JP6886962B2 - Ｒｎａシークエンシングライブラリーを生成する方法 - Google Patents

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Description

発明の分野
本発明は、ＲＮＡに転写されるＤＮＡコード鎖および非コード鎖を同定するために使用することができる鎖特異的ＲＮＡシークエンシングライブラリーの新規調製方法に言及する。そのような鎖特異的ＲＮＡシークエンシングライブラリーは、アンチセンスＲＮＡおよび非コードＲＮＡの発見において特に有用である。ライゲーションを遮断する部分と共有結合したランダムなプライマーオリゴヌクレオチドをＲＴ反応またはその後の第２のＤＮＡ鎖の生成のために使用し、したがって、生成された２本鎖ＤＮＡの一方の鎖のみが５’ヌクレオチドにおいてシークエンシングアダプターとライゲーションし、ペアエンドシークエンシングによってシークエンシングされる。
発明の背景
高等真核生物のゲノムの１．５％をカバーするｍＲＮＡに加えて、発現レベルが広範に変動する多数の非コードＲＮＡが同定されている。これらの新規転写物の生物学的機能はほとんど分かっておらず、生物学的プロセスを解明するためのハイスループットなトランスクリプトーム試験を必要とする新しい研究領域になっている。
次世代シークエンシングの最近の発展により可能になったハイスループットなＲＮＡシークエンシング（ＲＮＡ−Ｓｅｑ）技術は、遺伝子発現プロファイルの解析、転写物バリアントの検出、および非コード調節ＲＮＡの機能の理解における強力なツールになっている。標準のＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーは、シークエンシングアダプターを２本鎖ＤＮＡにライゲーションすることによって生成される。鎖特異的ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーを調製するための方法には２つの主要なクラスがある。第１の方法は、種々のアダプターをＲＮＡ分子の３’末端および５’末端にライゲーションすることを含む（例えば、Ｌｉｆｅ ＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓからのＩｏｎ Ｔｏｔａｌ ＲＮＡ−Ｓｅｑ Ｋｉｔ ｖ２を参照されたい）。もう１つの、より広く使用されている方法は、第２鎖ＤＮＡ合成においてｄＮＴＰに加えてｄＵＴＰを組み入れることを含む。アダプターライゲーションの後、第２鎖ＤＮＡをウラシル−Ｎ−グリコシラーゼ（ＵＮＧ）酵素によって特異的に消化することができ、したがって、第１鎖ｃＤＮＡを含有するライブラリー鎖のみがシークエンシングされ、したがって、転写物の方向に関する情報を得ることができる（Ｍ． Ｓｕｌｔａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、４２２巻（２０１２年）６４３〜６４６頁を参照されたい）。
しかし、これらの従来の方法には短所がある。
第１の方法では、ＲＮＡのライゲーションが偏ったものになりやすく、これは、ライゲーションに使用されるＲＮＡ基質およびアダプターの内部およびそれらの間の構造的性質によって引き起こされる。
第２鎖ＤＮＡ合成においてｄＮＴＰに加えてｄＵＴＰを適用する、より広く使用されている方法では、アダプターライゲーションの後に追加的なＵＮＧ消化ステップが必要になり、これにより、ライブラリー構築プロセスがより複雑で時間のかかるものになる。さらに、どんな酵素反応でもそうであるがように、ＵＮＧ反応は、１００％効率的なものではない。ＵＮＧ消化後であっても第２鎖ｃＤＮＡが残留している可能性があり、それにより、ＲＮＡシークエンシングデータの誤った解釈が引き起こされる可能性がある。
Ｍ． Ｓｕｌｔａｎら、Ｂｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ ａｎｄ Ｂｉｏｐｈｙｓｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ Ｃｏｍｍｕｎｉｃａｔｉｏｎｓ、４２２巻（２０１２年）６４３〜６４６頁
したがって、当技術分野において、ＲＮＡ配列解析のための、より単純かつより特異的な方法が必要とされている。
発明の要旨
ＲＮＡが転写される元の正確な鎖に関する情報は、アンチセンスおよび非コードＲＮＡ種の発見およびそれらの機能の試験において有用である。センス転写物を重複するアンチセンス転写物から区別できることにより、ＲＮＡ定量の正確度がさらに改善され得る。これに関連して、本発明者らは、１本鎖鋳型ならびに多数のそのような鎖の増幅に対して高度に特異的であり、また、上記の現在最も広く使用されているＲＮＡシークエンシング方法とは対照的に、単一のシークエンシング鋳型の増幅を実現するために追加的な酵素的ステップを伴わずに高度に特異的である、新しいＲＮＡシークエンシング方法を開発した。
具体的には、本発明は、ＲＮＡシークエンシングの方法であって、
（ｉ）ＲＮＡを提供するステップ、
（ｉｉ）逆転写酵素、第１のセットのオリゴヌクレオチドプライマー、およびステップ（ｉ）のＲＮＡを使用することにより上記ＲＮＡを逆転写に供することによって上記ＲＮＡと相補的な１本鎖の第１のＤＮＡ鎖（単数または複数）（ｃＤＮＡ）を生成するステップ、ならびに
（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、第２のセットのオリゴヌクレオチドプライマー、および（ｉｉ）の１本鎖ｃＤＮＡを使用することによって第２のＤＮＡ鎖を生成するステップ、
を含み、
ａ）上記第１のセットのオリゴヌクレオチドプライマーが、その５’末端ヌクレオチドに、生成された第１のＤＮＡ鎖の５’末端におけるライゲーションを遮断する共有結合した部分を含むか、または
ｂ）第２のセットのオリゴヌクレオチドプライマーが、その５’末端ヌクレオチドに、生成された第２のＤＮＡ鎖の５’末端におけるライゲーションを遮断する共有結合した部分を含む、
方法に言及する。
一部の実施形態では、上記方法は、その後の、
（ｉｖ）任意選択で、末端修復されたＤＮＡ鎖を得るために、ポリヌクレオチドキナーゼ、およびポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性とを有する酵素を使用して、２本鎖ＤＮＡ鎖を末端修復するステップ、
（ｖ）任意選択で、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を使用して上記ＤＮＡ鎖の３’末端に末端アデニンを付加するステップ、および
（ｖｉ）末端チミンを任意選択で含むアダプターを、３’末端アデニンを任意選択で含むＤＮＡ鎖にライゲーションするステップ
をさらに含む。
前記方法は、生成されたＤＮＡの配列解析をさらに含み得る。
一部の実施形態では、上記方法は、
（ｉ）ＲＮＡを提供するステップ、
（ｉｉ）逆転写酵素、第１のセットのオリゴヌクレオチドプライマー、およびステップ（ｉ）のＲＮＡを使用することにより上記ＲＮＡを逆転写に供することによって上記ＲＮＡと相補的な１本鎖の第１のＤＮＡ鎖（単数または複数）（ｃＤＮＡ）を生成するステップ、
（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、第２のセットのオリゴヌクレオチドプライマー、および（ｉｉ）の１本鎖ｃＤＮＡを使用することによって第２のＤＮＡ鎖を生成するステップ、
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の２本鎖ＤＮＡにアダプターをライゲーションするステップ、ならびに
（ｖ）生成されたＤＮＡのシークエンシングを行うステップ
を含み、
ａ）第１のセットのオリゴヌクレオチドプライマーが、その５’末端ヌクレオチドに、生成された第１のＤＮＡ鎖の５’末端におけるライゲーションを遮断する共有結合している部分を含むか；または
ｂ）第２のセットのオリゴヌクレオチドプライマーが、その５’末端ヌクレオチドに、生成された第２のＤＮＡ鎖の５’末端におけるライゲーションを遮断する共有結合した部分を含む。
第２のＤＮＡ鎖を生成するステップにより、２本鎖ＤＮＡが生成される。
上記の方法の一部の実施形態では、ステップ（ｉｖ）の前に、上記方法は、
（ｉｉｉ）（ａ）末端修復されたＤＮＡ鎖を得るために、ポリヌクレオチドキナーゼ、およびポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性とを有する酵素を使用して、２本鎖ＤＮＡ鎖を末端修復するステップを含む。
一部の実施形態では、ステップ（ｉｉｉ）（ａ）の後に、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を使用することによってＤＮＡ鎖の３’末端に末端アデニンを付加することを含むステップ（ｉｉｉ）（ｂ）であって、アダプターが３’末端チミンを含み、それがステップ（ｉｖ）において３’末端アデニンを含むＤＮＡ鎖とライゲーションする、ステップ（ｉｉｉ）（ｂ）を行う。
一部の実施形態では、遮断性部分と共有結合しているオリゴヌクレオチドプライマー、および／または非修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーである。
一部の実施形態では、上記方法は、目的のＲＮＡを抽出し、任意選択で富化する最初のステップを含む。一部の実施形態では、抽出されたＲＮＡを平均サイズ１９〜５１０ｂｐに断片化する。
上記の方法の一部の実施形態では、ペアエンドシークエンシングのために上記分子を固体支持体に付着させることができる。
本発明の別の態様は、キットであって
（ｉ）ＤＮＡとシークエンシングアダプターのライゲーションを遮断する、５’末端ヌクレオチドに共有結合した部分を含むオリゴヌクレオチドプライマー；
（ｉｉ）非修飾オリゴヌクレオチドプライマー；
（ｉｉｉ）逆転写酵素；および
（ｉｖ）任意選択で、ＤＮＡポリメラーゼ
を含む、キットをいう。
一部の実施形態では、上記キットは、
（ｉ）ＤＮＡとシークエンシングアダプターのライゲーションを遮断する、５’末端ヌクレオチドに共有結合した部分を含むオリゴヌクレオチドプライマー；
（ｉｉ）非修飾オリゴヌクレオチドプライマー；
（ｉｉｉ）逆転写酵素；
（ｉｖ）任意選択で、ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｖ）ポリヌクレオチドキナーゼ、およびポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性とを有する酵素；
（ｖｉ）任意選択で、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素；
（ｖｉｉ）末端チミンを任意選択で含み、それぞれが、表面にそれぞれ結合した増幅プライマーと相補的である、２つのアダプター、ならびに
（ｖｉｉｉ）リガーゼ
を含む。
上記のキットの一部の実施形態では、遮断性部分と共有結合しているオリゴヌクレオチドプライマーまたは非修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーである。
上記の方法またはキットの一部の実施形態では、逆転写酵素は、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、マウス白血病ウイルス逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ａｖｉａｎ ｍｙｅｏｌｏｂｌａｓｔｏｓｉｓ ｖｉｒｕｓ）（ＡＭＶ）、細菌逆転写酵素、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ、ならびに、それらの酵素的に活性な突然変異体、断片、バリアントおよび／または誘導体のうちの任意の１つから選択される。
一部の実施形態では、「ライゲーションを遮断する部分」、または「遮断性部分」とは、修飾されたプライマーオリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドに共有結合した、１つ超の原子である大きな分子の特定の一部分、本明細書では修飾オリゴヌクレオチドの一部分を指す。上記部分は、その部分が位置する部位、好ましくはオリゴヌクレオチドの５’末端の５’末端ヌクレオチドにおけるあらゆるライゲーションを遮断するものであることが好ましい。
上記の方法またはキットの一部の実施形態では、遮断性部分を含むオリゴヌクレオチドプライマーは、
（ｉ）オリゴヌクレオチドが、５’末端ヌクレオチドに、遊離していない５’リン酸を含み、任意選択で、５’末端ヌクレオチドの５’ＯＨ基または５’リン酸基が、ライゲーションを遮断する部分と共有結合していること；
（ｉｉ）５’末端ヌクレオチドの塩基が、チミン、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルのいずれでもないこと；
（ｉｉｉ）５’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの２’水素の一方または両方が別の原子または遮断性部分で置き換えられていること；ならびに／または
（ｉｖ）オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡまたはＤＮＡにおけるリボースまたはデオキシリボースの立体コンフォメーションではない立体コンフォメーションのペントースを有する５’末端ヌクレオチドを含む
ことを特徴とする。
ＲＮＡまたはＤＮＡにおけるリボースまたはデオキシリボースコンフォメーションは、β−Ｄ−リボフラノースまたはβ−Ｄ−デオキシリボフラノースの立体化学的コンフォメーションを含むか、またはそれからなる。
一部の実施形態では、遊離していないリン酸において、リン酸の１つまたは複数のＯＨ基が、リン酸基がさらなるモノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドとのライゲーション反応を受けることができないように修飾されている。
上記の方法またはキットの一部の実施形態では、ライゲーションを遮断する共有結合した部分を含むオリゴヌクレオチドプライマーは、ライゲーション遮断性質を付与する部分と共有結合する前に５’末端ヌクレオチドにおいて５’ＯＨまたは遊離の５’リン酸基を含む。
