CN117980494A - 寡核苷酸的合成 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种用于寡核苷酸合成的新型方法，其使用催化引物‑模板例如发夹引物以在同一反应中实现多轮寡核苷酸合成以及从模板解离，使得在所述反应结束时所生成的寡核苷酸的量大于所述反应中提供的模板的量。所述引物含有可切割位点，并且所述反应在具有切割剂的单一混合物中进行。所述可切割位点可以是肌苷，并且所述剂可以是核酸内切酶V。

Description

寡核苷酸的合成
本发明涉及一种用于合成寡核苷酸、特别是单链寡核苷酸的方法。本发明还涉及一种寡核苷酸，其通过本发明的方法产生。本发明涉及一种用于合成寡核苷酸的部件试剂盒和一种用于合成寡核苷酸的支持物。本发明还涉及一种反应，其包含引物/模板、聚合酶和切割剂。本发明还涉及一种细胞，其包含编码本发明的引物/模板的核酸序列或载体。
背景技术
与mRNA结合以调节疾病相关蛋白的产生的治疗性寡核苷酸已成为用于治疗各种疾病领域的新药物形式(Khvorova等人Nat.Biotechnol.2017,35,238)。近年来，随着因发现RNA干扰技术而获得诺贝尔奖以及FDA批准了若干种基于RNA的用于治疗罕见疾病的治疗剂，人们对治疗性寡核苷酸进行了大量投资。目前有超过160种寡核苷酸产品正在进行临床试验，包括用于基于人群的适应症的寡核苷酸产品(Hugget等人Nat.Biotechnol.2017,35,708)。潜在治疗剂(包括用于常见疾病的治疗剂)数量的增加产生了重大的制造挑战，因为现有的化学合成方法仅限于10Kg批次并且不适用大规模应用(>100Kg)(Tedebark等人Methods Mol.Biol.2011,683,505)。
治疗性寡核苷酸是短DNA类似物，其通过沃森-克里克(Watson-Crick)碱基配对来选择性地结合靶mRNA，以调控疾病相关蛋白的产生。它们包括被称为小干扰RNA(siRNA)的双链RNA分子和被称为反义寡核苷酸(ASO)的单链分子。虽然寡核苷酸已作为潜在药物分子被研究超过40年，但将其转化为成功的治疗剂的进展却受到生物功效不足、生物利用度不足和非途径毒性作用的限制。近年来，已报告了多种化学修饰，其显著改善寡核苷酸递送、代谢稳定性和效力，所述修饰包括对DNA骨架、嘧啶碱基和核糖的取代(图1)(Khvorova等人，同上；Rinaldi等人Nat.Rev.Neurol.2018,1,9；和Smith等人Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.2019,59,605；Dowdy,Nat.Biotechnol.2017,35,222)。
治疗性寡核苷酸可能需要化学修饰以提高功效、选择性、代谢稳定性和毒性特征(Rinaldi等人Nat.Rev.Neurol.2018,1,9；Smith等人Annu.Rev.Pharmacol.Toxicol.2019,59,605)。虽然天然聚合酶能够耐受一些核苷酸修饰(Nakamaye等人Nucleic AcidsRes.1988,21,9947；Yang等人Nucleic Acids Res.2007,35,3118；Romaniuk等人J.Biol.Chem.1982,257,7684)，但它们的活性可能会受到损害。
如今，siRNA和ASO作为一种新药物形式出现，产生重大的制造挑战(Tedebark等人Methods mol.Biol.2011,683,505；Kosuri,nat.Methods 2014,11,499)。目前的合成方法通常利用20世纪80年代开发的四步骤固相亚磷酰胺方法(Beaucage等人Tetrahedronleft.1981,22,1859)。这种方法可以容易地实现自动化，并且适于合成修饰的DNA结构。不幸的是，这种策略不适用大规模合成(>100kg)，并且目前仅限于<10kg批次的寡聚物产品(Kim等人Org.Process res.Dev.2016,20,1439)。目前使用直径至多1m且具有浅床(10-15cm)的柱进行千克级合成。增加柱尺寸会导致非线性流速并降低产品纯度，这意味着不可能强化合成，而是需要多个并列反应器。此类方法中使用的试剂对环境有害并且存在处理和处置问题。
目前还没有合理的在线反应监测方法，所述方法需要使用大量过量的昂贵的亚磷酰胺。这些单体含有多个保护基团(包括4'4-二甲氧基三苯甲基保护的5'-OH、苯甲酰基和异丙基保护的碱基、以及2-氰乙基保护的亚磷酸酯)，这进一步损害了原子效率并导致形成必须在合成期间分离的副产物。所述过程使用过大量的乙腈(每千克寡核苷酸1000千克)，并且需要对最终产品进行色谱纯化以去除由脱嘌呤、碱基修饰(由形成氰乙基加合物产生)和截短序列产生的杂质。由于现有合成方法的限制，目前市售的基于RNA的治疗剂通常以约90％的纯度并作为非对映异构体的复杂混合物(由硫代磷酸酯修饰产生)提供，事实上，对单个立体异构体的生物活性的了解仍然非常有限。尽管最近开发了许多替代方法，包括使用P(V)试剂(Knouse等人Science 2018,361,1234)以及核苷酸结构单元与脱氧核苷酸基转移酶的共价键联(Palluk等人Nat.Biotechnol.2018,36,645)，现有策略均具有在固体支持物上使用顺序偶联和脱保护反应的相同的基本方法。
因此，需要一种用于制造寡核苷酸，特别是治疗性寡核苷酸(诸如ASO和miRNA)的改进方法。
发明内容
本发明涉及一种合成寡核苷酸，例如治疗性寡核苷酸的方法。本发明旨在提供一种用于以低成本制造高纯度寡核苷酸的可扩展策略。以这种方式，本发明将寡核苷酸确立为可行的疾病治疗方法。本发明提供了一种方法，其中引物的延伸以及切割延伸的引物以释放寡核苷酸是同时进行的。引物-模板可以在反应或孵育阶段期间多次使用，从而催化寡核苷酸合成反应。
在第一方面，本发明提供了一种用于产生单链寡核苷酸的方法，所述方法包括：
i)提供引物-模板，其包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，b)指导寡核苷酸产物合成的模板，以及c)使寡核苷酸产物能够从模板释放的可切割位点；
ii)将引物-模板与核酸聚合酶、一种或多种dNTP和切割剂一起孵育，以形成反应混合物；
iii)将反应混合物维持在允许以下的条件下：a)通过聚合酶延伸引物以形成延伸的引物-模板，和b)通过切割剂在可切割位点处切割延伸的引物-模板以提供寡核苷酸产物；
iv)任选地从反应混合物中分离寡核苷酸产物。
在第二方面，本发明提供了一种寡核苷酸，其通过第一方面的方法产生。
在第三方面，本发明提供了一种用于产生单链寡核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包含：
i.引物-模板，其包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，b)指导寡核苷酸产物合成的模板，以及c)使寡核苷酸产物能够从模板释放的可切割位点；以及
ii.核酸聚合酶和任选地一种或多种核苷酸
iii.切割剂。
在第四方面，本发明提供了一种用于产生单链寡核苷酸的支持物，其包含固定在其上的引物-模板群体，其中每种引物-模板包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，b)指导寡核苷酸产物合成的模板，以及c)使寡核苷酸产物能够从模板释放的可切割位点。
在第五方面，提供了一种产生单链寡核苷酸群体的方法，所述方法包括：
i)提供引物-模板，其包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，b)指导寡核苷酸产物合成的模板，以及c)使寡核苷酸产物能够从模板释放的可切割位点；
ii)将引物-模板与核酸聚合酶、一种或多种dNTP和切割剂一起孵育，以形成反应混合物；
iii)将反应混合物维持在允许以下的条件下：a)通过聚合酶延伸引物以形成延伸的引物-模板，和b)通过切割剂在可切割位点处切割延伸的引物-模板以提供寡核苷酸产物；
iv)任选地从反应混合物中分离寡核苷酸产物。
v)将步骤iii)中的反应混合物维持合适的反应时间以生成寡核苷酸群体，
其中所述核苷酸包括修饰的硫代三磷酸(NTPαS)并且其中所述寡核苷酸群体包含基本上相同的立体异构体；
并且其中所述聚合酶选自由以下组成的组：如表3所示的来自Thermococcuskodakaraensis(KOD)、Stoffel家族B聚合酶9°N、丝状栖热菌(Thermus filiformis)(TfPol)和热液海洋嗜热菌(Marinithermus hydrothermalis)(MhPol)的聚合酶；来自大肠杆菌(E.coli)的Klenow片段、T4和T7聚合酶、SFP1、Stoffel变体SF4-6、来自丝状栖热菌和热液海洋嗜热菌(Mhpol)的Stoffel同源物、或如表3所示的任何前述聚合酶的变体。
本发明的一个方面还提供了一种用于产生单链寡核苷酸的反应混合物，所述反应混合物包含引物-模板，其包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，b)指导寡核苷酸产物合成的模板，以及c)使寡核苷酸产物能够从模板释放的可切割位点；以及：
i)核酸聚合酶和任选地一种或多种核苷酸
ii)切割剂
iii)寡核苷酸产物，其与模板序列互补。
还提供了一种用于产生单链寡核苷酸的细胞，所述细胞包含引物-模板，其包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，b)指导寡核苷酸产物合成的模板，以及c)使寡核苷酸产物能够从模板释放的可切割位点。
附图说明
下文参考附图进一步描述本发明的实施方案，其中：
在附图和实施例中，T是指模板序列，E是指延伸模板，并且P是指产物。本文提及的T、E和P序列的序列可见于表1。
图1示出了寡核苷酸化学修饰。
图2示出了Spinraza核苷酸和序列(*＝PS m＝2’MOE)。
图3是示出了根据本发明的可扩展的寡核苷酸制造的示意图。
图4示出了：A)使用dNTP(1mM)对T1(表1，20μM)进行KOD(Merck，2.5单位)催化的延伸，提供延伸产物E1(表1，7.0分钟，预期质量18170.8)，产率>99％；B)对延伸模板E1(20μM)进行TmEndoV(ThermoFisher，5单位)催化的切割，提供产物P1(表1，4.85分钟，预期质量5544.6)和模板T1(6.54分钟，预期质量12644.2)，产率>99％。左侧示出了UV迹线，并且右侧示出了质谱；C)使用T1(20μM)和dNTP(各自0.25mM)进行一锅KOD和TmEndoV级联过程，提供产物P1(5.45分钟，预期质量5544.6)。
图5不同dNTP浓度下的聚合酶和核酸内切酶活性。PAGE分析示出了A)dNTP浓度高达30mM时的KOD(0.2μM)催化的T1(20μM)延伸。B)dNTP浓度高达2mM时E1(20μM)的TmEndoV(2μM)催化的切割，C)dNTP浓度高达20mM时E1(20μM)的TnEndoV(2μM)催化的切割。
图6示出了温度优化实验：A)热漂移测定，其示出了TnEndoV(顶峰)、TmEndoV(中间峰)和PtEndoV(最低峰)的解链温度；B)在不同温度下由KOD和TnEndoV催化的一锅反应的聚丙烯酰胺凝胶分析。泳道1：梯，泳道2：E1标准品(顶部条带)、T1标准品(中间条带)和P1(底部条带)，泳道3-8：在60℃、65℃、70℃、75℃、80℃、85℃(从左到右)下执行的一锅反应；C)HPLC迹线的叠加示出了KOD活性不受70℃下预孵育24小时的影响。使用T1(20μM)、dNTP(4mM)和新鲜KOD(0.2μM，绿色)或在70℃下预孵育24小时的KOD(0.2μM，蓝色)执行生物转化。HPLC迹线示出了30分钟反应时间后转化为E1。D)HPLC迹线的叠加示出了在70℃下预孵育24小时后，TnEndoV保留85％的活性。使用E1(20μM)和新鲜TnEndoV(2μM，绿色)或在70℃下预孵育24小时的TnEndoV(0.2μM，蓝色)执行生物转化。HPLC迹线示出了30分钟反应时间后转化为T1和P1。
图7示出了对具有不同序列的自引模板的聚合酶/核酸内切酶活性的研究结果。PAGE分析示出了在聚合酶催化的模板延伸和核酸内切酶催化的产物切割的循环之后的P1形成。使用KOD(0.2μM)、TnEndoV(2μM)、模板(10μM)和dNTP(各自1mM)执行一锅反应。DNA梯在泳道1中示出，并且T1和E1标准品在泳道2中示出。产物P1的产率基本上不受5'-生物素化(泳道4)、替代发夹序列(泳道7)、改变肌苷核碱基配对(泳道8和9)或使用模板和单独的引物(泳道6)的影响。在发夹(泳道5)处放置生物素或改变发夹长度(泳道10和11)导致产物产率轻微降低。
图8在优化条件下聚合酶/核酸内切酶催化的P1形成的HPLC分析。HPLC迹线示出了在70℃下孵育12小时后，使用T1(1μM)、dNTP(各自4mM)于20mM Tris-HCl(pH 8)、20mMMgCl2、100mM精氨酸-HCl(pH 8)、100mM谷氨酸盐-KOH(pH 8)、DTT(10mM)、甲酰胺(10％)、海藻糖(0.2M)、1,2-丙二醇(1M)和乙酰化BSA(0.01mg/ml)中的溶液在KOD(2μM)和TnEndoV(2μM)催化的反应期间形成的产物P1。在330个模板延伸和产物切割循环后生成产物，得到0.33mM(相当于1.9g/L)的P1。
图9示出了对修饰的dNTP的聚合酶活性。使用基于时间分辨FRET的测定评价了对修饰的核苷三磷酸的聚合酶活性。使用三种天然dNTP和一种修饰的NTP执行反应。每种聚合酶的值相对于天然dNTP活性来报告，并且代表一式三份测量的平均值。
图10含有单个硫代磷酸酯键联的寡核苷酸的立体选择性合成。HPLC迹线示出了在一锅聚合酶-核酸内切酶反应期间形成的产物。使用T0-T13(10μM)以及3种未修饰的NTP(各自1.4mM)与A)Sp-dATPαS；B)Sp-dCTPαS；C)Sp-dTTPαS；D)Sp-dGTPαS；E)Rp/Sp-dATPαS；F)Rp/Sp-dCTPαS；G)Rp/Sp-dTTPαS；H)Rp/Sp-dGTPαS；(0.7mM)的混合物来执行反应。酶促合成的产物与通过化学合成产生的非对映异构体混合物的比较示出了生物催化过程得到了作为单一非对映异构体的d.e.>99％的产物。
