을 사용하는 것이 절단에 영향을 미친다는 것이 관찰되었다.
실시예 III
단일 사슬 기질을 사용한 제한 엔도뉴클리아제에 관한 연구
도5에서 본 바와 같이, 단일 사슬 주형으로부터 다중 올리고뉴클레오티드를 합성하기 위하여 RNA 주형과 함께 리보오스-함유 시발체를 사용하는 것이 가능하다. 시발체 신장 산물을 리보오스 잔기의 위치에서 절단하고 주형을 분해하기 위하여 알칼리 및/또는 RNA 분해효소를 사용하면, 분해되어야 하는 단일 사슬 산물이 남는다. 실시예 I로부터, 단일 사슬의 표적물을 분해하는 제한 엔도뉴클리아제의 능력을 시험하기 위하여, 시험될 모든 효소들을 위한 제한 엔도뉴클리아제 인식 서열을 함유하는 올리고뉴클레오티드 기질을 화학적으로 합성하였다. 이 올리고뉴클레오타이드의 서열은 서열 동정 번호 1에 나타내었다. 실시예 II에서 언급한 표준 조건을 사용하여 단일 사슬 올리고뉴클레오타이드 기질을 분해하는 여러 효소들의 능력을 시험하였다. 이 결과는 아래 표3과 같다.
단일 사슬 기질을 사용한 제한 엔도뉴클리아제의 연구
효소 결과
BstN I -
Hae III +
HinP I +
Mva I -
ScrF I ++
TaqαI +
+는 올리고뉴클레오티드 기질이 부분적으로 분해된 것을 나타낸다. ++는 올리고뉴클레오티드 기질이 완전히 분해된 것을 나타낸다. -는 분해가 없는 것을 나타낸다. 이들 절단 조건하에서 어느 한 결과는 시험된 특정 제한 엔도뉴클리아제는 사용하기에 적합하다는 것을 나타낸다.
실시예 IV
RNA 주형으로부터 올리고뉴클레오티드의 합성
A. 주형의 제조
HIV REV 단백질을 암호하는 서열 동정 번호 2로 표시한 mRNA 서열에 상보적인 앤티센스 올리고뉴클레오티드의 합성을 지시하는 주형을 선택하였다(피터슨,등., 국제 출원 제95/03407호). 주형을 우선 다음 두 서열, 즉, T7 RNA 중합효소 자기-상보적(헤어핀) 프로모터 서열(서열 동정 번호 3)과 목적하는 주형에 상보적인 서열(서열 동정 번호 4)을 갖는 올리고디옥시뉴클레오티드를 화학적으로 합성하여 제조하였다. 이 올리고뉴클레오티드의 서열은 서열 동정 번호 5에 표시하였다.
올리고뉴클레오티드에서의 시험관 내의 전사는 40mM 트리스(pH 8.0), 20mM MgCl2, 4mM ATP, 4mM GTP, 4mM CTP, 4mM UTP, 1mM 스페미딘, 0.08%(w/v) 폴리에틸렌 글리콜(PEG) 8000, 0.01% 트리톤 X-100, 5mM 디티오트레이톨(DTT), 50㎍/㎖ 소혈청 알부민(BSA), RNA 분해 효소 800단위 및 T7 RNA 중합효소 120,000단위 중에 올리고데옥시뉴클레오티드 0.256 A260단위를 함유하는 20㎖의 반응 혼합물에서 수행되었다. 반응 혼합물은 37℃에서 약 1시간 동안 또는 피로인산 마그네슘 침전물이 생성될 때까지 배양하였다.
이렇게 만들어진 주형은 서열 동정 번호 6에 나타낸 서열을 가지며, 두 개의 서열 즉, 시발체 결합 영역 (서열 동정 번호 7) 및 올리고뉴클레오티드 상보적인 영역 (서열 동정 번호 8)으로 이루어졌다.
주형은 다음과 같이 크로마토그래피에 의해서 분리되었다. 피로인산 마그네슘 침전물을 최종 농도가 20mM이 되도록 EDTA를 첨가하여 용해시켰다. 반응 혼합물은 에탄올로 침전시켜 농축하였고 pH 7.5인 10㎖의 100mM 트리에틸암모늄 아세테이트에 재용해시켰다. 재용해된 RNA를 아세토니트릴 구배로 용출한 C4칼럼에서 역상 HPLC에 의해 분리하였다. RNA를 포함하는 분획을 에탄올 침전으로 농축하였다.
B. 올리고뉴클레오티드 산물의 합성
서열 동정 번호 9로 표시된 서열을 갖는 DNA 시발체 (U는 리보뉴클레오티드이고 C는 디옥시리보뉴클레오티드인 UC로 구성된 3' 말단을 갖는)를 사용하였다. 시발체 130 A260단위, 주형 130 A260단위, 50mM 트리스, pH 8.3, 75mM KCl, 25mM NaF, 3mM MgCl2, 1mM DTT, 100㎍/㎖ BSA, RNasin 200 단위/㎖, 1mM dTTPαS, 1mM dCTPαS 및 1mM dGTPαS(목적하는 올리고뉴클레오티드는 단지 C,G 및 T로 구성되므로 1mM dATPαS는 필요하지 않음)를 포함하는 9㎖의 반응 혼합물이 제조되었다. 그리고, 몰로니 뮤린 백혈병 바이러스(MMLV) 역전사효소 3.6×106단위를 첨가하고 반응 혼합물을 37℃에서 21시간동안 배양하였다.
