CN1620503A

CN1620503A - 细胞内制备单链dna

Info

Publication number: CN1620503A
Application number: CN02828039.3A
Authority: CN
Inventors: 彼得·M·格拉泽
Original assignee: Yale University
Current assignee: Yale University
Priority date: 2001-12-14
Filing date: 2002-12-13
Publication date: 2005-05-25
Also published as: MXPA04005747A; US20030148352A1; WO2003052071A3; WO2003052071A2; EP1468086A2; CA2470033A1; AU2002363997A1; IL162462A0

Abstract

本发明提供细胞内产生单链DNA分子的方法，该DNA分子在介导三链体依赖性或非依赖性染色体事件中具有活性。该方法所依据的发现即是将病毒载体或质粒导入细胞，它们在被改造的细胞内生成单链DNA分子，该DNA分子结合于目标染色体DNA从而形成三链体，该三链体可以诱导所需要的突变和/或进行基因重组并通过掺入供体DNA分子诱导染色体DNA的改变。上述载体或质粒不仅可编码TFO和任意供体DNA，而且可编码一种逆转录酶和任选一种限制酶，这在优选实施例中呈现为一种融合蛋白，逆转录上述载体或质粒编码的RNA，接着在一个限制酶切位点切割产生单链DNA。该单链DNA可以被直接生成或最初作为双链茎－单链环结构，然后被切割生成单链DNA。

Description

细胞内制备单链DNA

交叉参照相关申请

此申请要求2001年12月14日提交的美国临时申请No.60/340,803的权利。

美国政府对此发明拥有一定的权利，因为本发明由国立卫生研究院(NIH)资助，编号为RO1 GM54731和RO1CA64186。

发明背景

基因治疗可以通过将异种DNA导入一种宿主细胞的方法来定义或通过在细胞内改变内源基因表达的方法来定义。这样，基因治疗方法可用于改变细胞的表型和/或基因型。一个例子是反义治疗领域。在反义治疗中，核酸分子被导入一种细胞，在那里该核酸分子杂交或结合于一种编码特殊蛋白的mRNA。此反义分子结合于某种类mRNA降低了该mRNA的翻译效率和速率。

改变细胞基因型的方法通常依赖导入该细胞中一个缺陷基因的一个完整置换拷贝、一个异源基因或一个小核酸分子如一条寡核苷酸来治疗人类、动物和植物遗传性疾病。被导入的基因或核酸分子通过随机整合来补充内源基因。这些途径需要复杂的传递系统将置换基因导入细胞中，比如基因工程化的病毒或病毒载体。基因治疗正被用于人类已较了解的遗传性疾病的实验性治疗，例如视网膜母细胞瘤、囊性纤维化和镰状细胞性贫血。然而，在体内效率低下，因为实际上导致缺陷基因整合的重组事件是有限的。此外，基因能整合到染色体的某些部位，在那里或者表达受到限制，或者导致有害的结果，比如诱导某种癌基因。

通过基因替代对基因组有目的的修饰作为一种研究工具在基因治疗中是有价值的。容易的方法是将新基因导入哺乳类动物细胞，但该方法同源整合的频率是有限的(Hanson et al.，(1995)Mol.Cell.Biol.15(1)，45-51)，并且分离具有位点特异性基因插入的细胞需要筛选程序(Capecchi，M.R.，(1989)Science 244(4910)，1288-1292)。以稀有核酸内切酶而致双链断裂形成的位点特异性DNA损伤，在几个细胞系统里可在染色体基因座位促进染色体的同源重组，但这种操作方法需要将识别序列提前插入座位。

自从多年前Felsenfeld等，J.Am.Chem.Soc.79：2023(1957)最初发现三链DNA，由寡核苷酸引导的三链体(triplex)形成已经成为分子生物学中一种有价值的工具。近来的知识提示寡核苷酸可以作为DNA的第三条链以一种序列特异性的方式结合于双链DNA多聚嘌呤/多聚嘧啶的大沟中。在一个基序中，多聚嘧啶寡核苷酸以与二聚体中的嘌呤链平行的方向结合，如Moser和Dervan，Science 238：645(1987)，Praseuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA85：1349(1988)，和Mergny等，Biochemistry 30：9791(1991)描述。在交替嘌呤基序中，多聚嘌呤链以与嘌呤链反向平行方向结合，如Beal和Dervan，Science251：1360(1991)所描述。三链体形成的特异性源于氢键连接的碱基三联体(嘌呤基序中的AAT和GGC)。错配使该三链体(triple helix)不稳定，如Mergny等，Biochemistry 30：9791(1991)和Beal和Dervan，Nuc.Acids Res.11：2773(1992)描述。

单链DNA(ssDNA)对一些分子生物学技术而言是有用的。单链DNA可以以序列特异性方式结合双链DNA形成三股螺旋(triple helices)(Giovannangeli等，2000，Curr Opin.Mol.Ther.，2，288-296；Chan等，1997，JMol.Med.75，267-282)。在下文中提到的这种单链DNA指形成三链体的寡核苷酸(triplex forming oligonucleotide)，或TFO。研究显示三链体形成能抑制基因表达(Faria et al.，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，3862-3867；Kim等，1998，Biochemistry，37，2299-304)以及在哺乳类动物细胞中通过定向突变或被诱导的基因重组来介导靶基因组的修饰(Luo等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA97，9003-9008 Vasquez et al.，2000，Science，290，530-533)。研究显示TFO刺激重组的能力分别有赖于XPA和Rad51(Datta et al.，2001，J BioL Chem.，27，18018-18023；Faruqi et al.，2000，Mol.Cell.Biol.，20，990-1000)，以及核苷酸剪切修复和同源重组相关的因素。这些结论与三链体结构驱使DNA修复的验证研究相一致(Wang et al.，1996，Science，271，802-805)。

美国专利5,962,426和6,303,376至Glazer等描述了使用TFO来诱导位点特异性突变和/或供体寡核苷酸重组用于基因治疗。研究证实一个富含G的30-mer TFO(AG30)，当被转染到小鼠纤维母细胞系(FL-10)时，能够诱导染色体底物中单纯疱疹病毒胸苷激酶(TK)基因同向重复(direct repeat)拷贝间的重组，在该染色体中三链体形成靶点被置于基因间(Luo et al.，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，97，9003-9008)。通过丙胺基团的修饰，所述AG30 TFO的3’端受到保护从而免于降解，并且或者通过与阳离子脂质体混合或者直接经由微注射被转染入细胞。尽管脂质体介导的转染产生了特异的和可检测的重组诱导，但显微注射却产生高于300倍以上的重组体频率。另外，高亲和力、形成三链体的寡核苷酸和它的应用方法已被描述并且被用于与一个目标DNA分子的一个特异性DNA片断形成三链核酸分子。在三链体形成时，寡核苷酸的结合在体内应用细胞DNA合成或修复机制刺激了目标序列内或其临近的突变发生而没有重组。

上述方法的缺点在于它们需要TFO诱导和，任选地，为进行重组需要供体DNA进入将被改造的细胞。而在体内绝大多数传递方法效率很低。

因此提供一种在细胞内传递提供大量TFO和/或用于重组的供体DNA的方法是本发明的一个目的。

发明概述

本发明提供细胞内产生具有介导三链体(triplex)依赖性或非依赖性染色体事件活性的单链DNA分子的方法。本方法所依据的发现即是将病毒载体或质粒导入细胞，它们在将被改造的细胞内生成单链DNA分子，该DNA分子结合于目标染色体DNA形成三链体，从而可以诱导所需要的突变，和/或基因重组并通过掺入供体DNA诱导染色体DNA的改变。上述载体或质粒不仅可编码TFO和任意供体DNA，而且可编码逆转录酶，和任选限制酶，其在优选实施例中呈现为一种融合蛋白形式，逆转录上述载体或质粒编码的RNA，接着在限制酶切位点切割产生单链DNA。该单链DNA可以被直接生成或最初作为双链茎-单链环结构(double stranded stem-single stranded loopstructure)，然后被切割生成单链DNA。