图11TnEndoV对修饰的寡核苷酸的活性的LC-MS分析。UV迹线示出了在延伸模板(20μM)A)E6；B)E2；C)E3；D)E4；E)E5的TnEndoV(2μM)催化的切割反应期间形成的产物。表中提供了每个18聚体产物和模板的解卷积质量。硫代磷酸酯修饰的寡核苷酸E6的EndoV切割提供了预期产物(PA)和5'-去磷酸化类似物(PB)。在70℃下在反应缓冲液中孵育PA标准品(20μM)导致5'-去磷酸化，从而确认副反应不是酶催化的。
图12：EndoV组的底物范围。PAGE分析示出了延伸模板(20μM)的EndoV(2μM)催化的切割，所述延伸模板在切割位点的3'处不含有修饰(E1)、含有18个连续硫代磷酸酯(E6)、2'-氟(E2)、2'-甲氧基(E3)或2'-甲氧基乙氧基(E4)修饰或一个LNA修饰(E8)。在70℃下孵育2小时和4小时后分析样品。标准品包含延伸模板E1、模板T1和18聚体寡核苷酸(P)。
图13：P1的制备规模合成。HPLC迹线示出了使用T2(4μM)和dNTP(各自4mM)由KOD(2μM)和TnEndoV(2μM)催化的P1合成。A)孵育12小时后反应混合物的HPLC，B)分离的产物。表格示出了存在于粗反应混合物和分离的产物中的观察到的质量和杂质。以粗体打印的序列对应于目标产物。
图14：聚合酶组的底物范围。PAGE分析示出了聚合酶(0.2μM)对修饰的NTP的活性。使用T22(20μM)以及3种未修饰的NTP(各自0.25mM)与一种修饰的NTP(0.25mM)的混合物执行反应，并且在70℃下孵育1小时。聚合酶能够转录模板并且掺入修饰的NTP的两个拷贝，从而导致全长延伸。在修饰的NTP不存在下执行对照反应，以确定非互补碱基的背景错误掺入率。A)聚合酶对dNTP(PO)、Sp-dNTPαS(Sp)、Sp-2’-氟-NTPαS(Sp-2’F)、Rp-dNTPαS(Rp)、2’氟-NTPs(2’F)和LNA-NTPs(LNA)的活性。B)聚合酶对2’-甲氧基修饰的NTP的活性，其中+表示2’MeO-NTP添加并且-表示在2’-MeO-NTP不存在下的对照反应。T22＝5’-CTG ACT GAC ACGTGC ACC ATT GGT GCA CGI G-3’
图15聚合酶对依次掺入的2’MeO-NTP和LNA-NTP的活性。分别使用互补的2’MeO-NTP(1mM)或LNA-NTP(1mM)以及最合适的聚合酶SF4-6(0.2μM)或KOD DGLNK(0.2μM)来延伸编码单个核碱基的八个拷贝的模板(T18-T21，20μM)。LC-MS分析揭示了在孵育12小时后，反应产生了部分延伸的产物的混合物。通过MS分析将UV光谱中标记的峰特定为截短的产物，无法特定额外的峰。nt添加＝通过聚合酶掺入的核苷酸碱基数目。
图16：使用修饰的NTP混合物的聚合酶催化的反应。分别使用KOD(0.2μM)和TfPol*(0.2μM)，使用Sp-dNTPαS(2种，每种0.25mM)和2’F-NTPs(3种，每种0.25mM)的混合物来延伸模板T2(20μM)。使用Sp-2’F-A/GTPαS(4种，每种0.25mM)和KOD(0.2μM)的混合物来延伸模板T7(20μM)。PAGE分析示出了反应已完全转化为延伸产物；B)使用LC-MS分析来确认产物身份。添加数目＝聚合酶掺入的核苷酸碱基数目。
图17：硫代磷酸酯中心的TnEndoV立体选择性经历水解。使用KOD(0.2μM)和Sp-dNTPαS(各自0.5mM)产生立体定义的延伸模板。将酶促合成产物(20μM)的TnEndoV(2μM)介导的切割与对应的立体随机寡核苷酸(20μM)的切割进行比较。PAGE分析示出了A)模板T1和T15-T17(20μM)的聚合酶催化的延伸进行至完成。每个模板编码在第一位置具有不同的核碱基的18聚体寡核苷酸产物。B)具有Rp键联的立体定义寡核苷酸的TnEndoV(2μM)介导的切割(泳道9-12)进行至完成，而对应的立体随机寡核苷酸的切割在50％转化时停止(泳道13-16)。活性不受切割位点3'的碱基的影响。
图18：一锅聚合酶/EndoV催化的P19-P32产生。UPLC色谱图(在260nm处记录)示出了在一锅聚合酶-核酸内切酶催化的反应后的产物形成。表S1中给出了每种生物转化的具体反应条件。通过质谱法确认产物和副产物的质量。T：模板，E：延伸模板。以粗体打印的核苷酸序列对应于正确的8聚体产物(+：LNA，*：硫代磷酸酯键联，f：2’-氟，P：5’磷酸基团，HO/OH：5’/3’羟基)。以粗体打印的序列对应于正确的产物。以红色突出显示的碱基对应于非模板化过度延伸。
图19：Vitravene的制备规模合成。UPLC色谱图(在260nm处记录)示出了A)在70℃下孵育12小时后的粗反应混合物。B)在反应后处理后的分离产物。在反应期间，产物发生5'-脱硫代磷酸化(峰a)。在反应缓冲液中孵育标准品会导致5'-脱硫代磷酸化，从而确认副反应不是酶催化的。目标产物含有5'羟基，因此在反应后处理期间使用碱性磷酸酶去除任何剩余的5'硫代磷酸基团。
图20：在钴和锰辅助因子存在下，聚合酶对Rp-dNTPsαS的活性。A)PAGE分析示出，使用互补的Rp-dNTPαS(1mM)并在0.5mM COCl2或MgCl2存在下，编码单个核碱基的八个拷贝的模板的KOD催化的延伸。B)LC-MS分析示出，在1mM CoCl2和0.4mM MnCl2的混合物存在下，将八个Rp-dATPαS核苷酸添加到KOD催化的自引模板中。5.2分钟处的峰对应于延伸产物(观察到的质量为12141)，并且0.5分钟处的峰对应于未反应的NTP。
图21：在替代性亲核试剂存在下的核酸内切酶活性。在高浓度的不同亲核试剂存在下执行的EndoV反应的LC-MS分析后的UV迹线。延伸模板E1的亲核攻击产生“修饰的18聚体产物”，其含有甘油(检测到的质量为5618.8)、乙二醇(检测到的质量为5587.4)、1,2-丙二醇(5601.9)或1,3-二氨基丙醇(检测到的质量为5616.6)官能化的5'-磷酸基团。主要产物是具有未修饰的5'-磷酸基团的典型18聚体。
图22：寡核苷酸序列的生物催化合成。使用最合适的聚合酶和TnEndoV在一锅生物转化中产生具有不同序列和化学修饰的寡核苷酸。转化百分比描述了NTP起始材料到产物的转化。具体反应条件参见表3。
具体实施方式
本发明提供了一种用于以通用且可扩展的方式合成单链寡核苷酸，例如治疗性寡核苷酸的方法。
本发明基于提供可循环的或催化的引物-模板的新概念，所述引物-模板通过聚合酶延伸以形成双链体核酸分子，其在本文中被称为延伸的引物模板。使用合适的切割系统来切割双链体的一条链以允许释放延伸的部分，所述延伸的部分是期望的单链寡核苷酸产物。合适地，双链体在构建于核酸分子中的可切割位点处被切割，从而释放单链寡核苷酸产物并重新生成引物-模板。重新生成引物-模板的切割实现了延伸和切割的重复循环，这将导致寡核苷酸产物在反应混合物中积累。因此，本发明的方法能够在单个操作中递送靶寡核苷酸，这与本领域已知的与寡核苷酸的化学合成相关的链延伸、氧化和脱保护的迭代循环形成对比。在化学合成中，需要多个迭代反应来产生短寡聚物。在本发明中，可以在单个反应中产生寡核苷酸。本发明的方法的优点是能够在水性条件下执行，而不需要大量乙腈。此外，本发明的方法比标准亚磷酰胺化学具有更高的原子效率，因为不需要保护基团。本发明的方法的优点还在于能够递送与经由化学合成产生的寡核苷酸产物相比纯度显著更高的寡核苷酸产物，从而减少对昂贵的色谱纯化的需要。另外，本发明的方法可以是等温的。其优点是减少在每个循环的不同部分期间改变温度所需的能量。
本发明提供了一种用于以可扩展的方式制造治疗性寡核苷酸的方法，其通过提供一种用于以高纯度水平和可扩展方式产生可包含一种或多种修饰的或非天然的核苷酸的寡核苷酸以大量产生治疗性寡核苷酸的方法来实现。本发明的方法可利用适于将一种或多种修饰的核苷酸掺入到核苷酸链中的修饰的聚合酶。
本发明基于同时使用引物-模板、聚合酶和切割剂来产生寡核苷酸，其中在从模板释放新合成的寡核苷酸之后，引物-模板可在同一反应中用于其他一轮或多轮寡核苷酸合成。当模板被复制时，合成的寡核苷酸被切割系统切割并且从模板中释放，留下可用于下一轮寡核苷酸合成的引物-模板。因此，在同一反应中组合使用引物-模板、聚合酶和切割剂意指所述反应不是化学计量的，并且能够生成超过存在于反应中的模板量的产物。
定义
在本文中，“核酸分子”是指具有特定序列的核苷酸链。核酸分子可含有所有四种核苷酸(G、A、T/U和C)或其任何组合(例如，G、A、T/U或C或其任何组合)。
“寡核苷酸”是短核酸序列，通常长度为5至100个核苷酸。
在本文中，“单链核酸”是指未与独立的第二核苷酸多聚体结合(或碱基配对)的第一核苷酸多聚体，所述第二核苷酸多聚体能够与所述第一核苷酸多聚体形成双链体。“双链核酸”序列是与独立的第二核苷酸多聚体碱基配对以形成双链体的第一核苷酸多聚体。
如本文所用，术语“寡核苷酸合成反应”是指其中通过将单体逐一添加到生长链上来合成寡核苷酸的反应。核苷酸可以添加至生长链的3'端。所述反应可以通过合适的聚合酶执行。
本文提及的“核苷三磷酸”是指含有与三个磷酸基团结合的核苷(即，附接至脱氧核糖或核糖分子的碱基)的分子。“核苷酸”或“核酸残基”是指含有与一个磷酸结合的核苷的分子。核苷酸是指通常经由磷酸二酯键联掺入或可以掺入到寡核苷酸链中的任何化合物和/或物质。含有脱氧核糖的核苷三磷酸的实例是：脱氧腺苷三磷酸(dATP)、脱氧鸟苷三磷酸(dGTP)、脱氧胞苷三磷酸(dCTP)或脱氧胸苷三磷酸(dTTP)。含有核糖的核苷三磷酸的实例是：腺苷三磷酸(ATP)、鸟苷三磷酸(GTP)、胞苷三磷酸(CTP)或尿苷三磷酸(UTP)。其他类型的核苷可以与三个磷酸结合以形成核苷三磷酸(核苷酸)，诸如天然存在的修饰的核苷和人工核苷。
“修饰的”核酸是其中磷酸二酯键联、糖和/或碱基已被改变的核酸。
“RNA”是一种线性分子，由以下四种类型的被称为核糖核苷酸碱基的较小分子构成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和尿嘧啶(U)。“DNA”是一种线性分子，由以下四种类型的被称为脱氧核糖核苷酸碱基的较小分子构成：腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)和胸腺嘧啶(T)。RNA和DNA可以各自是单链或双链的。RNA和DNA可以各自形成二级结构。
“微小RNA”是约17-25个核苷酸的单链RNA，其可在细胞增殖、细胞凋亡或分化中发挥作用。miRNA可包含修饰的核苷酸。miRNA可以是治疗性寡核苷酸。
“ASO”(反义寡核苷酸)是一种可与mRNA靶标互补的短合成DNA或RNA。ASO可下调下游靶标。ASO通常被修饰，例如被硫代磷酸酯化。
“适体”是一种以高亲和力和特异性结合靶标的核酸分子，所述靶标诸如蛋白质、核酸、寡糖、小分子、激素、细胞因子、信号传导分子、金属离子或有机分子。适体可以是单链或双链的，或者部分单链或部分双链的。适体可包含修饰的核苷酸。
“聚合酶”催化通过添加来源于核苷三磷酸或脱氧核苷三磷酸的连续核苷酸来形成寡核苷酸链。聚合酶反应仅在适当的核酸模板存在下发生。每个引入的核苷三磷酸首先与该模板中的碱基形成适当的碱基对。然后，聚合酶将引入的碱基与链中的前体连接在一起。因此，聚合酶是模板导向酶。
如本文所用，“引物”是指天然或合成的寡核苷酸，其能够充当核酸合成的起始点并且沿着模板从其3'端延伸，使得形成延伸的双链体。引物的延伸通常用核酸聚合酶(诸如DNA或RNA聚合酶)来进行。延伸过程中添加的核苷酸的序列由模板多核苷酸的序列决定。引物通常由DNA聚合酶延伸。
在本文中，“模板”是由聚合酶复制的核酸序列。模板提供了待合成的所需寡核苷酸的互补序列。
“延伸的引物-模板”是在寡核苷酸合成期间形成的产物，其中引物启动与模板链碱基配对的核酸链的合成。
“引物-模板”是包含引物并且因此不需要单独的引物来启动寡核苷酸合成的模板。
“自引模板(self-priming template)”是一种核酸分子，其包含允许自我结合以形成双链引物序列和单链模板序列的序列。
“发夹环”或“茎环”结构是单链DNA或RNA中可能存在的分子内碱基配对模式。当同一条链的两个区域(通常在相反方向读取时序列互补)碱基配对以形成以不配对环结尾的双螺旋时，就会出现发夹环。
“切割”是指多核苷酸链中的两个核酸残基之间的磷酸二酯键的切割。
本文提及的“可切割位点”是核酸分子中的核苷酸之间的键或键对，其可被切割以断裂核酸分子或释放核酸分子的一条链。可切割位点可以由能够被酶识别的特定核苷酸序列来定义。可切割位点还可以由能够被某些核酸酶识别的修饰的核苷酸的位置来定义。
本文提及的“切割”酶或系统能够切割多核苷酸链内的磷酸二酯键。
“延伸”是指合适地通过聚合酶的作用合成新的寡核苷酸链。
“固定化”在本文中是指核酸分子或结合配偶体与支持物的可逆或不可逆附接。
与另一个序列“互补”的序列具有与另一个序列的核苷酸碱基配对以形成稳定的双链体或双链序列的核酸序列。“基本上互补”意指并非两个序列之间的所有碱基对都匹配，但存在的碱基配对足以形成稳定的双链体。
在本文中，“释放”是指合成的寡核苷酸链从模板解离。
“试剂盒”是指用于递送用于进行本发明的方法的材料或试剂的任何递送系统。
试剂
本发明在同一反应中利用用于合成所需寡核苷酸的试剂。同一反应中存在的试剂可包括引物、模板、聚合酶、切割系统、核苷酸残基、辅助因子和用于反应优化的试剂。
I)引物-模板
引物-模板可以是RNA或者可以是DNA，并且可以包括修饰的RNA或DNA。
引物-模板包含使其能够执行如下三种功能的特征：作为启动聚合酶介导的延伸的引物；作为用于合成新寡核苷酸链的模板；以及能够从核酸分子中切割新的寡核苷酸。因此，它可以包含用于启动寡核苷酸合成的引物、指导寡核苷酸合成的模板、以及使寡核苷酸产物能够从模板释放的可切割位点。
引物-模板通过向引物的3'端依次添加核苷酸来指导延伸，以形成延伸的引物-模板。引物相对于模板序列定位，使得模板序列(优选完整的)在引物的延伸中被复制。引物序列可以位于模板序列的上游。引物序列可以是与模板序列上游的序列结合以在单链模板序列上游形成双链(双链体)序列，并且从其启动聚合酶活性的序列。因此，引物-模板包含单链核酸模板序列和包含引物序列的双链(或双链体)部分。因此，单链模板序列延伸超过包含引物的双链部分，以形成5'尾或粘端，其可用于通过引物序列的3'端的延伸而被复制。模板序列可以是从双链部分延伸的5'至3'序列。