C. 올리고뉴클레오티드 산물의 정제
주형에 혼성화된 시발체 신장 산물(서열 동정 번호 10)로 이루어진 이중 사슬 산물은 톨루엔:페놀(9:1 v/v)로 추출하여 정제하였다. 톨루엔:페놀상은 10mM의 트리스(pH 8.0)로 세 번 추출하였고 조합된 수용액상을 에탄올로 침전시켰다. 에탄올 침전물은 1.2㎖의 10mM 트리스(pH 8.0)에 재용해시키고 100mM NaOH로 조정하고 70℃, 60분 동안 배양하였다. 이러한 알칼리 가수분해는 두 가지 작용, 즉, 1) 시발체의 우리딘과 올리고뉴클레오티드의 시티딘사이의 포스포디에스테르 결합을 분해하여 시발체로부터 올리고뉴클레오티드를 분리하는 기능 및 2) RNA 주형을 절단하는 기능을 갖는다.
알칼리 처리된 물질을 염산으로 중성화하고 RNA 주형을 12.5㎍ 대장균 RNA 분해효소로 2시간 동안 RNA 주형이 완전히 절단되도록 처리하였다. 올리고뉴클레오티드 산물 (서열 동정 번호 11)을 에탄올로 침전시켜 농축시켰고 pH 7.5의 100mM 트리에틸암모늄 아세테이트에 재용해시켰고 0.5% 구배를 사용하여 아세토니트릴로 추출한 C18역상 칼럼에서 고압 액상 크로마토그래피에 의해 분리하였다. 올리고뉴클레오티드 산물의 피크 분획을 따로 분리하여 에탄올로 침전하여 농축시켰고 살균된 인산 완충 살린에 재용해시켜 -20℃에 보관하였다.
D. 시발체의 재생 및 재사용
C단계로부터 사용된 시발체는 상기 단계 A 내지 C에 따라 이후 합성에 재사용되었으며 사용되지 않은 시발체에 비하여 28%정도의 활성을 보였다. 송아지 내장에서 얻은 알카리 포스파타제로 사용된 시발체를 처리한 결과 시발체가 완전히 재생되었고, 이는 단계 A 내지 C에 따라 이후의 합성에서 재사용되어 입증된 바와 같이, 사요되지 않은 시발체의 활성과 같은 100%의 활성을 보였다.
실시예 V
화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드와 올리고뉴클레오티드 산물과의 비교
화학적으로 합성된 올리고뉴클레오티드와 효소적으로 합성된 올리고뉴클레오티드를 비교하기 위하여, 자동화된 화학적 합성법(대조용)을 사용하여 실시예 IV(산물)로부터 얻은 올리고뉴클레오티드 산물과 동일한 서열을 갖는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드를 제조하였다.
A. 물리화학적 성질의 비교
산물은 20% 변성 폴리아크릴아미드 겔위에 하나의 밴드로 나타났고 대조군 올리고뉴클레오티드의 것과 전기 영동상에서 실질적으로 동일한 유동을 가졌다. 추가적으로 산물과 대조군의 열변성 곡선은 거의 동일하다.
산물과 대조군은 H3PO4로 보정된 핵 자기공명 분광기를 사용하여 비교되었다. 양자에서 얻어진 신호는 55.639 ppm에서 피크를 보였고, 산물은 Rp 배열을 갖는 포스포로티오에이트 결합을 함유하는 산물과 일치하는 화학적 높은장(upfield) 이동을 보였다.
B. p24 생산물에 대한 경쟁적 효과
산물을 시험관내에서 앤티센스제로서의 효과를 시험하고 대조군과 비교하였다. T-임파구(Advanced Biotechnologies, Inc., (콜롬비아주 메릴랜드 소재)로부터 구입한 SupT-1)를 10%(v/v)의 소태아 혈청 및 50㎍/㎖ 황산 젠타미신이 보충된 RPMI 1640 배지에서 37℃, 5% 습윤 이산화탄소 분위기하에서 증식시켰다. 트리판 불루 배제법으로 측정한 것처럼, 2×106세포/㎖ 미만의 생존 역가 및 90%이상의 생존도를 갖는 세포 배양액만이 급성 감염용 숙주세포로 사용되었다.
약 2.0×106세포를 8분 동안 약 170g로 원심 분리하여 침전시켰다. 배지를 제거하고 세포를 신선한 배지에 서서히 재현탁시켜 최종 농도가 1×106세포/㎖이 되도록 하였다. HIV-1 균주 IIIB(1×105TCID50/㎖; TCID = 조직 배양 감염량)를 세포당 0.04 신시튬(syncytium) 형성 단위(sfu)의 복수 감염 농도에서 세포에 첨가하였다(0.7sfu = 1.0 TCID50). 바이러스와 세포 혼합물을 5% 습윤 이산화탄소 분위기하에서 37℃에서 2시간동안 배양한 후, 10㎖의 배지에 희석하고 8분 동안 170g로 원심분리하여 침전시켰다. 침전된 세포를 10㎖의 배지로 3 회 세척하고 배지에 재현탁시켜 농도를 1×105세포/㎖가 되도록 하였다.
세포를 산물 또는 대조 올리고뉴클레오티드 및 올리고뉴클레오티드가 없는 블랭크를 다양한 농도로 함유하는 동부피의 환저웰의 96웰 플레이트에 100㎕씩 분산시켰다. 각각의 농도에서 적어도 두 번 시험하였다. 그 플레이트를 5% 습윤 이산화탄소 분위기에서 37℃에서 배양하였다. 7일 후, 각 배양액중의 세포를 약 170g에서 8분간 배양 플레이트를 원심분리하여 그 자리에서 침전시켰다. 각 웰로부터 얻은 상등액 100μl을 새로운 96웰 플레이트로 옮기고, 이후의 p24 코아 항원 수준 결정을 위하여 -80℃에서 동결시켰다.