一旦在体内产生，这些高亲和力、形成三链体的寡核苷酸就被靶向到染色体序列，在那里它们结合并诱导染色体事件。这类事件包括重组、基因转变、核苷酸取代、核苷酸缺失、核苷酸插入、在染色体位点改变或校正遗传缺陷。所述突变或重组导致活化、灭活或改变靶基因的活性及功能的变化。若靶基因包含引起遗传病的突变，那么这种寡核苷酸对恢复靶基因DNA序列至正常的诱变或重组的修复是有用的。如果靶基因是病毒存活或复制所需的病毒基因或是引起不受调控增生的癌基因，比如存在于癌细胞中的，那么所述诱变寡核苷酸导致突变是有益的，该突变灭活上述基因使其失去功能或阻止病毒的复制或者终止或减少癌细胞的不受控的增生。所述诱变寡核苷酸还是一种有用的抗癌剂，活化已经失去其抑制增殖能力的阻抑物基因。

该形成三链体的寡核苷酸还可以用作一种分子生物学研究工具在一个细胞中引起靶向突变。靶向突变对于靶向正常基因和对诸如DNA修复或基因组功能的任何类型的机理研究是有用的。动物卵母细胞中特异基因的靶向突变，比如一个小鼠的卵母细胞，提供了一种强而有用的工具，用于研究基因工程、治疗及用于科研和农业的新的“衍变(transmutated)”动物、植物株的生成。形成三链体的寡核苷酸作为分子研究工具在功能基因组领域是尤为有用的。

附图简述

图1在哺乳类动物细胞中产生单链DNA的载体系统的设计。(A)载体pssXA表达由劳氏肉瘤病毒(RSV)启动子驱动的RT-MboII融合蛋白。它还携带一个新霉素的抗性基因作为可选标记。pssXB(AG30)被改造从而由巨细胞病毒(CMV)启动子启动表达一个这样的转录本，该转录本含有位于NotI位点内的所需插入序列。设计该转录本使其还掺入MoMuLV RT的核心启动子部位，因此允许生成其中含有插入序列的一条链的cDNA。(B)pssXB(AG30)载体的部分DNA序列。插入到pssXB Not1位点可生成pssXB(AG30)的片断序列用印刷体大写字母形式列出，其具有用粗体列出的AG30 TFO序列。所述LUIboII和NotI位点分别用下划线和斜体标出。(C)茎环结构预测由pssXB(AG30)来源的转录本反转录生成的cDNA形成。被预测在茎中形成的MboII识别位点和预期的MboII切割位点被指出。逆转录酶可与本领域已知的任何限制酶融合。例如，所述酶可选自如下的酶，但并不限于此：EcoRI、MboI、HindIII、BamHI、NdeI、BglI、NotI、Pst1、SacI、SceI、SspI、或XbaI。，酶的筛选将与被切割的位点相一致。将逆转录酶融合到稀有切割酶上是令人期待的。比如一个18碱基对剪切器(cutter)，象SceI，限制消化特定的染色体DNA。(D)基于(C)中AllbolI切割的假定模式，预测34核苷酸单链DNA产物(AG34)产生自pssXA和pssXB(AG30)的联合转染。包含于AG34中的30核苷酸(nt)的AG30 TFO序列加下划线标出，从3′端额外的4nt区分出AG34中的该部分。

图2。(A)单链DNA产物的序列。AG34和rev34与AG30(下划线标出)的比较，所述AG34和rev34预期分别由pssXA加pssXB(AG30)和pssXA加pssXB(rev)产生。(B)靶底物被设计用来研究由TFO诱导的染色体内重组。LTK细胞在单一染色体座位携带TK基因的两个突变拷贝为同向重复，其侧面连接于一个多聚嘌呤三链结合位点，被用来检测由载体产生的单链DNA在介导三链体形成和重组诱导方面的能力。该TK基因在指示的位置携带由XhoI连接子插入组成的灭活突变。潜在的重组体确定为生长于选择性HAT培养基的TK⁺克隆。

发明详述

此处所描述的方法提供单链DNA分子，该分子在细胞内产生并在介导有待治疗的细胞内和/或细胞区域(compartment)内三链体依赖和/或重组基因的染色体事件中是有活性的。有三种基本情况：

(1)单链DNA与靶染色体DNA结合以形成足可以诱导位点特异性突变的三链体；

(2)其中单链DNA结合靶染色体DNA并诱导该染色体DNA重组；和

(3)(1)和(2)的组合，其中单链DNA既可形成三链体又可与靶染色体DNA重组。在此情况下，单链DNA可单独由形成三链体的序列所组成，形成三链体的序列与重组基因序列连接，或者可以有两个单链DNA，一个用以形成三链体，另一个是用于基因重组的(recombinagenic)。

这些寡核苷酸在将在被载体或质粒改造的细胞内产生，所述载体或质粒既可在细胞内生成寡核苷酸又可生成一种既是逆转录酶又是限制酶的融合蛋白。

虽然现有技术教导我们能够单独应用形成三链体的寡核苷酸或与重组基因的寡核苷酸结合应用，但人们在知道单链DNA可被摄入胞核并能有效地向染色体DNA中导入改变之前，必须为确定形成三链体的寡核苷酸或重组基因的寡核苷酸是否能够以病毒载体或质粒的形式被导入细胞进行研究，还必须研究加工所述寡核苷酸的方法。

此处描述的方法是高度特异和有效的，并使基因工程改造的效率与寡核苷酸外源传送入细胞相比，大大提高。

I.单链DNA分子形成三链体或重组于靶染色体序列。

如上所述，单链DNA分子可以是形成三链体的寡核苷酸、重组基因的寡核苷酸(recombinagenic oligonucleotide)，或者是它们的组合。

A. 形成三链体的寡核苷酸

TFO被定义为形成三链体的寡核苷酸，它以序列特异性方式作为第三条链与双链DNA结合。优选“TFOs”是单链DNA。单链DNA可以与双链DNA形成三条链，也可以不与双链DNA形成三条链。单链DNA能：1)与双链DNA一起形成三股螺旋(triple helices)，2)重组到靶染色体序列，或3)作为染色体片断体内修复的模板。此点下面会进一步描述。

优选的将会形成三链体结构的条件是体外诱变的标准测定条件和体内诱变的生理条件。(参见例如，Moser和Dervan，Science238：645(1987)；Praseuth等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85：1349(1988)；Mergny等，Biochemistry 30：9791(1991)；Beal和Dervan，Science 251：1360(1991)；Mergny等，Biochemistry 30：9791(1991)及Beal和Dervan，Nuc.Acids Res.11：2773(1992)，它们纳入本文作参考)。

三链体形成的一个有用指标是三链体的平衡解离常数K_d，这可以用三链体形成到最大值的一半时寡核苷酸的浓度估算。优选，寡核苷酸在生理性交互作用范围内对靶序列具有结合亲和力。优选的寡核苷酸具有的K_d约小于或等于10^-7M。最优选的，K_d小于或等于2×10^-8M以实现显著的细胞内交互作用。有许多种方法可用来确定一个寡核苷酸/靶碱基对的K_d值。