上記の方法またはキットの一部の実施形態では、ライゲーションを遮断する共有結合した部分を含むオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの５’リン酸基は、エステル化されているか、または、ライゲーションを遮断する共有結合した部分を含むオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチドの５’ＯＨ基は、エステル化もしくはエーテル化されている。
上記の方法またはキットの一部の実施形態では、ライゲーションを遮断する共有結合した部分を含むオリゴヌクレオチドプライマーの５’リン酸基は、アルキルアルコールまたはアリールアルコールによってエステル化されているか、または、ライゲーションを遮断する共有結合した部分を含むオリゴヌクレオチドプライマーの５’ＯＨ基は、モノアルキルホスフェート、ジアルキルホスフェート、モノアルキルホスホチオネートもしくはジアルキルホスホチオネート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏｎａｔｅ）によって、もしくはボロン酸によってエステル化されている。
上記の方法またはキットの一部の実施形態では、アルキルアルコールまたはアリールアルコールは、モノエーテルもしくはポリエーテル、モノエステルもしくはポリエステル、カルボン酸、第一級アミンもしくはヒドロキシル基、もしくはモノアルキルホスフェート、ジアルキルホスフェート、モノアルキルもしくはジアルキルホスホチオネートから選択される少なくとも１つの追加的な官能基を含むか、またはボロン酸は、モノエーテルもしくはポリエーテル、モノエステルもしくはポリエステル、カルボン酸、第一級アミンもしくはヒドロキシル基から選択される少なくとも１つの追加的な官能基を含む。
上記の方法またはキットの一部の実施形態では、ライゲーションを遮断する共有結合した部分を含むオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの５’ＯＨ基は、５’スペーサー１８、５’スペーサー９、５’Ｃ３−スペーサー、５’Ｃ６−スペーサー、５’脱塩基残基（ｄスペーサー、ｒスペーサー）、５’−５’反転ヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）などの５’−スペーサー、ならびにＤＡＤＥ−リンカー、５’Ｃ６−アミノ−リンカー、５’Ｃ１２−アミノ−リンカー、および５’−ビオチン化５’Ｃ６または５’Ｃ１２−アミノ−リンカーなどの５’リンカーから選択される分子によってエステル化されている。
５’ＯＨ基への共有結合のための作用剤／部分のサブセットは図５に開示されている。
上記の方法またはキットの一部の実施形態では、非修飾５’末端ヌクレオチドを、フルダラビン、アザチオプリン、メルカプトプリン、ペントスタチン、クラドリビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、およびテガフールのうちの任意の１つと共有結合させる。
上記の方法またはキットの一部の実施形態では、５’末端においてライゲーションを遮断する部分を含む、生成された第１のＤＮＡ鎖は、その３’末端に、前記３’末端におけるライゲーションを遮断するものであり、第１のＤＮＡ鎖の生成後に導入される、共有結合した部分をさらに含む。
一部の実施形態では、第１のＤＮＡ鎖の３’末端の３’ＯＨ基は遊離しておらず、前記３’ＯＨ基は、ライゲーションを遮断する部分と共有結合していることが好ましい。前記ライゲーションを遮断する部分との共有結合は、第１のＤＮＡ鎖の３’末端の３’ＯＨ基のエステル化またはエーテル化であることがなおより好ましい。
上記の方法またはキットの一部の実施形態では、アダプターを２つの異なる表面に結合した増幅プライマーとハイブリダイズさせる。
特定の実施形態では、例えば以下の項目が提供される。
（項目１）
ＲＮＡシークエンシングの方法であって、
（ｉ）ＲＮＡを提供するステップ；
（ｉｉ）逆転写酵素、第１のセットのオリゴヌクレオチドプライマー、およびステップ（ｉ）の前記ＲＮＡを使用することにより前記ＲＮＡを逆転写に供することによって前記ＲＮＡと相補的な１本鎖の第１のＤＮＡ鎖（単数または複数）（ｃＤＮＡ）を生成するステップ；
（ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、第２のセットのオリゴヌクレオチドプライマー、および（ｉｉ）の前記１本鎖ｃＤＮＡを使用することによって第２のＤＮＡ鎖を生成するステップ；
（ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の前記２本鎖ＤＮＡにアダプターをライゲーションするステップ；ならびに
（ｖ）前記生成されたＤＮＡのシークエンシングを行うステップ
を含み、
ａ）前記第１のセットのオリゴヌクレオチドプライマーが、その／それらの５’末端ヌクレオチドに、前記生成された第１のＤＮＡ鎖の５’末端におけるライゲーションを遮断する部分を含むか；または
ｂ）前記第２のセットのオリゴヌクレオチドプライマーが、その／それらの５’末端ヌクレオチドに、前記生成された第２のＤＮＡ鎖の５’末端におけるライゲーションを遮断する部分を含む、方法。
（項目２）
ステップ（ｉｖ）の前に、
（ｉｉｉ）（ａ）末端修復されたＤＮＡ鎖を得るために、ポリヌクレオチドキナーゼ、およびポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性とを有する酵素を使用して、前記２本鎖ＤＮＡ鎖を末端修復するステップ
を含む、項目１に記載の方法。
（項目３）
ステップ（ｉｉｉ）（ａ）の後に、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を使用することによってＤＮＡ鎖の３’末端に末端アデニンを付加することを含むステップ（ｉｉｉ）（ｂ）であって、前記アダプターが３’末端チミンを含み、それがステップ（ｉｖ）において３’末端アデニンを含む前記ＤＮＡ鎖とライゲーションする、ステップ（ｉｉｉ）（ｂ）を行う、項目２に記載の方法。
（項目４）
（ｉ）ＤＮＡとシークエンシングアダプターのライゲーションを遮断する、５’末端ヌクレオチドに共有結合した部分を含むオリゴヌクレオチドプライマー；
（ｉｉ）非修飾オリゴヌクレオチドプライマー；
（ｉｉｉ）逆転写酵素；
（ｉｖ）任意選択で、ＤＮＡポリメラーゼ；
（ｖ）ポリヌクレオチドキナーゼ、およびポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性とを有する酵素；
（ｖｉ）任意選択で、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素；
（ｖｉｉ）末端チミンを任意選択で含み、それぞれが、表面にそれぞれ結合した増幅プライマーと相補的である、２つのアダプター、ならびに
（ｖｉｉｉ）リガーゼ
を含む、キット。
（項目５）
ライゲーションを遮断する部分を含む前記オリゴヌクレオチドプライマー、および／または非修飾オリゴヌクレオチドプライマーが、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーである、項目１から３までのいずれか一項に記載の方法または項目４に記載のキット。
（項目６）
前記逆転写酵素が、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、マウス白血病ウイルス逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、細菌逆転写酵素、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼまたはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのうちの任意の１つから選択される、項目１から３までもしくは項目５に記載の方法または項目４もしくは５に記載のキット。
（項目７）
遮断性部分を含む前記オリゴヌクレオチドが、
（ｉ）前記オリゴヌクレオチドが、５’末端ヌクレオチドに、遊離していない５’リン酸を含み、任意選択で、５’末端ヌクレオチドの５’ＯＨ基または５’リン酸基が、ライゲーションを遮断する部分と共有結合していること；
（ｉｉ）前記５’末端ヌクレオチドの塩基が、チミン、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルのいずれでもないこと；
（ｉｉｉ）前記５’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの２’水素の一方または両方が別の原子または遮断性部分で置き換えられていること；ならびに／または
（ｉｖ）前記オリゴヌクレオチドが、ＲＮＡまたはＤＮＡにおけるリボースまたはデオキシリボースの立体コンフォメーションではない立体コンフォメーションのペントースを有する５’末端ヌクレオチドを含むこと
を特徴とする、項目１から３までおよび項目５から６までのいずれか一項に記載の方法または項目４から６までのいずれか一項に記載のキット。
（項目８）
ライゲーションを遮断する前記オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの５’リン酸基がエステル化されているか、またはライゲーションを遮断する前記オリゴヌクレオチドの５’末端ヌクレオチドプライマーの５’ＯＨ基がエステル化またはエーテル化されている、項目７に記載の方法またはキット。
（項目９）
ライゲーションを遮断する前記オリゴヌクレオチドプライマーの前記５’リン酸基は、アルキルアルコールまたはアリールアルコールによってエステル化されているか、または、ライゲーションを遮断する前記オリゴヌクレオチドプライマーの前記５’ＯＨ基は、モノアルキルホスフェート、ジアルキルホスフェート、モノアルキルホスホチオネートもしくはジアルキルホスホチオネート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏｎａｔｅ）によって、もしくはボロン酸によってエステル化されている、項目７または８に記載の方法またはキット。
（項目１０）
前記アルキルアルコールもしくはアリールアルコールが、モノエーテルもしくはポリエーテル、モノエステルもしくはポリエステル、カルボン酸、第一級アミンもしくはヒドロキシル基から選択される少なくとも１つの追加的な官能基を含むか、または、前記モノアルキルホスフェート、ジアルキルホスフェート、モノアルキルもしくはジアルキルホスホチオネート、もしくはボロン酸が、モノエーテルもしくはポリエーテル、モノエステルもしくはポリエステル、カルボン酸、第一級アミンもしくはヒドロキシル基から選択される少なくとも１つの追加的な官能基を含む、項目９に記載の方法またはキット。
（項目１１）
ライゲーションを遮断する前記オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの５’ＯＨ基は、５’スペーサー１８、５’スペーサー９、５’Ｃ３−スペーサー、５’Ｃ６−スペーサー、５’脱塩基残基（ｄスペーサー、ｒスペーサー）、５’−５’反転ヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）などの５’−スペーサー、ならびにＤＡＤＥ−リンカー、５’Ｃ６−アミノ−リンカー、５’Ｃ１２−アミノ−リンカー、および５’−ビオチン化５’Ｃ６または５’Ｃ１２−アミノ−リンカーなどの５’リンカーから選択される分子によってエステル化されている、項目７〜１０のいずれか一項に記載の方法またはキット。
（項目１２）
非修飾５’末端ヌクレオチドを、フルダラビン、アザチオプリン、メルカプトプリン、ペントスタチン、クラドリビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、およびテガフールのうちの任意の１つと共有結合させる、項目７に記載の方法またはキット。
（項目１３）
５’末端におけるライゲーションを遮断する共有結合した部分を含む、前記生成された第１のＤＮＡ鎖が、その３’末端に、前記３’末端におけるライゲーションを遮断するものであり、前記第１のＤＮＡ鎖の生成後に導入される修飾をさらに含む、項目１から３までおよび項目５から１２までのいずれか一項に記載の方法。
図１は、５’末端に５’Ｃ３スペーサーを有する遮断性部分と共有結合したオリゴヌクレオチドの使用を含む、ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製のワークフローである。そのようなスペーサーにより、生成されたｄｓＤＮＡとシークエンシングアダプターのライゲーションが阻害される。
図２は、遮断性部分と共有結合したオリゴヌクレオチドを使用することによって生成した対照（「対照」）ライブラリーおよび（「ＭＯＤ」）ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーの両方についてのマッピングされたリード（ｒｅａｄｓ）およびユニークなリードの高い百分率が示されているグラフである。
図３は、ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーの鎖特異性を示すグラフである。図３は、参照または遮断性部分と共有結合したオリゴヌクレオチドを含む試料のフォワード鎖（すなわち、２番目に生成されたＤＮＡ）またはリバース鎖（すなわち、最初に生成されたＤＮＡ鎖）に属する第１のリード（Ｒ１）または第２のリード（Ｒ２）のいずれかの百分率を示す。ＭＯＤ Ｒ１は、参照配列（既知の非重複コードＲＮＡ）のフォワード鎖、またはコード鎖にマッピングされるリードの百分率を指す。ＭＯＤ Ｒ２は、参照配列（既知の非重複コードＲＮＡ）のリバース（非コード）鎖にマッピングされるリードの百分率を指す。理想的な状況では、１００％リードがフォワード鎖にマッピングされるはずである。それでもリバース鎖にマッピングされる小さな百分率のリードは、参照配列の不完全性および／またはゲノムＤＮＡコンタミネーションによって引き起こされる可能性がある。
図４は、ＲＰＫＭ（マッピングされたリード１００万当たりの転写物１キロベース当たりのリード（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ））を示すグラフである。対照ライブラリーがＸ軸にプロットされており、ＲＴ反応においてランダムな遮断性部分と共有結合したオリゴヌクレオチドを用いて生成されたＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーからの対応するＲＰＫＭがＹ軸にプロットされている。９７．８９％のＲ２により、両方のＲＮＡ−ｓｅｑライブラリー調製方法の転写物定量における高い相関が示される。