상등액을 실온에서 녹였고 다양한 농도로 희석하였다. HIV-1 p24항원 수준은 컬터사(Hialeah, Florida)로부터 구입한 포획 ELISA를 사용하여 결정하였다. 반응 속도 분석 형식을 사용하였고 제조자의 지시에 따라 수행하였다. p24 항원 생산의 효과는 산물과 대조군간에 사실상 동일하였다.
C. 신시티아의 형성에 관한 비교 효과
플라크 형성에 대한 산물 및 대조군의 효과는 다음의 방법으로 결정되었다. HT-6C세포(재조합 리트로 바이러스 벡터로부터 CD4를 발현하는 헬라세포의 클론 6C, NIH AIDS 연구 및 참고 시약 프로그램)를 5% 습윤 이산화탄소 분위기하에서 37℃에서 10%의 소태아 혈청, 100단위의 페니실린, 100㎍의 스트렙토마이신, 2mM 의 글루타민이 보충된 DMEM 배지(Gibco BRL, 가이데스베르그, 메릴랜드)가 들어 있는 75㎠ 조직 배양 플라스크에 보관하였다. 원심분리에 의해 모아진 세포들을 트립신-EDTA(Gibco BRL, 가이데스베르그, 메릴랜드)를 이용하여 플라스크로부터 분리해냈다. 이들 세포들을 3.2×104세포/웰의 농도로 48-웰 조직 배양액 접시에 플레이트하고 5% 습윤 이산화탄소 분위기하에 37℃에서 하룻밤 동안 배양시켰다.
분석하기 위하여 배지를 각 웰로부터 제거하고 4%의 소태아 혈청, 100단위/㎖의 페니실린, 100㎍/㎖의 스트렙토마이신, 2mM 글루타민, 8㎍/㎖DEAE 덱스트란 및 0.5㎍/㎖ 폴리브렌이 보충된 DMEM 배지 중의 200㎕ HIV(100 내지 200 플라크 형성 단위)를 각각의 웰에 첨가하였다. 접시들을 5% 습윤 이산화탄소 분위기하에서 37℃에서 배양하였다. 2시간 후 다양한 농도의 산물과 대조군을 함유하는 배지 800㎕를 웰에 첨가하고 5% 습윤 이산화탄소 분위기하에서 37℃에서 3일간 배양시켰다. 각 웰에서 배지를 제거하고 100%의 메탄올 1㎖을 각 웰에 가하여 세포를 접시에 고정시켰다. 15 분후 메탄올을 제거하고 0.3%(w/v) 인산 완충액 염수 0.5㎖에 용해된 크리스탈 바이어렛 염색제를 각 웰에 첨가하였다. 5분 후 웰을 물로 세척하고 물을 빼고 건조시켰다. 각 웰에서의 신시티아의 수(검게 염색되는 거대 세포)를 현미경을 통하여 세었다. 다양한 농도의 올리고뉴클레오티드 산물 및 대조 올리고뉴클레오티드로 처리한 것으로부터 얻어진 신시튬 생성의 감소 %는 실질적으로 동일하였다.
실시예 VI
자기 시발 RNA 주형을 사용한 올리고뉴클레오티드의 합성
A. 주형 제조
HIV REV 단백질 (상기 피터슨 등 참조)을 암호하는 mRNA 서열(서열 동정 번호 2)에 상보적인 앤티센스 올리고뉴클레오티드 합성을 지시하는 주형을 선택하였다. 주형을 5'에서 3'의 순서로 된 3개의 서열, 즉 T7 RNA 중합효소 자가 상보적(헤어핀) 프로모터 서열(서열 동정 번호 12), 목적하는 자가 시발 주형(서열 동정 번호 13)에 상보적인 서열을 가지는 올리고뉴클레오티드를 우선 화학적 합성에 의해 제조하였다. 5'-비 뉴클레오티드 RXL 링커로 끝나는 이 올리고디옥시뉴클레오티드의 서열은 서열 동정 번호 14에 나타내었다.(더 상세한 RXL 링커의 구조는 본 발명에서 인용 문헌으로 언급한 아놀드등의 국제 특허 공개 제89/02439호, 실시예 8(a)의 링커 시약 23을 참조)
올리고데옥시뉴클레오티드에서의 시험관 전사는 40mM 트리스(pH 8.0), 20mM의 MgCl2, 4mM의 ATP, 4mM의 GTP, 4mM의 CTP, 4mM의 UTP, 1mM의스페르미딘, 0.08%(w/v)의 폴리에틸렌 글리콜 8000, 0.01%(w/v) 트리톤 X-100, 5mM의 디티오트레이톨, 5㎍/㎖ 소 혈청 알부민, RNasin 100단위 및 T7 RNA 중합효소 24000단위 중에0.252A260단위의 올리고데옥시뉴클레오티드를 함유하는 2.0㎖의 반응 혼합물에서 수행된다. 이 반응 혼합물은 37℃에서 약 4시간동안, 또는 피로인산 마그네슘이 침전될때까지 배양시켰다.
이렇게 형성된 자가-시발 주형은 서열 동정 번호 15에 나타내었으며 5'에서 3'의 순서로 두개의 서열, 즉, 올리고뉴클레오티드 상보 영역(서열 동정 번호 16) 및 자가 시발 영역(서열 동정 번호 17)로 구성된다.