在一个实施方案中，产生了高亲和力的寡核苷酸(Kd＜2×10^-8)，该寡核苷酸与靶基因DNA的特异性DNA片段形成三链。高亲和力寡核苷酸的K_d小于或等于2×10^-6是优选的。更优选高亲和力寡核苷酸的K_d小于或等于2×10^-7。高亲和力寡核苷酸的K_d低于2×10^-8甚至是更优选的。高亲和力寡核苷酸的K_d低于2×10^-9是最优选的。

寡核苷酸结合染色体靶基因或靶区域内的靶序列，形成三螺旋区域。优选，双链分子的靶区域包含或毗邻靶基因的缺陷或必须部分，比如能引起遗传缺陷的突变部位，引起癌基因活化的部位，或引起对癌基因抑制子的抑制或灭活的部位。最优选，这种基因是人类基因。

较好地，该寡核苷酸是长度在7和40核苷酸之间的单链核酸分子，用于体内染色体的修饰，长度在10到30核苷酸最优选。碱基构成最好是同源嘌呤(homopurine)或同源嘧啶(homopyrimidine)。或者，碱基构成是多聚嘌呤或多聚嘧啶。然而，其它构成也是有用的。

在此描述的该寡核苷酸的核苷酸序列是依据所述靶序列的序列、为满足寡核苷酸结合于靶区域大沟的需要所施加的物理约束力和寡核苷酸/靶序列之间有一个低的解离常数(Kd)的需要来选择的。该寡核苷酸将有这样的碱基构成，该碱基构成有助于三链体的形成，并且该寡核苷酸为第三链的结合将基于已知结构基序之一而制成。在后面的实例所使用的基序中(反向平行嘌呤基序)，当有GC配对时，G被使用，当靶序列中有AT配对时，A就被使用。当有插入，CG或TA对时，另外的残基被使用，例如，对TA对来说，T就被使用。对第三链结合寡核苷酸的碱基构成的论述在美国专利No.5,422,251中已经提供。

优选的是，寡核苷酸在高严谨和高特异的条件下结合到靶核酸分子。最好该寡核苷酸以序列特异的方式结合在双链DNA的大沟内。针对一个核酸序列的一个寡核苷酸或引物在体外三链体形成的反应条件随寡核苷酸的改变而改变，取决于像寡核苷酸的长度、G:C和A:T碱基对的数目以及结合反应中所用缓冲液的成份。基于第三条链结合密码，一个与双链核酸分子的靶区域充分互补的寡核苷酸是优选的。如此处所用的，如果说一个寡核苷酸与一个靶区域充分互补，那么该寡核苷酸就有一个允许与靶区域形成三链体的碱基构成。这样，一个寡核苷酸与靶区域充分互补，即使该寡核苷酸中存在非-互补碱基。有许多的结构基序是有用的，它们可被用来确定一个充分互补的寡核苷酸的核苷酸序列。

B. 基因重组或供体DNA分子

基因重组供体(recombinagenic donor)DNA片段是与靶序列同源的。供体分子优选长度是在35-1500个核苷酸之间；长度在50-500个核苷酸之间更优选。可以理解，本领域中与靶DNA同源位置的数量越大，该片段被重组到靶序列、靶区域、或靶位点的概率就越大。此处应用的术语“基因重组的((recombinagenic)”被用来定义能够重组到靶位点或序列的DNA片段、寡核苷酸，或成分(composition)。

所述重组基因供体DNA可产生自载体或质粒，作为与形成三链体的DNA分子分离的DNA分子或通过混合序列接头与形成三链体的寡核苷酸连接。所述核苷酸接头是可变的，有赖于与三链体形成相关的所需染色体变化的定位。然而，接头长度在1-100核苷酸之间是较好的。接头长度在1-15核苷酸之间更好。所述DNA供体和TFO可被直接连接(亦即，没有一个接头序列)。

经由三链体形成，这种“供体连接”的排列促进靶位点的识别，并且同时为可能的重组和信息转移定位供体片段。这种策略也打算用于开发三螺旋自身激发DNA修复的能力，潜在地增加与同源供体DNA重组的可能性。以质粒为基础的系统用于与人类细胞提取物(亦即，不是在细胞内)接合，以促进靶向重组(Datta等，2001，J.Biol.Chem.，27，18018-18023；chan等，1999，J.Biol.Chem，274，17，11541-11548)，所述系统掺入了被序列特异TFOs所限定的同源片段、指示菌和含有报告基因突变版本的质粒载体。通过混合的序列接头，TFO被限定到(tethered)与靶基因区同源的供体DNA片段。在双功能A-AG30分子中，供体片段，由长度为40的单链组成，与靶基因中除位置144外的位置同源，在这些位置所述序列与所述功能基因的序列相配，从而实现所需表型的筛选/选择。

三链体形成以促进与人无细胞提取物重组的能力在样品中得到了检测，在所述样品中，AG和供体寡核苷酸不相连接，但作为单独的分子与质粒底物一起简单地混合。这导致重组水平的提高，频率为40×10^-5，几乎与连接的A-AG30所产生的一样高。该结果提供了进一步的证据证明，TFO能刺激供体片段与靶座位之间的重组。另外，由于在这种情况下供体片段是与TFO分离的，因此该结果尤其证明TFO在刺激重组方面的作用，而这与其传送供体片段至靶位点的能力是不同的。

II.逆转录酶-限制酶融合蛋白

编码形成三链体的单链DNA或供体DNA的载体或质粒还必须包括从RNA转录DNA的工具，并且在一些实施方案中，还包括切割用作形成三链体的寡核苷酸或重组基因供体DNA的寡核苷酸的工具。在优选实施方案中，所述载体或质粒编码逆转录酶-限制酶融合蛋白。可以理解，逆转录酶和限制酶当然还可以被表达为单独的酶。

A.逆转录酶

许多逆转录酶和编码它们的核苷酸序列是商业上可购买的并且可能会运用在本文提供的方法中。逆转录酶包括，但不限于AMV逆转录酶(鸟髓母细胞过多症病毒(Avian myeloblastosis Virus)和M-MuLV逆转录酶。病毒逆转录酶(例如MuLV和AMV)也可使用。展现固有逆转录酶活性的耐热DNA聚合酶也可用。

B.限制酶

在本领域中已知任何限制酶(restriction enzyme)都可在此处所述的方法中应用。例如，所述限制酶可选自如下的酶，但并不只限于此：EcoRI、MboI、HindIII、BamHI、NdeI、BglI、NotI、PstI、SacI、SeeI、SspI或XbaI。而且，另外的商用II型限制酶和某些内含子及intein编码的内切核酸酶也可应用。酶的筛选将与被切割的位点相符。运用一种稀有切割酶是令人期待的。比如18碱基对的切割器(cutter)，例如SceI，来限制消化某个染色体DNA。用RecA辅助的限制酶(RARE)进行DNA分割也是可用的，藉此显著地限制染色体DNA的限制性消化。

III. 传输寡核苷酸的载体/质粒

“载体”或“质粒”是指任何一种能指导由载体编码的蛋白和/或mRNA转录本合成的自主遗传单位。本领域技术人员对这样的载体已熟知。“载体”是指多核苷酸分子，优选是衍生自，例如质粒、噬菌体或植物病毒的DNA分子，多聚核苷酸可插入其中或被克隆。载体最好包含一个或更多单一限制位点且能在特定的宿主细胞内自主复制，所述宿主细胞包括靶细胞或组织或其祖(progenitor)细胞或组织，在其中或是可与特定宿主的基因组整合，这样使得所克隆的序列是可复制的。相应地，所述载体可以是自主复制载体，亦即，载体作为一个额外的染色体实体存在，它的这种复制是不依赖于染色体而复制的，例如，线性或闭合环型质粒，染色体外的成份，微染色体，或人工染色体。