包含引物的引物-模板的双链部分由一对互补核酸序列形成。包含引物的双链部分可以由单链核酸分子形成，所述单链核酸分子包含一对互补序列，所述互补序列结合使得单链核酸分子折叠形成二级结构。由包含一对互补序列的单链核酸分子形成的引物模板在本文中可称为自引模板。可以在单链核酸分子中提供互补序列对，使得当结合以形成双链体时，核酸分子自身不对称折叠，以形成双链部分，其在一端具有折叠或环并且在另一端具有形成模板的单链序列的突出端。合适地，单链分子可以不对称折叠，使得突出的单链模板序列的末端是5'端，并且形成双链部分的序列的末端是3'端。该结构提供了用于延伸的游离3'OH端，从而通过与模板序列发生碱基配对来形成新的寡核苷酸序列。合适地，折叠单链序列，使得3'末端核苷酸与紧邻模板序列的第一个核苷酸(其上游)的核苷酸碱基配对。以这种方式，单链突出端从待复制的模板序列开始。
合适地，通过核酸分子的互补序列的配对形成的二级结构是发夹环。发夹环由采用二级结构的单链核酸分子形成，其中序列自身折叠以在一端形成双链茎部分和环。发夹环单链核酸分子由于存在被第三序列分隔的互补序列对而呈现发夹结构，使得互补序列碱基配对以形成双链茎部分，并且第三插入序列在双链茎部分的一端处形成环。互补序列对中的一条序列的3'端充当用于核酸序列转录的引物。合适地，茎部分的长度和/或环部分的尺寸具有合适的长度尺寸，以允许聚合酶结合发夹环并且从茎部分一端的游离3'羟基启动转录。
茎部分的长度由单链序列中的互补序列的长度决定，所述互补序列发生碱基配对以形成发夹环。环的尺寸通常由互补序列的两个区段之间的非互补序列的长度决定，所述区段发生碱基配对以形成茎部分。发夹环包含5'端和3'端，通常位于双链茎部分的末端。3'端包含游离OH基团，聚合酶可启动引物延伸至所述游离OH基团。发夹环可以是允许其充当转录引物的任何合适的尺寸。合适地，发夹的环部分包含多于3个核苷酸，以允许形成环结构。合适地，发夹环的环部分包含多于4个核苷酸，合适地4至30个核苷酸，更合适地4至25、4至20或10至20个核苷酸、或在其之间的任何范围或整数。双链茎部分可以是任何合适的长度，例如长度为1至200个核苷酸，或者长度为1至190、1至180、1至170、1至150、1至120、1至100、或10至90、20至80、或30至50个核苷酸，或使用任何前述起点和终点的任何范围、或在其之间的任何长度。发夹环的茎部分的最合适的长度可以是10至30个核苷酸，最合适地长度是10至20个核苷酸。
发夹环的茎部分通常是双链的，由如本文所述自身折叠的单链核酸形成。发夹环的茎部分具有游离5'端和游离3'端。茎部分的两条链可以具有相同的长度，从而形成平端，或者可以具有不同的长度，从而在一条链中形成粘端。平端或粘端的存在将由互补序列在形成发夹环的单链核酸序列内的位置来决定。合适地，茎部分包含平端。包含延伸超出双链茎部分(供聚合酶复制)的模板序列的核酸分子可被认为具有粘端，或不具有任何与其结合的互补碱基的序列。
用于在单链核酸分子中提供以实现发夹环形成的互补序列的实例在表1中示出。形成环结构的非互补序列的实例在表1中示出。形成用于本发明的发夹环的单链核酸序列可包含如表1中所示的互补(茎)序列和环序列的任意组合。
或者，引物-模板可包含不是由单一自互补核酸序列形成的单独的引物和模板相反，引物-模板可包含i)单链核酸分子模板；ii)与其发生碱基配对的单独的引物序列；以及iii)可切割位点。合适地，引物序列比单链分子模板短。合适地，引物在单链核酸分子模板的3'端发生碱基配对，从而提供在由引物和单链核酸分子模板形成的双链体下游延伸的单链模板。合适地，引物包含用于通过聚合酶延伸的游离3'羟基。因此，这种引物-模板可以等同于如本文所述的自引模板，但不具有诸如发夹环的二级结构。
除了碱基配对之外，引物和模板还可以通过其他方式连接。例如，引物可以固定在模板上，或者引物和模板可以化学连接。可以使用任何合适的方式将引物与模板结合。如果引物和模板在反应期间分离，则可能导致生成副产物而不是期望的寡核苷酸，因为除模板之外或与模板一起，引物可用于指导合成(即，可复制引物)。使用将引物和模板结合使得在反应期间分离的方式降低了副产物形成的可能性，并且有助于下游产物分离。
在引物-模板的引物部分作为单独的核酸分子提供的情况下，它可以是RNA分子或DNA分子。它可以包含一种或多种天然和/或修饰的核苷酸残基。引物可以是3'核糖核苷酸引物，其包含在其3'端具有核糖核苷酸残基的DNA序列。这种引物在将寡核苷酸从模板序列切割后保留其功能，并且可以重复使用。用于制备3'核糖核苷酸引物的合适方法是本领域技术人员已知的。
在寡核苷酸合成之前，将引物与模板合适地杂交。在使用自引模板的情况下，在寡核苷酸合成之前形成二级结构。形成引物-模板所需的杂交条件将取决于包括互补引物序列对或引物和模板序列的特异性在内的因素。
引物和模板的杂交可以在寡核苷酸合成反应中发生，或者在其之前发生。如果杂交在合成反应中在聚合酶、切割系统和任何其他试剂存在下发生，则杂交条件必须使得不影响其他试剂的功能。
引物-模板的模板部分包含单链序列，其提供待复制的序列，用于合成期望的寡核苷酸序列。合适地，模板的序列使得其不与引物-模板的任何部分退火或碱基配对，使得其保持单链并可用作用于聚合酶介导的延伸的模板。因此，合适地，引物-模板的模板部分的序列与引物-模板的序列的任何剩余部分的互补程度不足以允许模板的双链体形成。因此，模板序列包含与引物-模板核酸分子的剩余部分不超过1、3、5、10、15或20％的序列互补性。“序列互补性”意指序列能够发生碱基配对以形成双链序列。
模板将包含与待合成的期望寡核苷酸的序列互补的序列。因此，模板可包含与治疗性寡核苷酸(诸如适体、mRNA或siRNA)互补的序列。合适地，模板序列与待合成的寡核苷酸序列100％、99％、98％、97％、96％、95％、94％、93％、92％、91％、90％、95％或99％互补。
模板可包含两个或更多个部分，其中每个部分指导单个或不同的期望寡核苷酸的合成。因此，单个模板可用于产生两种或更多种不同的寡核苷酸。因此，模板序列可以指导寡核苷酸产物的合成，然后可以将寡核苷酸产物切割成单独的、期望的寡核苷酸。模板序列可以是将一个或多个限制性酶位点掺入产物中，以允许将产物切割成单独的期望的寡核苷酸的合适的序列。
模板可包含指导特征或基序合成的序列，例如但不限于终止序列、间隔序列、聚腺苷酸化序列、标签和/或可切割位点。当模板中包含间隔区或转录终止序列时，可包括可切割位点(或其互补序列)以实现合成的寡核苷酸的切割，从而产生期望的产物而不产生任何额外序列。
模板序列的长度可以合适地与期望的寡核苷酸的长度相同，或者可以更长，例如在它包含两个或更多个寡核苷酸的模板序列或如上所述的一个或多个特征或基序的模板的情况下。
模板可以是任何合适的长度。模板的长度可以是3至200个核苷酸，合适地长度为5至200、5至150、5至100、10至100、10至90、10至80、10至70、10至60、10至50、20至50、20至40或20至30个核苷酸，或使用任何前述起点和终点的任何范围、或在其之间的任何长度。模板序列的最合适的长度可以是10至30个核苷酸，最合适地长度是10至20个核苷酸。
延伸的引物模板可以是RNA、DNA或者可以是RNA和DNA的杂合体。例如，在引物-模板是DNA并且延伸部分是RNA的情况下，延伸的引物-模板是RNA和DNA的杂合体。延伸的引物-模板可包含一种或多种修饰的核苷酸。
引物-模板包含使合成的寡核苷酸能够从模板中释放的可切割位点，以及使引物-模板循环用于另外一轮或多轮寡核苷酸合成。
可以使用任何合适的可切割位点。
可切割位点合适地位于核酸分子的茎部分中，在引物起始位点的上游。它可以位于紧邻引物起始位点的茎部分中，或者可以在引物起始位点的1至5个核苷酸内，合适地在引物起始位点的1至2个核苷酸内，更合适地在切割位点和引物起始位点之间可以存在单个残基。适当地选择可切割位点，使得切割不改变寡核苷酸产物或引物-模板。换句话说，除了从引物-模板切割寡核苷酸之外，切割是无痕的并且在寡核苷酸产物中或在释放寡核苷酸的引物-模板中无法检测到。
可切割位点可包括可切割键联、可切割核苷酸或特定序列基序。
可切割键联包括例如修饰的3'-5'核苷酸间键联，其代替以下磷酸二酯基团之一，诸如二烷氧基硅烷、硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯、甲基膦酸酯、甲磺酰基亚磷酰胺和氨基磷酸酯核苷酸间键联。
可切割核苷酸可包括但不限于脱氨基碱基、碱基类似物、脱碱基位点或脲位点、或错配核苷。可切割寡核苷酸类似物还可以包括碱基或糖之一上的取代基或替换，诸如7-脱氮鸟苷、5-甲基胞嘧啶、肌苷、尿苷等。可切割核苷酸包括可被核酸内切酶(合适地为留下游离3'羟基以能够实现另外轮次的延伸的核酸内切酶)切割的碱基类似物。在一些实施方案中，可切割核苷酸包括包含可被甲酰胺嘧啶DNA糖基化酶切割的碱基类似物的核苷酸，所述碱基类似物包括但不限于7,8-二氢-8-氧代鸟嘌呤、7,8-二氢-8-氧代肌苷、7,8-二氢-8-氧代腺嘌呤、7,8-二氢-8-氧代水粉蕈素(nebularine)、4,6-二氨基-5-甲酰胺嘧啶、2,6-二氨基-4-羟基-5-甲酰胺嘧啶、2,6-二氨基-4-羟基-5-N-甲基甲酰胺嘧啶、5-羟基胞嘧啶、5-羟基尿嘧啶。在一些实施方案中，可切割核苷酸包括包含可被胸腺嘧啶DNA糖基化酶切割的碱基类似物的核苷酸，所述碱基类似物包括但不限于5-甲酰基胞嘧啶和5-羧基胞嘧啶。在一些实施方案中，可切割核苷酸包括包含可被人烷基腺嘌呤DNA糖基化酶切割的碱基类似物的核苷酸，所述碱基类似物包括但不限于3-甲基腺嘌呤、3-甲基鸟嘌呤、7-甲基鸟嘌呤、7-(2-氯乙基)-鸟嘌呤、7-(2-羟乙基)-鸟嘌呤、7-(2-乙氧基乙基)-鸟嘌呤、1,2-双-(7-鸟苷基)乙烷、1,N<6>-乙烯基腺嘌呤、l,N<2>-乙烯基鸟嘌呤、N<2>,3-乙烯基鸟嘌呤、N<2>,3-乙烯基鸟嘌呤、5-甲酰尿嘧啶、5-羟甲基尿嘧啶、次黄嘌呤。在一些实施方案中，可切割核苷酸包括可被5-甲基胞嘧啶DNA糖基化酶切割的5-甲基胞嘧啶。可以是核苷酸类似物，诸如被特定糖基化酶(例如，分别是尿嘧啶脱氧糖基化酶，随后核酸内切酶VIII，和8-氧代鸟嘌呤DNA糖基化酶)识别的脱氧尿苷或8-氧代-脱氧鸟苷。在一些实施方案中，可切割核苷酸包括包含可被核酸内切酶V识别的碱基类似物的核苷酸，所述碱基类似物例如肌苷、尿嘧啶、次黄嘌呤、黄嘌呤、脱碱基位点、脲位点、碱基对错配插入和缺失。合适的可切割核苷酸是肌苷，用于被核酸内切酶V切割。
可切割序列基序可以是被以序列特异性方式切割序列的酶识别的任何序列。例如，可切割序列可以是被酶(例如核酸内切酶)识别的特定序列。切割可以在序列基序的上游、下游或内部进行。例如，序列基序可以是被Nt BstNBI识别的GAGTCNNNN*N(其中N是任何碱基并且*是切割位点)；被NtAlwl识别的GGATCNNNN*N；或被NtBspQI识别的GCTCTTCN*N。其他实例是本领域技术人员已知的。合适地，切割位点(例如，核苷酸)位于引物起始位点上游并且合适地在引物起始位点的1至5个核苷酸内，合适地在聚合酶起始位点的1至2个核苷酸内，或者紧邻聚合酶起始位点。
合适地，在核酸分子中提供单个可切割位点，使得引物/模板可以在释放寡核苷酸产物后被回收。合适地，反应中产生的寡核苷酸产物不包含被该反应中使用的切割系统识别的可切割位点。
可切割位点可以是用于核酸内切酶V切割的脱氨基碱基，或用于切口核酸内切酶的相关序列。
合适地，脱氨基碱基不用于治疗性寡核苷酸产品中，因为它们可以与多个碱基发生沃森-克里克碱基配对，因此不具有特异性。
可切割位点可以是被限制性酶(例如核酸内切酶)识别的共有序列。在可切割位点是酶结合位点的情况下，可以在模板部分中提供可切割位点的互补序列，以在寡核苷酸分子的合成期间生成可切割位点，使得在新生成的序列中提供可切割位点。
引物-模板可包含一个或多个基序或序列，例如但不限于，包括结合位点、标记、固定位点和可切割位点。任何此类基序或序列中的一种或多种可以存在于引物序列中或可操作地连接至引物序列，所述引物序列包含发夹环或单链核酸模板或两者。
可以提供固定位点或部分以将核酸分子与支持物(例如，固体支持物)结合，例如在阵列的形成中。固定位点或结合位点可以是任何合适的序列或结合剂/部分，其介导直接与支持物结合或与支持物上提供的结合配偶体结合。结合配偶体的实例包括寡核苷酸衔接子，其被配置为结合核酸分子、分析物/抗体、寡核苷酸对、核酸分子和互补序列、适体、亲和力结合蛋白和受体或结合蛋白、脂质、碳水化合物等及其结合配偶体。合适的实例是链霉亲和素，其可以结合生物素化核酸分子。
固定位点可以提供在核酸分子的环、茎或模板序列的下游(5')中。合适地，固定位点提供在一个位置处，使得核酸分子的固定不会在空间上干扰聚合酶或切割系统与核酸分子的结合和/或活性。在合适的实施方案中，固定位点可以提供在发夹环的环中，合适地在环的中点处。在合适的实施方案中，固定位点可以提供在模板序列中，前提条件是固定位点的存在不影响聚合酶的活性。在合适的实施方案中，固定位点可以提供在模板序列的5'端处或5'端下游。
引物和模板可以使用本领域可用的合适技术来设计，例如Primer-BLAST，并且使用Primer 3、BLASTN、Melting、pandas和Python标准库来实现。
引物和模板设计的参数包括退火序列的长度和解链温度。对于给定序列，增加长度会增加特异性结合相互作用的强度，但也可能通过与脱靶序列的非特异性结合增加不适当的连接和/或降低反应中探针的有效浓度。
自引模板可以使用任何合适的方法，例如酶合成或化学合成来制备。自引模板可以使用重组或克隆方法来制备，所述方法是本领域技术人员已知的和可获得的。合适的方法可以包括酶促扩增核酸以提供引物-模板的多个拷贝。
II)核苷酸
提供核苷酸以使用模板使聚合酶能够延伸茎部分的3'端以产生期望的寡核苷酸，从而提供序列。核苷酸可包含腺嘌呤、胞嘧啶、胸腺嘧啶、鸟嘌呤和尿嘧啶。核苷酸可以是天然的(未修饰的)核苷酸或可以是修饰的或非天然的核苷酸、或核苷酸类似物、或其组合。非天然存在的类似物(或修饰的核苷酸)可包括包含修饰的碱基、糖或核苷间键联的核苷酸，所述修饰的碱基、糖或核苷间键联例如硫代磷酸酯核苷酸间键联、5'-N-亚磷酰胺键联、含有允许标记附接的连接基团的碱基，所述标记诸如荧光团或半抗原等。每当寡核苷酸或多核苷酸的使用需要酶促处理(诸如通过聚合酶延伸、通过连接酶连接等)时，普通技术人员将理解在这些情况下，寡核苷酸或多核苷酸在任何或一些位置处将不含有核苷间键联、糖部分或碱基的某些类似物。
在一些实施方案中，核酸类似物是以下各项、包含以下各项或由以下各项组成：一种或多种核苷类似物(例如，2-氨基腺苷、2-硫胸苷、肌苷、吡咯并嘧啶、3-甲基腺苷、5-甲基胞苷、C-5丙炔基-胞苷、C-5丙炔基-尿苷、2-氨基腺苷、C5-溴尿苷、C5-氟尿苷、C5-碘尿苷、C5-丙炔基-尿苷、C5-丙炔基-胞苷、C5-甲基胞苷、2-氨基腺苷、7-脱氮腺苷、7-脱氮鸟苷、8-氧代腺苷、8-氧代鸟苷、0(6)-甲基鸟嘌呤、2-硫胞苷、2'-脱氧核苷5'-三磷酸(dNTP)类似物(包括Sp-dNTPαS、Rp-dNTPαS、Sp-2’F-dNTP和dNTP-αS)、甲基化碱基、插入碱基及其组合。在一些实施方案中，与通常天然存在的核酸中的糖相比，核酸类似物包含一种或多种修饰的糖(例如，2'-氟核糖、2'-甲氧基核糖、2'-甲氧基乙氧基核糖、核糖、2'-脱氧核糖、阿拉伯糖、己糖或锁核酸)。