図５は、オリゴヌクレオチドプライマーのライゲーションを遮断する適切な作用剤／部分のサブセットの構造式を示す図である：波線は、プライマーヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、好ましくはプライマーオリゴヌクレオチドの５’末端ＯＨ基（インデックス５’）または３’末端３’ＯＨ基（インデックス３’）におけるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとのエステル結合による結合を示す。 図５は、オリゴヌクレオチドプライマーのライゲーションを遮断する適切な作用剤／部分のサブセットの構造式を示す図である：波線は、プライマーヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、好ましくはプライマーオリゴヌクレオチドの５’末端ＯＨ基（インデックス５’）または３’末端３’ＯＨ基（インデックス３’）におけるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとのエステル結合による結合を示す。 図５は、オリゴヌクレオチドプライマーのライゲーションを遮断する適切な作用剤／部分のサブセットの構造式を示す図である：波線は、プライマーヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、好ましくはプライマーオリゴヌクレオチドの５’末端ＯＨ基（インデックス５’）または３’末端３’ＯＨ基（インデックス３’）におけるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとのエステル結合による結合を示す。 図５は、オリゴヌクレオチドプライマーのライゲーションを遮断する適切な作用剤／部分のサブセットの構造式を示す図である：波線は、プライマーヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチド、好ましくはプライマーオリゴヌクレオチドの５’末端ＯＨ基（インデックス５’）または３’末端３’ＯＨ基（インデックス３’）におけるヌクレオチドまたはオリゴヌクレオチドとのエステル結合による結合を示す。
発明の詳細な説明
定義
別段の定義のない限り、本明細書において使用される全ての科学技術用語は、当業者（例えば、細胞培養、分子遺伝学的、核酸化学、ハイブリダイゼーション技法および生化学における）に共通して理解されるものと同じ意味を有する。
本発明の実行では、分子生物学、微生物学、および組換えＤＮＡにおける多くの従来の技法を使用することができる。これらの技法は周知であり、例えば、Ｃｕｒｒｅｎｔ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ ｉｎ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｂｉｏｌｏｇｙ、Ｉ巻、ＩＩ巻、およびＩＩＩ巻、１９９７年（Ｆ． Ｍ． Ａｕｓｕｂｅｌ編）；Ｓａｍｂｒｏｏｋら、１９８９年、Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ： Ａ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｍａｎｕａｌ、第２版、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ Ｐｒｅｓｓ、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ、Ｎ．Ｙ．；ＤＮＡ Ｃｌｏｎｉｎｇ：Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ａｐｐｒｏａｃｈ、Ｉ巻およびＩＩ巻、１９８５年（Ｄ． Ｎ． Ｇｌｏｖｅｒ編）；Ｏｌｉｇｏｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ、１９８４年（Ｍ． Ｌ． Ｇａｉｔ編）；Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄ Ｈｙｂｒｉｄｉｚａｔｉｏｎ、１９８５年、（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ）；Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔｉｏｎ ａｎｄ Ｔｒａｎｓｌａｔｉｏｎ、１９８４年（ＨａｍｅｓおよびＨｉｇｇｉｎｓ編）；Ａｎｉｍａｌ Ｃｅｌｌ Ｃｕｌｔｕｒｅ、１９８６年（Ｒ． Ｉ． Ｆｒｅｓｈｎｅｙ編）；Ｉｍｍｏｂｉｌｉｚｅｄ Ｃｅｌｌｓ ａｎｄ Ｅｎｚｙｍｅｓ、１９８６年（ＩＲＬ Ｐｒｅｓｓ）；Ｐｅｒｂａｌ、１９８４年、Ａ Ｐｒａｃｔｉｃａｌ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｃｌｏｎｉｎｇ；ｔｈｅ ｓｅｒｉｅｓ、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ（Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ， Ｉｎｃ．）；Ｇｅｎｅ Ｔｒａｎｓｆｅｒ Ｖｅｃｔｏｒｓ ｆｏｒ Ｍａｍｍａｌｉａｎ Ｃｅｌｌｓ、１９８７年（Ｊ． Ｈ． ＭｉｌｌｅｒおよびＭ． Ｐ． Ｃａｌｏｓ編、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ）；およびＭｅｔｈｏｄｓ ｉｎ Ｅｎｚｙｍｏｌｏｇｙ、１５４巻および１５５巻（それぞれＷｕおよびＧｒｏｓｓｍａｎ編、ならびにＷｕ編）に説明されている。
「ライブラリー」という用語は、多数の核酸断片、本明細書では、ＲＮＡから生成される、配列決定解析のためのＤＮＡ断片のコレクションを指す。本明細書で言及されるライブラリーは、分析される試料の断片化、逆転写およびｄｓＤＮＡの生成、任意選択の末端修復、任意選択の末端アデニンの付加、ならびに遮断性部分と共有結合したランダムオリゴヌクレオチドによってライゲーションが阻害されない場合に断片およびアダプターから生成された鎖のライゲーションによって生成される。任意選択で、精製されたＤＮＡ断片を、シークエンシング前に増幅し、かつ／または富化する。
本明細書で使用される場合、「約」という用語は、数値と共に使用される場合（例えば、温度または時間の詳記）、その値から２０％、好ましくは１０％、より好ましくは５％、なおより好ましくは２％、および最も好ましくは１％の偏差を包含することが意図されている。それと同時に、数値と共に使用される場合、まさにその数値は本発明による好ましい実施形態として個別に開示されていると理解されるべきである。
本明細書で使用される場合、「含む（ｃｏｍｐｒｉｓｉｎｇ）」という用語は、「含む（ｉｎｃｌｕｄｉｎｇ）」と「からなる（ｃｏｎｓｉｓｔｉｎｇ ｏｆ）」のどちらも包含すると解釈されるべきであり、どちらの意味も明確に意図されており、したがって、本発明に従って個別に開示される実施形態である。
「ＲＮＡ」とは、単一のＲＮＡ鎖と多数のＲＮＡ鎖のどちらも指す。したがって、「ＤＮＡ」とは、１本鎖ＤＮＡまたは２本鎖ＤＮＡ鎖のどちらも指し、また、多数のそのようなＤＮＡ鎖も指す。
「ｎｔ」は、「ヌクレオチド」の略語である。
「ｂｐ」は、「塩基対」の略語である。
「鋳型」という用語は、本明細書で使用される場合、第１の（１本鎖）ＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）または第２のＤＮＡ鎖の生成、それにより、増幅、コピーまたはシークエンシングされる２本鎖ＤＮＡの生成に使用される２本鎖または１本鎖核酸分子を指す。核酸鋳型、好ましくはＲＮＡ分子の一部と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを適切な条件下でハイブリダイズさせ、次いで、本発明の逆転写酵素により、前記鋳型またはその一部と相補的なＤＮＡ分子を合成することができる。
さらに、核酸鋳型、好ましくは第１のｃＤＮＡ鎖の一部と相補的なオリゴヌクレオチドプライマーを適切な条件下でハイブリダイズさせ、次いで、本発明のＤＮＡポリメラーゼＩにより、前記鋳型またはその一部と相補的なＤＮＡ分子を合成することができる。適切な条件は、高ストリンジェンシー条件であることが好ましい。
そのようなランダムオリゴヌクレオチドプライマーを鋳型ＲＮＡまたはＤＮＡと高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズさせることが好ましく、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーは、鋳型ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的であることがなおより好ましい。そのようなオリゴヌクレオチドは６〜１０ヌクレオチド、好ましくは６ヌクレオチドの長さを有する。
「高ストリンジェンシー」（例えば：高温および／または低塩濃度）の下では、正確にマッチする塩基のみがアニーリングし、一緒になったままになる。本明細書に記載されている増幅技法、例えばＰＣＲにおける高ストリンジェンシーを実現するために、プライマー／プローブのアニーリング温度は、通常、それらの所望の標的鎖のみが生成または増幅されることが確実になる、融解温度未満の約５℃である。
「オリゴヌクレオチド」とは、１つのヌクレオチドのペントースの３’位と隣接するヌクレオチドのペントースの５’位との間のリン酸ジエステル結合によって接合した２ヌクレオチド〜およそ２０ヌクレオチドの範囲の共有結合により連結したヌクレオチドの配列を含む合成分子または天然分子を指す。ペントースはデオキシリボースであることが好ましい。
ランダムオリゴヌクレオチドとは、ＤＮＡ配列上の多くのランダムな点でアニーリングする潜在性を有し、第１鎖ｃＤＮＡおよび／または第２鎖ＤＮＡ合成を開始させるためのプライマー（単数または複数）としての機能を果たす多数の範囲の配列を生じるように完全にランダムに合成されるオリゴヌクレオチド（単数または複数）を指す。
「非修飾オリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、ＲＮＡ鋳型を逆転写に供する場合にＤＮＡの増幅目的またはｃＤＮＡの生成のために生成することができる任意のオリゴヌクレオチドを指す。ＲＮＡシークエンシング目的で適用される非修飾オリゴヌクレオチドをそれらの５’末端ヌクレオチドにおいて５’リン酸化することが好ましい。そのようなオリゴヌクレオチドは、さらなるモノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドとのライゲーションを遮断する部分を含まない。
「ポリヌクレオチド」とは、１つのヌクレオチドのペントースの３’位と隣接するヌクレオチドのペントースの５’位との間のリン酸ジエステル結合によって接合したおよそ２０またはそれ超のヌクレオチドの範囲の共有結合により連結したヌクレオチドの配列を含む合成分子または天然分子を指す。ペントースはデオキシリボースであることが好ましい。
「Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ」とは、ＡＴＰのγ位からポリヌクレオチド（２本鎖および１本鎖ＤＮＡおよびＲＮＡ）ならびにヌクレオシド３’−一リン酸の５’−ヒドロキシル末端へのＰｉの転移および交換を触媒する酵素を指す。
「Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ」は、５’→３’方向でのＤＮＡの合成を触媒する、鋳型およびプライマーの存在を必要とする酵素を指す。この酵素は、ＤＮＡポリメラーゼＩ（Ｅ．ｃｏｌｉ）において見いだされるものよりもはるかに活性が高い３’→５’エキソヌクレアーゼ活性を有する。Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼは、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性を示さない。
「クレノウ断片エキソ」または「クレノウ断片（３’→５’エキソ）」とは、ポリメラーゼ活性は保持するが、５’→３’エキソヌクレアーゼ活性および３’→５’エキソヌクレアーゼ活性が欠失したＤＮＡポリメラーゼＩのＮ末端短縮型を指す。
「Ｔ４ ＤＮＡリガーゼ」とは、２本鎖ＤＮＡまたはＲＮＡにおける並んだ５’リン酸と３’ヒドロキシル末端との間のリン酸ジエステル結合の形成を触媒する酵素を指す。この酵素は、平滑末端と付着（粘着）末端のどちらも接合する。
「Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ」とは、バクテリオファージＴ３に由来するＡＴＰ依存性ｄｓＤＮＡリガーゼを指す。それは、２重鎖ＤＮＡの隣接する５’リン酸と３’ヒドロキシル基との間のリン酸ジエステル結合の形成を触媒する。この酵素は、付着（粘着の）末端と平滑末端のどちらも接合する。
「Ｔ７ ＤＮＡリガーゼ」は、バクテリオファージＴ７に由来するＡＴＰ依存性リガーゼである。この酵素は、付着（粘着）末端を接合し、ニックシーリングに適している。Ｔ７リガーゼの存在下では平滑末端ライゲーションは起こらない。
「Ｔ４ ＲＮＡリガーゼ」は、ＡＴＰがＡＭＰおよびＰＰｉに加水分解される、３’→５’リン酸ジエステル結合の形成による５’ホスホリル末端の核酸ドナーと３’ヒドロキシル末端の核酸アクセプターのライゲーションを触媒するＡＴＰ依存性酵素である。基質として、１本鎖ＲＮＡおよびＤＮＡならびにジヌクレオシドピロホスフェートが挙げられる。
「ＲＮＡ」という用語は、本発明では、ウイルスＲＮＡ、原核生物ＲＮＡ、古細菌ＲＮＡ、または真核生物ＲＮＡのうちの任意の１つに関する。ｃＤＮＡは、ウイルスＲＮＡならびに原核生物、古細菌、および真核生物に由来するＲＮＡのうちの任意の１つから、逆転写酵素を使用して逆転写を行うことにより相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）を生成することによって得ることができる。２本鎖ＤＮＡは、１本鎖ｃＤＮＡ鎖と相補的な第２鎖を生成することによって得ることができる。