所述载体可选择性地含有一些确保自我复制的工具。或者该载体当被导入宿主细胞内时，被整合到宿主基因组并随被整合的染色体一起复制。一个载体系统可由单个载体或质粒、两个或更多载体或质粒组成，它们还包含将被导入宿主细胞基因组的总DNA，或转座子。载体的选择通常依赖于载体和载体将被导入的宿主细胞的兼容性。该载体也可包括筛选标记例如抗生素抗性基因可被用于相配的转化子。这样的抗性基因实例本领域技术人员都熟悉，包括nptII基因(赋予对抗生素卡那霉素和G418(Geneticin.RTM.)的抗性)和hph基因(赋予对抗生素潮霉素B抗性)。各种各样的载体系统在本领域中都是很熟知的。例如，这样的系统包括但不仅仅限于腺病毒载体系统、腺相关病毒载体系统和逆转录病毒载体系统。

还可以使用质粒。

IV. 治疗的方法和组合物

任何上述载体可在其内生成所述ssDNA的真核细胞都能被上面所描述的系统改造。在所述优选实施例中，所述细胞是在一组织中或更优选在一动物体内。最优选的动物是人。适当的细胞系可以包括例如CV-1细胞、COS细胞或酵母细胞。所述细胞也可以是原核来源的。

有许多遗传疾病或缺陷可用所述系统治疗。例如，那些存在缺陷基因的疾病，如珠蛋白生成障碍性贫血、囊性纤维化、重度复合性免疫缺陷病(SCIDS)、血友病和镰状细胞性贫血。该方法也可以用于灭活基因特别是参与癌症和病毒性疾病的基因，在此情况下，所靶向的DNA是原癌基因或病毒基因。

在细胞内或细胞的核部位生成的单链DNA分子通常重组到靶染色体序列。靶定重组的诱导最好用于，例如，校正靶基因的突变，而该突变就是导致遗传疾病的原因。或者，如果所述靶基因是病毒存活或复制所必需的病毒基因或者是导致非可控增殖的癌基因，例如在癌细胞内，那么所述重组基因TFOs通过同源重组对诱导突变或校正该突变是有用的，从而灭活该基因使之失去功能(incapacitate)或阻止病毒的复制或者终止或减少所述癌细胞的不可控增殖。所述寡核苷酸与特定基因序列的靶区域结合在哺育动物细胞内刺激在染色体座位的重组。例如，已经证明直接细胞核内显微注射寡核苷酸后，在含有单纯疱疹病毒胸苷激酶基因的两个串联拷贝的染色体座位，重组被刺激。(Luo，Zet al.(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 97(16)，9003-9008)。

优选的是，所述供体寡核苷酸和/或生成它们的病毒载体和/或质粒被溶解于生理可接受的载体，如一种水溶液或被整合于脂质体内，然后该载体或脂质体被注射入机体内，如需要基因治疗或抗-病毒疗法的动物体内，进行基因操作。对哺乳动物的优选注射途径是静脉内注射。本领域技术人员都会知道，不用特殊的传送方法、载体或溶液，寡核苷酸就会被哺乳动物和如小鼠这样的动物的细胞或组织摄取。

将核酸和/或载体传送入细胞内可经由多种机制。作为一个例子如经由脂质体传送，用商业上可买到的脂质体制剂例如LIPOFECTIN，LIPOFECTAMINE(GIBCO-BRL，Inc.，Gaithersburg，Md.)，SUPERFECT(Qiagen，Inc.Hilden，Germany)和TRANSFECTAM(Promega Biotec，Inc.，Madison，Wis.)，依据本领域操作标准开发的其它脂质体也一样。另外，本发明所述核酸或载体可在体内通过电穿孔来传送，该技术可从Genetronics，Inc.(San Diego，Calif.)获得，并籍助于SONOPORATION仪器(ImaRxPharmaceutical Corp.，Tucson，Ariz.)实施。

作为一个例子，载体传递可以是经由病毒系统，例如一个能包装重组逆转录病毒基因组的逆转录病毒载体系统。所述重组的逆转录病毒可以用于感染并因此传递核酸到被感染的细胞。诱导该核酸进入哺乳动物细胞内的精确方法当然不是仅限于逆转录病毒载体的使用。其它技术在该操作中也是普遍可行的，包括腺病毒载体的使用、腺相关病毒(AAV)载体、慢病毒载体、假型(pseudotyped)逆转录病毒载体。物理转导技术也可以使用，如脂质体传送和受体介导的和其它的胞饮机制。

尽管核酸或载体经静脉内和/或直肠内给药通常是优选的，但也可口服、肠胃外(例如静脉内)给药，通过肌肉内注射、通过腹膜内注射、皮内(transdermally)、体外(extracorporeally)、直肠内，局部给药等等。所需的核酸或载体的精确量随对象的不同而不同，取决于物种、年龄、体重和对象的一般情况、被治疗疾病的严重性、所用的具体核酸或载体，其给药方式，等等。因此，不可能对每一种核酸或载体都给出一个精确的用量。然而，在本文的指导下，本领域任何一位普通技术人员仅通过常规实验即能确定一个适当的用量(参见，例如，Remington的“Pharmaceutical Sciences”一书)。

所述核酸和载体的非肠胃给药，如果被使用的话，一般使用注射。注射剂以常规形式制备，或者是液体溶液或者是悬浮液，固体形式注射前悬浮于液体作为溶液或作为乳剂。更新修订的非肠胃给药方法包括使用一个缓慢释放或持续释放系统，这样可以维持一个恒定的剂量。参见，例如引入本文作参考的美国专利号No.3,610,795。

适当的载体包括但不限于无热原盐水。对于非肠胃给药，无菌溶液或悬液是在盐水中制备的，其可含有添加剂，如油酸乙酯或十四酸异丙酯，并且可以被注射入例如皮下或肌内组织。

核酸口服给药的适合载体包含一种或多种物质，该物质可用作调味剂、润滑剂、悬浮剂或作为保护剂。适合的固体载体包括磷酸钙、碳酸钙、硬脂酸镁、糖、淀粉、明胶、纤维素、羧基多聚甲叉(carboxypolymethylene)、或环右旋糖酐(cyclodextrans)。适合的液体运载体可以是水、药用油或者二者的混合物。所述液体可以含有其它适合的制药添加剂如缓冲液、防腐剂、调味剂、粘度或渗透压-调节剂、稳定剂或悬浮剂。适合的液体载体实例包括有或没有添加剂的水，包括羧基多聚甲叉作为一种ph-调节胶。

例如，一名患者遭受一种病毒或遗传病可以通过体内或体外的方法治疗。例如，对于体内治疗，传送载体可以给药该患者，所述载体优选是以一种生物相容性的溶液或一种可药用载体，通过摄食、注射、吸入或任何其它方法给药。所述给药剂量将随患者不同而变化。“治疗有效剂量”将通过被转移基因物质后功能的提高水平与任何风险或有害的副作用相平衡后来确定。监测基因导入的水平、基因表达和/或所编码的抗病毒蛋白的存在或水平将有助于选择和调节给药剂量。一般来说，包含转染复合物的组合物将以单一剂量给药，剂量在10ng-100μg/kg体重的范围内，优选范围在100ng-10μ/kg体重，这样至少一个治疗载体拷贝被传送到每个靶细胞内。所述治疗载体当然将在靶细胞内与适当的基因表达调节序列有关。