주형은 다음과 같은 크로마토그래피에 의해 분리되었다. 피로인산 마그네슘 침전물을 최종 농도가 20mM이 되도록 EDTA를 첨가하여 용해시켰다. 반응 혼합물을 에탄올로 농축시켰으며 pH 7.5에서 0.1M의 트리에틸암모늄 아세테이트에서 재용해시켰다. 재용해된 RNA를 Sep-Pak C18카트리지(밀리포아 워터스)에 가하고 pH 7.5의 0.1M의 트리에틸암모늄 아세테이트로 세척하였다. 주형을 수중 70%의 메탄올로 추출하고 진공 증발법으로 농축하고 pH 7.5의 0.1M의 트리에틸암모늄 아세테이트에 재용해시켰다. RNA 전사체는 고압 액체 크로마토그래피에 의해 추가적으로 정제하였다.
B. 올리고뉴클레오티드 산물의 합성
1㎖의 반응 혼합물을 7.45A260단위의 자가-시발 주형, 50mM의 트리스, 75mM의 KCl, 3mM의 MgCl2, 336단위/㎖의 RNasin, 3mM 의 dTTPαS, 3mM 의 dCTPαS, 3mM 의 dGTPαS(목적하는 올리고뉴클레오티드가 단지 C, G 및 T로 구성되었으므로 1mM 의 dATPαS는 필요하지 않음에 주의)를 포함하도록 제조하였다. 그리고 1.3×106단위의 모로니 뮤린 류케미아 바이러스 역전사효소를 첨가하였고 반응 혼합물을 7일간 37℃에서 배양하였다.
실시예 VII
단일 사슬 주형으로부터 다수의 올리고뉴클레오티드의 합성
A. 주형의 제조
HIV REV 단백질( 상기 피터슨등을 참조)을 코딩하는 mRNA 서열(서열 동정 번호 18)에 상보적인 앤티센스 올리고뉴클레오티드 합성을 지시하는 주형을 선택하였다. 주형은 5'에서 3'의 순서로 된 3개의 서열, 즉 T7 RNA 중합효소 프로모터 서열(서열 동정 번호 19), 목적하는 주형에 상보적인 서열(서열 동정 번호 20) 및 세 개의 반복되는 서열로 구성된 올리고뉴클레오티드를 우선 화학적 합성에 의해 제조하였다. 이 올리고뉴틀레오티드의 서열은 서열 동정 번호 21에 나타내었다.
올리고디옥시뉴클레오티드에서의 시험관 전사는 40mM 트리스, 20mM의 MgC12, 4mM의 ATP, 4mM의 GTP, 4mM의 CTP, 4mM의 UTP, 1mM의 스페르미딘, 0.08%(w/v)의 폴리에틸렌 글리콜 8000, 0.01%(w/v) 트리톤 X-100, 5mM의 디티오트레이톨, 50㎍/㎖ 소태아 혈청 알부민 및 T7 RNA 중합효소 600단위 중에0.003A260단위의 올리고디옥시뉴클레오티드를 함유하는 0.1㎖의 반응 혼합물에서 수행된다. 이 반응 혼합물은 37℃에서 약 3시간 동안 배양시켰다. 이 반응은 70℃에서 10분간 가열하여 정지시켰다. 0℃로 냉각시킨후 RNasin 80 단위를 첨가하였다.
이렇게 형성된 주형은 서열 동정 번호 22에 나타내었다.
B. 올리고뉴클레오티드 산물의 합성
주형은 더 이상의 정제없이 역전사시켰다. 10㎕의 반응 혼합물을 19ng dT10시발체, 50mM의 트리스, 75mM의 KCl, 3mM의 MgCl2, 2mM의 dATPαS, 2mM의 dTTPαS, 2mM의 dGTPαS, 80단위/㎖의 RNasin, 2mM의 dCTPαS를 포함하도록 제조하였다. 이 반응 혼합물에 RNA 분해효소 H 활성이 없는 MMLV 역전사효소(Gibco BRL, 베테스다,MD)를 전체 부피가 100㎕이 되도록 첨가하였다. 이렇게 형성된 올리고뉴클레오티드 산물의 전구체는 제조자의 지시에 따라 NENSORB 20 카트리지(듀폰 NEN, 보스톤, MA)상에서 정제되었다. 이어서, 35단위의 Hae III(뉴잉글랜드 바오랩, 버버리, MA)과 1㎍의 RNA 분해효소 (DNA 분해활성 없음, Boehringer-Mannheim, Indianapolis, IN)를 37℃에서 22시간동안 제한 완충액 2(뉴잉글랜드 바오랩, 버버리,MA)에서 처리하여 각각의 올리고뉴클레오티드로 분해시켰다. 올리고뉴클레오티드 생산물의 서열은 서열 동정 번호 23에 나타나 있다.
비록 본 발명은 특정한 실시예로서 기술되었지만 본 발명의 많은 변형 및 수정이 상기 교시에 비추어 가능하다. 그러므로 첨부된 청구항의 범위내에서 본 발명은 구체적으로 기술된 것과 다르게 사용될 수 있는 것으로 이해된다.
