JP2013518598A - ランダム化配列を含むプライマー及び特異的プライマーを用いる核酸の等温増幅並びにその使用 - Google Patents
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Abstract
【選択図】図1
Description
を含んでいる。
ワトソン−クリック塩基対合、非ワトソン−クリック塩基対合、又は非天然/修飾ヌクレオチドによって形成される塩基対合を介して起こり得る。
る。
核酸増幅反応のために使用した試薬及び試薬溶液は、汚染核酸を除去するため、使用に先立って無核酸フード内で除染した。Phi29DNAポリメラーゼ、エキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII及びSSBタンパク質のような試薬は、50mM Tris−HCl(pH7.2)、200mM NaCl、10mM DTT、1mM EDTA、0.01%(v/v)Tween−20及び50%(v/v)グリセロール中に貯蔵した。プライマー及びヌクレオチド(dNTP)を含むプライマー−ヌクレオチド溶液(プライマー−ヌクレオチド混合物)は、プライマー−ヌクレオチド混合物をエキソヌクレアーゼI、エキソヌクレアーゼIII及び一本鎖DNA結合タンパク質(SSBタンパク質)と共にインキュベートすることで除染した。DNAポリメラーゼを含む酵素混合物は、二価陽イオン(例えば、Mg2+)の存在下でエキソヌクレアーゼと共にインキュベートすることで除染した。いずれの標的核酸増幅反応も、除染した酵素混合物及びプライマー−ヌクレオチド混合物を用いて実施した。
鋳型DNAを添加せずにDNA増幅反応を実施すること(無鋳型対照(NTC)増幅)で、核酸増幅反応中における非特異的増幅反応を評価した。かかる反応では、完全にランダムなプライマー又はLNAヌクレオチドを含む部分拘束プライマーを使用した。これらのプライマーはいずれも、配列の3’末端に近いヌクレオチド間にホスホロチオエート結合を有するエキソヌクレアーゼ耐性プライマーであった。
核酸増幅反応のため、プライマー−ヌクレオチド混合物及び酵素混合物を除染後に鋳型核酸と共に混合して増幅反応物を創製し、次いでこれを約30℃でインキュベートした。等温増幅反応は、Phi29DNAポリメラーゼの存在下、かつランダムプライマー、ビーズに結合した特異的プライマー及びpUC18プラスミドDNAの存在下で実施した。
特異的プライマーがビーズに結合したDNA捕獲ビーズを次のようにして合成する。DNA捕獲ビーズを合成するため、N−ヒドロキシスクシンイミドエステル(NHS)で活性化したSepharose(NHS HP SpinTrap(商標)、GE Healthcare社、ピスカタウェイ、米国ニュージャージー州)ビーズを使用した。次いで、製品文献(GE Healthcare NHS HP SpinTrap(商標)Protocol)に記載されたプロトコルを用いてビーズをオリゴヌクレオチドで官能化した。(増幅すべき鋳型である)pUC18プラスミドDNAの一本鎖の断片に対して相補的な−40ユニバーサル捕獲プライマーの5’末端に結合したアミン標識HEG(ヘキサエチレングリセロール)リンカー(5’−アミン−3 HEGスペーサー/5AmMC6/GTTTTCCCAGTCACGACGTTG*T*A−3’(配列番号1))をIDT Technologies社(コーラルビル、米国アイオワ州)から商業的に入手した。ここで、5AmMC6は、第一アミン基がヘキサエチレングリコールリンカーによってオリゴヌクレオチドの5’末端に結合されていることを表す。捕獲プライマーをTE緩衝液(pH8.0)に溶解して1mMの最終濃度を得た。3ピコモルのプライマーを各1μLのビーズに結合したが、1μLのプライマーをコンジュゲートしたビーズの充填スラリーは50000〜70000の個体ビーズを含み、ビーズは約30マイクロメートルの直径を有している。結合反応が100%完結した場合、これは60000個のビーズに結合した約3ピコモルのプライマー、即ちビーズ当たり1.5×108のプライマーを生じるであろう。