回体(ex vivo)治疗也是被期待的。细胞群可从患者中移除或者以治疗构建体提供，转导，然后重新导入患者。通常，回体细胞剂量将依据平衡任何有害的副作用后所希望的治疗效果来确定。该剂量范围通常在每周每天或间歇地每个患者10,000-100,000,000个细胞；优选每个患者1,000,000-10,000,000个细胞。

对于体外的研究，一种含有所述载体的溶液被直接加到一种含有感兴趣的DNA分子的溶液中，这与本领域技术人员很熟悉的方法一致并在下面的实例中有更具体的细节描述。体内的研究可通过质粒DNA转染细胞并且为了载体有足够时间进入细胞与表达的单链寡核苷酸形成三链体，可在溶液如生长介质中与转染细胞一起孵育该载体。被转染细胞可在悬浮液中或在附着于固相的单层中，或者可能是在一组织中的细胞，其中所述载体是在细胞外液。对于体外的研究，含有所述载体的溶液被直接加到含有感兴趣的DNA分子的溶液中，这与本领域技术人员所熟悉的方法一致。

V. 实施例

下面所描述的实施例示范了所设计的载体系统在哺乳动物细胞内生成ssDNA，该系统能够在小鼠细胞中产生所需要的34个核苷酸的TFO序列，就如通过引物延伸分析转染细胞裂解物所得到的证据一样。在先前报告三链体诱导事件的小鼠细胞测定中，所述ssDNA作为一个TFO起作用，能刺激染色体内重组(Luo等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，9003-9008)。具体地，组合的载体组pssXA和pssXB(AG30)，被特异性地改造以表达34个核苷酸的富含G的ssDNA，发现该组合的载体组以实质上高于本底水平45×10^-6的196×10^-6的频率在FL-10细胞中突变体TK基因间诱导重组。相反，单个应用的载体成份不产生高于本底的重组。当pssXA加pssXB(rev)时，后者含有与pssXB(AG30)完全一样的插入但方向相反，所希望的富含C的ssDNA可通过引物延伸测定法在细胞中被检测到，但没有发现被诱导的重组。生理条件下，所述富含C的ssDNA的无效性与该序列的ODN无能力在FL-10细胞的多聚嘌呤靶定位点处形成三链体相一致。

最近，Chen等描述了一个被设计为在细胞内生产ssDNA的载体系统，并证明了其在产生反义DNA或者催化DNA以介导靶向的mRNA的降解(Chen等，2000，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.，10，415-422)。在该系统中，设计一种逆转录酶-MboII融合蛋白的一个载体连同来自第二个载体的mRNA的共表达，以产生具有茎环结构的cDNA分子，其中所述的第二个载体含有Moloney小鼠白血病病毒(MoMuLV)核心启动子下游反向重复序列。MboII在所述茎基底部切割来释放包含在环中的感兴趣的ssDNA序列。

该载体系统在哺乳动物细胞内产生ssDNA的能力能使其充当TFO以诱导染色体内事件。被披露的ssDNA表达系统可在细胞内产生可检测数量的所需TFO，导致诱导重组水平比当合成的AG30用阳离子脂质体转染到细胞时先前所观察到的高了7倍(Luo等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.，USA，97，9003-9008)。此处呈现的这些结果显示所述ssDNA表达系统提供了一种有用的方法，用以体内生成活性TFO，以介导在产生TFO的细胞中基因组DNA的定点修饰。

参考以下非限制实施例可对本发明作进一步理解。

实例1：ssDNA载体系统的设计

在细胞内产生ssDNA的所设计的载体系统的关键特征图示于图1a(Chen等，2000，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.，10，415-422)。所示两种成分的系统由一个表达RT-MboII融合蛋白的质粒(pssXA)和表达可生成所需ssDNA的经改造的RNA转录本的另一个质粒(pssXB)组成。逆转录酶可以与本领域任一已知的限制酶融合。例如，所述酶可以非限制性地选自：EcoRI、MboI、HindIII、BamHI、NdeI、BglI、NotI、PstI、SacI、SspI、SceI或XhaI。所述pssXB构建体含有表达盒，其掺入了两端为反向重复序列的所需的插入DNA序列(在这种情况下双螺旋掺入了AG30 TFO序列)(图1b)。产生的转录本包括MoMuLV核心启动子和在3’端的tRNA引物结合位点(Chen等，2000，Antisense Nucleic Acid Drug Dev.，10，415-422)，从中RT可产生cDNA，该cDNA由于所述的反向重复序列可形成内部的茎-环结构(图1c)。设计茎部的MboII切割来释放环作为含有插入序列加少数外来核苷酸的ssDNA。在插入子掺入有AG30序列的情况下，所期待的34个核苷酸的ssDNA如图1d所示。在本工作中，使用了两个pssXB来源的载体；一个是pssXB(AG30)，其具有插入序列，该插入序列具有产生AG34 ssDNA的方向，见图1d；另一个载体有反向的NotI插入，因而产生一个充分但不完全与AG34互补的富含C的ssDNA序列(见下面)。

材料和方法

载体：所述pssXA和pssXB载体的构建(图.1a)前面已描述(Chen等，2000，Antisense Nucleic Acid DrugDev.，10，415-422)。上述载体分别含有7869和5459bp。为使载体表达所需的含有AG30 TFO序列或者与之互补序列的ssDNA，合成的寡核苷酸序列：5′d(GGGCCGCAGGCTCCCCCTCCCCCACCACCCCCCCCTTCCTGC)3′(SEQ ID NO：1)和5′d(GGCCGCAGGAAGGGGGGGGTGGTGGGGGAGGGGGAGCCTGC)3′(SEQ ID NO：2)退火产生具有NotI粘末端的合成的双链，在除去存在于原载体中的填充片段后连接入pssXB的NotI位点。转化入大肠杆菌后，通过直接测序鉴定包含有质粒的克隆，所述质粒有两个可能方向的插入序列。设计所述方向以产生掺入有所述AG30 TFO的34个核苷酸的G丰富序列，见图1，命名为pssXB(AG30)。反方向的载体命名为pssXB(rev)。

寡核苷酸：通过Midland Certified Reagent Co.(Midland，TX)合成ODNs，并用凝胶电泳或高压液相层析(HPLC)纯化，然后用双蒸馏水通过Centricon-3过滤(Amecon，Beverly，MA)。ODNs由磷酸酯键组成，并在一些情况下(如所示的)被合成含有3′丙胺基团(Zendugui等，1992，Nucleic AcidsRes.20，307-314)。

三链体结合试验：通过电泳迁移率改变分析法(Electrophoretic mobilityshift assays)确定表观分离常数(K_ds)。退火包含30bp多聚嘌呤TFO结合位点的ODNs(57bp)以形成合成的靶双螺旋(Wang et al.，1995，Mol.Cell.Biol.，15，1759-1768)。用T4多聚核苷酸激酶和[γ-³²P]ATP在5’末端放射标记双螺旋，凝胶纯化，并在包含10mM Tris-HC(pH7.6)，1mM精胺和10％甘油的缓冲液中，与浓度逐渐增加的所选TFOs，在37℃温育18小时。使样品在含89mM Tris、89 mM硼酸、pH8.0和10mMMgCl₂的12％天然凝胶中，60伏特电压，聚丙烯酰胺凝胶电泳4小时，接着放射自显影。

细胞：小鼠FL-10细胞的构建和特征前面已有描述(Luo等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，9003-9008)。上述细胞来源于LTK-细胞并被确定含有单拷贝的pTK2supF构建体作为三链体诱导的染色体内重组的靶底物。所述FL-10细胞在含10％胎牛血清的Dulbecco改良的Eagle培养基(DMEM)中培养。