本発明の方法および／またはキットにおける酵素としては、逆転写酵素活性を有する任意の酵素が挙げられる。そのような酵素としては、これだけに限定されないが、ＨＩＶ、ＳＩＶ、またはＨＴＬＶなどのレトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎ウイルス逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、マウス白血病ウイルス逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、細菌逆転写酵素、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ（Ｓａｉｋｉ， Ｒ． Ｋ．ら、Ｓｃｉｅｎｃｅ、２３９巻：４８７〜４９１頁（１９８８年）；米国特許第４，８８９，８１８号および同第４，９６５，１８８号）、Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ（ＷＯ９６／１０６４０）、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼ（米国特許第５，３７４，５５３号）およびその突然変異体、断片、バリアントまたは誘導体（例えば、米国特許第５，９４８，６１４号および６，０１５，６６８号を参照されたい）が挙げられる。修飾された逆転写酵素は、常套的であり、当技術分野で周知の組換えまたは遺伝子工学の技法によって得ることができる。突然変異体逆転写酵素は、例えば、目的の逆転写酵素をコードする遺伝子（単数または複数）を部位特異的またはランダム突然変異誘発によって突然変異させることによって得ることができる。そのような突然変異としては、点突然変異、欠失突然変異および挿入突然変異を挙げることができる。
「遮断性部分と共有結合したオリゴヌクレオチド」または「（ライゲーション）遮断性オリゴヌクレオチド」とは、本明細書で使用される場合、アダプターと１本鎖または２本鎖ＤＮＡ、好ましくは本発明に記載のｄｓＤＮＡのライゲーションを阻害または遮断する任意のオリゴヌクレオチドを指す。詳細には、このオリゴヌクレオチドは、５’オリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチドにおいてライゲーションを遮断する部分を含む。
具体的には、遮断性部分を５’末端ペントースの５’ＯＨ基と共有結合させる。他の実施形態では、遮断性部分を５’末端ペントースの５’リン酸基と共有結合させる。
遮断性部分内のデオキシリボースは、５’リン酸が遊離していない、すなわち、この部分内のリン酸基のＯＨ基の１つまたは複数が、さらなるモノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドとのライゲーション反応を受けることができないように、化学的に修飾することができる；部分内のデオキシヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドの塩基が、チミン、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルのいずれでもないように、化学的に修飾することができる；遮断性部分内のデオキシヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの２’水素（単数または複数）の一方または両方が別の原子または遮断性部分で置き換えられるように、修飾することができる；かつ／または、オリゴヌクレオチドは、非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡにおけるリボースまたはデオキシリボースの立体コンフォメーション以外の立体コンフォメーションにおいてペントースを有する５’末端ヌクレオチドを含む。非修飾ＲＮＡまたはＤＮＡにおけるリボースまたはデオキシリボースコンフォメーションは、β−Ｄ−リボフラノースまたはβ−Ｄ−デオキシリボフラノース立体化学的コンフォメーションを含むか、またはそれからなる。
「修飾（ｍｏｄｉｆｉｃａｔｉｏｎ）」または「修飾された（ｍｏｄｉｆｉｅｄ）」という用語は、それぞれの生成されるＤＮＡ鎖をライゲーションできないものにする、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドの任意の変化を指す。
「部分」という用語は、１つ超の原子である大きな分子の特定の一部分、本明細書では、ライゲーション遮断性プライマーオリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドと共有結合する、ライゲーション遮断性オリゴヌクレオチドの一部分を指す。前記部分は、部分が位置する部位における、好ましくはオリゴヌクレオチドの５’末端の５’末端ヌクレオチドにおける、あらゆるライゲーションを遮断するものであることが好ましい。
遮断性部分は、５’末端ヌクレオチドの５’リン酸または５’ＯＨ基と結合する共有結合した分子であってよく、したがって、前記結合は、どちらの場合でも、エステル結合、好ましくはジエステル結合によって実現することができる。５’ＯＨ基遮断性部分のサブセットが図５に開示されている。好ましくは、そのような遮断性部分として、これだけに限られないが、以下の５’スペーサー１８、５’スペーサー９、５’Ｃ３−スペーサー、５’Ｃ６−スペーサー、５’脱塩基残基（ｄスペーサー、ｒスペーサー）、５’−５’反転ヌクレオチドなどの５’−スペーサー、および、ＤＡＤＥ−リンカー、５’Ｃ６−アミノ−リンカー、５’Ｃ１２−アミノ−リンカー、または５’−ビオチン化５’Ｃ６または５’Ｃ１２−アミノ−リンカーなどの５’リンカー、または任意のその機能的類似体のうちの任意の１つが挙げられる。
「遊離の」５’リン酸とは、遊離の５’リン酸を有するオリゴヌクレオチドプライマーを使用することによって生成された、５’ヌクレオチドの５’ペントースの５’ＯＨ基のみ、好ましくは、末端モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチド、好ましくはオリゴヌクレオチドまたはＤＮＡ鎖のデオキシリボースとエステル化されたリン酸基を指す。前記リン酸化された５’ペントースは、モノエステルであり、２つの「遊離の」ＯＨ基、すなわち、少なくとも１つの第一級または第二級ＯＨ基を含む１つまたは２つの化合物とのエステル化に供することができるリン酸基内のＯＨ基を含む。そのような遊離の５’リン酸を含む（プライマー）オリゴヌクレオチドは、本明細書では、非修飾オリゴヌクレオチドと称される。とりわけ、さらなるモノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドとライゲーションすることによって、または本発明の遮断性部分によって、さらなるエステル化を行うことができる。
遊離していない５’末端ヌクレオチドのリン酸は、遮断性部分のアルコール基とエステル化されたリン酸を指す。例えば、アルコール（ＯＨ）基は、５’ペントース、好ましくは、その５’末端がさらにエステル化される、モノヌクレオチド、オリゴヌクレオチド、またはポリヌクレオチドなどのさらなるＤＮＡ分子の末端ヌクレオチドのデオキシリボースの５’ＯＨ基であってよい。そのような「ライゲーション遮断性部分を含むオリゴヌクレオチド」は、ＤＮＡ鎖を生成するためにプライマーとして使用することができ、これは、結果として、遊離していないリン酸基も含む。
オリゴヌクレオチド鎖の３’末端の３’ＯＨ基に部分として共有結合させることができる作用剤のサブセットが図５に開示されている。そのような作用剤分子としては、これだけに限られないが、以下の３’スペーサー１８、３’スペーサー９、３’Ｃ３−スペーサー、３’Ｃ６−スペーサー、３’脱塩基残基（ｄスペーサー、ｒスペーサー）、３’Ｃ６−アミノ−リンカー、および３’Ｃ１２−アミノ−リンカーおよび任意のその機能的類似体のうちの任意の１つが挙げられる。
「機能的類似体」または「類似体」という用語は、別の化合物または分子の構造と同様の構造を有するが、他の化合物または分子とはある特定の構成成分が異なる化合物または分子を指す。「機能的類似体」または「類似体」は、１つまたは複数の原子、官能基、または下部構造が異なり得、これらが、他の原子、基、または下部構造で置き換えられている。さらに、そのような類似体は、同様の物理的性質、化学的性質、および／または生化学的性質を有する。
「官能基」という用語は、分子内の、それらの分子の特有の化学反応に関与し得る原子または結合の特定の基（部分）を指す。本明細書に記載の官能基は、これだけに制限されないが、モノエーテルまたはポリエーテル、モノエステルまたはポリエステル、カルボン酸、第一級アミン、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、もしくはＩなどのハロゲン、またはヒドロキシル基のうちの任意の１つから選択される。
「ボロン酸」という用語は、炭素−ホウ素結合を含有し、有機ボランのより大きなクラスに属する、アルキル置換またはアリール置換されたホウ酸を指す。ボロン酸は、例えば、糖、アミノ酸またはヒドロキサム酸と、オリゴヌクレオチドの５’ヌクレオチドの５’ＯＨ基とのエステル結合などの、共有結合性の複合体を形成することができる。
「チオリン酸」という用語は、リン酸基の代わりにＰＳ４−ｘＯｘ ３−（ｘ＝０、１、２、または３）を含む化合物を指す。化学的性質および化学修飾、エステル化による結合などに関して本明細書で言及されるリン酸の特徴がチオホスフェートに類似して適用される。
「スペーサー」という用語は、長い人工的なアームをオリゴヌクレオチドに組み入れ、それにより、例えば、ハイブリダイゼーションプローブの固相固定化、および得られたｄｓＤＮＡと、シークエンシングアダプターなどの他のＤＮＡのライゲーションの阻害を可能にするために使用される部分を指す。そのようなスペーサー部分としては、これに限定されないが、リボヌクレオチド、デオキシリボヌクレオチド、または化学的に修飾することができる任意のその類似体が挙げられる。
「断片」という用語は、ウイルス、原核生物、真核生物、または古細菌から単離され、加熱などの当業者に公知の手段による断片化によって生成された任意のＲＮＡ配列を指す。ＲＮＡシークエンシング用の断片は、１９〜５１０ｂｐ、好ましくは、６０〜４５０ｂｐ、より好ましくは７０〜４２０ｂｐ、なおより好ましくは１００〜３５０ｂｐ、および最も好ましくは１００〜２００ｂｐの長さを有することが好ましい。
「ＲＮＡ」という用語は、少なくとも２００ｎｔの長さの「長いＲＮＡ分子」または２００ｎｔ未満の長さの「短いＲＮＡ分子」を指す。長いＲＮＡ分子としては、ｍＲＮＡ分子、ｒＲＮＡ分子、および高分子遺伝子間ＲＮＡ（ｌａｒｇｅ ｉｎｔｅｒｇｅｎｉｃ ＲＮＡ）（ｌｉｎｃＲＮＡ）分子などの長い非コードＲＮＡ分子が挙げられる。短いＲＮＡ分子としては、ｔＲＮＡ分子、および本明細書では一般に「低分子ＲＮＡ」と称される種々の低分子非コード調節ＲＮＡ、すなわち、短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、とても小さい（ｔｉｎｙ）非コードＲＮＡ（ｔｎｃＲＮＡ）および低分子調節ＲＮＡ（ｓｍＲＮＡ）が挙げられる。
本明細書で使用される場合、「アダプター」という用語は、ＤＮＡまたはＲＮＡをライゲーションすることができるオリゴヌクレオチドを指す。アダプターは、例えば、ＲＮＡアダプター、ＤＮＡアダプターであってよい、または、リボヌクレオチドおよびデオキシリボヌクレオチド、またはその類似体のいずれで構成されるものであってもよい。アダプターは標識されていても標識されていなくてもよい。アダプター配列は、約３０〜８０塩基、好ましくは約３０〜７０塩基、なおより好ましくは、６０〜７０塩基または３０〜４０塩基の長さを有する。一部のさらに好ましい実施形態では、アダプターの長さは、約６２塩基または３０〜４０塩基である。アダプターは、平滑末端になっていてもよく、粘着末端を有してもよい。アダプターは、付着末端を有し、３’チミンを含むことが好ましい。
方法
本発明の１つの態様は、特にＲＮＡライブラリーの生成に関してＲＮＡシークエンシングのための方法に言及し、それにより方法を以下により詳細に考察する。
本明細書に記載の方法の一部の実施形態は、インタクトな長いＲＮＡおよびインタクトな短いＲＮＡを含有する最初のＲＮＡの試料を断片化し、断片化されたＲＮＡ試料を得ることを伴う。最初の試料中の長いＲＮＡは、少なくとも２００ヌクレオチドであり、例えば、細胞ｍＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ（例えば、ｌｉｎｃＲＮＡなど）および／またはｒＲＮＡが挙げられる。ｍＲＮＡおよびｒＲＮＡを定義する特性は周知である。ｌｉｎｃＲＮＡは、最近発見され、多種多様なプロセス、例えば、胚性幹細胞多能性、細胞増殖、がんおよびクロマチン構造の調節に関与すると考えられている。Ｔｉｎｇｅｒａｓ（Ｎａｔｕｒｅ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ、２００９年、２７巻：３４６〜３４７頁）を参照されたい。最初の試料中の短いＲＮＡは、２００ヌクレオチド未満の長さであり、それらとして、ｔＲＮＡ、および本明細書では一般に「低分子ＲＮＡ」と称される種々の低分子非コード調節ＲＮＡ、すなわち、短鎖干渉ＲＮＡ、マイクロＲＮＡ、とても小さい非コードＲＮＡおよび低分子調節ＲＮＡが挙げられる。低分子ＲＮＡは、配列を規定する、１８〜２９ヌクレオチド（ｎｔ）の範囲の長さの非コード調節ＲＮＡの群である。多くの低分子ＲＮＡは、およそ１９〜２５ｂｐの長さである。
Ｎｏｖｉｎａら（Ｎａｔｕｒｅ、２００４年、４３０巻：１６１〜１６４頁）は、低分子ＲＮＡを少なくとも４つの群：ａ）短鎖干渉ＲＮＡ（ｓｉＲＮＡ）、ｂ）マイクロＲＮＡ（ｍｉＲＮＡ）、ｃ）とても小さい非コードＲＮＡ（ｔｎｃＲＮＡ）およびｄ）低分子モジュレーターＲＮＡ（ｓｍＲＮＡ）に分類している。ｓｉＲＮＡは、２本鎖ＲＮＡから生成される、およそ２１〜２２ｎｔの長さの２本鎖ＲＮＡのクラスである。ｓｉＲＮＡは、ｍＲＮＡの切断を促進することによって遺伝子発現をサイレンシングすると考えられている。他方では、ｍｉＲＮＡは、およそ１９〜２５ｎｔの長さの１本鎖ＲＮＡのクラスである。ｍｉＲＮＡは進化的に保存されていると思われ、また、翻訳を阻害することによって遺伝子発現をサイレンシングすると考えられている。ｔｎｃＲＮＡは、約２０〜２２ヌクレオチドのＲＮＡのクラスである。ｔｎｃＲＮＡは、発生的に調節されると思われるが、それらの機能は分かっていない。ｓｍＲＮＡは、成体ニューロンにおける神経特異的遺伝子発現の調節に関与する２本鎖ＲＮＡである。