捕獲ビーズは、それに結合した1以上の特異的プライマー配列を含んでいる。DNA捕獲ビーズ(ビーズ−スペーサー−配列番号1又はビーズ−スペーサー−配列番号2)を使用することで、次のようにして増幅DNA分子を捕獲した。反応中にビーズが懸濁状態に保たれることを保証するため、回転器プラットホーム上において除染プライマー−ヌクレオチド混合物及び除染酵素混合物をpUC18プラスミドDNA鋳型と共に30℃で約400分間インキュベートすることでDNA増幅反応を実施した。増幅反応混合物は、40μMのプライマー(配列W+WNN*S(式中、WはA又はT/Uを表し、SはG又はCを表し、Nはランダムヌクレオチドを表し(即ち、NはA、C、G又はT/Uのいずれかであり得る)、文字表記の前に付けたプラス(+)記号はその文字によって表されるヌクレオチドがLNAヌクレオチドであることを意味し、文字表記の前に付けた星印(*)記号はその文字によって表されるヌクレオチドがホスホロチオエート修飾ヌクレオチドであることを意味する。)の部分拘束プライマー)、3μLの特異的プライマー(1マイクロリットル当たり約70000個のビーズであって、特異的プライマーはビーズに共有結合している。)、400μMのdNTP(各400μMのdATP、dCTP、dGTP、dTTP)、2ngのpUC18プラスミドDNA、及び200ngのPhi29DNAポリメラーゼ(反応物10μL当たり200ng)からなっていた。インキュベーションは、15mM KCl、20mM MgCl2、0.01%(v/v)Tween−20及び1mM TCEPを含む50mM HEPES緩衝液(pH=8.0)中で実施した。反応後、ビーズを沈降させた。未結合のDNA増幅生成物を含む反応上清を反応管から除去し、後の分析のために保存した。次いで、残ったビーズペレット200μLのTEで洗浄した。これは、TEを添加し、渦動によって短時間かきまぜ、マイクロフュージを用いて短時間遠心することで行った。この工程からのTE上清を除去し、洗浄工程をさらに2回繰り返した。洗浄済みのペレットを97μLのTE中に懸濁した。上述した増幅反応からのTE洗浄捕獲ビーズ15μlをペトリ皿に移した。ビーズスラリーを沈降させ、個々のビーズをマイクロマニピュレーションによって単離した。
NTCからの増幅生成物及びpUC18プラスミドDNAからの増幅生成物を、上述のようにして特異的ビーズでコートされたビーズ上に捕獲した。ビーズをTEで3回洗浄し、次いでEcoRI制限消化に付した。(陽性対照としての)pUC18DNAを別途に制限消化に付した。DNAを消化するため、10単位のEcoRI、1μLの10×酵素緩衝液、1μLのTE洗浄ビーズ及び7μLの水を添加して10μLの総反応容量とし、反応混合物を水浴中において37℃で1時間インキュベートした。
DNA増幅、捕獲、及び1つのビーズから別のビーズへのDNAを評価するため、以下の方法を実施した。管内において除染プライマー−ヌクレオチド混合物及び除染酵素混合物をプライマーでコートした捕獲ビーズ及びpUC18プラスミドDNA鋳型と共に30℃で約400分間インキュベートすることで、DNA増幅反応を開始した。増幅反応混合物は上述したものと同じであった。増幅DNAは管内に存在するビーズ上に捕獲した。