载体转染和重组测定：每平方厘米1.67×10⁴密度的FL-10细胞(1×10⁶在100mm皿中)用3μg每种所选的载体DNA转染，按照生产者的指示所述载体DNA都提前与66μl的GenePorter转染试剂混合并稀释入总体积为2ml的无血清培养基中(Gene Therapy Systems，San Diego，CA)。5小时后，上述培养基用标准生长培养基置换。细胞在非选择培养基中再孵育24小时以便重新构建的(reconstituted)TK基因发生重组和表达，之后培养基换成含1×10^-4M次黄嘌呤、2×10^-6M氨基喋呤和1.6×10^-5M胸苷(HAT)的DMEM来筛选表达野生型TK的潜在重组体。细胞在含HAT培养基中维持10天，在此时记数存活的集落。

ODN转染：如制造商描述的那样，每平方厘米1.67×10⁴浓度的细胞(1×10⁶细胞在100mm皿中)在每个培养皿中用与66μl的GenePorter混合并稀释入总体积为2ml的无血清培养基中的10μg ODN DNA转染(Gene TherapySystems，San Diego，CA)。如上所述，转染5小时后，将所述细胞放到含10％FBS的完全生长培养基中。24小时以后培养基被换成HAT筛选。

细胞内ssDNA的检测：象上面提到的使用阳离子脂质体用所示载体转染细胞。24小时后，为分析所ssDNA的产生收获细胞。细胞层用PBS洗3次并通过每60mm皿加5ml Trizol试剂(Life Technologies，Gaithersburg，MD)裂解。裂解物中的高分子量DNA通过用巴斯德吸管反复吹打被剪断。该溶液被转移到50ml试管，与氯仿(每1ml Trizol溶液加0.2ml)混合，8000rpm离心30分钟。水样上清液与0.5ml异丙醇每毫升初始加入的Trizol混合，5500rpm 4℃再离心30分钟。

所得片状沉淀物(pellet)用75％的乙醇洗涤、风干，溶于水中。加入RNaseA(20μg/ml)，所得溶液在37℃孵育2小时。接着酚/氯仿抽提，-70℃用乙醇沉淀DNA，14,000rpm 4℃离心30分钟分离。所得片状沉淀物用75％的乙醇洗涤，溶于水中，该样品被用于引物延伸反应。对于引物延伸，25μl的每个样品与所选引物(用T4多核苷酸激酶和[Y-³²P]ATP在5’端标记)在34μl中以80pmol混合，从10mM储存液中每种dNTP取2μl，2μl vent聚合酶(NewEngland Biolabs，Beverly，MA)和7μl 10X Thermopol缓冲液(随vent聚合酶供给)。该反应在一个热循环仪中加热到95℃2分钟，然后进行30个循环：第一步，95℃30秒；第二步，48℃1分钟；第三步，70℃2分钟，接着70℃10分钟。通过15％变性聚丙烯酰胺凝胶电泳和接着放射自显影，产物可被看到。所述引物为15个碱基，设计为与预期产物(或者AG34或者rev34)3’端互补，且序列分别是5′d(CAGGCTCCCCCTCCC)3′(SEQ ID NO：3)和5′d(CAGGAAGGGGGGGGT)3′(SEQ ID NO：4)。

转染细胞内ssDNA的定量：转染24小时后，细胞用PBS洗3次并裂解用于制备低分子量DNA(同上)。同时，用合成的AG34 ODN(pssXA和pssXB(AG30)的预期产物)，以设计模拟每个细胞10⁴～10⁷个分子的浓度锲入(spike)平行检测的样品，假定裂解时大约4×10⁶个细胞存在。通过引物延伸的所述检测的其余部分同上。

实例2：合成的TFOs和潜在的ssDNA产物的结合比较

在所述载体系统cDNA产物中所预期的茎环结构内，MboII切割发生在所述茎内(图1c)。维持茎保存MboII切割位点要求插入序列在5’和3’端掺入互补核苷酸。以AG30序列为例，这就意味着，在最后产生的ssDNA中，4个额外的核苷酸将不得不被包括在5’端或3’端。尽管以前的工作已经显示在FL-10细胞重组底物中AG30 TFO高亲和力结合于多聚嘌呤靶点，但我们关注TFO 5’或3’端额外核苷酸可充分地减少结合。为了确定5’或3’尾对AG30三链体结合的作用，用合成的57bp的双螺旋作为结合靶进行凝胶迁移率改变分析。为了对照，我们也通过AG30 TFO与3’丙胺(与以前小鼠细胞和小鼠内靶向实验所使用的一样)(Luo等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，9003-9008；Vasquez etal.，2000，Science，290，530-533)和AG30与3’OH检测了结合，因为预期在细胞内通过载体系统产生的ssDNA会有一个3’OH。象显示的那样，AG30和5’尾及AG30和3’尾都显示相对于AG30结合均减少，平衡解离常数(K_ds)范围在5×10^-7M，对应AG30的5×10^-8。因此，所述4个核苷酸尾减少了但并没有消除三链体的结合亲和力。在我们实验使用的pssXB(AG30)构建体中，所预测的ssDNA相对于AG30序列将有一个3’尾(图1d)。

实例3：检测小鼠细胞内诱导的染色体内重组

一种三链体诱导的染色体内重组的检测被用于测试载体系统产生ssDNA的能力，该ssDNA能作为TFO结合染色体靶点。小鼠LTK细胞(FL-10)的亚克隆携带一对在单一基因座中作为同向重复的突变TK基因(图2)。在该构建体中，上述TK基因间的区域被改造成含有30bp富含G的多聚嘌呤序列，其负责通过所述AG30TFO(Wang等，1995，Mol.Cell.Biol.，15，1759-1768)在反向平行三链体基序中高亲和力的第三条链的结合(Beal等，1991，Science，251，1360-1363)。上述TK基因在不同位点(位置在TK26的735和在TK8的1220)含有灭活XhoI的接头插入突变。在该测定中，所述两个TK基因之间的重组有产生功能基因的潜力。因为亲代LTk细胞缺乏细胞的TK，那些突变体TK基因已经重组产生野生型TK的细胞能通过在HAT培养基上生成而被筛选出来。通过转染所选的载体或ODNs诱导的重组是通过计数HAT抗性克隆，以所处理细胞总数的比例来定量的。在以前的工作中，在所述FL-10细胞中重组底物偏向报告基因转化事件而不是交叉重组(Luo等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，9003-9008)，因此该测定事实上可能低估了三链体诱导事件的频率。

实例4：ssDNA载体诱导的重组

所述FL-10细胞被一系列载体(或单个或成对地)转染，然后HAT抗性克隆的诱导在至少三次独立实验中被测定。在这一系列的实验中，重组的本底频率在45×10^-6的范围，而当pssXA、pssXB，或pssXA加pssXB被转染到细胞时，高于此水平的诱导没有见到。然而，当pssXA加pssXB(AG30)被共同转染时，重组体却以196×10^-6的频率产生。当pssXA与含有反向的AG30插入序列的pssXB(rev)组合时，也没见到效果。该载体装置是期望表达富含C的rev34 ssDNA(图2)，其在生理pH条件下由于胞嘧啶质子化作用的需要，在多聚嘌呤靶点不形成三链体。

