CN1168696A - 端粒酶的rna成分 - Google Patents

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Abstract

含有哺乳动物端粒酶RNA成分的核酸，用作药物、治疗剂和诊断剂。

Description

端粒酶的RNA成分
本发明的背景技术
真核生物的染色体末端或端粒DNA通常由串联重复的简单序列组成。端粒酶为一种核糖核蛋白酶，合成端粒DNA的一条链。用作该酶RNA成分内的序列的模板。参见Blackburn，E.H.(1992)Annu.Rev.Biochem.61：113-129，此处将该文引为参考。
至今，哺乳动物端粒酶的RNA成分在科技文献中还未有报道，虽然已知人和小鼠端粒酶用于合成具有序列5’-TTAGGG-3’的端粒重复单元。参见Morin，G.B.(1989)，Cell 59：521-529；Morin，G.B.(1991)Nature353：454-456；Prowse等人(1993)PNAS 90：1493-1497，此处均引为参考。但这点知识并不足以分离或鉴别任一这些端粒酶RNA成分的核苷酸序列残余物。啤酒糖酵母(Saccharomyces cerevisiae)、四膜虫(Tetrahymena)的某些种以及其它纤毛虫如尖毛虫(Oxytricha)Euplotes和Glaucoma的端粒酶的RNA成分已被序列化并报导于科学文献中，参见Singer，M.S.和D.E.Gottschling(1994)Science 266：404-409；Lingner等人(1994)Genes & Development 8：1984-1988；Greider，C.W.和E.H.Blackburn(1989)Nature 337：331-337；Romero，D.P.和E.H.Blackbum(1991)Cell 67：343-353；Shippen-Lentz，D.和E.H.Blackbum(1990)Science 247：546-552。此处将这些文献的内容引入，作为参考。这些纤毛虫的端粒酶能合成明显不同于哺乳动物的端粒重复单元。
因此，非常需要更多的有关哺乳动物端粒酶的知识。尽管端粒DNA的重复单元性质看似简单，但长久以来科学家们就知道端粒在维持染色体结构和功能中具有重要的生物学作用。最近，科学家们推测端粒DNA的缺失可能是细胞衰老和老化的触发开关，端粒酶的调节作用可能具有重要生物学意义。参见Greider，C.W.(1994)Curr.Opin.GeneticsDevel.4：203-211；Harley，C.B.(1991)Mutation Res.256：271-282；Harley，C.B.等人(1990)Nature 345：458-460，此处均引为参考。
检测端粒酶活性的方法，对调节或影响端粒酶活性的化合物进行鉴别的方法以及通过控制端粒长度和端粒酶活性来治疗和诊断细胞老化和永生化的方法，在文献中也均有所描述。参见PCT专利公开号No.93/23572，公开于1993年11月25日，此处引为参考。
如果能够获得纯的或分离形式的包含端粒酶RNA成分和/或编码端粒酶蛋白质成分的核酸，并且知道这种核酸的核苷酸序列，那么，就会使端粒酶介导的疗法，端粒酶的测定和筛选方法都获得重大进展及寻找到新的途径。
发明概述
首先，本发明提供了基本上纯化形式的人端粒酶的RNA成分和该RNA成分的基因，以及包括该人端粒酶(hTR)的RNA成分的全部或至少一部分核苷酸序列的核酸。本发明还提供了基本上纯化形式的小鼠端粒酶的RNA成分和该RNA成分的基因，以及含有小鼠端粒酶(mTR)的RNA成分的全部或至少一部分核苷酸序列的核酸。本发明还进一步提供了其它物种的端粒酶RNA成分和编码该RNA成分的基因或其部分核酸，包括大鼠端粒酶RNA(rTR)、中国仓鼠端粒酶RNA(cTR)和牛端粒酶RNA成分(bTR)。RNA成分包括如灵长类哺乳动物的RNA，但不限于此。本发明的其它核酸包括与该RNA成分互补的核酸序列；具有RNA成分保守核苷酸残基的核酸；与RNA成分的核苷酸序列相关但明显不同的核酸序列，其以有用方式与RNA成分相互作用或与人端粒酶蛋白质成分的RNA成分编码基因相互作用；与RNA成分或RNA成分基因没有显著序列同源性或互补性的核酸，但其以所需方式或有用方式作用于RNA成分。正如下面更详细的描述，本发明核酸包括DNA和RNA分子及其经修饰的类似物，服务于多种目的。
因此，本发明的一种核酸为反义寡核苷酸，能在体内或体外用于抑制哺乳动物端粒酶，例如人端粒酶的活性。这种寡核苷酸能以多种方式阻断端粒酶活性，包括通过抑制端粒酶基因的转录(例如通过三股螺旋的形成)或通过与端粒酶RNA成分结合，这种结合方式能防止功能核糖核蛋白端粒酶装配或者一旦装配成端粒酶复合物，也能防止RNA成分用作端粒DNA.合成的模板。通常根据作用方式，本发明的这些寡核苷酸包括一种约10至25至200或更多核苷酸的特定序列，与端粒酶RNA成分或端粒酶RNA成分的基因中的一种特定核苷酸序列相同或者互补。
本发明的另一种类型的核酸是能够特异性切割哺乳动物端粒酶RNA成分的核酶，能使端粒酶失活。本发明再一种类型的核酸是与哺乳动物端粒酶RNA成分特异结合的探针或引物，因此它能被用于检测样品中端粒酶的存在。最后，本发明核酸包括生产本发明核酸的重组表达质粒。一种该质粒是用作人基因疗法的质粒或用于小鼠、大鼠、中国仓鼠、和牛或其它哺乳动物实验模型中的质粒。用于人基因疗法或动物模型的本发明质粒具有多种类型，不仅包括那些编码反义寡核苷酸或核酶的质粒，还包括那些驱使哺乳动物端粒酶RNA成分表达的质粒，或驱使缺失或改变(突变)的人、小鼠、大鼠、中国仓鼠或牛端粒酶RNA或其基因(或与这些RNA成分同源的其它物种RNA和/或当与适合的端粒酶蛋白质成分结合时编码功能RNA的序列)表达的质粒。
另一方面，本发明提供了与一个细胞或细胞群中端粒酶活性相关的疾病的治疗方法，通过将这些细胞与治疗有效量的药剂相接触，改变细胞中端粒酶活性。这种药剂包括端粒酶RNA成分编码核酸、形成三股螺旋的寡核苷酸、反义寡核苷酸、核酶以及上述用于人基因疗法或哺乳动物模型的质粒。在有关方面，本发明提供了包括这些治疗剂及可药用载体或盐的药物组合物。
第三，本发明提供了确定人端粒酶、鼠端粒酶、端粒酶中RNA成分的水平、量或是否存在的诊断方法，或确定细胞、细胞群或组织样品、或任一种前述提取物中端粒酶活性的方法。在有关方面，本发明提供了这种方法所用的试剂(包括上述的引物和探针)，可任选地将这些试剂装入试剂盒，并附有使用该试剂盒进行诊断的操作说明。
第四，本发明提供了重组端粒酶制剂和生产这种制剂的方法。因此，本发明提供了一种重组人、小鼠、大鼠、中国仓鼠、牛或其它哺乳动物端粒酶，其包括与本发明重组RNA成分结合的这些端粒酶的蛋白质成分和来自另一种哺乳动物的RNA成分与人、小鼠、大鼠、中国仓鼠、牛基本同源的端粒酶或其它端粒酶的蛋白质成分。本发明的这种重组RNA成分分子包括那些由重组体宿主细胞生产的通过一个或者多个碱基取代、缺失或插入而与天然存在RNA成分分子明显不同的RNA，以及与天然存在RNA成分分子相同的RNA。生产这种重组端粒酶分子的方法包括，使用一个编码本发明RNA成分分子的重组表达载体转化能表达端粒酶蛋白成分的真核宿主细胞，然后在一定条件下培养这种由所述载体转化的宿主细胞，由此蛋白成分和RNA成分被表达并装配形成一活性端粒酶分子，能在染色体DNA的端粒上添加序列(与天然端粒酶所加序列不必相同)。
第五，本发明提供了人端粒酶蛋白成分的纯化方法以及来自另一种哺乳动物的RNA成分与人端粒酶RNA成分基本同源的端粒酶蛋白成分的纯化方法。本发明还提供了编码这种蛋白成分的核酸的分离和鉴别方法。在有关方面，本发明提供了纯化的人、小鼠、大鼠、中国仓鼠或牛端粒酶，和其RNA成分与人、小鼠、大鼠、中国仓鼠、牛的RNA成分编码区基本同源的哺乳动物的纯化端粒酶或其它哺乳动物纯化端粒酶，还提供了编码一种或多种这些端粒酶制剂的纯化的核酸。本发明还提供了药物组合物，包括作为活性成分的端粒酶蛋白成分或编码端粒酶蛋白成分的核酸或与该核酸相作用的核酸。
第六，本发明提供了一种哺乳动物模型系统，通过该模型可进行端粒调节作用的体内研究。小鼠、大鼠或仓鼠模型，特别是昏迷小鼠，提供了一个良好的研究系统，其中能直接测试端粒酶在老化和永生化中的作用。改变的端粒酶和影响端粒酶活性的化合物能用于测定端粒酶在细胞存活和机体发育中的作用。
本发明的其它特点和优点可见于以下的附图，最佳实施方案，实施例和权利要求中。
附图的简要说明
图1A-1B是编码人端粒酶RNA成分的DNA序列(SEQ IDNO：1)。
图2是人端粒酶RNA成分的RNA序列(SEQ ID NO：2)。
图3是编码小鼠端粒酶RNA成分的DNA序列(SEQ ID NO：3)。
图4是小鼠端粒酶RNA成分的RNA序列(SEQ ID NO：4)。
图5是小鼠和人的包含端粒酶RNA成分的核糖核苷酸序列的比较，每一编码区起始于所示的+1位置。
图6是用于消除小鼠端粒酶RNA成分的靶构建物图。
图7A-7B是编码人、小鼠、大鼠(SEQ ID NO：5)、中国仓鼠(SEQ ID NO：43)和牛(SEQ ID NO：44)端粒酶RNA成分的DNA序列的比较。
图8A-8E表示人、小鼠、大鼠、中国仓鼠和牛端粒酶RNA成分折叠后推断出的二级结构。
发明的技术方案