最初のＲＮＡ試料は、例えば、ｒＲＮＡおよび／またはｔＲＮＡ、ｍＲＮＡ、低分子ＲＮＡ、長い非コードＲＮＡ、および低分子ＲＮＡなどの１つまたは複数の型のＲＮＡを富化または枯渇させた、全細胞ＲＮＡまたはＲＮＡを含有し得る。
例えばシークエンシング目的でＲＮＡを断片化するための方法としては、化学的断片化方法、酵素的断片化方法または熱的断片化方法が挙げられ、それに関するプロトコールは公知である（例えば、Ｃｈａｎｄｌｅｒら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００３年、６９巻：２９５０〜２９５８頁、Ｇｕｓｃｈｉｎら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、１９９７年、６３巻：２３９７〜２４０２頁；Ｋｅｌｌｙら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００２年、３１１巻：１０３〜１１８頁、Ｌｉｕら、Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００１年、３巻：６１９〜６２９頁、Ｍｅｈｌｍａｎｎら、Ａｎａｌ． Ｂｉｏｃｈｅｍ．、２００５年、３４７巻：３１６〜３２３頁、Ｎｇｕｙｅｎ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２０００年、２８巻：３９０４〜３９０９頁、Ｐｒｏｕｄｎｉｋｏｖ、Ｎｕｃｌｅｉｃ Ａｃｉｄｓ Ｒｅｓ．、２００６年、２４巻：４５３５〜４５４２頁、Ｓｍａｌｌら、Ａｐｐｌ． Ｅｎｖｉｒｏｎ． Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．、２００１年、６７巻：４７０８〜４７１６頁を参照されたい）。
一部の実施形態では、インタクトなＲＮＡを、塩基性条件、例えば、Ｌｉｕら（Ａｐｐｌｉｅｄ ａｎｄ Ｅｎｖｉｒｏｎｍｅｎｔａｌ Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌｏｇｙ、２００７年、７３巻：７３〜８２頁）に記載の通り、ＮａＯＨ（例えば、５０ｍＭのＮａＯＨ）中、高温度（例えば、５５℃）で、ある期間（例えば、１０〜３０分）にわたるインキュベーションを使用して断片化することができる。他の実施形態では、断片化は、インタクトなＲＮＡを、例えばＢｒｏｗｎら（Ｊ． Ａｍ． Ｃｈｅｍ． Ｓｏｃ．、２００２年、１２４巻：７９５０〜７９６２頁）に記載の通り、金属イオン、例えば、ランタニド系列のイオンまたは二価金属イオン、例えばＭｇ２＋またはＺｎ２＋など（例えば、５ｍＭ〜２００ｍＭの濃度であってよい）と一緒に、高温（例えば、５０℃〜９５℃の範囲）で、ある期間、例えば、１分〜１時間にわたってインキュベートすることができるという点で、金属イオンにより触媒されるものであり得る。例えば、ＲＮＡは、Ｌｉｕ、上記参照に記載されている通り、１０ｍＭの硫酸亜鉛（ＺｎＳＯ４）または亜鉛塩化物（ＺｎＣｌ２）と一緒に、２５ｍＭのトリス−ＨＣｌ（ｐＨ７．４）中、６０℃で３０分にわたってインキュベートすることによって断片化することができる。
一部の実施形態では、ＲＮＡを、１０ｍＭのＺｎＣｌ２と一緒に、１０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、ｐＨ７中、７０℃で１５分にわたってインキュベートして、６０〜２００塩基の長さの断片を生じさせることができる。一部の実施形態では、ＲＮＡを、４０ｍＭのトリス−酢酸塩、ｐＨ８．１、１００ｍＭのＫＯＡｃおよび３０ｍＭのＭｇＯＡｃ中に、７５℃で２０〜３０分にわたって置く。Ｍｅｈｌｍａｎｎら（Ａｎａｌｙｔｉｃａｌ Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ、２００５年、３４７巻：３１６〜３２３頁）に記載されている通り、一般に、３８塩基から１５０塩基の間の長さの断片が得られる。
上記のインキュベーション期間は全て、得られる断片の長さを所望の通り増減させるために変更することができる。ＲＮＡシークエンシングのための断片サイズは、約１９〜５１０ｂｐ、好ましくは約６０〜４５０ｂｐ、より好ましくは約７０〜４２０ｂｐ、なおより好ましくは約１００〜３５０ｂｐ、および最も好ましくは約１００〜２００ｂｐである。
上記の方法を使用した断片化は、ＲＮＡ全体を通してほぼランダムな位置で非特異的に起こるので、断片化は平均して、分子当たりでより長いＲＮＡに対して起こり、これは、より長いＲＮＡ分子は断片化が起こる潜在性のある部位をより多く含有することに起因する。例えば、ＲＮＡを６０〜２００塩基の長さの断片に断片化する断片化条件では、平均して、およそ１８〜３０ヌクレオチドの長さの低分子ＲＮＡの断片化を伴わずに、およそ１５〜５０部位において、３ｋｂの長さのＲＮＡ分子が断片化されるはずである。したがって、長いＲＮＡ分子と短いＲＮＡ分子とを含有するＲＮＡ試料の断片化により、ａ）長いＲＮＡ分子の断片、および、ｂ）ほとんどインタクトな短いＲＮＡ分子を含有する、断片化された試料がもたらされる。したがって、断片化は、断片化プロセスの間に断片化されないのに十分な短いオリゴヌクレオチドの存在下で行うことができる。
一部の実施形態では、第１の（１本鎖）ＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）を、ＲＮＡまたは断片化されたＲＮＡを鋳型（単数または複数）として使用することを含む、逆転写酵素（ＲＴ）の使用によって、およびＲＮＡとハイブリダイズするオリゴヌクレオチドプライマーの使用によって生成する。一部の実施形態では、これらの、ランダムであることが好ましいオリゴヌクレオチドは遮断性部分と共有結合している。相補ＤＮＡ（ｃＤＮＡ）鎖を生成するための逆転写酵素は、当業者に公知の任意の逆転写酵素または任意のその機能性誘導体を含み、それらとして、これだけに制限されないが、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、マウス白血病ウイルス逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、細菌逆転写酵素、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔａｑ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｎｅ ＤＮＡポリメラーゼ、Ｔｍａ ＤＮＡポリメラーゼまたは酵素的に活性なその突然変異体、断片、バリアントまたは誘導体が挙げられる。
一部の実施形態では、逆転写酵素は、ｑＳｃｒｉｐｔ逆転写酵素（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）である。好ましい実施形態では、逆転写酵素反応を２５℃で約１０分にわたって行い、その後、４２℃で約５０分にわたってインキュベートする。逆転写酵素の不活化を７０℃で約１５分にわたって行う。
一部の実施形態では、逆転写反応の後、ｃＤＮＡを、２本鎖ＤＮＡが生成される第２のＤＮＡ鎖の合成に供する前に、精製ステップを行う。そのような精製は、例えば、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用することによって行う。そのようなキットを適用することにより、取り込まれなかったヌクレオチド、塩、および他の夾雑物を除去し、オリゴヌクレオチド（＞１７ｎｔ）および４０ｂｐから１０ｋｂまでにわたるＤＮＡ断片を、単純かつ高速な結合−洗浄−溶出手順および約３０〜２００μｌの溶出液体積を使用して精製する。
一部の実施形態では、第２のＤＮＡ鎖を、配列生成のために第１のｃＤＮＡ鎖とハイブリダイズさせるオリゴヌクレオチドをプライマーとして適用することにより、ＤＮＡポリメラーゼＩを使用することによって生成する。一部の実施形態では、これらのランダムであることが好ましいオリゴヌクレオチドは遮断性部分と共有結合している。そのような第２鎖（単数または複数）を生成するために好ましい条件は、２５℃で約３０分である。
一部の実施形態では、第２のＤＮＡ鎖の生成が完了した後に、断片化されたＲＮＡから生成されたＤＮＡを末端修復するその後のステップを行うことができる。他の実施形態では、末端修復ステップを第２鎖の生成と同時に行う。末端修復ステップには、少なくとも２つの酵素：（ａ）ポリヌクレオチドキナーゼ、好ましくは２本鎖ＤＮＡ断片の５’末端をリン酸化するＴ４ポリヌクレオチドキナーゼ（ＰＮＫ）；および（ｂ）フィルイン反応またはトリミング反応のいずれかによってＤＮＡ断片の末端を平滑にする、ポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性とを有する酵素（単数または複数）、例えば、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼなどが必要である。ＤＮＡポリメラーゼＩ、ポリヌクレオチドキナーゼ、およびポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性とを有する酵素は、全て、約７０℃で約１０分にわたって不活化することが好ましい。
一部の実施形態では、第１の１本鎖ＤＮＡ鎖（ｃＤＮＡ）の生成に使用するオリゴヌクレオチドは、遮断性部分が共有結合したオリゴヌクレオチド、好ましくはランダムな修飾オリゴヌクレオチドである。他の実施形態では、第２のＤＮＡ鎖の生成ステップにおけるオリゴヌクレオチドは、遮断性部分が共有結合したオリゴヌクレオチド、好ましくはランダムな修飾オリゴヌクレオチドである。第２のＤＮＡ鎖の生成により、第２のＤＮＡ鎖が、オリゴヌクレオチドと結合していることが好ましい遮断性部分を含む、２本鎖ＤＮＡがもたらされる。遮断性部分を含むオリゴヌクレオチドとしては、これだけに限られないが、６ｍｅｒ〜１０ｍｅｒのランダムオリゴヌクレオチド、好ましくは、ランダムな６ｍｅｒオリゴヌクレオチドが挙げられる。これらのオリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドにおけるライゲーション反応が遮断されるように部分と共有結合していることが好ましい。その後のシークエンシングアダプターとのライゲーション反応が遮断されることがより好ましい。より詳細には、これらのオリゴヌクレオチドは、５’末端に遊離の５’リン酸基を有さない、５’末端オリゴヌクレオチドの塩基が、チミン、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルのいずれでもない；５’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの２’水素の一方または両方が別の原子または遮断性部分で置き換えられている、かつ／または、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡにおけるリボースまたはデオキシリボースの立体コンフォメーション以外の立体コンフォメーションのペントースを有する５’末端ヌクレオチドを含む。好ましくは、そのようなペントース分子として、これだけに制限されないが、アラビノースが挙げられる。
好ましい実施形態では、本明細書で言及される非修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、５’末端においてリン酸化されている。
一部の実施形態では、ライゲーションを遮断する共有結合した部分を含むオリゴヌクレオチドプライマーは、遮断性部分と共有結合する前の、５’末端ヌクレオチドの５’ＯＨまたは遊離の５’リン酸基を含む。
一部の実施形態では、遮断性部分が共有結合したオリゴヌクレオチドまたは非修飾オリゴヌクレオチドは、高ストリンジェンシー条件下でハイブリダイズする。オリゴヌクレオチドは、鋳型ＤＮＡまたはＲＮＡと相補的であることがより好ましい。
好ましい実施形態では、ライゲーションを遮断する共有結合した部分を含むオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端ヌクレオチドの５’ＯＨが遮断性部分と共有結合している。他の実施形態では、ライゲーションを遮断する共有結合した部分を含むオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端ヌクレオチドの５’リン酸基が遮断性部分と共有結合している。
一部の実施形態では、ライゲーションを遮断する共有結合した部分を含むオリゴヌクレオチドプライマーの５’ヌクレオチドの５’リン酸基は、ペントース、好ましくはオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチドのデオキシリボースのリン酸基と、少なくとも１つのＯＨ基を含む炭化水素、好ましくは、少なくとも１つのＯＨ基を含むアリールもしくはアルキルアルコール、より好ましくは第一級もしくは第二級アルキルアルコールのヒドロキシル（ＯＨ）基または５’５’反転ヌクレオチドのＯＨ基との間のジエステル結合によってエステル化されている。他の実施形態では、ライゲーションを遮断する部分を含むオリゴヌクレオチドプライマーの５’ＯＨ基は、好ましくは、酸性基によって、より好ましくは、モノアルキルホスフェート、ジアルキルホスフェート、モノアルキルホスホチオネートもしくはジアルキルホスホチオネート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏｎａｔｅ）によって、もしくはボロン酸によってエステル化もしくはエーテル化されている。
アルキルアルコールまたはアリールアルコール、好ましくは第一級または第二級アルキルアルコールは、少なくとも１つの追加的な官能基をさらに含んでよい。そのような官能基は、これだけに制限されないが、モノエーテルまたはポリエーテル、モノエステルまたはポリエステル、カルボン酸、第一級アミンまたはヒドロキシル基から選択されることが好ましい。アルキルアルコールまたはアリールアルコールは、２−メチル−テトラヒドロフランおよびその誘導体などの環状エーテルを含んでよい。一部の実施形態では、モノアルキルアルコールまたはアリールアルコール、好ましくは第一級または第二級アルコールは、ビオチニル基を含む。