合适地，提供了多个核苷酸(或群体)。多个核苷酸可以是或可以不是相同类型的碱基(例如，A、T、G、C、U等)。例如，溶液可包含或可不包含仅一种类型的碱基。溶液可包含至少1种类型的碱基或至少2种、至少3种、至少4种、至少5种、至少6种、至少7种、至少8种、至少9种或至少10种类型的碱基。例如，溶液可包含A、T、C、U和G的任何可能的混合物。可以提供A、T、C和G的任何可能的混合物。多个天然核苷酸和非天然核苷酸可以是或可以不是相同类型的碱基(例如，A、T、G、C)。在一些情况下，溶液可包含多种天然核苷酸和非天然核苷酸。多种天然核苷酸和非天然核苷酸可以是或可以不是相同类型的碱基(例如，A、T、G、C)。多种核苷酸可以基本上全部是天然核苷酸，或者可以基本上全部是修饰的核苷酸，如本文所述或技术人员已知的。多种核苷酸可以是天然的和修饰的核苷酸的混合物。在这种混合物中，修饰的:天然的核苷酸的比率可以取决于待产生的寡核苷酸的性质以及其中修饰的核苷酸的比例。修饰的核苷酸:天然的核苷酸的合适比率可以是1:99；5:95；10:90；20:80；30:70；40:60；50:50；60:40；70:30；80:20；90:10；95:5或99:1或任何前述上限和下限之间的任何范围、或在其之间的任何整数。
多种核苷酸中的一种或多种核苷酸可以用染料、荧光团或量子点标记。例如，溶液可包含标记的核苷酸。在另一个实例中，溶液可包含未标记的核苷酸。在另一个实例中，溶液可包含标记的核苷酸和未标记的核苷酸的混合物。
可以任何合适的浓度或量提供核苷酸，所述浓度或量可以基于模板的长度和单个反应中寡核苷酸合成的预期轮数来计算。可以合适的量提供核苷酸，使得所提供的核苷酸中至少30％、40％、50％、60％、70％、80％或90％或基本上所有都用于反应中。因此，可以基于技术人员的知识来计算每个反应的核苷酸量。或者，可以过量提供核苷酸，例如在延伸轮数尚未预先确定的情况下。与反应中待产生的期望数量的寡核苷酸所需的核苷酸的计算量相比，可以1.5倍、2倍、3倍、4倍或五倍过量提供核苷酸。例如，如图8所示的“优化”反应使用4uM模板并完成53轮，以产生212uM产物。寡核苷酸产物含有18个核苷酸，因此反应使用3.78mM dNTP。反应条件提供16mM核苷酸，即4倍过量。
III)聚合酶
用于本发明的聚合酶可以是能够合成核苷酸链的任何合适的酶。聚合酶可以是RNA聚合酶或DNA聚合酶。合适地，用于本发明的聚合酶可以是能够将修饰的或非天然的核苷酸掺入到核酸链中的聚合酶。聚合酶可以是天然存在的或者可以是工程化的。合适的聚合酶可以是真核的或原核的。
合适的聚合酶可以是能够耐受高浓度的dNTP而基本上不影响其活性或性能的聚合酶。本文描述了此类聚合酶的实例。能够耐受高浓度dNTP的聚合酶的实例是KOD或其变体。
合适的聚合酶可以是热稳定性聚合酶，例如Taq聚合酶、来自激烈火球菌(Pyrococcus furiosus)的pfu或来自Thermococcus kodakaraensis的KOD(Tkod-pol)、或其变体或工程化版本。可能适合用于本发明的其他合适的聚合酶包括来自大肠杆菌的Klenow片段、T4和T7聚合酶、SFP1、Stoffel变体SF4-6、来自丝状栖热菌和热液海洋嗜热菌(Mhpol)的Stoffel同系物、以及家族B聚合酶9°N、Q5 DNA聚合酶及其变体或工程化版本。可能适合用于本发明中的工程化聚合酶的列表在Trends in Biotechnology,2019年10月,第37卷,第10期https://doi.org/10.1016/j.tibtech.2019.03.011中提供，或者是本领域技术人员已知的。变体可以具有适用于本发明的一个或多个改进的特征，例如改进的保真性、稳定性或提供基本上单一的立体异构体的能力。合适的变体包括例如如本文所提供的SF4-6、TfPol*和MhPol*。最合适地，SF4-6、TfPol*和MhPol*可用于生成基本上相同的立体异构体的寡核苷酸群体。
本文还提供了一种聚合酶，其具有如表3中定义的序列或与其具有至少80％、85％、90％或95％或更多序列同一性的序列。合适的修饰的聚合酶将能够延伸RNA或DNA序列；将能够接受一个或多个修饰的核苷酸进入核苷酸链；并且将具有如表3所述的核苷酸突变中的一种或多种。这种聚合酶可以用于本发明的方法中，或者可以在本发明的试剂盒中提供。本发明的聚合酶可以是能够耐受高浓度核苷酸，使得高于3、5、8、10、15、20、25、30、35、40、45或50mM的核苷酸浓度基本上不抑制或影响聚合酶活性的聚合酶。
反应中可以使用任何合适量的聚合酶。聚合酶的量可以基于反应的特征0.1-5来选择，诸如待生成的产物的量、核苷酸的浓度、聚合酶的性质和效率、以及切割剂的性质。技术人员将能够使用本文提供的信息和他的公知常识来确定引物的合适量。合适地，本发明的方法可以使用不超过10mol％、9mol％、8mol％、7mol％、6mol％、5mol％、4mol％、3mol％、2mol％或1mol％的聚合酶。合适的范围可以是0.1-5μM。
用于本发明的聚合酶可以通过任何合适的方法产生，例如聚合酶可以在宿主细胞中重组产生。合适的宿主细胞将是本领域已知的，并且可以是微生物细胞、哺乳动物细胞或细胞系。合适的宿主细胞可以是细菌细胞，例如大肠杆菌。
V切割剂
本发明的试剂包括合适的切割剂，其可以介导延伸的核酸分子在可切割位点处的切割，以使合成的寡核苷酸能够从核酸分子模板解离。切割剂合适地是位点特异性的，使得其在特定位点处切割延伸的引物-模板。
本文提及的“切割剂”是指能够切割新形成的寡核苷酸和引物之间的键的物质。用于本发明的合适的切割剂将合适地从引物-模板切割寡核苷酸并在末端留下游离的3'OH基团，使得引物-模板可以被回收并再次用作用于寡核苷酸合成的模板。切割剂可以是化学切割剂、酶切割剂、或光切割剂、或任何其他合适的试剂或系统。合适地，切割剂是酶切割剂。
合适的切割剂可以是能够耐受高浓度的dNTP而基本上不影响其活性或性能的聚合酶。本文描述了此类切割剂的实例，例如酶切割剂，例如核酸内切酶V，合适地TnEndoV。
合适的酶切割系统的实例包括可以切割单链核酸的任何酶，例如限制性酶或核酸内切酶。用于本发明的合适的核酸内切酶的实例包括来自海栖热袍菌的TmEndoV(TmEndoV)、来自新阿波罗栖热袍菌的TmEndoV、来自温泉假栖热袍菌(Pseudothermotogathermarum)的PtEndov、来自美热栖热腔菌(Thermosipho melanesiensis)的TmeEndoV以及来自大西洋栖热腔菌(Thermosipho atlanticus)的TaEndoV、或切口核酸内切酶NtBstNBI、NtAlwl和Nt BspQI。蛋白质序列可见于表2。还包括与表2的核酸内切酶基本上相同的核酸内切酶。
酶切割剂(诸如核酸内切酶)可以是能够耐受高浓度核苷酸，使得高于3、5、8、10、15、20、25、30、35、40、45或50mM的核苷酸浓度基本上不抑制或影响酶活性的聚合酶。
优选的核酸内切酶对脱氨基碱基(诸如肌苷)具有特异性。核酸内切酶V将切割/水解肌苷3'的第二磷酸二酯键。
切割可以在单个步骤中进行，或者可以是多步骤过程。
在切割剂需要酶或试剂与核酸分子结合的情况下，预期核酸内切酶将不与模板结合，直到聚合酶被释放，以避免因聚合酶的尺寸而造成空间限制。
对于核酸内切酶的切割，产物需要是双链的，以进行结合和切割。在另一个实施方案中，切割溶液包含一种或多种缓冲液。本领域技术人员应当理解，缓冲液的选择取决于所需的确切切割化学和切割剂。
切割通常可以在水性系统中进行。或者，切割可以在替代性亲核试剂存在下发生，使得替代性亲核试剂掺入到寡核苷酸产物的5'磷酸基团中。这种亲核试剂掺入提供了适用于缀合至递送媒介物(诸如抗体、肽、蛋白质或糖)以靶向递送至特定器官的修饰的寡核苷酸。可以使用任何合适的亲核试剂，例如但不限于甘油、乙二醇、1,2丙二醇或1,3-二氨基丙醇。可以确定合适的浓度以实现期望的掺入。例如，可以使用至少30％、40％、50％、60％、70％或80％w/v，或者前述整数之间的任何合适的范围。
VI)其他试剂
可以提供额外试剂，包括例如但不限于洗涤溶液、缓冲液、引物、酶、催化剂、猝灭剂、染料、探针、标签、标记、辅助因子、流体组分(例如，表面活性剂、缓冲液、triton X-100、nonidet P-40、DMSO等)和/或光学组分(例如，参考珠、染料等)、以及镁离子(Mg2+)、锰离子(Mn2+)、谷氨酰胺、精氨酸、四甲基氯化铵、甜菜碱、甲酰胺、牛血清白蛋白或其任何组合中的一种或多种。
广泛使用的dNTP骨架变体是硫代磷酸酯(也称为S寡核苷酸)，其中磷酸二酯键转化为硫代磷酸酯键。硫化过程产生R和S非对映异构体。将不同的辅助因子应用于反应混合物中，可用于直接合成R或S立体异构体。例如，在聚合酶天然接受S异构体的情况下，可能适合应用辅助因子以将聚合酶导向R异构体，从而能够使用两种形式。例如，在使用KOD的情况下，可能适合与钴辅助因子组合使用。用于所述反应的合适的试剂可以是钴盐，例如氯化钴。聚合酶和辅助因子的其他合适的组合可以使用本文和本领域可用的教导来确定。
用于本发明的合适的缓冲液是提供水性条件的缓冲液。因此，缓冲液合适地是水性缓冲液。合适的缓冲液可包含选自Tris-HCl、Hepes、硫酸铵、氯化钾、氯化钙、硫酸镁、谷氨酰胺、精氨酸、甲酰胺、nonidet和Triton X-100的一种或多种试剂。合适的缓冲液可包含Tris-HCl、(NH4)2SO4、KCl、Triton X-100和MgSO4。例如，合适的缓冲液可包含20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SC4、10mM KCl、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100，pH 8.8。另一种合适的缓冲液可包含Tris-HCl、MgCl2、谷氨酸钾、精氨酸-HCl、乙酰化BSA、DTT、海藻糖和1,2-丙二醇。例如，合适的缓冲液可包含20mM Tris-HCl(pH8)、20mM MgCl2、100mM谷氨酸钾、100mM精氨酸-HCl、0.01mg/ml乙酰化BSA、10mM DTT、0.2M海藻糖和1M 1,2-丙二醇。另一种合适的缓冲液可包含Tris-AcOH、MgSO4、KOAc、谷氨酸钾、精氨酸-HCl、乙酰化BSA、Triton X-100和DTT。例如，合适的缓冲液可包含50mM Tris-AcOH(pH 8)、20mM MgSO4、50mM KOAc、100mM谷氨酸钾、100mM精氨酸-HCl、0.01mg/ml乙酰化BSA、0.1％Triton X-100和30mM DTT。另一种合适的缓冲液可包含Tris-HCl(pH 8.8)、(NH4)2SO4、KCI、MgSO4、Triton X-100和NiCl220。例如，合适的缓冲液可包含20mM Tris-HCl(pH 8.8)、10mM(NH4)2SO4、10mM KCI、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100和2mM NiCI2。另一种合适的缓冲液可包含Tris-HCl(pH 8)、MgCl2、谷氨酸钾、精氨酸-HCl、乙酰化BSA、DTT。例如，合适的缓冲液可包含20mM Tris-HCl(pH 8)、20mMMgCl2、100mM谷氨酸钾、100mM精氨酸-HCl、0.01mg/ml乙酰化BSA、10mM DTT。技术人员可以使用本文和本领域可用的教导来鉴定替代性缓冲液。
缓冲液和酶的合适组合可以使用本文和本领域可用的教导来确定。例如，上述缓冲液中的任一种可以与选自KOD或其变体(诸如KOD DGLNK)或TfPol或其变体的聚合酶组合使用。
合适地，本发明方法中使用的试剂是水性的。
合适地，本发明方法中使用的试剂基本上不包含乙腈。
组合
在本发明中，合适的试剂包括酶的组合(即，聚合酶和核酸内切酶)，合适地与任何试剂，诸如如本文所定义的合适地最适合生成期望的寡核苷酸的一种或多种试剂组合。合适地，反应可以包含引物-模板、聚合酶、核酸内切酶、dNTP和缓冲液。合适地，反应可以包含自引模板、聚合酶、核酸内切酶、dNTP和缓冲液。聚合酶可以是KOD、TfPol*、KOD DGLNK或SFM4-6。核酸内切酶可以是核酸内切酶V，合适地TnEndoV。
在一个实施方案中，本发明可包含选自表3的组的聚合酶和选自表2的组的核酸内切酶。所有此类组合都包括在本发明的范围内，与引物-模板组合或具体地与自引模板组合。合适地，内切核酸酶是TnEndoV。合适地，核苷酸可包含一种或多种类型的修饰的核苷酸。合适地，可切割位点是可切割核苷酸，例如肌苷。
在一个实施方案中，聚合酶可以是如表3所示的修饰的聚合酶，并且核酸内切酶可以是核酸内切酶V。合适地，核酸内切酶是TnEndoV。一种或多种核苷酸可以是修饰的核苷酸。合适地，可切割位点可以是肌苷残基。合适地，缓冲液可以如本文所提供。
方法
本发明提供了一种用于产生单链寡核苷酸的方法，所述方法包括：
i)提供引物-模板，其包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，b)指导寡核苷酸产物合成的模板，以及c)使寡核苷酸产物能够从模板释放的可切割位点；
ii)将引物-模板与核酸聚合酶、一种或多种dNTP和切割剂一起孵育，以形成反应混合物；
iii)将反应混合物维持在允许以下的条件下：通过聚合酶延伸引物以形成延伸的引物-模板，以及通过切割剂在可切割位点处切割延伸的引物-模板以提供寡核苷酸产物；
iv)任选地从反应混合物中分离寡核苷酸产物。
引物-模板、聚合酶、dNTP和/或切割剂可以各自单独地如本文所述。如本文所述的引物-模板、聚合酶、dNTP和/或切割剂的任何合适的组合可用于本发明的方法中。
核苷酸可以是天然核苷酸，或者可包含一种或多种修饰的核苷酸，例如如本文所述。可以提供超过所需量的核苷酸，例如如本文所述。
在合适的实施方案中，方法用于制备治疗性寡核苷酸。合适地，切割剂是TnEndoV并且核苷酸包含一种或多种修饰的核苷酸。
本发明的方法可以是单步骤方法，或者可以包括两个或更多个连续步骤。在单步骤方法中，所有试剂可以在单步骤中在适用于延伸和切割反应的条件下组合。本发明的方法可以是一锅法，其中延伸和切割在单个反应容器中发生。