本发明提供了与核糖核蛋白哺乳动物端粒酶相关的方法、试剂和药物组合物。本发明部分源于哺乳动物端粒酶RNA成分的克隆和分离，特别是人、小鼠、大鼠、中国仓鼠和牛端粒酶及其RNA成分的基因。人和小鼠端粒酶的RNA成分核苷酸序列分别示于图2和图4。大鼠、中国仓鼠和牛端粒酶RNA成分序列示于图7A-7B。为方便起见，所示序列均使用核苷酸的标准缩写(A是腺嘌呤，G为鸟嘌呤，C为胞嘧啶，T为胸腺嘧啶，U为尿嘧啶核苷)。人和小鼠端粒酶RNA基因的DNA序列分别示于图1A-1B和图3。
图2、图4和图7中的序列所示方向为5’-3’，并用数字编号以供参考。人RNA成分(图2)的模板序列被认为位于核苷酸50-60所限定的区域内(5’-CUAACCCUAAC-3′)，其与约1/3和2/3端粒重复单位组成的端粒序列互补。
这些序列源自RNA成分的cDNA克隆和基因组克隆。当RNA成分首先从相应的人或小鼠基因转录时，所产生的至少一些RNA转录物长度远远多于所示-560和-535核苷酸序列，事实上可包括1000多个核苷酸。但是，从图中所示的由-560和-535核苷酸序列组成的转录物能装配完整功能的端粒酶分子。
天然人端粒酶RNA成分的3’-末端被认为位于上述人序列514-559核苷酸所限定的区域内；一项测定实验提示3’-末端可能是位于第538位核苷酸的U残基。上述所示包括少于人序列1-559核苷酸的重组RNA成分分子也可用于制备活性端粒酶。
人端粒酶的RNA成分
人端粒酶RNA成分的克隆需要一种新方法，包括下述阴性选择和阳性选择循环。但起初所作的努力是使用反转录和所谓“5’-RACE PCR扩增”克隆cDNA末端的方法来克隆RNA成分。使用一种与人端粒DNA单链部分中重复单元相同的引物引发反转录反应，因此该引物与被认为存在于人端粒酶RNA成分中的序列互补。在该引物的5’-末端还含有与限制性酶识别位点相应的序列。但是，当通过凝胶电泳及对凝胶中存在的核酸区带进行的核苷酸序列分析来检测反转录反应和PCR扩增生产的cDNA时，仅检测出核糖体RNA序列。使用嵌套引物变换这种5′-RACE途径时，同样会遇到类似的问题。
成功的克隆始于由人端粒酶纯化制剂以及具有人端粒酶活性的细胞系和不具有可测的人端粒酶活性的细胞系制备cDNA。制备cDNA的方法在下述实施例1中有详细描述。使用了两步阴性选择和连续阳性选择循环并与来自于两种人细胞系的cDNA制剂相结合，以降低非所需序列的浓度并提高所需RNA成分序列的浓度。
阴性选择步骤包括从不具有可测出端粒酶活性的人细胞系制备的cDNA制备生物素化的PCR产品。使该生物素化的PCR产品失活，然后将其在含极低浓度非生物素化PCR产品(生物素化产品：非生物素化产品为100∶1)的溶液中进行杂交，其中非生物素化PCR由具有端粒酶活性的人细胞系制备的cDNA制备。由于端粒酶阴性细胞系可能会含有一些少量的RNA成分，所以进行杂交步骤以排除或针对仅在两种细胞系中充分表达的RNA进行选择。当杂交到达选定为使大部分充分表达的RNA发出杂交的Cot，之后，通过与链亲和素化磁性颗粒结合除去非所需物质；收集颗粒后残存的上清液中含有所需的人端粒酶RNA成分的cDNA。cDNA的PCR扩增方法描述于下面的实施例2。
通过阳性选择的连续循环，将这一物质进一步富集使富含所需cDNA。在阳性选择步骤中，使人端粒酶RNA成分中预言模板序列互补的生物素化探针与PCR产品杂交，其中PCR产品来自具有端粒酶活性人细胞系所得的PCR扩增cDNA的富集(通过阴性选择)样品。杂交后，将探针/靶复合体与亲和素化的磁性颗粒结合，然后收集这些颗粒，并用作下一步阳性选择循环中富含RNA成分序列的核酸来源。阳性选择方法详细描述于下面的实施例3和4。
阳性选择第3次循环之后，通过凝胶电泳分离扩增产品，并移去相应于核酸大小为200bp大小的凝胶部分。然后从凝胶部分中洗脱核酸并以PCR扩增。用限制性酶Not 1消化该PCR扩增产品，再通过连接将其插入质粒pBluescriptIISK+的Not 1位点，该质粒可购自Stratagene。所得质粒被转化入E.Coli宿主细胞，并分离出个体菌落，将其用作进一步分析和DNA测序的核酸来源。将这些个体菌落生长于96-孔微滴板的孔中，然后将该板用作主平板，制备来自平板中菌落的DNA印迹并与含端粒重复序列的由此与人端粒酶RNA成分互补的探针杂交。然后通过DNA测序和各种其它试验分析该试验中大量的阳性克隆。
上面所说的其它试验包括如下：(1)测定与推断RNA成分互补的反义寡核苷酸是否能抑制已知含有端粒酶的人细胞的提取物中的端粒酶活性(Greider，C.W.和E.H.Blackburn(1989)如前所述)；(2)确定特异于推断的RNA成分克隆序列的PCR引物是否能用于扩增端粒酶样品中存在的核酸，并且如果有观察到的产品，其是否能在端粒酶纯化过程中示踪端粒酶活性(上述Greider，C.W.和E.H.Blackburn(1987))；和(3)确定特异于推断的RNA成分克隆序列的PCR引物是否能扩增来自已知端粒酶活性高的细胞(即肿瘤细胞)细胞提取物中的核酸，核酸丰度高于来自已知没有端粒酶活性或仅有少量端粒酶活性的细胞细胞提取物。表示为质粒pGRN 7的一个克隆在这些试验中产生与确定该质粒含相应于人端粒酶RNA成分的cDNA一致的结果。
因此，与推断的pGRN 7的RNA成分序列相应的反义寡核苷酸表现了在体外对端粒酶活性性的抑制。因此，当通过下述方法从细胞提取物中纯化端粒酶时，即(1)DEAE色谱；(2)Sephadex S300色谱；和(3)甘油梯度、SP琼脂糖分离或苯基琼脂糖分离并收集级分，特异于推断的pGRN 7 RNA成分序列的PCR引物扩增一适当大小的核酸，且扩增产物的量与收集级分中观测的端粒酶活性值密切相关。最后，来自正常细胞(不具有可测出的端粒酶活性)、癌细胞(具有端粒酶活性)以及睾丸细胞(存在端粒酶活性)的细胞提取物中表现出具有相应量的由反转录和PCR扩增(RT-PCR)得到的PCR产品，使用的引物为pGRN 7中所含的特异于推断RNA成分。RT-PCR方法描述于下述实施例5和6。
上述结果提供了人端粒酶RNA成分已被克隆的确凿证据。因此，正如下面实施例7中所述，质粒pGRN 7被用于从人细胞系中分离RNA成分的基因组克隆。从插入购自Stratagene的λ载体FIXII的人DNA基因组文库中鉴别出该基因组克隆并分离出来。含RNA成分基因序列的所需克隆包括一个-15KB的插入片段并且被称为克隆28-1。这一克隆已被保存于美国典型培养物收集中心，保藏号为ATCC No.75925。再从这一噬菌体中进行各种限制性片段的亚克隆及测序。该基因也已被定位于染色体3的q臂的远端。从SauIIIA 1限制性酶识别位点-15kb插入片段的一端至内部HindIII限制性酶识别位点所得的序列信息，其包括λ克隆28-1中的全部成熟的RNA成分序列以及RNA成分基因的转录控制元件，用标准脱氧核糖核苷酸缩写示于图1A-1B，显示方向为5’-3’。
RNA成分序列起始于第1459位碱基，终止于第2017位碱基。各种转录控制元件也可在序列中鉴别出。发现A/T BOX共有序列位于第1438-1444位核苷酸；PSE共有序列位于第1238-1250位核苷酸及1406-1414位核苷酸；CAAT BOX共有序列位于第1399-1406位核苷酸；SP1共有序列位于第1354-1359位核苷酸；且β-干扰素效应元件共有序列位于第1234-1245位核苷酸。
上述在人端粒酶RNA成分和RNA成分基因的克隆中构建的质粒为本发明的重要内容。这些质粒能用于生产基本纯的人端粒酶RNA成分及其基因，这也是本发明的另一重要方面。此外，本领域技术人员能认识到基本上纯的含所有或至少部分人端粒酶RNA成分的核苷酸序列的各种其它质粒，以及非质粒核酸属于本发明内容。
小鼠端粒酶RNA成分
通过5步不同的柱色谱分离高度纯化的鼠端粒酶级份，开始端粒酶鼠RNA成分的克隆。这些活性级份中高度富集RNA成分，并为克隆程序提供必需的核糖核酶(ribonucleoenzyme)物质。克隆方法详细描述于实施例9-13，小鼠端粒酶RNA成分基因示于图3。该RNA成分序列始于第531位碱基，止于第1065位碱基。
与端粒酶共纯化的小RNA被测序，鉴别出那些具有模板区CTAACCCTAA的RNA，作为端粒酶延伸中有效的RNA的靶。在克隆人端粒酶RNA成分中产生的潜在RNA也表现有端粒酶成分的性质。使用人RNA成分的基因组克隆，从在中等严格条件下与人探针杂交的λ文库中鉴别出小鼠基因组片段。使用含500bp人端粒酶RNA基因的探针筛选出5当量基因组。对阳性λ噬菌体作限制性酶切图谱，四个彼此相同。与人基因杂交的克隆在Pst 1消化中的两条阳性区带被亚克隆并测序。该序列与人端粒酶RNA编码区的550个核苷酸具有64％的等同性，表明该克隆可能是小鼠端粒酶RNA基因。编码区外序列等同性降至45％。人编码区和推断出的小鼠RNA间的序列等同性明显低于人鼠间其它小RNA基因的情况。U-RNA类范围为U6 100％等同性至U7 85％等同性。小鼠与人之间的RNA酶P RNA和MRP RNA的等同性分别为86％和78％。因此，在所鉴别的哺乳动物小的功能RNA中人和鼠间的端粒酶RNA是保守性最差。在纤毛虫中也发现了这种端粒酶RNA间序列保守性水平低。见上述Lingner等人(1994)；上述Romero，D.P.和E.H.Blackbum(1991)。
人RNA的模板区在鼠序列中不绝对保守。在人RNA的有效模板中有11个核苷酸CUAACCCUAAC，而在鼠RNA中仅有9个可能的核苷酸CCUAACCCU。这种变化可能是小鼠酶相对于人酶而言持续合成能力降低的原因。见上述Prowse等(1993)。