一部の実施形態では、モノアルキルホスフェート、ジアルキルホスフェート、モノアルキルまたはジアルキルホスホチオネートまたはボロン酸は、以下のうちの任意の１つから選択される少なくとも１つの追加的な官能基を含む：モノエーテルまたはポリエーテル、モノエステルまたはポリエステル、カルボン酸、第一級アミンまたはヒドロキシル基。好ましい実施形態では、５’ヌクレオチドの５’ＯＨ基は、これだけに限定されないが、５’スペーサー１８、５’スペーサー９、５’Ｃ３−スペーサー、５’Ｃ６−スペーサー、５’脱塩基残基（ｄスペーサー、ｒスペーサー）、５’−５’反転ヌクレオチドなどの５’−スペーサー、およびＤＡＤＥ−リンカー、５’Ｃ６−アミノ−リンカー、５’Ｃ１２−アミノ−リンカー、またはビオチン化５’Ｃ６−アミノ−リンカー、５’Ｃ１２−アミノ−リンカーなどの５’リンカー、または任意のその機能的類似体を含めた分子によってエステル化されている。
一部の実施形態では、５’末端ヌクレオチドの５’末端にライゲーションを遮断する部分（鎖に共有結合した遮断性部分）を含む、生成された第１の１本鎖ＤＮＡ鎖は、３’末端に、ライゲーションを遮断する別の部分（鎖に共有結合した遮断性部分）をさらに含んでよい。前記遮断性部分の共有結合は、第１のＤＮＡ鎖の生成後に導入される。第１のＤＮＡ鎖の３’末端の３’ＯＨ基は遊離していないことが好ましく、前記３’ＯＨ基が遮断性部分と共有結合していることが好ましい。
一部の実施形態では、非修飾５’末端ヌクレオチドを、フルダラビン、アザチオプリン、メルカプトプリン、ペントスタチン、クラドリビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、およびテガフールのうちの任意の１つと共有結合させる。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’末端の５’ヌクレオチドの２’水素（単数または複数）の一方または両方が、これだけに制限されないが、ハロゲン原子、好ましくはＦ、Ｃｌ、ＢｒもしくはＩ、または、１つまたは複数の追加的な官能基を含んでも含まなくてもよいＣ１〜Ｃ５アルキル基もしくはＣ１〜Ｃ５アルコキシ基、好ましくはＣ１〜Ｃ３アルキル基もしくはＣ１〜Ｃ３アルコキシ基から選択される原子または遮断性部分で置き換えられている。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの３’末端（ｅｎｄ）／末端（ｔｅｒｍｉｎｕｓ）の３’ＯＨ基には、遮断性部分が共有結合している。一部の実施形態では、修飾は、ジデオキシヌクレオチド、または３’末端ジデオキシヌクレオチドを含むオリゴヌクレオチドからなる。
一部の実施形態では、３’末端ヌクレオチドのペントース、好ましくは生成された第１鎖の３’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの３’ＯＨ基は、モノアルキルまたはジアルキルホスフェートでさらにエステル化されている。他の実施形態では、ペントース、好ましくは生成された第１鎖の３’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの３’ＯＨ基は、ホスホチオネートによってエステル化されていてよい。さらに他の実施形態では、ペントース、好ましくはオリゴヌクレオチドの３’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの３’ＯＨ基は、ボロン酸によってエステル化されている。モノアルキルホスフェートもしくはジアルキルホスフェート、アルキルホスホチオネート、またはボロン酸は、少なくとも１つの追加的な官能基を含むことが好ましい。好ましくはそのような官能基は、これだけに制限されないが、モノエーテルもしくはポリエーテル、モノエステルもしくはポリエステル、カルボン酸、第一級アミンまたはヒドロキシル基から選択される。モノアルキルホスフェートは、２−メチル−テトラヒドロフランおよびその誘導体などの環状エーテルを含んでよい。
３’ヌクレオチドの３’ＯＨ基は、好ましくはジエステルによって、エステル化されていることが好ましい。３’ヌクレオチドの３’ＯＨ基は、以下の３’スペーサー１８、３’スペーサー９、３’Ｃ３−スペーサー、３’Ｃ６−スペーサー、３’脱塩基残基（ｄスペーサー、ｒスペーサー）、３’Ｃ６−アミノ−リンカー、３’Ｃ１２−アミノ−リンカー、および任意のその機能的類似体を含めた分子のうちの任意の１つのＯＨ基によってエステル化されている。
一部の実施形態では、上記の遮断性部分は、好ましくはＴ４ ＲＮＡリガーゼを使用することによって、オリゴヌクレオチドが１本鎖ｃＤＮＡとライゲーションするように、導入することができ、それによって、前記オリゴヌクレオチドは、３’末端、好ましくは３’末端３’ＯＨ基に、ライゲーションを遮断する上記の遮断性部分のいずれかを含有する。
任意選択の末端修復ステップおよび第２鎖の生成後、チミジンヌクレオチドによって形成された突出部、すなわち、Ｔ−突出部を有し得るアダプターをシークエンシングするためのドッキング部位としての末端アデニンを生成する、いわゆるＡ付加ステップを行うことができる。
一部の実施形態では、末端修復されたＲＮＡとシークエンシングアダプターのドッキングは、ＲＮＡおよびアダプター分子がどちらも平滑末端を有する、平滑末端クローニングによって実現することができる。シークエンシングアダプターは、表面に共有結合していることが好ましい。
Ａ−突出部をＰＣＲ産物の３’末端に付加し、それを、例えば、５’→３’ポリメラーゼ活性は有するが、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性と５’→３’エキソヌクレアーゼ活性の両方を欠く、ＤＮＡポリメラーゼＩの大きな断片であるクレノウ断片エキソ−によって末端修復することができる。クレノウ断片エキソ−を使用することによるＡ付加ステップは、３７℃で約３０分にわたって行うことが好ましい。酵素の不活化を７５℃で約１０分にわたって行う。
あるいは、Ａ付加ステップは、Ｔａｑポリメラーゼなどの、末端ヌクレオチドトランスフェラーゼ活性を有する酵素を用いて容易にすることができる。
任意選択のＡ付加ステップの後、シークエンシングアダプターとＤＮＡをＴ４ ＤＮＡリガーゼ、Ｔ３ ＤＮＡリガーゼ、またはＴ７ ＤＮＡリガーゼなどのリガーゼ、好ましくはＴ４ ＤＮＡリガーゼによってライゲーションすることができる。平滑末端ライゲーションはＴ４ ＤＮＡリガーゼまたはＴ３ ＤＮＡリガーゼ、好ましくはＴ４ ＤＮＡリガーゼを用いて行うことができる。ライゲーションは、第１鎖（ｃＤＮＡ）配列の構成物として遮断性部分を含む５’末端ランダムオリゴヌクレオチドを含まない鎖に対してのみ有効である。したがって、逆転写酵素を用いた１本鎖ｃＤＮＡ生成または第２のＤＮＡ鎖の生成のいずれを、遮断性部分を含むオリゴヌクレオチドの存在下で行うかに応じて、５’末端および３’末端におけるＴＡ−ライゲーションによって第２鎖または第１鎖のみをアダプターに付着させることができる。一部の実施形態では、第１のＤＮＡ鎖の５’末端および３’末端の両方がライゲーション阻害性部分（遮断性部分）と結合している場合、アダプターは、第２のＤＮＡ鎖のみに付着させることができる。
第１のＤＮＡ鎖または第２のＤＮＡ鎖を３’末端および５’末端に付着させるアダプターは、同じでないことが好ましい。
好ましい実施形態では、シークエンシングアダプターとのライゲーションを、ＧｅｎｅＲｅａｄ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を製造者の説明書に従って適用することによって行う。ライゲーション産物を、ＧｅｎｅＲｅａｄ Ｓｉｚｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、ＧｅｎｅＲｅａｄ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を使用することにより、１０回またはそれ超のサイクルにわたってＰＣＲ増幅することが好ましい。
一部の実施形態では、上記の方法は、ＲＴ反応物を精製するための精製ステップをさらに含む。前記精製反応は、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて行うことが好ましい。前記方法は、第２のＤＮＡ鎖の生成および任意選択の末端修復反応後に使用される、ＰＣＲ精製ステップをさらに含み得る。前記方法は、アダプター−ライゲーションステップ後、シークエンシングおよび配列解析を行う前に適用される、さらなる精製ステップを含み得る。そのような精製ステップのためにＧｅｎｅＲｅａｄ ｓｉｚｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔを選択することが好ましい。
一部の実施形態では、シークエンシングは、ペアエンドシークエンシングを適用することによって行うことができる。そのようなシークエンシングにより、ｄｓＤＮＡ末端の両側から開始する配列解析が可能になる。好ましい実施形態では、断片から生成されたアダプターとライゲーションした鎖を、固体表面、例えばＩｌｌｕｍｉｎａ（登録商標）（Ｓｏｌｅｘａ）シークエンサー、より好ましくはＭｉＳｅｑシークエンサーなどに適用することができる。２つのアダプター配列のそれぞれが、フローセル上のそれぞれの表面に結合した増幅プライマーと相補的である。
キット
本発明の別の態様はキットを指し、係るキットは、
（ｉ）ＤＮＡとシークエンシングアダプターのライゲーションを遮断する、５’末端ヌクレオチドに共有結合した部分を含むオリゴヌクレオチドプライマー；
（ｉｉ）非修飾オリゴヌクレオチドプライマー；
（ｉｉｉ）逆転写酵素；ならびに
（ｉｖ）任意選択で、ＤＮＡポリメラーゼ；
を含む。
一部の実施形態では、キットは、逆転写酵素の有効な逆転写活性を可能にする緩衝液をさらに含む。そのような緩衝液は、７．５．〜９．０の範囲、好ましくは８．０〜８．５、より好ましくは約８．３のｐＨを有する。適切な緩衝液は、トリス−ＨＣｌ（約５０ｍＭ、２５℃で）、４０〜７５ｍＭのＫＣｌ、３〜１０ｍＭのＭｇＣｌ２、より好ましくは７ｍＭ ＭｇＣｌ２、および約１〜１０ｍＭのＤＴＴを含む。
一部の実施形態では、本明細書で言及されるキットは、
（ｖ）ポリヌクレオチドキナーゼ、およびポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性とを有する酵素；
（ｖｉ）任意選択で、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素；
（ｖｉｉ）末端修復されたＤＮＡ鎖とのライゲーションのための末端チミンを任意選択で含み、それぞれが、表面にそれぞれ結合した増幅プライマーと相補的である、２つのアダプター；ならびに
（ｖｉｉｉ）リガーゼ
をさらに含む。
一部の実施形態では、ライゲーションを遮断する部分と共有結合したオリゴヌクレオチドプライマーまたは非修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、ランダムオリゴヌクレオチドプライマーである。
上記のキットの一部の実施形態では、逆転写酵素は、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、マウス白血病ウイルス逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、細菌逆転写酵素、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼ、またはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのうちの任意の１つから選択される。
一部の実施形態では、ＤＮＡポリメラーゼはＤＮＡポリメラーゼＩであり、ポリヌクレオチドキナーゼはＴ４ポリヌクレオチドキナーゼであり、ポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性とを有する酵素はＴ４ ＤＮＡポリメラーゼであり、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素はクレノウ断片エキソ−である。
一部の実施形態では、第２鎖の生成および末端修復を同時に行うための、キット中の適切な緩衝液条件は、１０〜３０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、８〜１５ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、２〜１０ｍＭのＭｇＣｌ２、０．１〜０．２のβ−ＮＡＤ、それぞれｐＨ７．４、２５℃を含む、またはそれからなる。緩衝液条件は、約２０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、約１２ｍＭの（ＮＨ４）２ＳＯ４、約５ｍＭのＭｇＣｌ２、約０．１６のβ−ＮＡＤ、それぞれ約ｐＨ７．０〜７．６、好ましくは７．４、２５℃を含む、またはそれからなることが好ましい。
一部の実施形態では、キットは、約５０ｍＭのトリス−ＨＣｌ、約１０ｍＭのＭｇＣｌ２、約１ｍＭのＡＴＰ、および約１０ｍＭのＤＴＴ、それぞれ約ｐＨ７．５、２５℃を含む、またはそれからなる、リガーゼの有効な酵素活性のための緩衝液をさらに含み得る。
上記のキットの好ましい実施形態では、オリゴヌクレオチドは、５’末端ヌクレオチドにおけるライゲーション反応が遮断されるように、より詳細には、５’末端ヌクレオチドの５’リン酸において遮断性部分と共有結合している。その後のシークエンシングのためのアダプターとのライゲーションが遮断されることがより好ましい。
より詳細には、遮断性部分と共有結合したこれらのオリゴヌクレオチドは、５’末端に遊離の５’リン酸基を有さず、５’末端オリゴヌクレオチドの塩基が、チミン、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルのいずれでもなく；５’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの２’水素の一方または両方が別の原子または遮断性部分で置き換えられている、かつ／または、オリゴヌクレオチドは、ＲＮＡまたはＤＮＡにおけるリボースまたはデオキシリボースの立体コンフォメーション以外の立体コンフォメーションのペントースを有する５’末端ヌクレオチドを含む。好ましくは、そのようなペントース分子として、これだけに制限されないが、アラビノースが挙げられる。
一部の実施形態では、ライゲーションを遮断する共有結合した部分を含むオリゴヌクレオチドプライマーは、遮断性部分と共有結合する前の、５’末端ヌクレオチドの５’ＯＨまたは遊離の５’リン酸基を含む。