在所述测定中去除自发重组本底，pssXA和pssXB(AG30)对所述FL-10细胞的转染平均产生在10⁶中有151个重组的诱导频率。为了对照，在以前工作中，当AG30-NH2(末端保护用丙胺取代3′OH)通过阳离子脂质体被转染到相同的细胞时，高于本底的诱导是在10⁶中有21个重组(Luo等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，9003-9008)。为进一步比较，AG34的合成版本(被设计成匹配预测的ssDNA分子，因此没有丙胺保护)通过阳离子脂质体被转染到所述FL-10细胞时，没有诱导重组。总之，这些结果提示使用ssDNA系统在细胞内胞内生成AG34，在实现染色体打靶方面比用合成的TFOs，无论是AG30-NH2还是AG34，实际上更有效。另外，上述结果也证明，与预期的一样，当被转染到所述FL-10细胞时，合成的AG34版本比AG30活性更低。这与AG34与AG30相比，AG34对这些细胞内30bp的多聚嘌呤靶点的结合亲和力降低是一致的，而且可能也反应出AG34末端保护阻断核酸酶降解的缺乏。

实例5：在细胞内检测ssDNA产物

为确定所预期的ssDNA分子是被转染的载体产生的，低分子量DNA在载体转染24小时后被从细胞分离，并用5’端标记引物进行引物延伸测定。从未转染细胞和用单独pssXA、单独pssXB、pssXA加pssXB或用pssXA加pssXB(AG30)转染的细胞中获得的裂解物，使用被设计与所述AG34序列互补的15核苷酸引物来测定(图1d)。来自转染有pssXA和pssXB(rev)的细胞裂解物用设计检测rev34序列的15核苷酸的引物进行测定(图2)。就像显示的那样，34个核苷酸的ssDNA只有分别用AG34-和rev34-特异引物，在从转染有pssXA加pssXB(AG30)或pssXA加pssXB(rev)的细胞来的裂解物中才能被显现。只有用pssXA加pssXB(AG30)的转染才产生诱导的重组。

实例6：细胞内产生ssDNA的定量

为了确定每个细胞所述载体组pssXA加pssXB产生ssDNA分子的大概产量，小鼠FL-10细胞或用pssXA加pssXB(AG30)(经用阳离子脂质体共混合)，或为进行对照，用合成的ODN、AG34(也通过脂质体转染)转染。所述AG34寡聚体用丙胺作3’端保护并被设计精确地匹配所预期的pssXA加pssXB(AG30)载体的产物。与上面一样，低分子量DNA在载体转染24小时后被从细胞分离，然后引物延伸测定被用于显现和定量ssDNA(图6)。在裂解的时候，平行检测样品用已知量的AG34锲入，所用AG34的浓度为所计算的模仿每个细胞从10⁴到10⁷的浓度。所得数据通过磷屏成像仪(phosphorimager)定量，且标准曲线通过线性回归决定。实验样品中每个细胞ssDNA的量从上述标准曲线中通过内插法评估，对于pssXA加pssXB(AG30)样品而言，每个细胞生成6.2×10⁵个分子和AG34样品生成1.9×10⁵个分子。

以前，不仅确定在FL-10细胞中，转染的TFOs能在双TK底物中诱导重组(Luo etal.，2000，Proc.Natl.Acad Sci.USA，97，9003-9008)，而且也已经确定，该检测能报告超过一个频率范围，即从10^-6到10^-2的诱导重组。重要的是该之前的工作透露了TFO诱导的重组水平是非常依赖TFOs的细胞内传送效率的。当所述AG30 TFO用阳离子脂质转染时，见到了超过本底的21×10^-6的诱导重组频率(Luo等，2000，Proc.Natl.iliad.Sci.USA，97，9003-9008)。当所述TFOs被用显微注射导入时，1％范围的重组频率被检测到了。

在此报告的工作中，pssXA和pssXB(AG30)通过与阳离子脂质混合被共转染，超过本底的平均诱导是151×10^-6。这一结果可与基于引物延伸测定的细胞内产生ssDNA的定量相关，通过pssXA加pssXB(AG30)载体组每个细胞产生估计6.2×10⁵个分子的ssDNA。相反，通过脂质体转染，合成的ODN、AG34的转染每个细胞大约产生1.9×10⁵个分子。载体组产生ssDNA的相对水平是的大量的(substantial)，考虑到这一点，在这些实验中，两个载体的共转染没有被优化，因此有可能相当大数目的细胞没有被两个载体共转染。

对该载体系统的改进，例如重要元件合并(例如编码逆转录酶-限制性酶融合蛋白的核酸和编码单链三链体形成的寡核苷酸的核酸)到单个质粒并掺入到病毒载体，提高转染效率和导致活性增加。

在相关术语中，在以前的工作中(Luo等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，9003-9008)通过将合成的AG30 TFO显微注射到FL-10细胞得到重组子的产量比此处pssXA加pssXB(AG30)所诱导的重组子高66倍。另一方面，发现ssDNA载体系统产生重组子在频率上较用阳离子脂质体转染AG30刺激的超出本底七倍(数据依然来源于以前的研究(Luo等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，9003-9008))。通过这些方法每个细胞产生的ODN或ssDNA分子的估计数量分别为7×10⁴，6×10⁵，和1.9×10⁵。

与预期的ssDNA产物相匹配的合成的34-mer具有的结合亲和力较AG30本身低大约10倍。ssDNA系统虽然亲和力下降但在诱导重组时仍然有效，这更证明了该系统的效力，并且这也提示，当额外的核苷酸被剔除时TFO活性大量增加是可能的。另外，亲和力的不同部分解释了为什么显微注射精确的AG30分子比ssDNA载体系统更有效(Luo等，2000，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97，9003-9008)。

所述资料在此描述了诱导重组的方法和所预期的ssDNA产生的文献。依据Chen等(Chen等，2000，AntisenseNucleic Acid Drug Dev.，10，415-422)第一次报道反义DNA生成的途径，ssDNA之类来源于逆转录酶的活性(见Chen等，其中它们提供了在载体转染细胞内RT活性的证据)。

而这里第一次使用为在细胞内染色体三链体形成生产ssDNA的载体系统。以前的一些研究已经探索了细胞内生成的RNA转录本用于此目的的应用(Noonberg等，1994，Nucleic AcidsRes.，22，2830-2836；Shevelev et al.，1997，Cancer Gene Therapy，4，105-112)。但RNA基础上的方法有数种缺点。RNA不能与DNA重组。天然生成的RNA被用于三链体形成的反向平行的嘌呤基序排除，而更偏爱富含G:C碱基对的靶点，如在此处实验中所使用的(Beal等，1991，Science，251，1360-1363；Roberts etal.，1992，Science，258，1463-1466；Semerad etal.，1994，Nucleic Acids Res.，22，5321-5325)。另一方面，通过自然产生的RNA或DNA在并行嘧啶基序中的三链体形成因为胞嘧啶质子化的需要而需要酸性的PH值。(Asensio等，1998，J Mol.Biol.，275，811-822；Singletonetal.，1992，Biochemistry，31，10995-1003)。克服该问题的策略需要化学修饰C残基，这不能在生物学制备分子的情况下完成。另外，还没有一种机制能够转录后修饰RNA(以类似于这里使用MboII活性的方式)，因此转录本通常携带大量额外的减少第三条链结合亲和力的核苷酸。另一方面，细胞内产生的经过改造的RNA转录本的用途也显示了在反义应用方面的巨大前景(Gorman等，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95，4929-4934)。

综上所述，这里提供的结果证明ssDNA可在哺乳类动物细胞中有效制备，实现制备针对靶染色体位点的TFO的目的。三链体技术的其它应用，比如靶基因敲除或转录抑制，可适应于使用这里描述的方法。在哺乳动物细胞中高效率产生抗基因(anti-gene)TFO的能力提供了一种新的、重要的研究工具，并且还为一种新的治疗形式奠定了基础。