由于人和小鼠克隆间的序列保守性水平低，所以采用了几种方法来确定鼠序列是否代表了功能端粒酶RNA。首先，当用潜在编码区检测时，高严格度条件检测的基因组Southem印迹能鉴别出一条单一区带(数据未示出)。较低严格度时会观察到若干条区带；因此，进行试验以确定所得序列是否被表达为功能RNA。采用或不采用起始的反转录酶一步，进行整个RNA的RT-PCR。使用两个引物进行起始扩增，随后用内部嵌套引物进行第二轮PCR，扩增一条预测为300bp的区带。这条区带依赖于起始的反转录酶一步，表明它是由RNA产生的，而不是低含量的杂质基因组DNA产生。此扩增产品序列包括CCTAACCCT模板，与起始基因组DNA的序列完全相匹配。
功能测试表明被克隆的序列代表了鼠端粒酶RNA成分。与端粒酶活性进行的共纯化研究(见上述Greider，C.W.和E.H.Blackbum(1987))及对反义寡核苷酸的抑制作用(见上述Greider，C.W.和E.H.Blackburn(1989))均显示出阳性结果。通过DEAE琼脂糖、精胺琼脂糖和苯基琼脂糖色谱纯化端粒酶；测定端粒酶活性，从所有级份中制备RNA。Northern分析表明，约550bp的RNA存在于这些色谱柱的活性级份中。使用甘油梯度洗脱也可使RNA与端粒酶活性共纯化。小鼠细胞中RNA的大小与人细胞中表现的相似(Villeponteau等(1995))。
使用四膜虫端粒酶进行的早期工作表明，反义寡核苷酸包含抑制端粒酶的模板，3’末端与该模板邻接的寡核苷酸被端粒酶延伸(见上述Greider，C.W.和E.H.Blackburn(1989)；Lingner等(1994))。检测相对于小鼠RNA定向的寡核苷酸对小鼠RNA的抑制作用和延伸作用。测试寡核苷酸抑制端粒酶或用作引物的能力，该寡核苷酸与包含模板区、MI-2或反3’与模板MP-1杂交的候选鼠端粒酶RNA互补。为测定抑制作用，在加入底物d(TTAGGG)3前，每个寡核苷酸与小鼠端粒酶一起预温育。在4μM或10μM时，含模板3’11个寡核苷酸的MI-2是端粒酶活性的有效抑制剂。与MP-1一起温育，或与另外二个与模板的3’杂交的寡核苷酸MP-2或MP-3一起温育，不会抑制延伸，表明不与模板交叉的寡核苷酸不会阻碍延伸。
为确定反义寡核苷酸用作底物的能力，在没有(TTAGGG)3引物时向端粒酶反应中加入每种寡核苷酸。通过加入8个残基，使寡核苷酸MP-1延伸，其3’端正好与3’RNA模板邻接，并且这些产物的加入均对RNA酶敏感。在此实验中两个对照寡核苷酸MP-2和MP-3没有被延伸。向MP-1中加入8个核苷酸与在引物上加入模板互补序列AGGGTTAG是一致的(如下所述)。
为检测反义引物抑制作用和延伸的特异性，合成了三个对照寡核苷酸(MI-3、MI-4和MI-5)。MI-4通过RNA的模板区延展MP-1寡核苷酸的RNA互补性。这种新的寡核苷酸抑制d(TTAGGG)3的延伸，因此，虽然它在3’端具有端粒序列，但它不再被用作延伸底物。
为确定MI-2抑制作用的特异性，寡核苷酸最靠近5’端的9个核苷酸的序列被改变，这样它不再与RNA互补。这一新的寡核苷酸MI-3不再抑制d(TTAGGG)3延伸；但是，由于3’端粒重复序列，它被用作延伸底物。由于寡核苷酸的3’末端具有序列TTAGG，主要产物在凝胶中迁移至所预期的引物位置+5。端粒酶被认为在具有此3’序列的引物上合成5个核苷酸GTTAG。
作为最后一个对照物，抑制性MI-2寡核苷酸的最靠近3’的9个残基被改变，这样所得的寡核苷酸(称为MI-5)不再与CCUAACCCU模板杂交。MI-5不是端粒酶底物，不抑制d(TTAGGG)3延伸。因此除去反义寡核苷酸的互补性会消除其以可预言方式与端粒酶相互作用的能力。为确定MI-2和MI-4的抑制作用效率，在加入d(TTAGGG)3之前，将端粒酶与浓度逐渐减少的每种反义寡核苷酸预温育，然后用于延伸测试。在0.2μM两种寡核苷酸抑制作用完全。这些数据表明克隆的RNA基因是小鼠端粒酶的功能部分。
小鼠和非洲爪蟾属(Xenopus)端粒酶RNA在延伸过程中主要产生一条带。解离位置已作出图谱在序列TTAG的第一个G残基(Mantell，L.L.和C.W.Greider(1994)；EMBO J.13：1211-3217；上述Prowse等人(1993))。为确定加在MP-1寡核苷酸上的序列，在延伸反应中用双脱氧TTP取代脱氧TTP。在32P-dGTP、dATP和dTTP或32P-dGTP、dATP和ddTPP存在时进行端粒酶反应。dTTP存在时使用引物(TTAGGG)3，观察到在引物+4处典型的主要区带(见上述Prowse等人(1993))。当ddTTP被取代时，由于在标记32P-dGTP加入前dTMP的掺入，所有掺入作用丧失。因此，没有标记产物产生。使用MP-1，当加入ddTTP时，带有dTTP的8核苷酸标记产物大小减为5核苷酸。再者，这与在引物3’末端合成AGGGTTAG是一致的；以ddT终止的链抑制最后TAG序列的加入。
如果复制小鼠RNA的整个潜在模板区，CCUAACCCU，引物转运发生在模板末端，则在重复序列d(TTAGGG)的第2个G残基处会出现暂停。见上述Lingner等人(1994)；Greider，C.W.和E.H.Blackburn(1989)。使用变换的序列引物寡核苷酸，人和小鼠端粒酶会在序列第1个G处暂停或解离。见上述Prowse等人(1993)；Morin，G.B.(1989)。这些上述的数据和反义寡核苷酸的延伸表明，存在于小鼠而不存在于人模板区的最靠近5’端的C不用作小鼠RNA成分中的模板。这一点与Stylonichia端粒酶RNA模板的最靠近5’端的C的情况相似，其显然也不作为模板位置(见上述Lingner等人(1994))。类似地，当附加的C残基被加在四膜虫模板区的最靠近5’端时，该额外的C残基不被掺入反应产物(Autexier，C.和C.W.Greider(1994)未公开数据)，表明存在一种作用机理，确定端粒酶RNA中模板序列的边界。
引物延伸和RT-PCR被用于鉴定小鼠RNA的5’端。Northem分析表明小鼠和人端粒酶RNA大小相似。从整个小鼠RNA进行的引物延伸产生两条明显不同的带，一条作图谱比人5’端长20个核苷酸，一条作图谱比人5’端短15个核苷酸。为确定RNA延伸是否超出人5’端图谱位置，在RT-PCR反应中使用针对该序列的寡核苷酸。用随机六聚物作为引物将整个RNA反转录，然后，使用一内部引物和一18个核苷酸引物扩增此cDNA，该18核苷酸引物与引物延伸鉴别出的最靠近5’区杂交。产生一条独特的450核苷酸带，使用内部嵌套引物将该产物进一步扩增，又会产生200核苷酸的正确大小的产物。克隆该产物，相应于基因组序列的序列示于图4。这表明RNA起始于序列5’CUCGACC，在图5的小鼠序列中指示为+1。还未确定人和小鼠端粒酶RNA起始位点的不同是否具有功能意义。在图5中，人和小鼠RNA序列间保守的核糖核苷酸残基被框起来，模板区被框起来涂上灰色使其突出明显。
在端粒酶活性水平各不相同的细胞系和组织中测定RNA的表达。原始Mus spretus成纤维细胞缺乏可测出的端粒酶活性，端粒缩短，与人细胞中所发现的情况相似，而永生成纤维细胞具有端粒酶活性。Northern分析表明，永生成纤维细胞表达550核苷酸RNA，而在没有端粒酶活性的原始细胞中没有测出此RNA。相似地，存在于小鼠组织中的RNA水平与端粒酶活性水平一致。在具高水平端粒酶活性的睾丸和肝中检测出RNA。此外，脾中RNA水平高。由于脾粗提取物中抑制剂的存在，虽然相对于肝和睾丸的相对端粒酶活性水平未知，但在脾中存在端粒酶活性。
总之，对于本发明核酸及含这些核酸的制剂，本领域技术人员可知，本发明核酸包括DNA和RNA分子，以及其合成的、非天然存在的类似物和脱氧核糖核苷酸、核糖核苷酸杂聚物和/或其类似物。本发明具体的核酸或核酸类似物的组成物取决于使用该材料的目的及该材料被放置的环境。已设计出修饰或合成的非天然存在的核苷酸服务于各种目的，并在各种环境中保持稳定，如本领域所熟知的存在核酸的环境。与天然存在的核苷酸相比，与天然存在的核糖核苷酸或脱氧核糖核苷酸相比，修饰的或合成的非天然核苷酸在核苷酸的糖类(糖)、磷酸酯链或碱基部分不同，或在某些情况下可能还含有非核苷酸碱基(或根本没有碱基)。参见Arnold等人，PCT专利公布No.WO 89/02439，题目为“用于核苷酸探针的非核苷酸连接剂”，此处引作参考。
正是由于本发明核酸可包括广范围的各种核苷酸，这些核苷酸也可用于多种功能。RNA探针或引物，特别是那些由包含SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3之间保守序列的DNA编码的含约20至200或更多个脱氧核苷酸的探针或引物，能用于探测其它物种端粒酶RNA成分，抑制或增强端粒酶活性，如下所述。DNA探针或引物，包含约20至200或更多个脱氧核糖核苷酸，包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3间保守序列以及在中等严格条件下与这些保守序列杂交(Ausubel等人(1989)，CurrentProtocols in Molecular Biology，John Wiley和Sons，NY)的DNA序列，其也可用于鉴别、诊断、测定和治疗目的。该探针或引物可包括连续的或不连续的存在于天然RNA成分中的核苷酸或编码这些成分的DNA中的核苷酸。特别是RNA和DNA探针可用于鉴别其它哺乳动物细胞中的端粒酶和端粒酶活性。基本上与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3间保守序列同源的RNA序列，或中度严格条件下与这些保守序列杂交的RNA序列，也包括在本发明范围内。