一部の実施形態では、非修飾オリゴヌクレオチドプライマーは、５’末端においてリン酸化されており、ライゲーションを遮断する共有結合した部分を含むオリゴヌクレオチドプライマーは、その５’末端ヌクレオチドの５’ＯＨまたは遊離の５’リン酸基が部分と共有結合している。
上記の方法またはキットの一部の実施形態では、ライゲーションを遮断する共有結合した部分を含むオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの５’リン酸基は、エステル化されている、またはライゲーションを遮断するオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチドの５’ＯＨ基は、エステル化またはエーテル化されている。
上述の方法またはキットの一部の実施形態では、ライゲーションを遮断する共有結合した部分を含むオリゴヌクレオチドプライマーの５’リン酸基は、アルキルアルコールまたはアリールアルコールによってエステル化されているか、または、ライゲーションを遮断するオリゴヌクレオチドプライマーの５’ＯＨ基は、モノアルキルホスフェート、ジアルキルホスフェート、モノアルキルホスホチオネートもしくはジアルキルホスホチオネート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏｎａｔｅ）によって、もしくはボロン酸によってエステル化されている。
一部の実施形態では、５’ヌクレオチドの５’リン酸基は、ペントース、好ましくはオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチドのデオキシリボースのリン酸基と、少なくとも１つのＯＨ基を含む炭化水素、好ましくは、少なくとも１つのＯＨ基を含むアリールまたはアルキルアルコール、より好ましくは第一級または第二級アルキルアルコールのヒドロキシル基との間のジエステル結合によってエステル化されている。他の実施形態では、ＯＨ基は、５’５’反転ヌクレオチドのＯＨ基である。アルキルアルコールまたはアリールアルコール、好ましくは第一級または第二級アルキルアルコールは、少なくとも１つの追加的な官能基をさらに含んでよい。そのような官能基は、これだけに制限されないが、モノエーテルまたはポリエーテル、モノエステルまたはポリエステル、カルボン酸、第一級アミンまたはヒドロキシル基から選択されることが好ましい。アルキルアルコールまたはアリールアルコールは、２−メチル−テトラヒドロフランおよびその誘導体などの環状エーテルを含んでよい。一部の実施形態では、モノアルキルアルコールまたはアリールアルコール、好ましくは第一級または第二級アルコールは、ビオチニル基を含む。
一部の実施形態では、５’ヌクレオチドの５’ＯＨ基に共有結合した遮断性部分は、以下のいずれかから選択される： ５’スペーサー１８、５’スペーサー９、５’Ｃ３−スペーサー、５’Ｃ６−スペーサー、５’脱塩基残基（ｄスペーサー、ｒスペーサー）、５’−５’反転ヌクレオチドなどの５’−スペーサー、ならびにＤＡＤＥ−リンカー、５’Ｃ６−アミノ−リンカー、および５’Ｃ１２−アミノ−リンカー、および５’−ビオチン化Ｃ６、Ｃ１２−アミノ−リンカーなどの５’リンカー、ならびに任意のその機能的類似体。
一部の実施形態では、非修飾５’末端ヌクレオチドを、フルダラビン、アザチオプリン、メルカプトプリン、ペントスタチン、クラドリビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、およびテガフールのうちの任意の１つと共有結合させる。
一部の実施形態では、オリゴヌクレオチドの５’末端の５’ヌクレオチドの２’水素（単数または複数）の一方または両方が、これだけに制限されないが、ハロゲン原子、好ましくはＦ、Ｃｌ、Ｂｒ、もしくはＩ、または、１つまたは複数の追加的な官能基を含んでも含まなくてもよいＣ１〜Ｃ５アルキルもしくはＣ１〜Ｃ５アルコキシ基、好ましくはＣ１〜Ｃ３アルキルもしくはＣ１〜Ｃ３アルコキシ基から選択される原子または部分で置き換えられている。
上記のキットの一部の実施形態では、ペントース、好ましくは生成された第１のＤＮＡ鎖の３’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの３’ＯＨ基は、ライゲーションを遮断する部分と共有結合していてよい。３’ヌクレオチドの３’ＯＨ基は、より好ましくはジエステルによって、エステル化されていることが好ましい。
キットの一部の実施形態では、３’末端の３’ＯＨ基における遮断性部分の共有結合は、炭化水素ホスフェート、好ましくはアルキルホスフェートまたはアリールホスフェート、より好ましくはモノアルキルホスフェートまたはジアルキルホスフェートからなる。他の実施形態では、遮断性部分の共有結合は、炭化水素ホスホチオネート、好ましくはアリールホスホチオネートまたはアルキルホスホチオネート、より好ましくはモノアルキルホスホチオネートまたはジアルキルホスホチオネートからなる。さらに他の実施形態では、遮断性部分の共有結合は、ボロン酸からなる。さらに他の実施形態では、修飾は、アリールホスホボロネート（ｐｈｏｓｐｈｏｂｏｒｏｎａｔｅ）またはアルキルホスホボロネート、より好ましくはモノアルキルホスホボロネートまたはジアルキルホスホボロネートである。
アルキルホスフェート、アルキルホスホチオネート、またはボロン酸は、モノエーテルまたはポリエーテル、モノエステルまたはポリエステル、カルボン酸、第一級アミンまたはヒドロキシル基から選択される少なくとも１つの追加的な官能基を含むことが好ましい。モノアルキルまたはジアルキルホスフェートは、２−メチル−テトラヒドロフランおよびその誘導体などの環状エーテルも含んでよい。３’ヌクレオチドの３’ＯＨ基は、好ましくはジエステルによって、エステル化されていることが好ましい。３’ヌクレオチドの３’ＯＨ基は、以下の３’スペーサー１８、３’スペーサー９、３’Ｃ３−スペーサー、３’Ｃ６−スペーサー、３’脱塩基残基（ｄスペーサー、ｒスペーサー）、３’Ｃ６−アミノ−リンカー、３’Ｃ１２−アミノ−リンカー、および任意のその機能的類似体を含めた分子のうちの任意の１つのＯＨ基によってエステル化されている。
一部の実施形態では、上記の遮断性部分は、好ましくはＴ４ ＲＮＡリガーゼを使用することによって、オリゴヌクレオチドが１本鎖ｃＤＮＡとライゲーションするように導入することができ、それによって、前記オリゴヌクレオチドは、３’末端、好ましくは３’末端３’ＯＨ基に、ライゲーションを遮断する上記の遮断性部分のいずれかを含有する。
上記のキットの一部の実施形態では、キットは、ＲＴ反応セットアップを精製するための精製キットをさらに含み得る。前記精製キットはＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）であることが好ましい。前記キットは、第２のＤＮＡ鎖の生成および末端修復反応の後に使用するＰＣＲ精製キットをさらに含み得る。精製はＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を適用することによって行うことが好ましい。前記キットは、アダプター−ライゲーションステップの後に適用する、さらなる精製ステップを含み得る。そのような精製ステップのためにＧｅｎｅＲｅａｄ Ｓｉｚｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔを選択することが好ましい。
ＨｅＬａ細胞由来のＲＮＡを、ＲＮｅａｓｙ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて抽出し、ＰｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡを、ＧｅｎｅＲｅａｄ Ｐｕｒｅ ｍＲＮＡ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて富化する。次いで、ＰｏｌｙＡ＋ｍＲＮＡ８６ｎｇを以下のプロトコールに従って各ＲＮＡ−Ｓｅｑ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ反応に使用する：
ｍＲＮＡ３２μｌ（総量：８６ｎｇ）をｑＳｃｒｉｐｔ Ｆｌｅｘ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｍｉｘ（５×）（Ｑｕａｎｔａ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）８μｌ、ランダムな８ｍｅｒオリゴ２μｌ（２００μＭ、ＩＤＴ）と混合した。ランダムなオリゴは、ネイティブなオリゴ（「対照」）、または、得られるｃＤＮＡとシークエンシングアダプターのライゲーションを遮断するＣ３スペーサーを５’に有するオリゴ（「Ｍｏｄ」、／５ＳｐＣ３／ＮＮＮ ＮＮＮ ＮＮ、ＩＤＴ））のいずれかである。
ｍＲＮＡ／ランダムなオリゴ混合物を９４℃で１５分間加熱して、ＲＮＡを平均サイズ約１００〜２００ｂｐに断片化する。熱媒介性断片化の後、混合物を氷上で冷却する。
その後、逆転写（ＲＴ）構成成分：ＲＮＡｓｅ阻害剤（４Ｕ／μｌ、ＱＩＡＧＥＮ）２μｌ、ｄＮＴＰ（各１０ｍＭ、ＱＩＡＧＥＮ）２μｌ、ＤＴＴ（０．１Ｍ）４μｌ、およびｑＳｃｒｉｐｔ Ｒｅｖｅｒｓｅ Ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔａｓｅ（Ｑｕａｎｔａ ＢｉｏＳｃｉｅｎｃｅｓ）２μｌを添加する。以下の温度プロファイルをＲＴ反応に使用する：２５℃で１０分間、４２℃で５０分間、および酵素を不活化するために７０℃で１５分間。
ＲＴ反応が完了したら、第１鎖ｃＤＮＡ合成反応液を、ＱＩＡｑｕｉｃｋ Ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ Ｒｅｍｏｖａｌ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製した後、ｃＤＮＡを、精製された第１鎖ｃＤＮＡ（溶出液４０μｌ中）、１０×ＮＥＢ Ｓｅｃｏｎｄ Ｓｔｒａｎｄ Ｓｙｎｔｈｅｓｉｓ Ｒｅａｃｔｉｏｎ Ｂｕｆｆｅｒ（Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）８μｌ、Ｅ．ｃｏｌｉ ＤＮＡリガーゼ（１０Ｕ／μｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）１０μｌ、ＤＮＡポリメラーゼＩ（５Ｕ／μｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）４．８μｌ、ＲＮａｓｅ Ｈ（５Ｕ／μｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）４μｌ、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼ（１０Ｕ／μｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）４μｌ、Ｔ４ ＤＮＡポリメラーゼ（３Ｕ／μｌ、Ｎｅｗ Ｅｎｇｌａｎｄ Ｂｉｏｌａｂｓ）およびＲＮａｓｅを含まない水（ＱＩＡＧＥＮ）５．２μｌを含有する、総反応体積を８０μｌにした、第２鎖合成に供する。
２本鎖ｃＤＮＡの末端修復を容易にし、シークエンシングアダプターとのライゲーションをすぐに行えるようにするために、Ｔ４ポリヌクレオチドキナーゼおよびＴ４ ＤＮＡポリメラーゼを添加する。第２鎖ｃＤＮＡ合成反応液を２５℃で３０分にわたって実施し、次いで、７０℃で１０分にわたって熱不活化を行う。
反応混合物を、ＭｉｎＥｌｕｔｅ ＰＣＲ Ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎ Ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、水２５μｌ中に溶出させる。クレノウ（エキソ−）３μｌおよび１０×Ａ付加緩衝液３μｌ（どちらもＧｅｎｅＲｅａｄ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ Ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ）を溶出液２５μｌに添加し、Ａ付加反応を３７℃で３０分にわたって実施し、７５℃で１０分にわたって不活化を行う。
次いで、アダプターライゲーション反応を、ＧｅｎｅＲｅａｄ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｄａｐｔｅｒｓ ｆｏｒ Ｉｌｌｕｍｉｎａ Ｓｅｑｕｅｎｃｅｒｓ（ＱＩＡＧＥＮ）、ＧｅｎｅＲｅａｄ Ｌｉｂｒａｒｙ Ｐｒｅｐ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）からのライゲーション緩衝液およびリガーゼを製造者の説明書に従って用いて行う。上記プロセスのワークフローを図１に示す。
ライゲーションされたシークエンシングライブラリーを、ＧｅｎｅＲｅａｄ Ｓｉｚｅ Ｓｅｌｅｃｔｉｏｎ ｋｉｔ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いて精製し、１０サイクルにわたってＰＣＲ増幅する（ＧｅｎｅＲｅａｄ Ｌｉｂｒａｒｙ Ａｍｐｌｉｆｉｃａｔｉｏｎ ｋｉｔ、ＱＩＡＧＥＮ）。
次いで、両方のライブラリーのシークエンシングを、ｍｉＳｅｑ計器においてＭｉＳｅｑ Ｒｅａｇｅｎｔ Ｋｉｔ Ｖ２（３００ ｎｔ）を用い、ペアエンドシークエンシングを適用することによって行う。ＣＬＣ Ｇｅｎｏｍｉｃｓ Ｗｏｒｋｂｅｎｃｈ（ＱＩＡＧＥＮ）を用いてシークエンシングデータを解析する。
図２に示されている通り、どちらのライブラリーも、ヒトゲノム参照ｈｇ１９にマッピングされた高いリードの百分率（９７．３１％および９７．３２％）、ならびにユニークなリードの百分率（７６．９３％および７９．０６％）を有し、これにより、ライブラリーの品質が良好であることが実証される。
両方のライブラリーの鎖特異性を調査する。図３に示されている通り、遮断性部分と共有結合したランダムなオリゴを用いて生成したライブラリーの第１のリード（ＭＯＤ、Ｒ１）は、主に参照のフォワード鎖にマッピングされ、一方、第２のリード（ＭＯＤ、Ｒ２）は、主にリバース鎖にマッピングされる。対照的に、対照ライブラリーでは、Ｒ１またはＲ２のいずれのマッピングも、フォワード鎖とリバース鎖とで比較的バランスがとれている。