维持如步骤iii)中所定义的反应混合物可以持续一定的反应时间段，合适地是所定义的反应时间段。在所定义的反应时间段期间，延伸和切割可以在反应混合物中发生，合适地在同一反应时间段中发生。因此，反应可以包括在反应时间段中在同一反应混合物内延伸和切割的重复循环。以这种方式，连续地重复使用引物-模板。
合适地，延伸和切割可以在同一组反应条件下发生。反应条件可包括存在合适的缓冲液以及一种或多种如本文所定义的额外试剂，在合适的温度下持续预定义的反应时间段。
合适地，延伸和切割可以发生。以上iii)的任何先前或后续步骤可以在单独的步骤和/或容器中执行，或者在与步骤i)至iv)相同的步骤/和/或容器中执行。用于任何先前或后续步骤的条件或条件的任何部分可以相同或可以不同。
本发明的方法可包括并行地进行两种或更多种方法，例如在一个阵列或多个阵列中。每个反应可以包含相同或不同的模板。
本发明的方法可以在任何合适的条件下进行，以允许延伸引物序列以生成新的寡核苷酸序列；并且合适地保留引物模板双链体。在使用自引模板的情况下，条件合适地允许在反应时间段的持续时间期间维持二级结构，例如作为发夹环。合适的条件包括合适的温度、pH、缓冲液、孵育时间和盐浓度。方法的任一步骤的条件可以与一个或多个其他步骤相同，或者可以不同。
步骤iii)可以在等于或高于模板和切割产物的解链温度的温度下执行。在这种温度下，延伸产物(寡核苷酸产物)在切割后从引物-模板中释放，留下可用于另一个延伸循环的引物-模板。然而，引物在反应条件下保持结合并且不解离。合适的温度可以由本领域技术人员基于诸如模板和延伸产物及其序列的长度以及聚合酶和切割剂的最佳温度的因素来计算。较长的寡核苷酸产物的解链温度高于较短的产物。当使用自引模板合成较长的寡核苷酸产物(例如18聚体)时，合适的温度可以是60-85℃或在其之间的任何整数或范围。更合适的温度范围可以是65-80℃或在其之间的任何整数，例如约70℃。如果靶治疗性寡核苷酸较短，则可以使用较低的温度，例如45至60℃或在其之间的任何整数或范围。或者，温度可以在适用于引物延伸的第一温度和用于切割的第二温度之间循环。
在允许寡核苷酸产物从引物-模板解离的条件下，在同一反应中提供聚合酶和切割剂的组合允许引物-模板在反应中重复使用。引物-模板可以被认为是具有催化性的，因为它介导产物增加超过常规延伸反应中模板:产物的通常1:1比率，并且因为它在延伸或切割步骤中保持不变。
因此，本发明的方法实现了生成与反应开始时的引物-模板量相比超过1倍或至少2倍、3倍、4倍、5倍、10倍、20倍、30倍、40倍、50倍、100倍或200倍、300倍、500倍或1000倍产物量的寡核苷酸产物。所述量可以表示为mol％。
延伸反应可以在合适的pH下发生，所述pH表示聚合酶活性的合适pH，例如8.0和9.5之间。可以提供合适的缓冲液，诸如Tris-HCl或具有一种或多种如本文所述的缓冲试剂、或本领域技术人员已知的等同物，以稳定pH。
反应时间将取决于所需产物的量和延伸循环的次数。典型的延伸时间可以是每个循环1至2分钟。反应可以孵育几分钟至几小时，或者长达一天或更长时间，以实现合适的产率。可以计算每个反应的延伸的最佳孵育时间。最佳反应时间可以是12小时或更长。反应时间可以基于延伸循环的数量，所述延伸循环可以是2个或更多个、10个或更多个、50个或更多个、100个或更多个、200个或更多个、300个或更多个、500个或更多个、或1000个或更多个。方法可以允许寡核苷酸产物在反应混合物中积累。
执行延伸反应的条件可以是水性的。在一个实施方案中，条件基本上不包含乙腈。
方法可包括提供合适的缓冲液，在缓冲液中组合各试剂以执行延伸反应。合适的缓冲液可包含选自以下的一种或多种组分：缓冲盐(例如Tris-HCl、Tris-AcOH、HEPES-KOH、Bicine-HCl)、金属离子(例如MgSO4、MgCl2、MgOAc2、CaCl2)、氨基酸(例如谷氨酸盐、精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸盐)和添加剂(例如柠檬酸钠、(NH4)2SO4、四甲基氯化铵(TMAC)、KCI、KOAc、甘油、1,2-丙醇、蔗糖、海藻糖、乙酰化BSA、Tween-20、Triton X-100、DTT、甲酰胺、DMSO和/或PEG-3000)。合适的缓冲液可包含镁、氯化钾、Tris-HCL、硫酸铵、一种或多种共溶剂(包括例如DMSO、甘油、甲酰胺)、BSA、PEG、明胶、非离子去污剂(TWEEN 20或Triton-X-100)和N,N,N三甲基甘氨酸。最合适的缓冲液可包含20mM Tris-HCL、10mM(NH4)2SO4、10mM KCl、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100，pH 8.8。另一种合适的缓冲液可包含50mMTris AcOH、20mM MgSO4、50mM KOAc、100mM KGIu、100mM ArgHCL、0.01mg/ml AcBSA、0.1％Triton X-100,、30mM DTT、5％甲酰胺。其他合适的缓冲液在本文中描述，或者可以是本领域技术人员已知的和可用的。
在聚合酶是KOD的情况下，切割剂可以是核酸内切酶V，例如TnEndoV(2μM)催化扩增是20mM Tris-HCl(pH 8)、20mM MgCl2、100mM精氨酸-HCl(pH 8)、100mM谷氨酸盐-KOH(pH8)、DTT(10mM)、甲酰胺(10％)、海藻糖(0.2M)、1,2-丙二醇(1M)和乙酰化BSA(0.01mg/ml)。用于大规模反应的优化条件实例是含有以下的缓冲液：50mM Tris AcOH、20mM MgSO4、50mMKOAc、100mM KGIu、100mM ArgHCL、0.01mg/ml AcBSA、0.1％Triton X-100、30mM DTT、5％甲酰胺，pH 8.0，使用Sp-dGTPαS(2.5mM)、Sp-dCTPαS(2.5mM)、Sp-dTTPαS(5mM)、模板(4μM)、KOD(2μM)、TnEndoV(6μM)和0.012U/μl TIPP(无机焦磷酸酶)；在70℃下孵育12小时或更长时间；通过加热至98℃持续2小时而淬灭。
酶和核苷酸的量可以根据例如聚合酶的性质、核苷酸的浓度、螯合剂和蛋白质的存在来凭经验确定。任何试剂都可以过量提供。
切割可以酶促进行或通过基于光的切割或任何其他合适的机制来进行。切割所需的条件将取决于所使用的切割系统的性质并且是本领域技术人员已知的。最合适的条件是不影响或基本上不影响反应中任何试剂(诸如酶)的功能，使得可以进行多个循环的条件。
本发明的方法可用于产生双链DNA，例如通过执行本发明的方法以产生单链核酸的两条互补链，以及执行退火步骤以产生双链寡核苷酸。
本发明的方法还可以包括一个或多个额外步骤，例如停止、终止或淬灭反应，萃取蛋白质；萃取产物；洗涤产物，纯化产物，修饰或改造寡核苷酸产物，例如通过连接至另一个分子或切割成不同的寡核苷酸。方法可包括例如通过冷冻干燥、包装和/或储存产物来保存产物。
合适的纯化方法和条件是技术人员已知的。可以使用任何合适的方法来萃取寡核苷酸产物，合适地无需引物/模板核酸分子。合适方法的实例在本文中描述并且包括选择性结晶、乙醇/氯仿沉淀或使用已建立的过滤系统。
固体支持物/阵列
本发明提供了一种或多种本发明的引物-模板，其提供在支持物(例如固体基底)上。核酸分子在表面上的固定可以是可逆的或不可逆的。可以使用任何合适的固定方法，即通过与表面结合的核酸序列或者通过掺入介导与表面结合的合适部分。例如，合适的结合基序可包括与固体支持物上的互补序列结合的序列，诸如polyA序列。
结合可以经由核酸分子中的固定位点和提供在固体支持物上的互补位点或结合部分来介导。或者，核酸序列可以非共价附接至支持物，例如通过物理吸附。
基底可以是固体基底。基底可以完全或部分地包含以下中的一种或多种：橡胶；玻璃；硅；金属，诸如铝、铜、钛、铬或钢；陶瓷，诸如氧化钛或氮化硅；塑料，诸如聚乙烯(PE)、低密度聚乙烯(LDPE)、高密度聚乙烯(HDPE)、聚丙烯(PP)、聚苯乙烯(PS)、高抗冲聚苯乙烯(HIPS)、聚氯乙烯(PVC)、聚偏二氯乙烯(PVDC)、丙烯腈丁二烯苯乙烯(ABS)、聚乙炔、聚酰胺、聚碳酸酯、聚酯、聚氨酯、聚环氧化物、聚甲基丙烯酸甲酯(PMMA)、聚四氟乙烯(PTFE)、苯酚甲醛(PF)、三聚氰胺甲醛(MF)、脲醛(UF)、聚醚醚酮(PEEK)、聚醚酰亚胺(PEI)、聚酰亚胺、聚乳酸(PLA)、呋喃、有机硅、聚砜；任何前述材料的任何混合物；或任何其他适当的材料。基底可以完全或部分地涂覆有一个或多个以下层：金属，诸如铝、铜、银或金；氧化物，例如氧化硅(SixOy，其中x、y可以取任何可能的值)；光致抗蚀剂，诸如SU8；表面涂层，诸如氨基硅烷或水凝胶、聚丙烯酸、聚丙烯酰胺葡聚糖、聚乙二醇(PEG)；或任何前述材料的任何组合；或任何其他适当的涂层。
可以对基底的表面进行修饰以包含本文描述的任何固定试剂或结合配偶体。可以对基底的表面进行修饰以包含活性化学基团，诸如胺、酯、羟基、环氧化物等或其组合。在一些情况下，此类结合配偶体、化学剂、蛋白质、核酸序列或表面修饰可以作为额外的层或涂层添加至支持物。
基底可具有圆柱体、圆柱壳或圆盘、矩形棱柱或任何其他几何形状的一般形式。基底的表面可以是平面的。基底的表面可以未被覆盖并且可以暴露于大气。替代地或另外地，基底的表面可以是有纹理的或有图案的。例如，基底可以包括凹槽、波谷、斜坡和/或柱。基底可限定一个或多个空腔(例如，微米级空腔或纳米级空腔)。基底可限定一个或多个通道。基底可在基底表面上具有规则的纹理和/或图案。例如，基底可以具有高于或低于表面参考水平面的规则几何结构(例如，楔形、长方体、圆柱体、椭球体、半球体等)。或者，基底可在基底表面上具有不规则的纹理和/或图案。例如，基底可以具有高于或低于基底参考水平面的任意结构。
基底可以包括阵列。例如，阵列可以位于基底的侧表面上。阵列可以是平面阵列。阵列可以具有圆形、环形、矩形或任何其他形状的一般形状。阵列可以包括线性和/或非线性的行。阵列可以是均匀间隔的或分布的。阵列可以是任意间隔的或分布的。阵列可以具有规则的间距。阵列可以具有不规则的间距。阵列可以是有纹理的阵列。阵列可以是有图案的阵列。阵列可以包括多个单独可寻址的位置。
可以将引物-模板固定在阵列上。因此，阵列可以包含一种或多种结合配偶体，或者包含介导如本文所述的引物-模板固定的手段。此类手段可包含一种或多种物理或化学接头或衔接子。替代地或另外地，引物-模板可偶联至珠粒，所述珠粒可固定在阵列上。
可以将任何数量的引物-模板固定在支持物上。例如，支持物可固定有至少1个、至少2个、至少3个、至少4个、至少5个、至少6个、至少7个、至少8个、至少9个、至少10个样品，可以固定数千、数万、数十万、数百万、数亿、数十亿或更多的引物-模板。
引物-模板可以通过非特异性相互作用，诸如亲水相互作用、疏水相互作用、静电相互作用、物理相互作用(例如粘附)等中的一种或多种来固定。核酸分子可以通过特异性相互作用(例如经由结合配偶体)来固定。例如，结合配偶体可以包括被配置为结合核酸分子的寡核苷酸衔接子；或者抗体、寡核苷酸、核酸分子、适体、亲和力结合蛋白、脂质、碳水化合物等中的一种或多种。合适的实例是链霉亲和素，其可以结合生物素化核酸分子。结合配偶体可以通过任何可能的相互作用组合，例如通过物理和化学相互作用的组合、通过蛋白质和核酸相互作用的组合等来固定生物分析物。
支持物可包含一个或多个特征，并且许多结合配偶体可存在于支持物上的同一特征中，例如数千、数万、数十万、数百万、数亿、数十亿或更多个。阵列可以具有在由前述值中的任意两个定义的范围内的多个结合物。在一些情况下，单个结合配偶体可以结合单个引物-模板。在一些情况下，单个结合配偶体可以结合多个引物-模板。在一些情况下，多个结合配偶体可以结合单个引物-模板。
试剂盒
本发明的一个方面提供了一种试剂盒。试剂盒可以允许合适地在适当的容器中储存、运输或递送一种或多种如本文所述的反应试剂，以及任何额外组分，诸如基底、支持物和/或用于执行方法的说明书和/或从一个位置到另一位置的支持材料。例如，试剂盒可包括一个或多个含有相关反应试剂和/或支持材料的外壳(例如，盒)。此类内容物可以一起或分开递送给预期接收者。例如，第一容器可含有用于本发明的核酸分子，而第二容器或更多个容器可含有如本文所述的核苷酸、聚合酶和/或缓冲液。
试剂盒还可以包括支持物，合适地具有附接至其上的如本文所述的引物-模板。支持物可包含附接至其上的核酸分子群，例如如本文所述。试剂盒中提供的支持物可以是如上所述的支持物。试剂盒可包含一种或多种如本文所述的支持物。在每个支持物或每个试剂盒中，核酸分子可以包含不同的模板以合成不同的寡核苷酸产物。
寡核苷酸产物
本发明的方法首先涉及生成单链寡核苷酸，所述单链寡核苷酸从模板序列切割并解离。通过下游加工，单链寡核苷酸可用于生成双链寡核苷酸产物。
通过第一方面的方法生成的寡核苷酸将具有与模板序列基本上相同的长度。因此，通过第一方面的方法的步骤i)至iv)生成的寡核苷酸的长度将是2至500个核苷酸，更合适的长度为2至200个核苷酸。寡核苷酸的长度可以是例如5至20、21至30、31至40、41至50、51至60、61至70、71至80、80至100、100至150或150至250个核苷酸。
寡核苷酸的长度可以由于下游加工(诸如切割、剪接或重组)而增加或减少。
本发明的第一方面的方法的包含寡核苷酸的产物可以合适地具有至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％的纯度。因此，通过本发明的第一方面的方法产生的产物可以合适地具有小于20％、15％、10％或5％的污染物。污染物可包括含有具有碱基取代、截短序列和/或过度延伸序列(含有额外碱基)的寡核苷酸的产物、或含有盐的产物。
本文提及的寡核苷酸包括一种或多种寡核苷酸。因此，本发明的方法可以产生一种或多种期望的寡核苷酸，但需要多个延伸和切割循环。因此，本发明的方法的产物可以是寡核苷酸群体。合适地，群体包含单链寡核苷酸。
核酸序列中最丰富的修饰之一是引入硫代磷酸酯(PS)键联，其中磷酸基团内的非桥接氧原子之一被硫替换。这种PS修饰使寡核苷酸对溶核降解更加稳定，并通过增加蛋白质结合赋予显著的药代动力学益处。用硫代磷酸酯替换磷酸酯会在磷原子处产生手性中心(Sp或Rp)。因此，将每个PS键联引入到寡核苷酸中导致产生两组非对映异构体，并且在不存在立体控制合成的情况下，获得N-聚体硫代磷酸酯寡核苷酸作为2N-1个非对映异构体的不可分离的混合物，所有非对映异构体具有不同且可能相反的物理和生化性质。两种立体异构体表示为S和R。当提供核苷酸的Sp/Rp混合物时，如本文所定义的聚合酶可以仅使用Sp-dNTP来提供作为单一非对映异构体的产物。