本发明另一种特别有用的核酸是反义寡核苷酸，其能在体内或体外抑制人或另一种哺乳动物端粒酶活性。反义寡核苷酸包含一个特异序列，其含约10至约25至200或更多个(即如果需要，大到足以形成稳定的双螺旋，但又小到足以根据传递方式在体内给药)核苷酸，与哺乳动物端粒酶RNA成分中特异核苷酸序列互补。这种寡核苷酸的作用机理包括RNA成分的结合，以便抑制功能核糖核蛋白端粒酶的装配或抑制RNA成分用作端粒DNA合成的模板。
本发明描述的体内和/或体外用于抑制端粒酶活性的反义寡核苷酸包括上述与确定克隆pGRN 7是否包含人端粒酶RNA成分的cDNA的试验相关的寡核苷酸。三种这样的寡核苷酸被合成为2’-O-甲基RNA寡核苷酸，其比未修饰的RNA寡核苷酸更能抵抗水解，并且正如上述其用于证明体外抑制端粒酶活性。每个这种O-甲基RNA寡核苷酸序列如下所示。
T3  5’-CUCAGUUAGGGUUAGACAAA-3’    (SEQ ID NO：6)
P3  5’-CGCCCUUCUCAGUUAGGGUUAG-3’  (SEQ ID NO：7)
TA3 5’-GGCGCCUACGCCCUUCUCAGUU-3’  (SEQ ID NO：8)
这些寡核苷酸也能用于抑制人细胞中端粒酶活性。
本领域技术人员可知，本发明提供了多种能抑制端粒酶活性的反义寡核苷酸。本发明另一个有用的反义寡核苷酸是寡核苷酸Tel-AU，其具有序列5’-CAGGCCCACCCTCCGCAACC-3’(SEQ ID NO：9)，且与本发明任一反义寡核苷酸一样，能使用硫代磷酸核苷酸、手性甲基膦酸酯、天然存在的核苷酸或其混合物合成此寡核苷酸，以获得稳定性和所需Tm值。本领域技术人员可知，各种修饰的核苷酸类似物，如O-甲基核糖核苷酸、硫代磷酸苷酸和甲基硫代磷酸核苷酸能用来生产本发明核酸，比用天然存在的核苷酸生产的核酸具有更多所需性质(即抗核酸酶、结合紧密等)。使寡核苷酸能抗核酸酶的其它技术包括那些PCT专利公布No.94/12633中所述技术。
此外，对于本发明反义寡核苷酸，可构建与在折叠的RNA成分或该RNA成分基因中的双螺旋核酸结合的寡核苷酸，形成一含三股螺旋的或三螺旋核酸以抑制端粒酶活性。使用形成三股螺旋的碱基配对原则和RNA成分的核苷酸序列，构建本发明的这种寡核苷酸。这种寡核苷酸能以多种方式阻断端粒酶活性，包括抑制端粒酶基因的转录或以一种方式与端粒酶RNA成分的双螺旋区结合，防止RNA成分形成功能核糖核蛋白端粒酶或成为端粒DNA合成所用的模板。通常，依据作用方式，本发明形成三股螺旋的寡核苷酸包含一个特异性序列，从约10至约25至200或更多个(即如果需要大到足以形成稳定的三股螺旋，但依据传递方式小到足以在体内给药)核苷酸，与端粒酶RNA成分或端粒酶RNA成分基因中的一个特异序列“互补”(在此上下文中，互补是指能形成稳定的三股螺旋)。
除本发明反义寡核苷酸和形成三股螺旋的寡核苷酸外，与人端粒酶或另一种哺乳动物端粒酶的至少一部RNA成分序列相同的“有义”寡核苷酸也能用于抑制端粒酶活性。本发明这种寡核苷酸的特征在于，含有(1)少于形成功能端粒酶必需的RNA成分全序列或(2)形成功能端粒酶必需的RNA成分全序列以及取代或插入的一个或多个核苷酸，使所得RNA失去功能。在这两种情况中，由于“突变”的RNA成分与端粒酶蛋白质成分结合形成非活性端粒酶分子，会观察到端粒酶活性的抑制。由此这种寡核苷酸的作用机理包括非功能核糖核蛋白端粒酶的装配或抑制功能核糖核蛋白端粒酶装配。本发明这种类型的有义寡核苷酸通常包括一个特异性序列，具有约20、50、200、400、500或更多个核苷酸，与端粒酶RNA成分中一个特异性核苷酸序列相同。
因此，本发明另一个寡核苷酸包含一个人或另一种哺乳动物端粒酶RNA成分的改变或突变序列。Yu等(1990)Nature 344：126表明，四膜虫端粒酶RNA成分的一种突变形式能被掺入到四膜虫细胞的端粒酶中，这种掺入对那些细胞具有破坏性效果。人或另一种哺乳动物端粒酶RNA成分的突变形式的掺入对具有端粒酶活性的人或哺乳动物细胞也可能具有类似的效果，而不影响没有端粒酶活性的正常细胞。这种突变形式包括那些其中序列5’-CTAACCCTA-3’突变为5’-CAAACCCAA-3’、5’-CCAACCCCAA-3’、或5’-CTCACCCTCA-3’的形式。每一个这种改变的RNA成分序列改变了插入在染色体DNA中的端粒重复单元，因此而影响染色体结构和功能。可通过端粒DNA或一个延伸的端粒酶底物的限制酶消化作用设计这种含有限制酶识别位点的寡核苷酸，用于诊断改变的RNA成分存在的方法中。
为说明本发明的这个方面，使用含有来自λ克隆28-1(见下述实施例7)的2.5kb HindIII-SacI片段和SV40复制起点(但没有起动子活性)的质粒(称为pGRN 33，得自美国典型培养物中心，保藏号ATCCNo.75926)，进行位点特异诱变。所得质粒，称为pGRN 34(含5’-CAACCCAA-3’)、pGRN 36(含5’-CCAACCCCAA-3’)和pGRN 37(含5’-CTCACCCTCA-3’)，将其转化入真核宿主细胞(一种表达SV40大T抗原的293-衍化的细胞系)，使用来自转化体的细胞提取物进行端粒酶测定。
测定表明，细胞中的端粒酶活性导致含改变序列的核酸的形成，表明该基因组克隆含一个功能RNA成分基因，质粒含改变的但功能化RNA成分基因。这些结果说明了本发明如何提供重组端粒酶制剂及生产这种制剂的方法。本发明提供了与本发明重组RNA成分功能相关的重组人或哺乳动物端粒酶。本发明这些重组RNA成分分子包括那些通过一个或多个碱基取代、缺失或插入与天然存在RNA成分分子不同的RNA成分，以及与重组宿主细胞生产的天然存在RNA成分分子相同的RNA成分分子。生产这种重组端粒酶分子的方法包括，在一定条件下用重组表达载体转化能表达端粒酶蛋白质成分的真核宿主细胞，由此，蛋白质成分和RNA成分被表达并装配形成一个活性端粒酶分子，能在染色体DNA端粒添加序列(不必是天然端粒酶添加的相同序列)。这种重组DNA表达载体(或质粒)的其它有用实例包括带有缺失、插入或其它使基因非功能化的修饰的含人端粒酶RNA成分基因的质粒。虽然需要高效的转化和重组系统这种质粒能特别用于基因疗法以“剔除”(knock-out)内源RNA成分基因，虽然需要高效的转化和重组系统以使受治疗细胞不可逆地死亡。
本发明称为“核酶’’的其它寡核苷酸也可用于抑制端粒酶活性。不同于上述结合RNA、DNA或端粒酶蛋白质成分的反义寡核苷酸和其它寡核苷酸，核酸不仅结合靶RNA，且能特异切割靶RNA并由此使靶RNA失活，例如人端粒酶RNA成分。这种核酶可含与端粒酶RNA互补的5’-和3’-末端序列。根据切割位点，核酶可使端粒酶失活。见上述PCT专利公布No.93/23572。本领域技术人员在观察人或小鼠端粒酶RNA成分的RNA序列时会注意到它的存在着一些有用的核酶靶位点并易被如锤头基元核酶切割。本发明描述的这种类型的人核酶包括如下核酶，其为具有所示序列的RNA分子：
1：5’-UAGGGUUACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACAAAAAAU-3’(SEQ ID NO：10)
2：5’-UUAGGGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGACAAAA-3’  (SEQ ID NO：11)
3：5’-UCUCAGUCUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAAGGGUUA-3’   (SEQ ID NO：12)
4：5’-CCCGAGACUGAUGAGUCCGUGAGGACGAAACCCGCG-3’   (SEQ ID NO：13)
可根据Sullivan等PCT专利公布No.94/02595和Draper等PCT公布No.93/23569中所述方法确定用于核酶介导的抑制端粒酶活性的其它最佳靶位点。上述两篇文献在此引为参考。正如Hu等PCT专利公布No.94/03596所述，反义和核酶功能被结合入单一寡核苷酸，此文献在这里引为参考。并且，核酶可包含一个或多个修饰的核苷酸或核苷酸间修饰的连接链，正如以上有关本发明反义寡核苷酸的说明部分所述。
因此，本发明提供了许多寡核苷酸来抑制端粒酶的活性。这些寡核苷酸可用于本发明治疗疾病的治疗方法，该方法包含给病人使用本发明治疗上有效量的端粒酶抑制剂或激活剂。可使用上面提及的共同未决的美国专利申请和PCT专利公开号93/23572中所述的测定方案测量端粒酶抑制或激活以确定按治疗上有效量传递的试剂量。如上面申请所述及上面所讨论，端粒酶活性抑制导致永生细胞致死，而端粒酶活性激活可增强细胞的复制寿命。端粒酶抑制疗法是对涉及永生细胞生长不受控制的癌症的有效治疗方法，而端粒酶激活是防止细胞衰老的有效治疗方法。传递抑制或封闭端粒酶活性的试剂，如反意寡核苷酸，三螺旋形成寡核苷酸，核酶或促使端粒酶突变RNA成分表达的质粒，可防止端粒酶作用并最终导致细胞衰老和处理的细胞发生细胞死亡。
另外，本发明提供了保证正常细胞保持致死的治疗方法；例如，可使用标准遗传工程方法修饰RNA成分，经遗传重组去掉编码该成分的全部或部分天然基因(例如，经体外诱变)。这些细胞就成为不可逆致死细胞。该方法在基因治疗中有用，其中修饰成含表达质粒的正常细胞被导入病人且希望保证癌细胞不被导入，或如果导入该细胞，那么已诱导该细胞不可逆致死。