서 열 표
(1) 일반적인 정보
(i) 출원인: 젠-프로브 인코포레이티드
(ii) 발명의 명칭: 효소적으로 절단가능한 주형 및 시발체 기제
올리고뉴클레오티드의 합성
(iii) 서열수: 23
(iv) 연락주소:
(A) 주소: 리온 리온
(B) 거리: 웨스트 피프쓰 633
슈트 4700
(C) 도시명 : 로스엔젤레스
(D) 주 명 : 캘리포니아
(E) 국 명 : 미국
(F) 우편번호: 90071-2066
(v) 컴퓨터 판독가능 형태
(A) 매 질 형 태: 3.5 디스켓, 1.44 Mb
(B) 컴 퓨 터 : IBM 겸용
(C) 작동시스템 : MS-DOS (버젼 6.22)
(D) 소프트웨어 : 워드 퍼펙트 (버젼 5.1)
(vi) 현행 출원 데이터:
(A) 출원번호:
(B) 출 원 일:
(C) 분 류:
(vii) 우선권 출원 데이터:
하기 출원을 포함한
총 우선권 출원: 5
(A) 출 원 번 호: 08/484,519
(B) 출 원 일 : 06/07/95
(C) 출 원 번 호: 08/484,668
(D) 출 원 일 : 06/07/95
(E) 출 원 번 호: 08/484,816
(F) 출 원 일 : 06/07/95
(G) 출 원 일 자: 08/476,626
(H) 출 원 일 : 06/07/95
(I) 출 원 일 자: 08/477,228
(J) 출 원 일 : 06/07/95
(viii) 변호사/대리인 정보:
(A) 이름: 쉬나이더 카롤 에이.
(B) 등록번호: 34,923
(C) 참고/사건 번호: 219/070-PCT
(ix) 전기통신 정보:
(A) 전 화 번 호: (213) 489-1600
(B) 팩 스 번 호: (213) 955-0440
(C) 텔렉스 번호:
(2) 서열 동정 번호 1에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 90 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 1의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 2에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 26 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 2의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 3에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 38 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 3의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 4에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 39 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 4의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 5에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 77 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 5의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 6에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 39 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 6의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 7에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 10 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 7의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 8에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 29 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 8의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 9에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 11 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 9의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 10에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 39 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 10의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 11에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 29 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 11의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 12에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 40 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 12의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 13에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 55 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 13의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 14에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 95 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 14의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 15에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 55 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 15의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 16에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 28 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 16의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 17에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 27 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 17의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 18에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 14 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 18의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 19에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 40 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 19의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 20에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 70 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 20의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 21에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 110 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 21의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 22에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 70 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 22의 서열기재:
(2) 서열 동정 번호 23에 대한 정보:
(i) 서열특징:
(A) 길 이 : 18 염기쌍
(B) 유 형 : 핵산
(C) 쇄의 수 : 단쇄
(D) 토폴로지: 직쇄상
(xi) 서열 동정 번호 23의 서열기재:

Claims (76)

  1. (a) 시발체 결합 영역 및 상기 시발체 결합 영역의 5'에 위치한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역을 포함하는 핵산 주형을 제공하고,
    (b) 상기 주형 및 상기 주형의 시발체 결합영역과 혼성화할 수 있는 핵산 시발체를 접촉시켜 주형-시발체 혼성체를 제조하고,
    (c) 상기 주형-시발체 혼성체를 DNA 합성이 일어나는 조건하에서 하나 이상의 DNA 중합효소의 존재하에 배양하여 시발체의 연장 산물을 제조하고,
    (d) 시발체 신장 산물을 절단하여 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들로부터 시발체를 분리하고 필요하다면, 올리고뉴클레오티드들을 서로로부터 분리하고,
    (e) 단계 (d) 전에, 동시에 또는 후에 상기 주형을 분해하는 단계를 포함하는 하나 이상의 키랄 순수한 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법.
  2. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들은 개질된 것이 특징인 방법.
  3. 제 2항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들은 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드들 또는 포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드들인 것이 특징인 방법.
  4. 제 1항에 있어서, 주형이 RNA인 것이 특징인 방법.
  5. 제 1항에 있어서, 주형이 DNA인 것이 특징인 방법.
  6. 제 1항에 있어서, 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역이, 이웃한 하부 영역과 절단부위에 의해 분리되어 있는 하나 이상의 하부 영역을 포함하고, 상기 주형이 절단되어 동일 또는 상이한 길이 및/또는 서열을 갖는 2 이상의 올리고뉴클레오티드를 형성할 수 있는 시발체 신장 산물의 합성을 지시하는데 사용되는 것이 특징인 방법.
  7. 제 1항에 있어서, 상기 시발체 신장 산물이 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열에 의해 분리되어 있고, 시발체로부터 시발체 신장 산물의 절단이 상기 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 인식할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제로 절단함으로써 달성되는 것이 특징인 방법.
  8. 제 6항에 있어서, 상기 시발체 신장 산물이 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열에 의해 분리되어 있고, 시발체로부터 시발체 신장 산물의 절단이 상기 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 인식할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제로 절단함으로써 달성되는 것이 특징인 방법.
  9. 제 1항에 있어서, 상기 시발체가 그의 3'-말단 또는 그 근처에 하나 이상의 리보뉴클레오티드를 갖는 DNA인 것이 특징인 방법.
  10. 제 9항에 있어서, 올리고뉴클레오티드로부터 시발체를 분리하기 위한 상기 시발체 신장 산물의 절단이 알칼리 가수분해 또는 RNA의 효소적 분해에 의해서 달성되는 것이 특징인 방법.
  11. 제 9항에 있어서, 올리고뉴클레오티드로부터 시발체를 분리하기 위한 상기 시발체 신장 산물의 절단이 알칼리 가수분해 및 RNA의 효소적 분해에 의해서 달성되는 것이 특징인 방법.