寡核苷酸群体可以是混合非对映异构体(S和R)的群体，或者可以基本上是单一立体异构体。群体可以基本上是S立体异构体或R立体异构体。基本上是单一异构体意指群体包含至少80％、85％、90％、95％或99％的单一立体异构体。
通过本发明的方法合成的寡核苷酸可以是任何寡核苷酸，例如具有工业或治疗用途或者在研究中具有用途或作用的寡核苷酸。在一些实施方案中，通过本发明的方法合成的寡核苷酸具有酶活性。在一些实施方案中，通过本发明的方法合成的寡核苷酸发挥机械功能，例如在核糖核蛋白复合物或转移RNA中。在一些实施方案中，通过本发明的方法合成的寡核苷酸可以充当适体。在一些实施方案中，通过本发明的方法合成的寡核苷酸可以用于数据存储。在一些实施方案中，通过本发明的方法合成的寡核苷酸可以是治疗性寡核苷酸，例如靶向核酸(RNA或DNA)的RNA、靶向蛋白质的RNA或编码治疗性蛋白质的RNA。治疗性RNA寡核苷酸包括：i)适体，其是短单链核酸，可以凭借适体的三级结构而不是其序列结合多种靶标(诸如蛋白质、肽、碳水化合物和其他分子)，例如哌加他尼(Pegaptanib)(Macugen,Bausch+Lomb Pharmaceutical Retina Portfolio)、Emapticap pegol(NOXXONPharma)、聚乙二醇化奧拉希德(olaptesed pegol)(NOXXON Pharma)和REG1；ii)mRNA，例如作为替代疗法，其中向患者施用mRNA以补偿有缺陷的基因/蛋白质(例如但不限于AZD8601(Moderna)、mRNA-3704(Moderna)、MRT5005(Translate Bio)、mRNA-2416、mRNA-2752和MEDI1191(moderna)、mRNA-2752、BNT131(SAR441000)、CV8102(CureVac)或MEDI1191；或提供治疗蛋白；疫苗接种，其中施用编码特定抗原的mRNA以引发保护性免疫(例如但不限于COVID-19疫苗或癌症疫苗；或细胞疗法，其中将mRNA离体转染到细胞中以改变细胞表型或功能，然后将这些细胞递送至患者体内(例如但不限于基于TriMix的免疫疗法(ECI-006)、MCY-M11(MaxCyte)；或iii)单链反义寡核苷酸(ASO)，其包括RNA酶H依赖性ASO或RNA酶H独立性(空间阻滞)ASO，包括例如但不限于努西纳森(nusinersen)(也称为spinraza；lonisPharmaceuticals)、替普利森(eteplirsen)(Sarepta Therapeutics)和伊诺特森(inotersen)(lonis Pharmaceuticals和Akcea Therapeutics)；以及RNAi(miRNA或siRNA)，它们是短单链DNA、硫代磷酸酯DNA、RNA类似物、构象限制性核苷(锁核酸，LNA)或与其靶向的某些RNA区域互补并且促进蛋白质降解或抑制蛋白质翻译的寡核苷酸。微小RNA(miRNA)是小的非编码RNA分子，其通过阻断靶mRNA的翻译或促进其降解来调控多种mRNA的表达。siRNA是来源于前体siRNA的小的非编码RNA双链体。本发明的方法可用于制备双链寡核苷酸，例如其中它们可单独合成并在合适的条件下退火。
细胞
可以提供包含本发明的核酸分子或编码本发明的核酸分子的核酸序列的细胞或细胞群体。合适的哺乳动物和细菌细胞是本领域技术人员已知的。
在整篇本说明书的描述和权利要求中，词语“包含”和“含有”及其变体意指“包括但不限于”，并且它们不旨在(并且不)排除其他部分、添加物、部件、整数或步骤。在整篇本说明书的描述和权利要求中，除非上下文另有要求，否则单数涵盖复数。特别地，在使用不定冠词的情况下，除非上下文另有要求，否则说明书应理解为考虑复数以及单数。
结合本发明的特定方面、实施方案或实施例描述的特征、整数、特性、化合物、化学部分或基团应理解为适用于本文所述的任何其他方面、实施方案或实施例，除非与其不相容。本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的所有特征和/或如此公开的任何方法或过程的所有步骤都可以任何组合进行组合，但是其中至少一些此类特征和/或步骤互相排斥的组合除外。本发明不限于任何前述实施方案的细节。本发明扩展到本说明书(包括任何所附权利要求、摘要和附图)中公开的特征的任何新颖特征或任何新颖组合，或者扩展到如此公开的任何方法或过程的步骤的任何新颖步骤或任何新颖组合。
读者应注意与关于本申请的本说明书同时或在之前提交并且与本说明书一起公开供公众查阅的所有文件和文档，并且所有此类文件和文档的内容均以引用的方式并入本文。
本文所述的任一个方面的特征在已作必要修改后适用于其他方面。
实施例
首先使用可商购获得的酶单独评价延伸和切割反应，并通过LC-MS分析对产物进行表征。来自Thermococcus kodakaraensis的聚合酶(KOD)成功催化了具有未修饰的dNTP(1mM)的发夹模板(表1a的T1，20μM)的延伸，以在定量转化中得到双链延伸产物(E1，表1a)(图4A)。使用化学合成的E1标准品(表1a，20μM)和来自海栖热袍菌的EndoV(TmEndoV)进行的裂解反应完成，得到18聚体产物(P1，表1)和模板(T1，表1a)(图4B)。接下来，使用KOD、TmEndoV,T1(表1a，20μM)和dNTP(1mM)执行一锅聚合酶-核酸内切酶反应，得到29μM P1，代表1.4个模板延伸和切割循环(图4C)。
研究了增加底物(dNTP)加载对聚合酶延伸和核酸内切酶切割反应的影响。在30mMdNTP存在下，KOD能够高效衍生T1(图5)。筛选了从NCBI数据库的BLAST搜索中鉴定的一组TmEndoV同源物(表2)，以提高在高dNTP浓度存在下的活性。来自新阿波罗栖热袍菌的TnEndoV在高dNTP浓度下表现最佳，并且在30mM dNTP存在下成功地水解E1(表1，20μM)(图5B)。为了使切割产物能够有效地从模板解离以实现模多个板延伸和切割循环，所述过程优选地在高于产物解链温度下操作。KOD和TnEndoV的最佳温度分别为>100℃和80.5℃(图6A)，并且在最佳反应温度70℃下预孵育24小时后，保留了100％和62％的延伸和切割活性(图6C-6D)。一组具有不同发夹序列的模板(T1-9)也在一锅聚合酶-核酸内切酶反应中进行了评价(图7)。产物P1(表1a)的产率在很大程度上不受肌苷核碱基配对(T1、T6和T7，表1a)、发夹序列(T5，表1a)或5'-生物素化(T2，表1a)的变化的影响。然而，在发夹(T3)处放置生物素或改变发夹长度(T8和T9)导致产物产率轻微降低。最后研究了缓冲液组成对一锅反应的效率的影响，选择20mM Tris pH 8、50mM KCI、12mM MgSO4、10mM DTT、0.1％BSA、100mM精氨酸、100mM谷氨酸盐作为最佳反应缓冲液。使用优化的工艺条件执行一锅反应，并且通过HPLC监测P1的形成。18小时后，系统完成了330个模板(1pM，0.3mol％)延伸和产物切割循环，得到0.33mM P1(相当于1.9g/L)(图8)。
为了进一步利用这种方法来制造治疗性寡核苷酸，需要对含有药学相关修饰的核苷三磷酸结构单元具有活性的聚合酶。选择一组聚合酶进行评价，包括Stoffel、KOD和9oN。也包括先前被工程化以部分扩增2'-甲氧基和2'-氟修饰的寡核苷酸的Stoffel变体(SF4-6)(Chen等人Nat.Chem.2016,8,556)。NCBI数据库的BLAST搜索鉴定了来自丝状栖热菌(TfPol)和热液海洋嗜热菌(MhPol)的Stoffel同源物，并且将显示增强SF4-6底物混杂性的点突变引入到TfPol和MfPol中，以分别得到TfPol*和MhPol*。使用基于时间分辨FRET的测定法评价对修饰的核苷三磷酸的聚合酶活性，所述测定法利用被FRET供体(荧光素)和FRET受体(罗丹明)修饰的模板。使用三种天然dNTP和一种修饰的NTP执行反应。能够转录模板并掺入修饰的NTP的四个拷贝的酶破坏模板二级结构，导致供体和受体的空间分离，从而产生荧光信号。在不存在修饰的核苷酸的情况下执行的对照反应不产生荧光，从而证明了高水平的酶保真度。所有聚合酶都接受2'-氟修饰的NTP(图9)。2’-MeO-NTP是SF4-6的已知底物(Chen等人Nat.Chem.2016,8,556)，并且LNA-NTP已知被KOD和9oN接受(Veedu等人Mol.BioSyst.,2009,5,787)，与天然dNTP相比，活性低于该测定的检测限。
对于聚合酶组对硫代磷酸核苷酸的单一非对映异构体(dNTPαS)的活性进行筛选。所有筛选的聚合酶均表现出对Sp非对映异构体(Sp-dNTPαS)的活性，但Rp-dCTPαS或Rp-dTTPαS均未被接受(图9)。变体SF4-6、77Pol*和MhPol*对2’-F-ATP和2’-F-GTP的Sp非对映异构体也有活性。为了证明我们的方法具有合成立体纯的治疗性寡核苷酸的潜力，使用3种天然的dNTP以及Sp-dNTPaS执行一锅聚合酶核酸内切酶反应，以生成含有单一硫代磷酸酯键联的产物(P2-P5)。酶促合成的产物(P2-P5)与通过化学合成产生的非对映异构体混合物的比较显示，生物催化过程得到了作为单一非对映异构体的d.e.>99％的产物。(图10a-d)。已知聚合酶会进行立体化学反转，因此由Sp-dNTP生成的产物将含有Rp键联。本发明人能够利用聚合酶立体特异性来执行动力学拆分并且由dCTPαS或dATPαS的非对映异构体混合物产生作为单一立体异构体的寡核苷酸产物(图10e-h)。
接下来，对于EndoV组对化学合成的延伸模板(20μM)的活性进行筛选，所述模板含有2'-氟(E2，表1a)、2'-甲氧基(E3，表1a)和2'-甲氧基乙氧基(E4，表1)核糖修饰、锁核酸(E5，表1a)和硫代磷酸酯键联(E6，表1)。所评价的所有EndoV均催化在切割位点的3'处含有2'-核糖修饰的DNA的切割，以提供预期产物P6-P10(表1a)，通过LC-MS或PAGE分析确认所述产物(图11和12)。尽管TmEndoV、TnEndoV和PfEndoV在18小时内以>99％转化率得到P1、P6-P9，但TnEndoV催化的反应速度最快，在1小时内几乎完全转化(>96％)(图12)。LNA修饰的延伸模板(E5)在切割位点的3'处仅含有单个LNA，由于已知长LNA序列会扭曲二级结构，因此此类治疗性寡核苷酸很少含有超过三个连续的LNA。
立体化学在用硫代磷酸酯键联修饰的延伸模板(E6)的化学合成期间不受控制，产生立体异构体的复杂混合物。EndoV催化硫代磷酸酯修饰的DNA的切割，以约50％的产率产生预期产物P6(表1a)(图12和图17)。为了测试TnEndoV立体特异性，使用KOD和Sp-dNTPαS酶促产生了含有Rp键联的延伸DNA模板(E11-E14)。使用寡核苷酸清理试剂盒(Monarch)分离延伸模板，随后与TnEndoV一起孵育。PAGE分析显示切割反应进行至完成，表明核酸内切酶能够切割Rp硫代磷酸酯键联(图17)。
材料和方法
材料
所有化学品和生物材料均从商业供应商处获得。卡那霉素、过硫酸铵、IPTG、N,N,N',N'-四甲基乙二胺和硼酸购自Sigma-Aldrich；LB琼脂、2xYT培养基、阿拉伯糖和Tris碱基购自Formedium；大肠杆菌5α、Q5 DNA聚合酶、T4 DNA连接酶、限制酶和ThermoPol反应缓冲液购自New England BioLabs；大肠杆菌BL21(AI)和DH10B购自ThermoFisher；Sp-和Rp-dNTPαS以及Sp-2’F dNTP购自Biolog Life Science Institute；LNA-NTP、2’F-NTP和dNTPαS(Sp/Rp)1:1)购自Jena Bioscience；2’MeO-NTP购自Trilink Biotechnologies；寡核苷酸由Integrated DNA Technologies(IDT)合成；丙烯酰胺/双丙烯酰胺19:1溶液购自SevernBiotech Ltd.；EDTA购自National Diagnostics；脲、甲酰胺和十二烷基硫酸钠购自FisherScientific；溴酚蓝购自Alpha Aesar。
蛋白质产生和纯化：
编码聚合酶和核酸内切酶V(endoV)的基因针对在大肠杆菌中的表达进行了密码子优化，并且从IDT以g块形式订购。使用Ndel和Xhol限制性位点将TfPol*和MhPol*基因克隆到pET28中。使用Ndel和Xhol限制性位点将所有其他基因克隆到pET29中。为了表达聚合酶和EndoV，使用用适当的质粒DNA转化的化学感受态大肠杆菌BL21 AI细胞，以接种含有50μg ml-1卡那霉素的5ml 2xYT培养基。在37℃下孵育18小时后，使用起始培养物(4mL)接种补充有50μgml-1卡那霉素的400ml 2xYT培养基。将培养物在37℃、200r.p.m.下孵育直至600nm处的光密度(OD600)为0.6。添加IPTG(1mM)和L-阿拉伯糖(3.33mM)来诱导蛋白质表达，并将培养物在37℃下孵育4小时。通过离心(8000r.p.m.，20分钟)沉淀细胞，并且丢弃上清液。将细胞重悬于裂解缓冲液(含有20mM咪唑的50mM Hepes、300mM NaCl pH 7.5)中并通过超声处理裂解。将细胞裂解物加热至70℃持续30分钟以使内源蛋白变性，然后通过离心(18,000rpm，20分钟)来清除。使用Ni-NTA琼脂糖(Qiagen)对His标记的蛋白质进行亲和色谱法，并且使用含有250mM咪唑的50mM HEPES、300mM NaCl,pH7.5进行洗脱。使用10DG脱盐柱(Bio-Rad)对纯化的蛋白质进行脱盐，并用2x储存缓冲液(20mM Tris-HCL、200mM KCI、0.2mM EDTA、2mM DTT pH 8.0)洗脱。使用消光系数在280nm处确定蛋白质浓度(补充表1和表2)。将一体积的甘油添加到等分的蛋白质中，之后在-20℃下储存。
用于聚合酶催化的延伸反应的通用程序(图4A)：