由于端粒酶仅在肿瘤，种系和人造血系统的某些干细胞中有活性，所以端粒酶抑制疗法不影响其它正常细胞。也可采用避免端粒酶抑制剂与种系或干细胞接触的步骤，尽管这可能是不必要的。例如，由于种系细胞表达端粒酶活性，端粒酶抑制可对精子发生和精子存活力产生负影响，这表明端粒酶抑制剂可以是有效的避孕剂或绝育剂。这种避孕效果可能不是接受本发明的端粒酶抑制剂来治疗癌症的患者所需要的。在这类情况中，可用确保抑制剂仅在治疗期间产生效果的方式传递本发明的端粒酶抑制剂，以便仅对种系细胞产生短暂的负影响。
本发明的其它治疗方法则采用本发明的端粒酶RNA核酸以刺激端粒酶活性并延长复制细胞寿命。可经过将本发明的细胞的功能性重组端粒酶核糖核蛋白传递给细胞来完成这些方法。例如，核糖核蛋白可用脂质体的形式传递给细胞，或人RNA成分的基因(或具有不同调节元件的重组基因)可用于真核表达质粒(具有或不具有编码表达端粒酶蛋白质成分的序列)以激活各种正常人细胞中的端粒酶活性，后者由于端粒酶RNA成分或蛋白质成分表达的水平低而缺乏可检测的端粒酶活性。如果端粒酶RNA成分不足以刺激端粒酶活性，那么RNA成分可与表达端粒酶蛋白质成分的基因一起转染以刺激端粒酶活性。因此，本发明提供了治疗与细胞或细胞组内端粒酶活性相关之症状的方法，经过将细胞与治疗上有效量的试剂接触以改变该细胞中的端粒酶活性。
掺入了额外的端粒的RNA基因拷贝的细胞可表现出端粒酶活性增加及相关的复制寿命延长。这种疗法可对来自体内的细胞进行并随后导入宿主或可在体内进行。经过将来自体内的外源性端粒酶基因加到正常二倍体细胞中来稳定或增加端粒长度的优势包括：端粒稳定化可抑制细胞衰老并允许细胞潜在的无限扩增；可体外培养寿命延长的正常二倍体细胞用于药品试验，病毒生产或其它有用的目的。而且来自体内的各种类型的径扩增的干细胞可用于对特定疾病的细胞治疗，如上所述。
端粒稳定化也可经过防止因细胞接近临界时端粒变得相当小来抑制复制细胞中的癌症事件。在临界期，由于失去端粒帽的保护效应而产生许多基因组不稳定性。“遗传结构”重新改组时，几乎全部细胞死亡。从这一过程中出现的少数细胞是典型地具有许多基因重排的非整体，并经过表达端粒酶而在其端粒重建稳定性。如果经过保持端粒长度而防止出现临界，那么也能防止与临界相关的基因组不稳定，限制单个细胞会发生所需数目的引起metatastic癌所需的遗传突变的可能性。
人类的可作为端粒酶基因治疗的靶细胞(该疗法涉及增强靶细胞的端粒酶活性)包括但不限于造血干细胞(AIDS和化疗后)、血管内皮(心和脑血管疾病)，皮肤成纤维细胞和表皮角质细胞(伤口愈合和烧伤)，软骨细胞(关节炎)，脑星形细胞和小神经胶质细胞(Alzheimer氏疾病)，成骨细胞(骨质疏松)，视网膜细胞(眼疾病)、和胰岛细胞(I型糖尿病)。
典型地，本发明的治疗方法涉及施用在体内生理条件下发挥抑制或刺激端粒酶活性的功能且在这些条件下是稳定的寡核苷酸或药品。如上所述，修饰的核酸在建立这种稳定性及在保证寡核苷酸传递给所需组织、器官或细胞中有用。在传递用作治疗目的的寡核苷酸中有用的方法在Inouye et al.，美国专利5,272,065中描述，本文引用以供参考。
尽管寡核苷酸可作为合适药用配方的药品直接传递，但也可使用本发明的基因疗法和重组DNA表达质粒传递寡核苷酸。一种这类举例性的质粒在下面实施例8中描述。一般来说，这类质粒包含启动子及任选的用于促使寡核苷酸转录的增强子(独立于包含在启动子序列内的任何增强子)，以及提供游离基因维持或染色体整合和高水平转录的其它调节元件(如果需要的话)。以腺病毒为基础的载体常用于基因治疗并适于与本发明的试剂和方法结合使用。见PCT专利公开号94/12650；94/12649；和94/12629。用于这类目的的有用的启动子包括金属硫蛋白启动子，组成型腺病毒主要晚期启动子，地塞米松诱导的MMTV启动子，SV40启动子，MRP polIII启动子，组成型MPSV启动子，四环素诱导的CMV启动子(如人立即早期CMV启动子)，和组成型CMV启动子。基因疗法中有用的质粒可包括其它功能元件，如选择标记，鉴定区和其它基因。重组DNA表达质粒也可用于制备本发明的寡核苷酸，用于以不同于基因疗法的方式进行传递，尽管经体外化学合成制备短寡核苷酸可能更为经济。
在有关方面，本发明的特征是包括治疗上有效量的本发明的端粒酶抑制剂或端粒酶激活剂的药用组合物。本发明端粒酶抑制剂的药用组合物包括突变的人或另一哺乳动物端粒酶的RNA成分，结合相同的人或另一哺乳动物端粒酶的RNA成分或基因的反意寡核苷酸或三螺旋形成寡核苷酸，或能裂解人或另一哺乳动物端粒酶的RNA成分的核酶，或它们的组合物或其它药用上可接受的载体或盐。本发明的其它药用组合物包括端粒酶激活剂制品，如纯化的人端粒酶或端粒酶蛋白质成分的mRNA和端粒酶的RNA成分，并用于治疗有关衰老的疾病。治疗剂可以适于肠胃外、鼻内，口有或其它用药方式的配方提供。见PCT专利公开号93/23572，出处同上。
除了上述药用配方和治疗方法外，本发明还提供了诊断方法和试剂。本发明提供了用于测定细胞，细胞群体或组织样品中端粒酶RNA成分，端粒酶或端粒酶活性水平，总量或存在的诊断方法。在相关方面，本发明提供了在这类方法中有用的试剂，任选地包装进试剂盒，并配以使用该试剂盒的说明书以实施该诊断方法。
另外，特异性地结合端粒酶RNA成分的探针或引物(编码该酶之基因的任一链)可用于诊断方法以检测样品中端粒酶核酸的存在。引物和探针互补于并因此可结合于靶核酸的寡核苷酸。尽管引物和探针在序列和长度方面有区别，但首要区别特征是一个功能：引物用于在PCR扩增中启动DNA合成，而探针仅用于结合靶核酸。引物或探针的典型长度范围可从8到20到30或更多核苷酸。引物或探针也可被标记成以利于检测(即，用典型地用于该目的放射活性或荧光分子)或纯化/分离(即，常用于该目的的生物素或生物素结合蛋白)。
本发明的一个特别优选的诊断方法涉及检测取自怀疑患有癌症的病人的细胞或组织样品中的端粒酶RNA成分序列。这种方法典型地涉及在只有完全匹配(互补)的序列互相结合(杂交)的条件下将标记的探针或引物与RNA成分序列结合。在样品中与RNA结合的标记物质的检测可与端粒酶活性的存在和癌细胞的存在相联系。本发明的诊断方法在检测组织活体检查和组织切片(其中可在原位实施该方法)中端粒酶活性的存在中特别有用，典型地在使用本发明的特异性PCR引物对端粒酶RNA成分扩增后进行。
依据于引物，探针或包含端粒酶RNA成分的序列的其它核酸的长度和目的功能，本发明的表达质粒是有用的。例如，使用本发明的重组DNA表达质粒可进行人端粒酶全长RNA成分的重组生产，该表达质粒包括含有在合适启动子控制下的用于转录的RNA成分之核苷酸序列的核酸。这类质粒的宿主细胞可以是原核的或真核的，启动子和选择用来插入表达质粒的其它调节成分和选择标记取决于生产所用的宿主细胞。
完整的RNA成分基因，即：启动子(包括基因5’区的调节序列)和RNA成分编码区可用于表达人细胞中的RNA成分，包括经病毒转化永生化的人细胞或癌症。可调节RNA成分基因的启动子，然而，由于这类和其它原因，可在不同启动子控制下表达RNA成分。另一方面，RNA成分基因的启动子可独立于RNA成分编码序列使用，以表达其它目的的编码序列。例如，可经过将RNA成分基因启动子与“报告子”编码序列(如B-半乳糖苷酶或另一酶或蛋白质的编码序列，其表达易于监测)的编码序列融合研究RNA成分基因的转录调控。因此，人端粒酶RNA成分之基因的启动子和其它调节元件不仅可用于表达RNA成分，还可用于表达人端粒酶蛋白质成分，反义或其它寡核苷酸以及人细胞中其它有意的基因产物。包含人端粒的RNA成分完整基因的表达质粒对于包括基因疗法的各种目的特别有用。本领域的技术人员可认识到许多表达质粒可用于生产本发明有用的核酸且本文使用的术语“质粒”指可用于将特异性遗传信息携带进宿主细胞并将该信息保留一段时间的任何类型的核酸(来自噬菌体，病病毒，染色体等)。
如前文所述，获得包括包含或编码端粒酶RNA成分序列的纯化的核酸提供了有价值的诊断和治疗方法和试剂以及其它重要益处。本发明的一个重要益处是本发明的方法和试剂可用于从具有基本上同源于本发明的人、小鼠、大鼠、中国仓鼠或牛RNA成分编码区之RNA成分的任何其它哺乳动物种类分离端粒酶RNA成分和RNA成分的基因。短语“基本上同源”指人、小鼠、大鼠、中国仓鼠或牛RNA成分的寡核苷酸或核酸序列与另一哺乳动物种类RNA成分序列的核酸序列特异性地杂交所需的同源程度。由于这类基本上同源性，本领域的普通技术人员可使用本发明的核酸和寡核苷酸引物和探针来鉴定和分离基本上同原的序列。另外，这些保守序列可建立一个构架，从中可合成和修饰RNA成分以评价核苷酸变化对二级结构和功能的影响，以及构建新的或嵌合体哺乳动物RNA成分用于诊断和治疗用途。因此，包含SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44中5个或更多个保守序列的DNA及由该DNA编码或与其基本上同源的RNA均在本发明的范围内。
RNA探针和引物，特别是那些包含由含有SEQ ID NO：1，SEQ IDNO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44中保守序列的DNA编码的大约20至200或更多核糖核苷酸的RNA探针和引物对于检测其它种类中的端粒酶RNA成分和抑制或增强端粒酶活性有用。DNA探针和引物，特别是那些包含有SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44中保守序列的大约20至200或更多核苷酸的DNA以及在中等严格条件下与这些保守序列杂交的DNA序列也可用于鉴定、诊断、测定和治疗用途。探针或引物可包含在天然产生的RNA成分或编码该成分的DNA中连续或不连接出现的核苷酸。RNA和DNA探都可用于鉴定其它哺乳动物细胞中的端粒酶和端粒酶活性，基本上同源于SEQ ID NO：1，SEQ ID NO：3，SEQ ID NO：5，SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44中保守序列或在中等严格条件下与这些保守序列杂交的RNA序列也在本发明的范围内。