  12. 제 1항에 있어서, 상기 시발체가 그의 3'-말단 또는 그 근처에 하나 이상의 디옥시우리딘을 함유하는 것이 특징인 방법.
  13. 제 12항에 있어서, 시발체로부터 시발체 신장 산물의 절단이 DNA 글리코실라제 및 AP-엔도뉴클레아제에 의해서 달성되는 것이 특징인 방법.
  14. 제 1항에 있어서, 자가-상보적 영역 및 올리고뉴클레오티드 상보적 영역을 포함하는 자가-시발 주형 및 자가-상보적 영역의 3'-말단을 포함하는 시발체 모두가 하나의 핵산 사슬상에 존재하는 것이 특징인 방법.
  15. 제 9항에 있어서, 상기 시발체가 그의 3'-말단 또는 그 근처에 하나의 리보뉴클레오티드를 갖는 것이 특징인 방법.
  16. 제 4항에 있어서, 단계 (e)가 알칼리 가수분해 또는 RNA의 효소적 분해에 의해 달성되는 것이 특징인 방법.
  17. 제 4항에 있어서, 단계 (e)가 알칼리 가수분해 및 RNA의 효소적 분해에 의해 달성되는 것이 특징인 방법.
  18. 제 1항에 있어서, 상기 시발체가 제2 주형의 시발체 상보적인 영역을 포함하는 것이 특징인 방법.
  19. 제 4항에 있어서, 상기 주형이 RNA 분해효소 H 활성에 의해 분해되는 것이 특징인 방법.
  20. 제 19항에 있어서, 상기 시발체가 RNA 분해효소 H 활성에 의해 상기 올리고뉴클레오티드로부터 분리되는 것이 특징인 방법.
  21. 제 6항에 있어서, 올리고뉴클레오티드로부터 시발체를 분리하기 위하여 사용된 절단제가 상기 올리고뉴클레오티드의 하부영역들을 분리할 수 있는 절단제와 상이한 것이 특징인 방법.
  22. 제 3항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드가 키랄 순수한 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드인 것이 특징인 방법.
  23. (a) 시발체 결합 영역, 및 상기 시발체 결합 영역의 5'에 위치하고 이웃한 하부 영역과 절단부위에 의해 분리되어 있는 하나 이상의 하부영역을 포함하는 올리고뉴클레오티드 상보적 영역을 포함하는, 절단되어 동일 또는 상이한 길이 및/또는 서열을 갖는 2 이상의 올리고뉴클레오티드를 형성할 수 있는 시발체 신장 산물의 합성을 지시하는데 사용되는, 핵산 주형을 제공하고,
    (b) 상기 주형 및 상기 주형과 혼성화할 수 있는 핵산 시발체를 접촉시켜 주형-시발체 혼성체를 제조하고,
    (c) 상기 주형-시발체 혼성체를 DNA 합성이 일어나는 조건하에서 하나 이상의 DNA 중합효소의 존재하에 배양하여 시발체의 연장 산물을 제조하고,
    (d) 시발체 신장 산물을 절단하여 시발체 및 올리고뉴클레오티드들을 서로로부터 분리하는 단계를 포함하는 2 이상의 올리고뉴클레오티드들을 합성하는 방법.
  24. 제 23항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드들이 개질된 것이 특징인 방법.
  25. 제 24항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드들이 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드들 또는 포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드들인 것이 특징인 방법.
  26. 제 23항에 있어서, 주형이 RNA인 것이 특징인 방법.
  27. 제 23항에 있어서, 주형이 DNA인 것이 특징인 방법.
  28. 제 23항에 있어서, 상기 시발체 신장 산물이 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 포함하는 하나 이상의 절단부위를 함유하고, 상기 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 인식할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제로 절단되는 것이 특징인 방법.
  29. 제 23항에 있어서, 상기 절단 부위가 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 포함하고, 시발체 신장 산물이 상기 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 인식할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제로 절단되는 것이 특징인 방법.
  30. 제 23항에 있어서, 상기 시발체가 그의 3'-말단 또는 그 근처에 하나 이상의 리보뉴클레오티드를 갖는 DNA인 것이 특징인 방법.
  31. 제 30항에 있어서, 올리고뉴클레오티드로부터 시발체를 분리하기 위한 상기 시발체 신장 산물의 절단이 알칼리 가수분해 또는 RNA의 효소적 분해에 의해서 달성되는 것이 특징인 방법.
  32. 제 30항에 있어서, 올리고뉴클레오티드로부터 시발체를 분리하기 위한 상기 시발체 신장 산물의 절단이 알칼리 가수분해 및 RNA의 효소적 분해에 의해서 달성되는 것이 특징인 방법.
  33. 제 23항에 있어서, 상기 시발체가 그의 3'-말단 또는 그 근처에 하나 이상의 디옥시우리딘을 함유하는 것이 특징인 방법.
  34. 제 33항에 있어서, 올리고뉴클레오티드로부터 시발체를 분리하기 위하여 시발체 신장 산물을 절단하고, 상기 절단이 DNA 글리코실라제 및 AP-엔도뉴클레아제에 의해서 달성되는 것이 특징인 방법.
  35. 제 23항에 있어서, 자가-상보적 영역 및 올리고뉴클레오티드 상보적 영역을 포함하는 자가-시발 주형 및 자가-상보적 영역의 3'-말단을 포함하는 시발체 모두가 하나의 핵산 사슬상에 존재하는 것이 특징인 방법.