ＲＰＫＭ（マッピングされたリード１００万当たりの転写物１キロベース当たりのリード（Ｒｅａｄｓ Ｐｅｒ Ｋｉｌｏｂａｓｅ ｏｆ ｔｒａｎｓｃｒｉｐｔ ｐｅｒ Ｍｉｌｌｉｏｎ ｒｅａｄｓ ｍａｐｐｅｄ））の比較により、２つのライブラリーが高い程度で一致することが実証され（９７．８９％のＲ２、図４、対照ライブラリーからのＲＰＫＭ：Ｘ軸；鎖ＲＮＡ−ＳｅｑライブラリーからのＲＰＫＭ：ＭＯＤ）、これにより、鎖ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーの遺伝子発現プロファイリング結果が対照である標準のＲＮＡ−ｓｅｑライブラリーと比較して変化しないことが示唆される。
まとめると、新規方法では、標準のＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリー調製プロトコール手順からの偏差は最小であり、しかしワークフローに追加的な酵素反応ステップを導入せずに、鎖特異的ＲＮＡ−Ｓｅｑライブラリーを生成することができることが示される。

Claims (32)

  1. ＲＮＡシークエンシングの方法であって、
    （ｉ）ＲＮＡを提供するステップ；
    （ｉｉ）逆転写酵素、第１のセットのランダムオリゴヌクレオチドプライマー、およびステップ（ｉ）の前記ＲＮＡを使用することにより前記ＲＮＡを逆転写に供することによって前記ＲＮＡと相補的な１本鎖の第１のＤＮＡ鎖（単数または複数）（ｃＤＮＡ）を生成するステップ；
    （ｉｉｉ）ＤＮＡポリメラーゼ、第２のセットのランダムオリゴヌクレオチドプライマー、および（ｉｉ）の前記１本鎖ｃＤＮＡを使用することによって第２のＤＮＡ鎖を生成するステップ；
    （ｉｖ）ステップ（ｉｉｉ）の前記２本鎖ＤＮＡにアダプターをライゲーションするステップ；ならびに
    （ｖ）前記生成されたＤＮＡのシークエンシングを行うステップ
    を含み、
    ａ）前記第１のセットのランダムオリゴヌクレオチドプライマーが、その／それらの５’末端ヌクレオチドに、前記生成された第１のＤＮＡ鎖の５’末端におけるライゲーションを遮断する、共有結合した部分を含むか；または
    ｂ）前記第２のセットのランダムオリゴヌクレオチドプライマーが、その／それらの５’末端ヌクレオチドに、前記生成された第２のＤＮＡ鎖の５’末端におけるライゲーションを遮断する、共有結合した部分を含み、
    ここで、前記第１のセットのランダムオリゴヌクレオチドプライマーに共有結合した部分または前記第２のセットのランダムオリゴヌクレオチドプライマーに共有結合した部分が、ステップ（ｉｖ）の間に除去されない、方法。
  2. ステップ（ｉｖ）の前に、
    （ｉｉｉ）（ａ）末端修復されたＤＮＡ鎖を得るために、ポリヌクレオチドキナーゼ、およびポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性とを有する酵素を使用して、前記２本鎖ＤＮＡ鎖を末端修復するステップ
    を含む、請求項１に記載の方法。
  3. ステップ（ｉｉｉ）（ａ）の後に、デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素を使用することによってＤＮＡ鎖の３’末端に末端アデニンを付加することを含むステップ（ｉｉｉ）（ｂ）であって、前記アダプターが３’末端チミンを含み、それがステップ（ｉｖ）において３’末端アデニンを含む前記ＤＮＡ鎖とライゲーションする、ステップ（ｉｉｉ）（ｂ）を行う、請求項２に記載の方法。
  4. （ｉ）ＤＮＡとシークエンシングアダプターのライゲーションを遮断する、５’末端ヌクレオチドに共有結合した部分を含むランダムオリゴヌクレオチドプライマー；
    （ｉｉ）非修飾ランダムオリゴヌクレオチドプライマー；
    （ｉｉｉ）逆転写酵素；
    （ｉｖ）ポリヌクレオチドキナーゼ、およびポリメラーゼ活性とエキソヌクレアーゼ活性とを有する酵素；
    （ｖ）２つのアダプター、ならびに
    （ｖｉ）リガーゼ
    を含む、キット。
  5. ＤＮＡポリメラーゼをさらに含む、請求項４に記載のキット。
  6. デオキシヌクレオチジルトランスフェラーゼ酵素をさらに含む、請求項４または５に記載のキット。
  7. 前記２つのアダプターが末端チミンを含み、そのそれぞれが、シークエンサーの表面にそれぞれ結合した増幅プライマーと相補的である、請求項４から６までのいずれか一項に記載のキット。
  8. 前記逆転写酵素が、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、マウス白血病ウイルス逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、細菌逆転写酵素、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼまたはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのうちの任意の１つから選択される、請求項１から３までのいずれか一項に記載の方法。
  9. 前記逆転写酵素が、レトロウイルス逆転写酵素、レトロトランスポゾン逆転写酵素、Ｂ型肝炎逆転写酵素、カリフラワーモザイクウイルス逆転写酵素、マウス白血病ウイルス逆転写酵素、トリ骨髄芽球症ウイルス（ＡＭＶ）、細菌逆転写酵素、Ｔｔｈ ＤＮＡポリメラーゼまたはＴａｑ ＤＮＡポリメラーゼのうちの任意の１つから選択される、請求項４から７までのいずれか一項に記載のキット。
  10. 共有結合した遮断性部分を含む前記ランダムオリゴヌクレオチドが、
    （ｉ）前記ランダムオリゴヌクレオチドが、５’末端ヌクレオチドに、遊離していない５’リン酸を含み、ライゲーションを遮断すること；
    （ｉｉ）前記５’末端ヌクレオチドの塩基が、チミン、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルのいずれでもないこと；
    （ｉｉｉ）前記５’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの２’水素の一方または両方が別の原子または遮断性部分で置き換えられていること；ならびに／または
    （ｉｖ）前記ランダムオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡまたはＤＮＡにおけるリボースまたはデオキシリボースの立体コンフォメーションではない立体コンフォメーションのペントースを有する５’末端ヌクレオチドを含むこと
    を特徴とする、請求項１から３までおよび請求項８のいずれか一項に記載の方法。
  11. （ｉ）において前記ランダムオリゴヌクレオチドの前記５’末端ヌクレオチドの５’ＯＨ基または５’リン酸基が、ライゲーションを遮断する部分と共有結合している、請求項１０に記載の方法。
  12. 共有結合した遮断性部分を含む前記ランダムオリゴヌクレオチドが、
    （ｉ）前記ランダムオリゴヌクレオチドが、５’末端ヌクレオチドに、遊離していない５’リン酸を含み、ライゲーションを遮断すること；
    （ｉｉ）前記５’末端ヌクレオチドの塩基が、チミン、アデニン、シトシン、グアニンおよびウラシルのいずれでもないこと；
    （ｉｉｉ）前記５’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの２’水素の一方または両方が別の原子または遮断性部分で置き換えられていること；ならびに／または
    （ｉｖ）前記ランダムオリゴヌクレオチドが、ＲＮＡまたはＤＮＡにおけるリボースまたはデオキシリボースの立体コンフォメーションではない立体コンフォメーションのペントースを有する５’末端ヌクレオチドを含むこと
    を特徴とする、請求項４から７までおよび請求項９のいずれか一項に記載のキット。
  13. （ｉ）において前記ランダムオリゴヌクレオチドの前記５’末端ヌクレオチドの５’ＯＨ基または５’リン酸基が、ライゲーションを遮断する部分と共有結合している、請求項１２に記載のキット。
  14. ライゲーションを遮断する前記ランダムオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの５’リン酸基がエステル化されている、請求項１０に記載の方法。
  15. ライゲーションを遮断する前記ランダムオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチドの５’ＯＨ基がエステル化またはエーテル化されている、請求項１１に記載の方法。
  16. ライゲーションを遮断する前記ランダムオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの５’リン酸基がエステル化されている、請求項１２に記載のキット。
  17. ライゲーションを遮断する前記ランダムオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチドの５’ＯＨ基がエステル化またはエーテル化されている、請求項１３に記載のキット。
  18. ライゲーションを遮断する前記ランダムオリゴヌクレオチドプライマーの前記５’リン酸基は、アルキルアルコールまたはアリールアルコールによってエステル化されている、請求項１０または１４に記載の方法。
  19. ライゲーションを遮断する前記ランダムオリゴヌクレオチドプライマーの前記５’ＯＨ基は、モノアルキルホスフェート、ジアルキルホスフェート、モノアルキルホスホチオネートもしくはジアルキルホスホチオネート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏｎａｔｅ）によって、またはボロン酸によってエステル化されている、請求項１１または１５に記載の方法。
  20. ライゲーションを遮断する前記ランダムオリゴヌクレオチドプライマーの前記５’リン酸基は、アルキルアルコールまたはアリールアルコールによってエステル化されている、請求項１２または１６に記載のキット。
  21. ライゲーションを遮断する前記ランダムオリゴヌクレオチドプライマーの前記５’ＯＨ基は、モノアルキルホスフェート、ジアルキルホスフェート、モノアルキルホスホチオネートもしくはジアルキルホスホチオネート（ｐｈｏｓｐｈｏｔｈｉｏｎａｔｅ）によって、またはボロン酸によってエステル化されている、請求項１３または１７に記載のキット。
  22. 前記アルキルアルコールまたはアリールアルコールが、モノエーテルもしくはポリエーテル、モノエステルもしくはポリエステル、カルボン酸、第一級アミンまたはヒドロキシル基から選択される少なくとも１つの追加的な官能基を含む、請求項１８に記載の方法。
  23. 前記モノアルキルホスフェート、ジアルキルホスフェート、モノアルキルもしくはジアルキルホスホチオネート、またはボロン酸が、モノエーテルもしくはポリエーテル、モノエステルもしくはポリエステル、カルボン酸、第一級アミンまたはヒドロキシル基から選択される少なくとも１つの追加的な官能基を含む、請求項１９に記載の方法。
  24. 前記アルキルアルコールまたはアリールアルコールが、モノエーテルもしくはポリエーテル、モノエステルもしくはポリエステル、カルボン酸、第一級アミンまたはヒドロキシル基から選択される少なくとも１つの追加的な官能基を含む、請求項２０に記載のキット。
  25. 前記モノアルキルホスフェート、ジアルキルホスフェート、モノアルキルもしくはジアルキルホスホチオネート、またはボロン酸が、モノエーテルもしくはポリエーテル、モノエステルもしくはポリエステル、カルボン酸、第一級アミンまたはヒドロキシル基から選択される少なくとも１つの追加的な官能基を含む、請求項２１に記載のキット。
  26. ライゲーションを遮断する前記ランダムオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの５’ＯＨ基は、５’−スペーサー、５’−５’反転ヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）、ならびに５’リンカーから選択される分子によってエステル化されている、請求項１１、１５、１９および２３のいずれか一項に記載の方法。
  27. 前記５’−スペーサーは、５’スペーサー１８、５’スペーサー９、５’Ｃ３−スペーサー、５’Ｃ６−スペーサー、または５’脱塩基残基（ｄスペーサー、ｒスペーサー）であり、前記５’リンカーは、ＤＡＤＥ−リンカー、５’Ｃ６−アミノ−リンカー、５’Ｃ１２−アミノ−リンカー、５’−ビオチン化５’Ｃ６アミノ−リンカーまたは５’−ビオチン化５’Ｃ１２−アミノ−リンカーである、請求項２６に記載の方法。
  28. ライゲーションを遮断する前記ランダムオリゴヌクレオチドプライマーの５’末端ヌクレオチドのデオキシリボースの５’ＯＨ基は、５’−スペーサー、５’−５’反転ヌクレオチド（ｉｎｖｅｒｔｅｄ ｎｕｃｌｅｏｔｉｄｅ）ならびに５’リンカーから選択される分子によってエステル化されている、請求項１３、１７、２１および２５のいずれか一項に記載のキット。
  29. 前記５’−スペーサーは、５’スペーサー１８、５’スペーサー９、５’Ｃ３−スペーサー、５’Ｃ６−スペーサー、または５’脱塩基残基（ｄスペーサー、ｒスペーサー）であり、前記５’リンカーは、ＤＡＤＥ−リンカー、５’Ｃ６−アミノ−リンカー、５’Ｃ１２−アミノ−リンカー、５’−ビオチン化５’Ｃ６アミノ−リンカーまたは５’−ビオチン化５’Ｃ１２−アミノ−リンカーである、請求項２８に記載のキット
  30. 非修飾５’末端ヌクレオチドを、フルダラビン、アザチオプリン、メルカプトプリン、ペントスタチン、クラドリビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、およびテガフールのうちの任意の１つと共有結合させる、請求項１０または１１に記載の方法。
  31. 非修飾５’末端ヌクレオチドを、フルダラビン、アザチオプリン、メルカプトプリン、ペントスタチン、クラドリビン、フロクスウリジン、ゲムシタビン、シタラビン、ゲムシタビン、カペシタビン、およびテガフールのうちの任意の１つと共有結合させる、請求項１２または１３に記載のキット。
  32. ５’末端におけるライゲーションを遮断する共有結合した部分を含む、前記生成された第１のＤＮＡ鎖が、その３’末端に、前記３’末端におけるライゲーションを遮断するものであり、前記第１のＤＮＡ鎖の生成後に導入される修飾をさらに含む、請求項１から３まで、８、１０、１１、１４、１５、１８、１９、２２、２３、２６、２７および３０のいずれか一項に記載の方法。
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