例如，可探测基因组成或cDNA文库以检测同源序列。也可使用与RNA成分序列区域相对应的引物和在较低或中等严格条件下进行PCR扩增以扩增哺乳动物种类RNA或DNA制品中特异性同源的核酸序列。经过使用这些和其它相似的技术，本行业的普通技术人员不仅易于从人或小鼠细胞中分离不同的RNA成分核酸，也能从其它哺乳动物细胞，如从灵长类，从兽医用途的哺乳动物，即绵羊、马、狗和猫及从其它啮齿类的细胞中分离同源RNA成分核酸。本申请已描述了一个实施例，其中分离并测序了小鼠RNA成分。实施例15也说明了该方法如何用于鉴定和分离大鼠、中国仓鼠和牛RNA成分的序列和灵长类RNA成分的序列。而且，包含编码人、小鼠、大鼠、中国仓鼠和牛端粒酶RNA成分中保守核糖苷酸之核苷酸序列的探针或引物(见图7A-7B)对该目的特别有用，因为它们很可能是最保守的且构成其它哺乳动物RNA成分的一部分。
本发明的试剂也允许克隆和分离以前不能获得的编码人及其它哺乳动物端粒酶蛋白质成分的核酸。这些核酸的获取补充了由包含人或其它哺乳动物端粒酶RNA成分之核酸序列的核酸所提供的益处。例如，如上所述，在某些情况下，经过使用人端粒酶蛋白质成分的纯化制品和经过获取其编码核酸可提高本发明的治疗效益。编码人端粒酶RNA成分的本发明的核酸也可用于分离编码人端粒酶蛋白质成分的核酸以获得效益。因此，本发明提供了分离和纯化人端粒酶蛋白质成分的方法以及鉴定和分离编码人端粒酶蛋白质成分之核酸的方法。在有关方面，本发明提供了纯化的人端粒酶，编码人端粒酶蛋白质成分的纯化的核酸，人端粒酶蛋白质成分的重组表达质粒。本发明还提供了包含人端粒酶蛋白质成分或编码该蛋白质成分或与编码该蛋白质成分之核酸相互作用(如反义寡核苷酸，三螺旋形成寡核苷酸，核糖酶或上述任一物质的重组DNA表达质粒)的核酸作为活性成分的药用组合物。
人或其它哺乳动物端粒酶的克隆的RNA成分可用于鉴定和克隆编码核糖核蛋白端粒酶蛋白质成分的核酸。可采用一些不同的方法实现蛋白质成分的鉴定和克隆。例如，可使用下面任一物质作为酶或部分变性酶的亲和配体进行亲和捕获：(1)互补于RNA成分的核苷酸序列来结合完整酶的RNA成分；或(2)RNA成分来结合部分或完全变性酶的蛋白质成分。配体可固定于固相支持物上或经化学修饰(如生物素化)用于随后固定于支持物上。与含人端粒酶的细胞提取物接触，接着洗涤并洗脱结合于支持物上的端粒酶可提供高度纯化的端粒酶。然后可任选进一步纯化蛋白质成分或经蛋白质测序直接分析。测定的蛋白质序列可用于制备引物和探针以及克隆cDNA或在包含编码端粒酶蛋白质成分之核酸的基因组文库中鉴定某一克隆。
使用改造的RNA成分进行的端粒酶亲和捕获也可使用体外转录的端粒酶RNA和端粒酶活性重建系统进行。见Autexier，C.和C.W.Greider(1994)，Genes & Development 8：563-575，本文引用以供参考。RNA改造成含有一个标记，类似于蛋白质的抗原决定基标记。标记可以是RNA序列，可获得与其牢固结合的配体，例如，RNA序列特异性抗体，序列特异性核酸结合蛋白质或牢固结合特异性RNA序列的有机染料。端粒酶对标记序列的耐受性和位置可使用标准方法测试。改变的RNA成分的合成和该方法的重建步骤也可在体内进行。然后，可使用RNA标记的固相配体的亲和捕获来分离该酶。
表达筛选也可用于分离端粒酶的蛋白质成分。在该方法中，可用标记端粒酶RNA筛选cDNA表达文库，可鉴定编码特异性地结合端粒酶RNA之蛋白质的cDNA。使用翻译抑制的分子遗传研究也可用于分离编码端粒酶蛋白质成分的核酸。在该方法中，端粒酶RNA序列可与选择标记上游融合。当在合适的系统中表达时，选择标记发挥功能。当编码端粒酶RNA结合蛋白质的cDNA被表达时，蛋白质与其识别序列结合，从而抑制选择标记的翻译，从而允许鉴定编码该蛋白质的克隆。在本方法的另一实施方案中，选择标记之翻译的抑制允许转化的细胞生长。可采用的其它系统包括在PCT专利申请号WO94/10300中所述的“相互作用标记系统”；在Li and Herskowitz(1993)Science 262：1870-1874，和Zervos，et al.(1993)Cell 27：223-232描述的“一杂交”系统；和可从Clontech买到的“二杂交”系统。
用于检测特异性结合蛋白质和活性的端粒酶RNA结合或端粒酶活性试验可用于帮助端粒酶的纯化和编码该酶的蛋白质成分的核酸的鉴定。例如，包含RNA成分序列的核酸可用作亲和试剂以分离，鉴定和纯化肽，蛋白质或特异性地与在RNA成分中所含的序列结合的其它化合物，如人端粒酶的蛋白质成分。还存在着其它一些方式，包括凝胶移位，滤膜结合，足迹法，Northwestern(蛋白质印迹的RNA探针)和光交联以检测这种结合并分离与RNA成分特异性结合的成分。这些试验或用于鉴定结合蛋白质，示踪结合蛋白质的纯化，鉴定RNA结合位点，测定结合蛋白质的分子大小，标记蛋白质用于制备分离，和用于随后的为产生抗体而进行的动物免疫以获得抗体并用于分离该蛋白质或在偶联的转录/翻译系统中鉴定编码蛋白质的核酸。
小鼠、大鼠或中国仓鼠RNA成分具有许多其它的用途。与人RNA成分一样，它们可用于制备高品质的转基因动物用于筛选和试验调节端粒酶活性的药品。
例如，经过使用质粒，可失效RNA成分基因或用Mus muculus胚胎干细胞的重组可诱导基因代替天然RNA成分基因并随后产生在作为研究癌症，或与老化或衰老有关的疾病之模型或试验系统中有用的转基因小鼠。缺乏端粒酶的小鼠和小鼠细胞的产生使直接测定端粒酶抑制剂的效力成为可能。另外，可在已去掉特异性靶的动物模型中测定端粒酶抑制剂的毒性。因此，可在小鼠模型中揭示这类抑制剂的任何副作用。
开始用两个缺失的端粒酶等位基因之一产生失效小鼠。作为用于该目的的失效质粒的一个例子，可使用标准克隆方法构建质粒载体(图6)。Sambrook，et all.(1989)出处同上。在该质粒中，删除了全部端粒酶RNA基因并用细菌新霉素基因(neo)取代。小鼠端粒酶RNA基因组区域的限制性图谱在图6中显示，还显示了克隆进失效载体的部分。该质粒可用于从许多Mus musculus ES细胞株中产生失效小鼠。
小鼠模型系统也可用于研究哺乳动物各端粒酶的调节和端粒的长度。与人细胞相似，小鼠成纤维细胞在生长期间不显示端粒酶活性而端粒长度减少，直至培养物通过临界，此时检测到端粒酶活性而端粒长度稳定。而且，单个成年小鼠组织的端粒长度在组织之间有区别。例如，精巢端粒长度明显比其它组织长，这表明发育调控的端粒长度增加可能在出生后出现。因此小鼠提供了一个极好的系统，在其中可直接试验端粒酶在老化和永生化中的作用，因为可在体内测定改变的端粒酶对细胞活力和抗体发育的影响。
该系统和另一哺乳动物系统可用于测定治疗和药用化合物对端粒酶活性的影响。可筛选针对端粒酶活性的抗端粒酶组合物，包括抗体的效力和副作用。
通过阅读本说明书，对本领域的技术人员而言为显而易见的是本发明提供了涉及人或哺乳动物端粒酶的有用试剂及各种有用的治疗和诊断方法和模型系统。上面必要性的描述提供了这类方法的有限例子，它不应构成对本发明的范围的限制。从下面实施例和权利要求书可以更清楚地看到本发明的其它特征和优势。
下面实施例描述了本发明的具体方面以说明本发明并提供了对本领域的技术人员用于分离和鉴定人、小鼠、大鼠、中国仓鼠和牛端粒酶RNA成分的方法的描述。这些实施例不应构成对本发明的限制，因为这些实施例仅仅提供了在理解和实施本发明中有用的具体方法。本发明的最佳实施例
                     实施例1
              PCR可扩增的cDNA的制备
经过硫氰酸胍提取酚/氯仿提取的纯化的端粒酶馏分从293个细胞中获得RNA。在2％琼脂糖凝胶上对293个细胞的总RNA进行大小分离并分离500bp以下的RNA。
用从Bethesda Research Laboratories(BRL)获得的SuperscripyTM II逆转录酶进行第一链cDNA合成。大约0.5到1.0μg RNA与大约40ng随机引物(6聚体)在11μl总体积的水中混合。溶液在95℃加热10分钟。然后在冰上冷却5-10分钟。经离心收集变性的核酸。然后经过以所示顺序加入下面溶液重悬变性的RNA和引物混合物：4μl 5x第一链合成缓冲液；2μl 0.1M二硫苏糖醇(DTT)；1μl RNAsin(Pharmacia)；和1μl dNTP(各0.125mM，总浓度为0.5mM)。反应混合物在42℃保温1分钟，然后加入1μl(200单位)SuperscriptTM IIRTase(BRL)并混合进反应，然后在42℃保温60分钟。所得的含新合成的cDNA的反应混合物放于冰上直至进行第二链合成。
按下面进行第二链cDNA合成：将第一链cDNA合成反应混合物(从上面)的大约20μl反应混合物按所示顺序与下列成分混合：111.1μl水；16μl 10x E.coli DNA连接酶缓冲液；3μl dNTP(各2.5mM贮液)；1.5μl E.coli DNA连接酶(15单位，来自BRL)；7.7μl E.coliDNA聚合酶(40单位，来自Pharmacia)；0.7μl E.coli RNase H(BRL)。轻轻混合所得溶液并在16℃保温2小时，此时向反应管中加入1μl(10单位)的T4 DNA聚合酶并在相同温度(16℃)下继续保温5分钟。终止反应，经过用酚/氯仿提取反应两次，用乙醇沉淀核酸，离心反应混合物以沉淀核酸来收集核酸。