为了比较聚合酶对不同修饰的NTP的活性，使用模板(20μM)、dNTP(0.25mM)和聚合酶(0.2μM)在ThermoPol缓冲液(20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCI、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100,pH 8.8)中的溶液执行分析规模的生物转化。除非另有说明，否则反应在70℃下孵育12小时，并且通过HPLC、LC-MS或PAGE分析样品。为了研究修饰的NTP的依次掺入，如所述但使用1mM修饰的NTP延伸模板T18-T21。如所述但使用商业KOD(Merck，2.5单位)执行初始测定。用于核酸内切酶催化的切割反应的通用程序(图4B)：
为了比较EndoV对不同修饰的寡核苷酸的活性，使用延伸模板(20μM)和EndoV(2μM)于ThermoPol缓冲液(20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCI、2mM MgSO4、0.1％TritonX-100,pH 8.8)中的溶液执行分析规模的生物转化。除非另有说明，否则将反应在70℃下孵育12小时，并且通过HPLC、LC-MS或PAGE分析样品。为了研究增加底物(dNTP)加载对EndoV活性的影响，如所述通过添加dNTP(总共0-60mM)来进行生物转化。如所述但使用商业TmEndoV(ThermoFisher，5单位)执行初始测定。
用于一锅聚合酶-核酸内切酶反应的通用程序：
为了比较模板序列的效果，使用模板(20μM)、dNTP(1mM)、KOD聚合酶(0.2μM)和TnEndoV(2μM)于ThermoPol缓冲液(20mM Tris-HCL、10mM(NH4)2SO4、10mM KCI、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100,pH 8.8)中的溶液执行分析规模的生物转化。除非另有说明，否则将反应在70℃下孵育12小时，并且通过HPLC、LC-MS或PAGE分析样品。如所述但使用商业KOD(Merck，2.5单元)、TmEndoV(ThermoFisher，5单元)和dNTP(各自0.25mM)执行初始测定。用于合成P19-P32的反应条件在表4中报告。
作为单一立体异构体的PS修饰的寡核苷酸的合成
使用模板T10-T13(10μM)、三种dNTP(各自1.4mM)和一种Sp-dNTPαS(0.7mM)或Rp/Sp dNTPαS混合物(0.7mM)执行一锅KOD(0.1μM)和TnEndoV(2μM)反应。将反应在70℃下孵育12小时，并通过HPLC进行分析，并且与化学合成标准品进行比较。
用于P1合成的优化条件
对一系列具有不同组成和浓度的缓冲液的产物产率进行了评价。反应中以下组分发生了变化：缓冲盐(Tris-HCl、Tris-AcOH、HEPES-KOH、Bicine-HCL、pH 8.0)、金属离子(MgSO4、MgCl2、MgOAc2、CaCI2)、氨基酸(谷氨酸盐、精氨酸、脯氨酸、甘氨酸、丝氨酸、天冬氨酸盐，pH8)和添加剂(柠檬酸钠、(NH4)2SO4、四甲基氯化铵(TMAC)、KCI、KOAc、甘油、1,2-丙醇、蔗糖、海藻糖、乙酰化BSA、Tween-20、Triton X-100、DTT、甲酰胺、DMSO和PEG-3000)。使用T1(1μM)和dNTP(各自4mM)进行KOD(2pM)和TnEndoV(2pM)催化的P1扩增的优化反应条件为20mM Tris-HCl(pH 8)、20mM MgCl2、100mM精氨酸-HCl(pH 8)、100mM谷氨酸盐-KOH(pH8)、DTT(10mM)、甲酰胺(10％)、海藻糖(0.2M)、1,2-丙二醇(1M)和乙酰化BSA(0.01mg/ml)。在这些条件下，实现了330个模板延伸和产物切割循环(图8)
P1的制备规模合成
在优化的反应缓冲液(20mM Tris HCl、20mM MgSO4、100mM KGIu、100mM ArgHCl、0.01mg/ml AcBSA、10mM DTT、10％甲酰胺、0.2M海藻糖、1M 1,2-丙二醇pH 8.0)中，使用dNTP(各自4mM)、T2(4μM)、KOD(2μM)和TnEndoV(2μM)执行5ml规模生物转化。在70℃下孵育12小时后，通过添加0.5M EDTA pH 8(最终浓度40mM)来淬灭反应。通过加热至98℃持续2小时使蛋白质变性，并通过离心(在13,300r.p.m.下15分钟)沉淀。收集含有寡核苷酸的上清液并且用水(1000μl)洗涤蛋白质沉淀。将合并的水性级分用6ml Tris饱和苯酚:氯仿:异戊基溶液(Sigma Aldrich)萃取并用氯仿洗涤。使用10KMWCO超滤装置(Sartorius)去除残留蛋白质。使用3K MWCO超滤装置(Merck Millipore)收集流出液，将其浓缩并脱盐。将最终产物冷冻干燥。图13)。
结果：最终产物P1的纯度为88％(11.5mg)，无需色谱纯化
经历水解的硫代磷酸酯中心的TnEndoV立体选择性
使用模板T14-T17(20μM)、Sp-dNTPαS(各自0.25mM)和KOD(0.2μM)于ThermoPol缓冲液(20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCI、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100,pH 8.8)中的溶液合成立体定义的延伸模板。将反应在70℃下孵育12小时，并且通过PAGE分析样品。根据制造商的方案，使用Monarch 5μg DNA清理试剂盒(New England Biolabs)纯化延伸的寡核苷酸产物。将酶促合成的寡核苷酸(20μM)与TnEndoV(2μM)一起在ThermoPol缓冲液中在70℃下孵育12小时。为了进行比较，还将化学合成的立体随机寡核苷酸与如所述的TnEndoV一起孵育。通过PAGE分析样品。
色谱分析：
对于色谱分析，通过添加20mM EDTA来淬灭反应，添加一体积的水并且将样品在98℃下加热两小时以使蛋白质变性。通过离心(14,000g，5分钟)去除沉淀的蛋白质，并且将上清液转移至样品小瓶中。
使用1290Infinity II Agilent LC系统和AdvanceBio Oligonucleotides 2.7μm柱,50x2.1mm(Agilent)在60℃下执行离子对反相色谱法。在5％缓冲液B中保持2分钟后，在10分钟内使用5-50％缓冲液B的梯度以0.6mL min-1洗脱寡核苷酸，然后在注入下一个样品之前重新平衡五分钟至起始条件。通过与化学合成标准品比较来分配峰，并使用AgilentOpenLab软件对峰面积取积分。相对摩尔消光系数根据进行到完成的反应来计算(补充表3)，并且这些值用于计算不完全反应的转化百分比。对于涉及硫代磷酸酯修饰的反应，使用对应磷酸化产物的相对摩尔消光系数。
缓冲液B：100mM三乙基乙酸铵与25％乙腈
缓冲液A：100mM三乙基乙酸铵
使用Waters Vion IMS QTOF执行LC-MS分析，所述仪器在2.2kV毛细管下以负ESI模式运行，采集高达2000m/z。将其与具有DNAPacTMRP 4μm柱,50x2.1mm(ThermoFisher)的Waters Acquity I类UPLC在65℃下耦联。在30％缓冲液B中保持2分钟后，在8分钟内使用30-80％缓冲液B的梯度以0.3mL min-1洗脱寡核苷酸，然后在注入下一个样品之前重新平衡五分钟至起始条件。使用Waters Unifi软件对所得多电荷谱进行分析，并且使用MaxEnt1算法在4000-20000Da之间进行解卷积。
缓冲液B：400mM六氟异丙醇、15mM三乙胺水溶液与50％甲醇
缓冲液A：400mM六氟异丙醇、15mM三乙胺水溶液
聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)分析：
为了分析长度>18个核苷酸的寡核苷酸，制备了TBE-脲丙烯酰胺凝胶，其中在1xTBE缓冲液(0.1M Tris碱基、0.1M硼酸、2mM EDTA)中含有15％丙烯酰胺/双丙烯酰胺和8M脲。为了解析<18个核苷酸的寡核苷酸，制备了TBE-脲丙烯酰胺凝胶，其含有20％丙烯酰胺/双丙烯酰胺、8M脲、1x TBE缓冲液(0.1M Tris碱基、0.1M硼酸、2mM EDTA)。通过添加过硫酸铵(最终浓度0.1％w/v)和N,N,N',N'-四甲基乙二胺(最终浓度4.7μM)来启动聚合。将2μl样品体积与2x变性RNA加载染料(95％v/v甲酰胺、0.02％w/v十二烷基硫酸钠、1mM EDTA、0.02％w/v溴酚蓝)和水混合，以得到最终体积10μl。加载前，将样品在95℃下变性1分钟。在室温下在1x TBE中在200V下运行凝胶50分钟，并且用200mg/L亚甲基蓝水溶液可视化。
增加底物(dNTP)加载对酶活性的影响(图5A-5C)：
为了研究dNTP浓度对KOD活性的影响，如“用于聚合酶催化的延伸反应的通用程序”中所述执行生物转化，但使用不同的dNTP浓度(10-40mM)。为了研究dNTP浓度对TnEndoV和TmEndoV的影响，如“用于核酸内切酶催化的切割反应的通用程序”中所述执行反应，但添加不同浓度的dNTP(TnEndoV和TmEndoV分别添加0-50mM和0-3mM)。通过PAGE分析样品。
蛋白质热漂移测定(图6A)
将SYPRO Orange添加到ThermoPol缓冲液(20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mMKCI、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100,pH 8.8)中的蛋白质(5μM)中至最终浓度50x。将样品在25℃下孵育45分钟，然后使用CFX96 Touch实时PCR(BioRad)以0.5℃增量加热至95℃。使用CFX Maestro软件计算荧光的导数。
反应温度对一锅聚合酶-核酸内切酶反应的影响(图6B)
为了研究温度对产物产率的影响，如“用于一锅聚合酶-核酸内切酶反应的通用程序”中所述执行生物转化，但反应在不同温度(60-85℃)下孵育
KOD和TnEndoV温度曲线(图6C-6D)
为了评价反应中KOD和TnEndoV的热稳定性，使用在热循环仪(BioRad)中在70℃下预孵育0小时或24小时的酶溶液执行分析规模的生物转化。使用T1(20μM)和dNTP(4mM)于ThermoPol缓冲液中的溶液执行KOD(0.2μM)催化的延伸反应。使用E1(20μM)于ThermoPol缓冲液中的溶液执行TnEndoV(2μM)催化的切割反应。将反应在70℃下孵育，在15分钟、30分钟、45分钟和1小时采集样品，通过添加20μM EDTA淬灭，并且通过HPLC进行分析。
温度发夹序列对一锅聚合酶-核酸内切酶反应的影响(图7)
为了评价发夹序列对产物产率的影响，如“用于一锅聚合酶-核酸内切酶反应的通用程序”中所述，但使用模板T1-T9(20μM)来执行生物转化。
一锅聚合酶-核酸内切酶反应的优化程序(图8)
将模板(4μM)、dNTP(16mM)、聚合酶(0.2μM)和EndoV(2μM)于缓冲液(20mM Tris pH8、50mM KCI、12mM MgSO4、10mM DTT、0.1％BSA、100mM精氨酸、100mM谷氨酸盐)中的溶液在70℃下孵育12小时。采集样品并且通过HPLC进行分析。
基于时间分辨FRET的聚合酶测定(图9)
在含有FRET模板(400nM)、FRET引物(500nM)和dNTP(各自2.5mM)于Thermopol缓冲液(15μL)中的溶液的黑色384孔板(Greiner)中执行测定。
在4000rpm下离心2分钟，去除任何气泡。将样品在37℃下孵育20分钟，然后通过添加聚合酶(5ul，0.25μM最终浓度)启动反应。在60分钟内在Clariostar读板器(BMG)上用485nm激发和518nm发射来测量荧光。一式三份地测量初始反应速率，并且相对于天然dNTP活性，报告对修饰的底物的反应速率。
含有单个硫代磷酸酯键联的寡核苷酸的立体选择性合成(图10)
使用KOD(0.1μM)、TnEndoV(2μM)、10μM模板和含有3种天然dNTP和一种dNTPaS的5mM dNTP混合物(Sp-dNTP或Rp/Sp-dNTP混合物)执行一锅反应。将反应在70℃下孵育12小时，然后通过HPLC进行分析。
核酸内切酶V组的底物分析(图11和12)
使用延伸引物(20μM)和EndoV(5μM)于ThermoPol缓冲液(20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCI、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100,pH 8.8)中的溶液执行分析规模的生物转化，并且将反应在70℃下孵育。在1小时和18小时采集样品并且通过添加20mM EDTA来淬灭。通过PAGE、HPLC和LC-MS分析来分析样品。
聚合酶的底物分析(图14和15)
为了比较聚合酶对不同修饰的NTP的活性，使用模板T18-T21(20μM)、NTP(各自0.25mM)和聚合酶(0.2μM)于ThermoPol缓冲液(20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCI、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100,pH 8.8)中的溶液执行分析规模的生物转化。将反应在70℃下孵育，并且通过LC-MS和变性脲PAGE分析样品。
结果：已鉴定出对硫代磷酸酯、2'-氟、2'-甲氧基和锁核酸修饰的NTP具有活性的聚合酶
对使用钴和锰辅助因子的Rp-dNTPαS的聚合酶活性(图20)
使用模板T18-T21(10μM)和KOD(6μM)于20mM Tris-HCl pH8、10mM KCI、10mM(NH4)2SO4中的溶液、具有CoCl2或MgCl2盐的对应Rp-dNTPαS执行分析规模的延伸反应。将反应在70℃下孵育12小时，并且通过变性脲PAGE和LC-MS分析来分析样品。
结果：在CoCl2存在下，KOD可以接受Rp-dNTPαS结构单元
使用水的替代性亲核试剂进行的核酸内切酶催化的切割(图21)
使用TnEndoV(2μM)和延伸模板E1(20μM)于ThermoPol缓冲液(20mM Tris-HCl、10mM(NH4)2SO4、10mM KCI、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100,pH 8.8)中的溶液执行分析规模的生物转化，添加60％w/v甘油、40％w/v乙二醇、60％w/v 1,2-丙二醇或60％w/v 1,3-二氨基丙醇。将反应在70℃下孵育2小时，然后通过LC-MS进行分析。