上述したビーズが増幅鋳型を含むことのさらなる実証例として、ビーズからDNA配列情報を得た。実施例5に関して上述したようにして、増幅DNAをビーズ上に捕獲した。増幅及び捕獲後、TEで洗浄したビーズをDNA配列決定反応用の鋳型として使用することで、ビーズが表面に結合した増幅DNAを含むことを実証した。得られた洗浄ビーズ1μL(50000個のビーズ)を取り出し、3.2ピコモル(1μL)のM13逆配列決定プライマー、4μLのBig Dye DNA配列決定プレミックス、2μLの配列決定緩衝液及び12μLの水の混合物を前記ビーズに添加した。DNAを製造業者の推奨条件に従ってサイクル配列決定し、配列決定生成物を沈殿によって精製し、ABI 3730x1配列決定機(Applied Biosystem社)上で分解した。配列決定データ(配列番号2)を図7に示す。これらのビーズから得られた配列は、約200ngのpUC18鋳型DNAを用いて通常得られるものと同等なシグナル強度を有していた。これは、各ビーズが約10ピコグラムの結合増幅pUC18DNAを有し得ることを表している。得られた配列はpUC18 DNAから得られる配列と正確なマッチを示し、ビーズに結合したDNAが増幅pUC18 DNAであることを表している。
Claims (23)
- 核酸の増幅方法であって、
核酸鋳型、DNAポリメラーゼ、デオキシリボヌクレオシド三リン酸、ランダム化配列を含むプライマー、及び特異的プライマーを用意する段階、並びに
等温条件下で核酸鋳型を増幅して増幅核酸配列を生成させる段階
を含んでなる方法。 - ランダムプライマーが1以上の修飾核酸塩基を含む、請求項1記載の方法。
- 修飾核酸塩基がランダム化配列を含むプライマーの融解温度を高める、請求項2記載の方法。
- 修飾核酸塩基がロックド核酸塩基、ペプチド核酸塩基及びリボ核酸塩基から選択される、請求項2記載の方法。
- 特異的プライマーが第1の基材に結合されている、請求項1記載の方法。
- 第1の基材がビーズ、試験管、マルチウェルプレート及びスライドから選択される、請求項5記載の方法。
- 第1の基材の材料がポリマー、ガラス及び金属から選択される、請求項5記載の方法。
- さらに、増幅核酸配列を特異的プライマーとハイブリダイズして第1の基材に結合した核酸配列を生成させることで増幅核酸配列を捕獲する段階を含む、請求項5記載の方法。
- さらに、第1の基材に結合した核酸配列を鋳型として用いて特異的プライマーのハイブリダイゼーション部位から核酸配列を伸長させる段階を含む、請求項1記載の方法。
- さらに、ランダム化配列を含むプライマーによって第1の基材に結合した核酸配列を増幅して第2の増幅核酸配列を生成させる段階を含む、請求項8記載の方法。
- さらに、第2の増幅核酸を第2の基材に結合した特異的プライマーとハイブリダイズすることで、第2の核酸配列を第2の基材によって捕獲する段階を含む、請求項10記載の方法。
- 特異的プライマーが捕獲剤に結合されている、請求項1記載の方法。
- 捕獲剤が親和性タグを含む、請求項12記載の方法。
- 増幅がエマルジョン中で実施される、請求項1記載の方法。
- 増幅がローリングサークル増幅又は多重置換増幅を含む、請求項1記載の方法。
- 増幅核酸配列がタンデム反復核酸配列である、請求項1記載の方法。
- 核酸鋳型が環状核酸である、請求項1記載の方法。
- 核酸鋳型が組換え部位を含む、請求項1記載の方法。
- 核酸鋳型がDNAである、請求項1記載の方法。
- DNAポリメラーゼがPhi29DNAポリメラーゼである、請求項1記載の方法。
- ランダムプライマーが5以上のヌクレオチドを含む、請求項1記載の方法。
- 核酸を増幅するためのキットであって、
Phi29DNAポリメラーゼ、
ランダム化配列を含む1以上のプライマー、及び
1以上の特異的プライマー
を含んでなるキット。 - 特異的プライマーが基材又は捕獲剤に結合されている、請求項23記載のキット。
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