经离心收集的cDNA沉淀重悬于20μl TE缓冲液中并连接到由2条寡核苷酸组成的称为“NotAB”的双链寡核苷酸上(NH2是氨基封闭基团)：
Not A：5’-pATAGCGGCCGCAAGAATTCA-NH2(SEQ ID NO：14)
Not B：5’-TGAATTCTIGCGGCCGCTAT-3’(SEQ ID NO：15)经过在46.25μl水中混合50μl Not A寡核苷酸(100pmol)与50μl NotB寡核苷酸(100pmol)，在95℃加热所得的溶液5分钟，在热溶液中加入3.75μl 20x SSC缓冲液制备双链寡核苷酸。然后将含混合物的管放入含热水(温度大约为70至75℃)的烧杯中，允许温度缓慢下降到15℃以下，以便2个寡核苷酸能杂交形成双链寡核苷酸NotAB。经沉淀和离心收集所得的核酸。
双链NotAB寡核苷酸重悬于大约30μl TE缓冲液中，然后在含10μl上述cDNA制品，大约50pmol(以OD260计算)NotAB；2μl 10xT4 DNA连接酶缓冲液；1.2μl T4 DNA连接酶；0.2μl 10mM ATP；和水的总体积为20μl的反应混合物中经过在16℃培养反应混合物过夜连接到cDNA上。然后经过在65℃加热反应混合物10分钟热灭活反应。典型地，大约1至2μl所得的混合物用于PCR扩增，可扩增连接混合物10至15个循环(94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，1.5分)并用作贮液，如实施例2所述。
                   实施例2
                cDNA的PCR扩增
经过制备由5μl 10x PCR缓冲液(500mM KCL；100mM Tris，ph＝8.3和20mM MgCl2)；5-8μl dNTP(各2.5mM)；1μl Taq聚合酶(Boehringer-Mannheim)；0.1μl基因32蛋白质(Boehringer-Mannheim)；6μl Not B引物(20μM贮液)；2μl cDNA(按实施例1所述制备)并加水至50μl组成的扩增反应混合物按常规扩增cDNA。然后混合物用50至100μl矿物油覆盖，进行PCR扩增10至15个循环(94℃，45秒；60℃，45秒；72℃，1.5分钟)。扩增后，用酚/氯仿提取反应混合物，用乙醇沉淀扩增的核酸并经离心收集。然后沉淀溶于100μl TE缓冲液中以制备贮液。
                   实施例3
              循环筛选的PCR扩增
为制备循环筛选的PCR产物，按实施例2所述制备的大约1μl贮液在按实施例2所述制备的50μl PCR反应混合物中扩增，不同的是进行21-24个循环的引物退火，延伸和产物的变化。扩增后，用酚/氯仿提取反应混合物，用乙醇沉淀并离心收集。产量的估测经过取反应混合物的小等份试样进行琼脂糖凝胶电泳后用溴化乙锭染色。典型地，大约2μg的核酸产物用于循环选择，
循环选择(在实施例4中描述)后，大约1到2μl选择的“取出”产物(从20μl的总体积中)按实施例2所述进行PCR扩增，用乙醇沉淀，在制品中离心收集以便进一步循环选择。
                   实施例4
           PCR扩增的cDNA的阳性选择
为了进行用于克隆人端粒酶RNA成分的循环选择过程的阳性选择步骤，将大约2μg的PCR扩增的cDNA稀释进25μl TE缓冲液中，然后与1.25μl 20x SSC混合并将所得溶液在95℃加热3分钟。将温度降低到60℃ 5分钟并加入1μl(0.1μg/μl)R2或R4生物素化的探针。这些探针的序列如下所示。探针是O-甲基-RNA探针，所以U是O-甲基-尿苷，A是O-甲基-核糖腺嘌呤，G是O-甲基-核糖鸟嘌呤，I是肌苷。
R2：5’-UUAGGGUUAGII-生物素
R4：5’-AUUGGGUUAUII-生物素R2探针对端粒重复具有特异性，R4探针对RNase P具有特异性，它用于示踪循环选择过程的效力和效率。经过同时但分别对RNase P RNA，已知序列的分子进行循环选择，可更确信对目的分子的循环选择过程(在本例中是人端粒酶的RNA成分)进行正常。
在65℃下向混合物中加入R2或R4探针后，杂交反应混合物的温度降低至30℃，在此温度下培养混合物5分钟，然后反应混合物进一步降温到14℃，在此温度下保温60分钟。最后，混合物在4℃保温2-12小时。
将各样品(R2或R4)的全部杂交反应混合物加入400μl 4℃的0.5xSSC中，然后向管中加入冰冻的磁珠(它购自Promega并在用前经0.5xSSC预洗4次)。所得的混合物在4℃保温30分钟以保证全部结合到磁珠上。然后各反应管在磁台(Promega)上简短地在室温下保温以沉降磁珠。磁珠重悬于冷的0.5xSSC(600μl)中并放于冰上(在管中)。以这种方式用0.5xSSC洗涤样品3次。经过将磁珠重悬于100μl水中并在65℃保育2分钟，消脱核酸，然后将磁珠放回磁台进行收集。将该方法重复3次，在最后一次，将重悬的磁珠在65℃保温5分钟，然后将磁珠放在磁台上收集。合并所有100μl上清(对每个样品)并在SpeedVacTM离心机上干燥成20μl。然后PCR扩增回收的DNA以进行另一轮的扩增和选择。每次扩增后，PCR产物用酚-氯仿提取2次，乙醇沉淀并重悬于20μl TE缓冲液中。
典型地是，经琼脂糖凝胶电泳证实PCR扩增。另外，使用各种对照来监测循环选择过程。作为一个对照，PCR“臂”(限定序列的寡核苷酸，用作引物杂交位点)放于包含提供新霉素抗性基因的核酸上。所得的核酸与PCR扩增的cDNA混合并经定量PCR在每次选择中监测。作为另一对照，在RNase P选择的和端粒酶RNA成分选择的文库中都进行RNase P选择。
                   实施例5
                  RT-PCR方法
基本上按照实施例1所述的方法制备第一链cDNA。首先从含0.1至1μg RNA的各端粒酶级分中纯化RNA，典型地是，使用从300μl级分制备的1/3至1/5的RNA。将RNA与10μl 40至80ng随机6聚体混合，在95℃变性10分钟(使用热循环仪)并在冰上冷冻。将变性的RNA和6聚体加入含4μl 5x第一链合成缓冲液并补充有逆转录酶产物(RTase，购自BRL)，2μl的0.1 DTT，1μl 10mM dNTP(每种核苷)，1μl RNase抑制剂(Pharmacia)并加水至9μl总体积的反应混合物中。合并的混合物放入42℃水浴中。保温1-2分钟后，将1μlSuperscriptTM II RTase(BRL)加入混合物中。在42℃持续保温60分钟。经过在95-98℃加热管10分钟终止反应。经短期离心收集第一链cDNA，等分进新试管中，立即在干冰上冷冻并贮存于-80℃或立即使用。
                   实施例6
        用特异性引物对进行cDNA的PCR扩增
为了用放射活性标记的核苷酸进行20μl PCR反应，根据实施例5的方法制备的1μl cDNA与20pmol引物1，20pmol引物2，2.5μl的2.5 mM dNDP，5μCiα-32p-dATP，2单位的Taq聚合酶(Boehringer-Mannheim)，0.2μg T4基因32蛋白质(Boehringe4-Mannheim)，2μl10x缓冲液(500mM KCl，100mM Tris-HCl-pH8.3和20mM MgCl2)混合并加水至总体积20μl。然后向管中加入一滴矿物油。
端粒酶RNA成分克隆的PCR扩增条件是：94℃45秒，60℃ 45秒，72℃ 1.5分钟。循环次数的变化取决于用于RNA制备的纯化物质的类型，但典型地从18到25个循环。至于全部定量的RT-PCR，对待测各样品进行不同循环的一些反应以确定何时PCR扩增饱和且非线型。
对于用作对照的RNase P，PCR扩增条件是：94℃ 45秒，50℃45秒，72℃ 1.5分钟。同样，根据样品特征，循环次数范围为从15到22个循环。用于RNase P扩增的引物序列如下所示：
P3：5’-GGAAGGTCTGAGACTAG-3’(SEQ ID NO：16)
P4：5’-ATCTCCTGCCCAGTCTG-3’(SEQ ID NO：17)用这两个引物获得的PCR产物是大约110bp大小。
PCR后，将产物(5到10μl反应混合物)上样到6％天然聚丙烯酰胺凝胶上并电泳。电泳后，凝胶干燥并与PhosphorImagerTM盆接触或与放射自显影膜接触进行分析。
                   实施例7
          人端粒酶RNA成分的基因克隆
用于克隆人端粒酶RNA成分的基因的方法一般按Maniatis，et al.，Laboratory Molecular Cloning Manual所述进行。插入噬菌体λ载体FIX II的人肺成纤维细胞系统WI-38的DNA的基因组DNA文库购自Stratagene。噬菌体以每平板大约25,000噬菌斑的浓度涂布到三组15(150mm)平板上。用NZY琼脂和NZY顶级琼脂糖制备平板；用于噬菌体转化的细胞是XLlBlueMARP2细胞；转化子在37℃下生长过夜大约16小时。然后将平板在4℃冷却大约1小时，随后将噬菌斑转移到C/P尼龙环(滤纸来自Bio Rad)。重复该方法以产生转移滤膜的复制品。将滤膜(一式二份)变性，中和，在6x SSC缓冲液中平衡，进行紫外照射以便将核酸交联到滤膜上，然后在印迹纸上干燥。