本领域技术人员会识别，或能够确认只是应用常规实验方法的，本发明所述的特定实施方案的很多等同情况。所述等同包括在下述权利要求中。

序列表

<110>耶鲁大学

<120>细胞内制备单链DNA

<130>YU 1224

<150>60/340，803

<151>2001-12-14

<160>12

<170>PatentIn version 3.1

<210>1

<211>42

<212>DNA

<213>人工的

<220>

<223>合成的寡核苷酸；pssXB(AG30)载体的部分ss序列；与SEQ ID NO：2部分互补

<400>1

gggccgcagg ctccccctcc cccaccaccc cccccttcct gc 42

<210>2

<211>41

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸；pssXB(AG30)载体的部分ss序列；与SEQ ID NO：1部分互补

<400>2

ggccgcagga aggggggggt ggtgggggag ggggagcctg c 41

<210>3

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AG34(或)rev34的合成的寡核苷酸PCR引物

<400>3

caggctcccc ctccc 15

<210>4

<211>15

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AG34(或)rev34的合成的寡核苷酸PCR引物

<400>4

caggaagggg ggggt 15

<210>5

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>指向大肠杆菌supF基因的合成的寡核苷酸

<400>5

aggaaggggg gggtggtggg ggagggggag cctg 34

<210>6

<211>85

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>寡核苷酸形成的单链AG30，MboII剪切位点，和双链茎(茎-环结构)

<400>6

ggtcggcggc cttgaacagc ggccgcagga aggggggggt ggtgggggag ggggagcctg 60

cggccgctct tcaaggccgc cgacc 85

<210>7

<211>88

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pssXB(AG30)载体的部分序列；互补于SEQ ID NO：8

<400>7

ctaggtcggc ggccttgaag agcggccgca ggctccccct cccccaccac cccccccttc 60

ctgcggccgc tcttcaaggc cgccgacc 88

<210>8

<211>88

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>pssXB(AG30)载体的部分序列；互补于SEQ ID NO：7

<400>8

ggtcggcggc cttgaagagc ggccgcagga aggggggggt ggtgggggag ggggagcctg 60

cggccgctct tcaaggccgc cgacctag 88

<210>9

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>指向大肠杆菌supF基因的合成的寡核苷酸

<220>

<221>misc_feature

<222>(30)..(30)

<223>用丙胺取代3′OH来保护AG30末端

<400>9

aggaaggggg gggtggtggg ggagggggag 30

<210>10

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>AG30靶向的富含G的多聚嘌呤；与SBQ ID NO：11互补

<400>10

gagggggagg gggtggtggg gggggaagga 30

<210>11

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>SEQ ID NO：10的互补链

<400>11

tccttccccc cccaccaccc cctccccctc 30

<210>12

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>合成的寡核苷酸；相反方向的AG30序列

<400>12

aggctccccc tcccccacca cccccccctt cctg 34

Claims

1.在目标染色体核酸分子中诱导一种特异变化的方法，包括以下步骤：

(a)导入细胞内编码逆转录酶的一种核酸分子；和

(b)导入细胞内一种编码RNA的核酸分子，该RNA分子将在该细胞内被逆转录酶逆转录成单链DNA；

这其中上述单链DNA分子结合于细胞内目标染色体核酸分子形成螺旋以诱导位点特异性变化和/或介导与目标染色体核酸分子的重组。

2.权利要求1的方法，其中单链DNA介导与目标的重组。

3.权利要求1的方法，其中所述三链体的形成诱导重组。

4.权利要求1的方法，其中所述三链体诱导突变而非重组。

5.权利要求3的方法，其中所述重组是染色体内重组。

6.权利要求3的方法，其中所述重组是染色体间重组。

7.权利要求1的方法，其中所述RNA是被逆转录成DNA并形成双链茎-单链环结构，其中该双链茎被与逆转录酶一起导入的限制酶从单链环结构中切除。

8.权利要求7的方法，其中所述限制酶选自Mbo II、Sce I、EcoRI、MboI、Hind III、Bam HI、Nde I、BglI、NotI、PstI、Sac I、Ssp I、SceI或XbaI。

9.权利要求7的方法，其中所述限制酶是一种罕见的切割性限制酶。

10.权利要求9的方法，其中所述罕见的切割性限制酶是Sce I。

11.权利要求7的方法，其中所述三链体诱导重组。

12.权利要求11的方法，其中所述重组是染色体内重组。

13.权利要求11的方法，其中所述重组是染色体间重组。

14.权利要求7的方法，其中所述逆转录酶和限制酶是在一种融合蛋白内。

15.权利要求11的方法，其中所述单链DNA刺激外源提供的DNA片断与目标染色体序列的重组。

16.权利要求11的方法，其中所述单链DNA刺激被限定的DNA片断与目标染色体序列的重组。

17.权利要求1的方法，其中所述目标染色体基因是一种癌基因。

18.权利要求1的方法，其中所述目标染色体基因是一种缺陷型基因，选自缺陷型血红素基因、血友病基因、囊性纤维化基因、干皮病色素形成基因、核苷酸剪切修复途径的基因或血友病基因。

19.权利要求1的方法，其中所述目标染色体序列是病毒基因组的全部或一部分。

20.权利要求1的方法，其中所述单链DNA是由同源嘌呤或同源嘧啶核苷酸组成。

21.权利要求1的方法，其中所述单链DNA是由多聚嘌呤或多聚嘧啶核苷酸组成。

22.根据权利要求1的方法，其中所述逆转录酶和限制酶及所述RNA是从两种或两种以上载体表达的。

23.根据权利要求1的方法，其中所述逆转录酶、限制酶及所述RNA是从同一种载体表达的。

24.权利要求1的方法，进一步包括：(C)向所述细胞中导入一种编码基因重组供体DNA片断的核酸。

25.权利要求1的方法，进一步包括：(C)向所述细胞中导入一种合成来源的基因重组DNA供体片断。

26.一种在细胞中生成单链DNA的表达系统，其中所述单链DNA结合到所述细胞中的目标染色体序列上，该表达系统包含：

(a)编码逆转录酶的核苷酸分子；和

(b)编码RNA的核苷酸分子，该RNA被所述逆转录酶逆转录成所述的单链DNA。

27.权利要求26所述表达系统，其中所述单链DNA结合到所述目标染色体序列形成三链体。

28.权利要求26所述表达系统，其中所述单链DNA是一种重组基因供体DNA分子。

29.权利要求26所述表达系统，包含形成三链体的单链DNA和重组基因单链DNA分子。

30.权利要求26所述表达系统，进一步编码限制酶，该系统包含编码RNA的核苷酸分子，所述RNA被逆转录成形成双链茎-单链环结构的DNA，其中双链茎被所述限制酶从单链环结构处切除。

31.权利要求30所述表达系统，其中所述逆转录酶和限制酶被表达为一种融合蛋白。

32.权利要求26所述表达系统，其中所述RNA、逆转录酶和限制酶是由同一个核苷酸分子表达的。

33.权利要求26所述表达系统，其中所述RNA、逆转录酶和限制酶是由两个或两个以上单独的核苷酸分子表达的。

34.权利要求26所述表达系统，其中所述编码RNA的DNA和编码所述逆转录酶-限制酶融合蛋白的DNA是可以整合于所述染色体的。

35.权利要求30所述表达系统，其中所述限制酶选自Mbo II，Sce I、Eco RI、Mbo I、Hind III、Bam HI、Nde I、Bgl I、Not I、PstI、SacI、Ssp I、SceI或XbaI。