  36. 제 31항에 있어서, 상기 시발체가 그의 3'-말단 또는 그 근처에 하나의 리보뉴클레오티드를 갖는 것이 특징인 방법.
  37. 제 26항에 있어서, 상기 주형이 단계 (d) 전, 동시 또는 후에 알칼리 가수분해 또는 RNA의 효소적 분해에 의해 분해되는 것이 특징인 방법.
  38. 제 26항에 있어서, 시발체를 올리고뉴클레오티드로부터 분리하기 위한 시발체 신장 산물의 절단이 알칼리 가수분해 및 RNA의 효소적 분해에 의해 달성되는 것이 특징인 방법.
  39. 제 38항에 있어서, 주형이 알칼리를 사용하여 분해되는 것이 특징인 방법.
  40. 제 23항에 있어서, 제2 주형의 시발체 상보 영역이 시발체를 포함하는 것이 특징인 방법.
  41. 제 1항에 있어서, 상기 시발체 신장 산물이 상기 시발체 및 상기 절단 부위를 함유하는 올리고뉴클레오티드를 얻기 위하여 절단되고, 2 이상의 절단 부위가 상이한 절단제에 의한 절단을 요하는 것이 특징인 방법.
  42. 제 1항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 상보적 영역 중 적어도 일부분이 하나 이상의 절단제에 의한 절단에 내성인 것이 특징인 방법.
  43. 제 19항에 있어서, 상기 시발체 신장 산물이 RNA 분해효소 H 활성으로 하나 이상의 절단 부위에서 절단되는 것이 특징인 방법.
  44. 제한 엔도뉴클레아제 인식 핵산 서열 5'-GGCC-3'를 갖는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드를 유효량의 제한 엔도뉴클레아제 Hae III와 상기 제한 엔도뉴클레아제가 활성을 갖는 조건하에서 접촉시키는 것이 특징인 상기 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드들의 절단 방법.
  45. 제한 엔도뉴클레아제 인식 핵산 서열 5'-GCGC-3'를 갖는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드를 유효량의 제한 엔도뉴클레아제 HinP I과 상기 제한 엔도뉴클레아제가 활성을 갖는 조건하에서 접촉시키는 것이 특징인 상기 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드들의 절단 방법.
  46. 제한 엔도뉴클레아제 인식 핵산 서열 5'-CCNGG-3'를 갖는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드를 유효량의 제한 엔도뉴클레아제 ScrF I과 상기 제한 엔도뉴클레아제가 활성을 갖는 조건하에서 접촉시키는 것이 특징인 상기 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드들의 절단 방법.
  47. 제한 엔도뉴클레아제 인식 핵산 서열 5'-TCGA-3'를 갖는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드를 유효량의 제한 엔도뉴클레아제 TaqαI과 상기 제한 엔도뉴클레아제가 활성을 갖는 조건하에서 접촉시키는 것이 특징인 상기 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드들의 절단 방법.
  48. (a) 시발체 결합 영역 및 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역을 포함하는 핵산 주형을 제공하고,
    (b) 상기 주형 및 상기 주형의 시발체 결합영역과 혼성화할 수 있는 핵산 시발체를 접촉시켜 주형-시발체 혼성체를 제조하고,
    (c) 상기 주형-시발체 혼성체를 DNA 합성이 일어나는 조건하에서 하나 이상의 DNA 중합효소의 존재하에 배양하여 5'-GGCC-3', 5'-GCGC-3', 5'-CCNGG-3'(N은 임의의 뉴클레오티드임), 5'-TCGA-3'로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 포함하는 시발체의 연장 산물을 제조하고,
    (d) 시발체 신장 산물을 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 인식할 수 있는 Hae III, HinP I, ScrF I 및 TaqαI으로 구성된 군으로부터 선택된 유효량의 제한 엔도뉴클레아제와 접촉함으로써 달성되는 하나 이상의 절단으로 시발체 신장 산물을 절단하여 올리고뉴클레오티드로부터 시발체를 분리하거나 또는 올리고뉴클레오티드들을 서로로부터 분리하는 단계를 포함하는 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드 또는 포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드의 합성하는 방법.
  49. 제 48항에 있어서, 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열이 5'-GGCC-3'이고 제한 엔도뉴클레아제가 Hae III인 것이 특징인 방법.
  50. 제 48항에 있어서, 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열이 5'-GCGC-3'이고 제한 엔도뉴클레아제가 HinP I인 것이 특징인 방법.
  51. 제 48항에 있어서, 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열이 5'-CCNGG-3'이고 제한 엔도뉴클레아제가 ScrF I인 것이 특징인 방법.
  52. 제 48항에 있어서, 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열이 5'-TCGA-3'이고 제한 엔도뉴클레아제가 TaqαI인 것이 특징인 방법.
  53. 제 48항에 있어서, 주형이 RNA인 것이 특징인 방법.
  54. 제 48항에 있어서, 주형이 DNA인 것이 특징인 방법.
  55. 제 48항에 있어서, 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역이 다른 하부 영역과 절단부위에 의해 분리되어 있는 하나 이상의 하부 영역을 포함하고, 상기 주형이 절단되어 동일 또는 상이한 길이 및/또는 서열을 갖는 2 이상의 올리고뉴클레오티드의 합성을 지시하는데 사용되는 것이 특징인 방법.
  56. 제 48항에 있어서, 상기 시발체가 그의 3'-말단 또는 그 근처에 하나 이상의 리보뉴클레오티드를 갖는 DNA인 것이 특징인 방법.