结果：MS分析显示，在高浓度亲核试剂存在下，EndoV催化将替代性亲核试剂加成到18聚体产物的5'-磷酸基团上。这提供了适用于缀合至递送媒介物(诸如抗体、肽、蛋白质或糖)以靶向递送至特定器官的修饰的寡核苷酸。尽管修饰的18聚体是次要产物，但可以通过使用定向进化对EndoV进行工程化来提高产率。
用于一锅聚合酶/EndoV催化的寡核苷酸合成的通用方案(图18和22)
使用模板(20μM)、dNTP(各自1mM)、KOD(0.2μM)和TnEndoV(2μM)于ThermoPol缓冲液(20mM Tris-HCL、10mM(NH4)2SO4、10mM KCI、2mM MgSO4、0.1％Triton X-100,pH 8.8)中的溶液执行分析规模的生物转化。将反应在70℃下孵育12小时，并且通过LC-MS和变性脲PAGE分析样品。用于合成P19-P32的反应条件在补充表3中报告。
结果：成功扩增出一系列具有不同碱基序列和多种2’F、Rp-PS、Rp-2’F-PS和LNA修饰的8聚体寡核苷酸产物。在有利的情况下，实现了多达238个模板延伸和产物切割循环，消耗了76％的NTP起始材料
Vitravene的制备规模合成(图19)
使用Sp-dGTPαS(1.4mM)、SP-dCTPαS(1.7mM)、Sp-dTTPαS(2.9mM)、模板T25(4μM)、KOD(4μM)和TnEndoV(4μM)，在含有50mM Tris AcOH、20mM MgSO4、50mM KOAc、100mM KGIu、100mM ArgHCl、0.01mg/ml AcBSA、0.1％Triton X-100、30mM DTT、5％甲酰胺(pH 8.0)的缓冲液中执行0.75ml规模的生物转化。在70℃下孵育12小时，通过加热至98℃持续2小时来淬灭反应。将反应混合物在1K MWCO Microsep Advance(Pall)上脱盐。通过添加DNA酶I(最终浓度60U/ml)(New England Biolabs)和DNA酶I10x缓冲液(最终浓度1x)去除模板，并且在37℃下孵育1小时。将DNA酶I在75℃下热灭活10分钟，并且将反应混合物再次在1K MWCOMicrosep Advance上脱盐。随后，通过添加quick CIP(最终浓度250U/ml)(New EnglandBiolabs)和10x quickCIP缓冲液(最终浓度1x)来去除5'末端磷酸基团，然后在37℃下孵育3小时。通过将样品在95℃下孵育20分钟使蛋白质热变性，并且通过离心(13,300r.p.m.，15分钟)来沉淀出蛋白质。收集含有寡核苷酸的上清液并且用水(200μl)洗涤蛋白质沉淀。将合并的水性级分用Tris饱和苯酚-氯仿-异戊基溶液(Sigma Aldrich)萃取并用氯仿洗涤以去除任何剩余的蛋白质。通过在1KMWCO Microsep Advance上洗涤产物来去除残留的有机杂质和盐。将最终产物冷冻干燥。
结果：在65个模板延伸和产物切割循环后，产生了最终产物(0.26mM)，这与90％可用Sp-dNTPαS起始材料的消耗相关。最终产物的以87％的纯度分离而无需色谱纯化。
序列
表1a
寡核苷酸序列
/>
/>
(p)＝5’-磷酸
生物素＝5’-生物素
t-(生物素)＝生物素修饰的胸苷残基
i5-TAMK＝TAMRATM的5-异构体
iFluorT＝荧光素通过6-碳间隔臂附接至胸腺嘧啶环的位置5/ideoxyl/＝脱氧肌苷
*＝5’-硫代磷酸酯键联
*Rp＝5’-Rp硫代磷酸酯键联
*sp＝5’-Sp硫代磷酸酯键联
表1续额外的寡核苷酸序列
(P)：5’磷酸基团
I：2’-脱氧肌苷
(Bio)：5’-生物素化的(IDT代码：/5Biosg/)
m：2’-OMe
+：LNA
Me：2’-甲氧基乙氧基
MeC：2’-甲氧基乙氧基核糖-5’-甲基胞苷
*：硫代磷酸酯键联
f：2’-氟
表3聚合酶序列
KOD(SEQ ID NO:75)
来自Thermococcus kodakaraensis的聚合酶，具有校对结构域(proof readingdomain)中的突变(D141A E143A)消光系数：125,030M-1cm-1质量：91.0kDa
9oN(SEQ ID NO:76)
来自嗜热球菌属(Thermococcus)物种9ON-7的聚合酶，具有校对结构域中的突变(D141A E143A)消光系数：122,050M-1cm-1质量：90.8kDa
Stoffel片段(SEQ ID NO:77)
来自水生栖热菌(Thermus aquaticus)的Stoffel片段消光系数：70,360M-1cm-1质量：62.0kDa
SFM4-6(SEQ ID NO:78)
来自水生栖热菌的DNA聚合酶的Stoffel片段，具有I322E E323GD363N L366ME389K E450N M455R突变消光系数：70,360M-1cm-1质量：62.0kDa
TfPol(SEQ ID NO:79)
来自丝状栖热菌(野生型)的Stoffel片段同源物消光系数：56,380M-1cm-1质量：62.0kDa
TfPol*(SEQ ID NO:80)
来自丝状栖热菌的Stoffel片段同源物，含有显示增强SF4-6的底物混杂性的点突变1341E E342G D382N L384M E408K E469NM474R消光系数：56,380M-1cm-1质量：63.0kDa
MhPol*(SEQ ID NO:81)
来自热液海洋嗜热菌的Stoffel片段同源物，含有显示增强SF4-6的底物混杂性的点突变I144Y I343E E344G D384N L386M E410KE471N M476R消光系数：90,300M-1cm-1质量：63.0kDa
MhPol(SEQ ID NO:82)
来自热液海洋嗜热菌的Stoffel片段同源物消光系数：90,300M-1cm-1质量：61.8kDa
KOD DGLNK KOD变体N210D、Y409G、A485L、D614N、E664K(Ref.21)(SEQ ID NO:83)
核酸内切酶V序列(表2)
/>
表4ii：用于合成P19-P32的反应条件。所有反应均使用模板(4μM)、TnEndoV(2μM)执行并且在70℃下孵育12小时。
dNTP混合物含有1mM 2’F-ATP和0.5mM的各种其他NTP
缓冲液A：20mM Tris-HCl(pH 8)、20mM MgCl2、100mM谷氨酸钾、100mM精氨酸HCl、0.01mg/ml乙酰化BSA、10mM DTT、0.2M海藻糖和1M 1,2-丙二醇
缓冲液B：50mM Tris-AcOH(pH 8)、20mM MgSO4、50mM KOAc、100mM谷氨酸钾、100mM精氨酸HCl、0.01mg/ml乙酰化BSA、0.1％Triton和30mM DTT
缓冲液C含有20mM Tris-HCl(pH 8.8，在25℃下)、10mM(NH4)2SO4、10mM KCI、2mMMgSO4、0.1％X-100和2mM NiCI2。
缓冲液D：20mM Tris-HCl(pH 8)、20mM MgCl2、100mM谷氨酸钾、100mM精氨酸HCl、0.01mg/ml乙酰化BSA、10mM DTT

Claims (23)

1.一种用于产生单链寡核苷酸的方法，所述方法包括：
i.提供引物-模板，其包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，b)指导寡核苷酸产物合成的模板，以及c)使所述寡核苷酸产物能够从所述模板释放的可切割位点；
ii.将所述引物-模板与核酸聚合酶、一种或多种dNTP和切割剂一起孵育，以形成反应混合物；
iii.将所述反应混合物维持在允许以下的条件下：通过所述聚合酶延伸所述引物以形成延伸的引物-模板，以及通过所述切割剂在所述可切割位点处切割所述延伸的引物-模板以提供寡核苷酸产物；
iv.任选地从所述反应混合物中分离所述寡核苷酸产物。
2.根据权利要求1所述的方法，其中所述聚合酶是如表3所示的来自Thermococcuskodakaraensis(KOD)、Stoffel家族B聚合酶9°N、丝状栖热菌(TfPol)和热液海洋嗜热菌(MhPol)的聚合酶；来自大肠杆菌的Klenow片段、T4和T7聚合酶、SFP1、Stoffel变体SFM4-6、来自丝状栖热菌和热液海洋嗜热菌(Mhpol)的Stoffel同源物、以及如表3所示的具有所列突变的任何前述聚合酶的变体。
3.一种产生单链寡核苷酸群体的方法，所述方法包括：
i)提供引物-模板，其包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，
b)指导寡核苷酸产物合成的模板，以及c)使所述寡核苷酸产物能够从所述模板释放的可切割位点；
ii)将所述引物-模板与核酸聚合酶、一种或多种dNTP和切割剂一起孵育，以形成反应混合物；
iii)将所述反应混合物维持在允许以下的条件下：通过所述聚合酶延伸所述引物以形成延伸的引物-模板，以及通过所述切割剂在所述可切割位点处切割所述延伸的引物-模板以提供寡核苷酸产物；
iv)任选地从所述反应混合物中分离所述寡核苷酸产物，
其中所述核苷酸包括修饰的硫代三磷酸(NTPαS)并且其中所述寡核苷酸群体包含基本上相同的立体异构体；
并且其中所述聚合酶选自由以下组成的组：如表3所示的来自Thermococcuskodakaraensis(KOD)、Stoffel家族B聚合酶9°N、丝状栖热菌(TfPol)和热液海洋嗜热菌(MhPol)的聚合酶；来自大肠杆菌的Klenow片段、T4和T7聚合酶、SFP1、Stoffel变体SF4-6、来自丝状栖热菌和热液海洋嗜热菌(Mhpol)的Stoffel同源物、以及如表3所示的任何前述聚合酶的变体。
4.根据权利要求1至3中任一项所述的方法，其中所述试剂基本上不包含乙腈。
5.根据权利要求1至4中任一项所述的方法，其中所述切割由核酸内切酶V介导，所述核酸内切酶优选来自海栖热袍菌的TmEndoV(TmEndoV)、来自新阿波罗栖热袍菌的TmEndoV、来自温泉假栖热袍菌的PtEndov、来自美热栖热腔菌的TmeEndoV以及来自大西洋栖热腔菌的TaEndoV；或其变体。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法，其中步骤iii)中维持所述反应混合物的所述步骤包括将所述反应混合物维持一定的反应时间段，其中一定的反应时间段是允许在同一反应混合物内进行两个或更多个延伸和切割循环的持续时间。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法，其中步骤iii)的所述反应条件包括等于或高于所述引物和延伸产物的解链温度的反应温度，并且优选地步骤iii)的所述反应条件是等温的。
8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法，其中所述方法还包括一个或多个以下步骤：从所述模板解离寡核苷酸产物；从反应混合物分离所述寡核苷酸产物；以及纯化所述寡核苷酸产物。
9.一种用于产生单链寡核苷酸的试剂盒，所述试剂盒包含：
i.引物-模板，其包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，b)指导寡核苷酸产物合成的模板，以及c)使所述寡核苷酸产物能够从所述模板释放的可切割位点；以及任选地以下中的一种或多种：
ii)核酸聚合酶和任选地核苷酸
iii)切割剂。
10.根据权利要求9所述的试剂盒，其包含含有引物-模板的第一容器，以及含有核苷酸、聚合酶和/或缓冲液的第二容器或其他容器。
11.一种用于产生单链寡核苷酸的反应混合物，所述反应混合物包含引物-模板，所述引物-模板包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，b)指导寡核苷酸产物合成的模板，以及c)使所述寡核苷酸产物能够从所述模板释放的可切割位点；以及：
i.核酸聚合酶和任选地核苷酸
ii.切割剂
iii.寡核苷酸产物，其与所述模板序列互补。
12.根据权利要求1至11中任一项所述的方法、试剂盒、反应或支持物，其中所述切割位点是脱氨基碱基，优选肌苷。
13.根据权利要求1至12中任一项所述的方法、试剂盒、反应或支持物，其中所述模板序列是治疗性RNA的互补序列。
14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法、试剂盒、反应或支持物，其中所述寡核苷酸产物是治疗性RNA，优选miRNA或反义寡核苷酸(ASO)或适体。
15.根据权利要求1至14中任一项所述的方法、试剂盒、反应或支持物，其中所述寡核苷酸产物包含一种或多种修饰的核苷酸。
16.根据权利要求1至15中任一项所述的方法、试剂盒、反应或支持物，其中所述聚合酶为如表3所定义的聚合酶或其变体；所述切割系统包含核酸内切酶V，并且所述切割位点是肌苷残基。
17.根据权利要求1至16中任一项所述的方法、反应或试剂盒，其中所述核苷酸包含天然和/或修饰的核苷酸，并且其中修饰的核苷酸包括包含修饰的碱基、糖或核苷酸间键联的核苷酸，所述修饰的碱基、糖或核苷酸间键联例如硫代磷酸酯核苷酸间键联、5'-N-亚磷酰胺键联、含有允许标记附接的连接基团的碱基，所述标记诸如荧光团或半抗原。
18.根据权利要求1至17中任一项所述的方法、试剂盒、反应或支持物，其中所述核酸分子包含固定部分，优选地其中所述固定部分是生物素。
19.一种用于产生单链寡核苷酸的支持物，其包含固定在其上的引物-模板群体，其中每种核酸分子包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，b)指导寡核苷酸产物合成的模板，以及c)使所述寡核苷酸产物能够从所述模板释放的可切割位点。
20.根据权利要求19所述的支持物，其中所述支持物是阵列，优选地其中所述阵列包含100、1000、10,000、100,000、1,000,000、10,000,000、100,000,000、1,000,000,000或更多个固定在其上的核酸分子。
21.一种寡核苷酸群体，其通过如权利要求1至20中任一项所述的方法产生。
22.根据权利要求21所述的寡核苷酸群体，其中所述群体的纯度为至少70％。
23.一种用于产生单链寡核苷酸的细胞，所述细胞包含引物-模板，所述引物-模板包含a)用于启动寡核苷酸合成的引物，b)指导寡核苷酸产物合成的模板，以及c)使所述寡核苷酸产物能够从所述模板释放的可切割位点。
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