  57. 제 56항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들로부터 시발체를 분리하기 위한 상기 시발체 신장 산물의 절단이 알칼리 가수분해 또는 RNA의 효소적 분해에 의해서 달성되는 것이 특징인 방법.
  58. 제 48항에 있어서, 상기 시발체가 그의 3'-말단 또는 그 근처에 하나 이상의 디옥시우리딘을 함유하는 것이 특징인 방법.
  59. 제 58항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들로부터 시발체를 분리하기 위하여 시발체 신장 산물이 절단되고 상기 절단이 DNA 글리코실라제 및 AP-엔도뉴클레아제에 의해서 달성되는 것이 특징인 방법.
  60. 제 48항에 있어서, 자가-상보적 영역 및 올리고뉴클레오티드 상보적 영역을 포함하는 자가-시발 주형 및 자가-상보적 영역의 3'-말단을 포함하는 시발체 모두가 하나의 핵산 사슬상에 존재하는 것이 특징인 방법.
  61. 제 48항에 있어서, 상기 주형이 단계 (d)의 전, 동시 또는 후에 알칼리 가수분해 또는 RNA의 효소적 분해에 의해 분해되는 것이 특징인 방법.
  62. 제 61항에 있어서, 상기 주형이 알칼리를 사용하여 분해되는 것이 특징인 방법.
  63. 제 48항에 있어서, 상기 시발체가 제2 주형의 시발체 상보적 영역을 포함하는 것이 특징인 방법.
  64. (a) 시발체 결합 영역 및 상기 시발체 결합 영역의 5'에 위치한 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역을 포함하는 핵산 주형을 제공하고,
    (b) 상기 주형과, 이와 혼성화할 수 있고 그의 3'-말단 또는 그 근처에 하나 이상의 리보뉴클레오티드를 갖는 DNA를 함유하는 핵산 시발체를 접촉시켜 주형-시발체 혼성체를 제조하고,
    (c) 상기 주형-시발체 혼성체를 DNA 합성이 일어나는 조건하에서 하나 이상의 DNA 중합효소의 존재하에 배양하여 시발체의 연장 산물을 제조하고,
    (d) 시발체 신장 산물을 상기 리보뉴클레오티드(들)로부터 3' 방향에 있는 뉴클레오티드간의 인산 결합(들)을 가수분해함으로써 절단하여 시발체 및 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들을 제조하고,
    (e) 단계 (d)로부터 얻은 시발체를 사용하여 단계 (b) 및 (c)를 1회 이상 반복하는 단계를 포함하는 하나 이상의 올리고뉴클레오티드를 합성하는 방법.
  65. 제 64항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들이 동일한 뉴클레오티드 서열을 갖는 비개질된 올리고뉴클레오티드보다 하나 이상의 뉴클레아제에 대하여 더 내성을 갖도록 개질된 것이 특징인 방법.
  66. 제 65항에 있어서, 상기 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들은 포스포로티오에이트 올리고뉴클레오티드들 또는 포스포로티오에이트-함유 올리고뉴클레오티드들인 것이 특징인 방법.
  67. 제 64항에 있어서, 주형이 RNA인 것이 특징인 방법.
  68. 제 64항에 있어서, 주형이 DNA인 것이 특징인 방법.
  69. 제 64항에 있어서, 올리고뉴클레오티드에 상보적인 영역이, 이웃한 하부 영역과 절단부위에 의해 분리되어 있는 하나 이상의 하부영역을 포함하고, 상기 주형이, 절단되어 동일 또는 상이한 길이 및/또는 서열을 갖는 2 이상의 올리고뉴클레오티드들을 형성할 수 있는 시발체 신장 산물의 합성을 지시하는데 사용되는 것이 특징인 방법.
  70. 제 69항에 있어서, 상기 시발체 신장 산물이 하나 이상의 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 포함하고, 올리고뉴클레오티드들을 서로로부터 분리하기 위한 시발체 신장 산물의 절단이 상기 제한 엔도뉴클레아제 인식 서열을 인식할 수 있는 제한 엔도뉴클레아제를 사용하여 달성되는 것이 특징인 방법.
  71. 제 64항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들로부터 시발체를 분리하기 위한 상기 시발체 신장 산물의 절단이 알칼리 가수분해 또는 RNA의 효소적 분해에 의해서 달성되는 것이 특징인 방법.
  72. 제 64항에 있어서, 올리고뉴클레오티드 또는 올리고뉴클레오티드들로부터 시발체를 분리하기 위한 상기 시발체 신장 산물의 절단이 알칼리 가수분해 및 RNA의 효소적 분해에 의해서 달성되는 것이 특징인 방법.
  73. 제 64항에 있어서, 자가-상보적 영역 및 올리고뉴클레오티드 상보적 영역을 포함하는 자가-시발 주형 및 자가-상보적 영역의 3'-말단을 포함하는 시발체 모두가 하나의 핵산 사슬상에 존재하는 것이 특징인 방법.
  74. 제 64항에 있어서, 상기 시발체가 그의 3'-말단 또는 그 근처에 하나의 리보뉴클레오티드를 갖는 것이 특징인 방법.
  75. 제 67항에 있어서, 상기 주형이 단계 (d)의 전, 동시 또는 후에 알칼리를 사용하여 분해되는 것이 특징인 방법.
  76. 제 64항에 있어서, 상기 시발체가 제2 주형의 시발체 상보적 영역을 포함하는 것이 특징인 방법.
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