在50％甲酰胺缓冲液中在37℃进行预杂交1小时。滤膜用来自克隆pGRN7的218bp放射活性标记的NotI片段探测，该片段经电泳分离后从5％聚丙烯酰胺凝胶中电洗脱分离并然后按照厂家说明用来自Boehringer-Mannheim Biochemical的缺口转移试剂盒以α-32p-dCTP进行缺口转移。每张滤膜使用大约25ng(～10μCi标记)的探针，并在50％甲酰胺杂交缓冲液中在37℃进行杂交过夜。杂交后，在室温下洗涤滤膜6次，前3次洗涤用含0.1％SDS的6x SSC进行，后三次洗涤仅用6x SSC进行。将一些两份滤膜在PhosphorImagerTM盒中首次处理检测杂交效率和信息强度后，在0.5x SSC中65℃洗涤滤膜。然后使用2个增强器筛将滤膜放在Kodak XAR5膜下并接着使膜在-70℃曝光大约100小时。
从含有噬菌体的滤膜上发射出的一个强信号后来命名为28-1，它包含人端粒酶RNA成分的基因。与滤膜上观察到的信号相对应的噬菌斑用于制备第二平板，以便培养分离的噬斑(经过用标记的pGRN 7核酸探测证实)用于大量分离噬菌体DNA。可按ATCC保存号75925从美国典型培养物收集中心获得的噬菌体28-1，它包含～15kb的插入片段并包含一些含有与pGRN 7 RNA成分序列杂交之序列的限制性片段：4.2kb EcoRI限制性酶片段；4.5kb ClaI限制性酶片段和2.5kb HindIII-SacI限制性酶片段。后一片段包含上面所示RNA成分的全长～560个核苷酸序列并据信包含RNA成分的完整基因。包含pBluescript载体中的2.5kbHindIII-SacI限制性酶片段的质粒命名为质粒pGRN 33并可从美国典型培养物中心以ATCC保存号75926获得。当人基因可能包含不同于在2.5kb片段上的序列时，这些序列可从噬菌体28-1或从其它噬菌体克隆分离并用2.5kb片段(或本发明的另一探针)探测来鉴定。
上面提到的限制性酶片段以不同的限制性酶消化物分离制备；消化产物在0.7％琼脂糖凝胶上经电泳分离，或仅对于～2.5kb片段在3％聚丙烯酰胺凝胶上分离；从凝胶上切下所需的带并经过使用GeneCleanTM试剂盒II(来自Boil01，Inc.)或经过在0.1x TBE的Spectropor#2透析管中以100V电洗脱2小时(仅对于～2.5kb片段)制备亚克隆。
将这些限制性酶片段亚克隆进来自pUC-来源质粒或来自也含有SV40复制起点(但无SV40启动子活性)的pBluescript II质粒的大肠杆菌表达/诱变质粒中。所得的质粒可用于制备改变的(突变的)RNA成分核酸以导入人类或其它真核细胞中以达到各种目的。如上面在优选实施方案描述中所述。
                   实施例8
         人端粒酶RNA成分的反义质粒
使用下列引物对经RNA成分cDNA的PCR扩增制备反义表达质粒：(1)NotB和G1，它产生小于质粒中cDNA插入片段的反义核酸；(2)NotB和R3C，它产生全长(相应于质粒中的插入片段)反义核酸。NotB的核苷酸序列在上面实施例1中给出，G1和R3引物的核苷酸序列在下面显示：
G1： 5’-GAGAAAAACAGCGCGCGGGGAGCAAAAGCA-3’(SEQ ID NO：18)
R3C：5’-GTTTGCTCTAGAATGAACGGTGGAAG-3’(SEQ ID NO：19)
PCR扩增后，扩增片段在Pml I位点克隆进～10kb表达质粒：该质粒包含提供嘌呤霉素，DHFR和潮霉素B抗性基因作选择标记，以及复制的SV40起点；定位便于人端粒酶RNA成分基因反意链表达的可诱导的人金属硫蛋白基因启动子(也可使用更强的启动子以得到更高表达水平)，和SV40晚期poly A添加位点。
所得的质粒(对NotB/G1产物命名为pGRN42，对NotB/R3C产物命名为pGRN45)经磷酸钙方法(见Maniatis，et al.，出处同上)转染进入维肉瘤细胞系HT1080。HT1080细胞在正常情况下是永生的；人端粒酶RNA成分的反义RNA表达将阻止人端粒酶RNA成分与蛋白质成分相联系，抑制活性端粒酶的形成并导致细胞致死。
                   实施例9
              小鼠端粒酶活性纯化
40升小鼠FM3A细胞在补充了10％小牛血清的DMEM培养基中悬浮生长至密度为0.5×105个细胞/ml。按(Counter，et al.(1992)EMBO J.11：1921-1929；Prowse，et al.(1993)，出处同上)所述制备S-100细胞质提取物，加入甘油和NaCl至终浓度分别为10％和0.1M。为了纯化小鼠端粒酶活性，将S-100提取物通过预先在含0.1M NaCl及一些蛋白酶抑制剂的1x hypo-缓冲液(Prowse，et al.(1993)，出处同上)中平衡的30mlDEAE-琼脂糖柱。收集后，用3倍体积的hypo-缓冲液-0.1M NaCl洗涤过柱。含增加NaCl浓度(0.2M，0.35M，0.5M和0.7M)的Hypo缓冲液用作洗脱剂，在每个盐浓度处收集100ml级分。端粒酶活性在0.35MNaCl处洗脱。然后用1x hypo缓冲液稀释含端粒酶的级分至0.1M NaCl终浓度并上样到10ml预先用1x hypo-缓冲液-0.1M NaCl平衡的精胺琼脂糖柱上。收集流出液后，按前述(Prowse，et al.(1993)，出处同上)进行洗涤和洗脱步骤；各洗脱物的体积为20ml，活性在0.35M和0.5MNaCl之间洗脱出来。含大多数端粒酶活性的较低盐级分上样到用1xhypo-缓冲液-0.1M NaCl平衡的八烷基琼脂糖柱上。按前面所述洗涤柱并且用含1％triton X-100的1x hypo-缓冲液洗脱柱，收集3ml的级分，大多数端粒酶活性在级分号3中。
20μl各级分用于按(Prowse，et al.(1993)，出处同上)所述测定端粒酶活性。经过先用1体积的酚再用1体积的酚/氯仿提取100μl各级分，接着用乙醇沉淀来从所有柱级分中制备RNA(Sambrook，et al.，(1989)Molecular Cloning-a laboratory manual，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)。在6％丙烯酰胺/尿素凝胶上以20W对RNA走电泳。将RNA电印迹到HybondN+膜上并用300bp的小鼠端粒酶RNA(mTR)基因PCR片段进行杂交。杂交在65℃下在1％BSA，200mMNaPO4，15％甲酰胺，1mM EDTA和7％SDS中进行。在65℃下在0.4x SSC，0.1％SDS中洗涤滤膜。
                   实施例10
              小鼠基因组文库筛选
用克隆进λEMBL3的D3胚胎干细胞基因组文库进行筛选。使用菌株LE392(P2)作为涂布细胞涂布3到4个基因组用作第一次筛选。人端粒酶RNA(hTR)基因的450bp PCR产物用凝胶纯化并使用高比活(3000Ci/mmol)dNTPs经六聚体标记物(Sambrook，et al.(1989)，出处同上)进行放射活性标记。用于生产探针的引物序列如下：
u3b：5’-GCCTGGAGGGGTGGTGGCCATTTTTTG-3’(SEQ ID NO：20)
ol3：5’-GATCGGCGTTCCCCCCACCAAC-3’(SEQ ID NO：21)
在中等严格缓冲液(Sambrook，et al.(1989)，出处同上，含1％BSA，500mM NaPO4，15％甲酰胺，1mM EDTA和7％SDS)中在55℃下用人序列探测小鼠文库。在55℃下在0.4x SSC和0.1％SDS中洗涤滤膜。再次涂布阳性噬菌斑并再次探测以进一步纯化阳性λ克隆。分离单个阳性噬菌体克隆后，感染50ml LE392(P2)培养物并使用λDNA纯化Qiagen试剂盒制备DNA。用不切λDNA序列的4种不同酶做各阳性克隆的限制性图谱。4个不同的克隆对每个酶具有相同的图谱，而且，各酶的相同大小的限制性片段在Southem印迹中与人探针杂交。含人RNA同源区的5kb EcoRI基因组片段克隆进KS+Bluescript载体并进一步做限制性图谱。限制性酶PstI在同源区内切割。克隆并测序两PstI片段。
                   实施例11RT-PCR方案
将FM3A细胞系的3μg，总RNA样品与8ng随机六聚体以10μl终体积混合，在95℃变性10分钟并在冰上冷却。退火混合物在与引物延伸相同条件下加入反转录混合物中。在对照管中不加入反转录酶。在50℃保温60分钟。经过在95℃加热管10分钟终止反应。各第一链cDNA的1μl等分试样用于各PCR反应。含1x PCR缓冲液的PCR反应液中加入Taq聚合物，5mM dNTP，各引物100ng，T4基因32蛋白质0.1μg和2单位的Taq聚合酶(Perkin-Elmer)。PCR扩增的条件是：94℃ 1分钟；60℃ 45秒；72℃ 1.5分钟。典型地，对第一次扩增进行35到40个循环。对于嵌套式扩增，1μl第一PCR用于第二PCR。为了进行克隆，PCR产物用酚提取，沉淀并用限制性酶NotI和SalI消化，再克隆进预先用NotI和SalI消化的KS+Bluescript中。使用的引物是：
第一扩增：
mTR5b：5’-CGTCGACTAGGGTCGAGGGCGGCTAGGCCT-3’(SEQ ID NO：22)
mTR3： 5’-GGAGGCGGCCGCAGACGTTTGATTTTTTGAGGC-3’(SEQ D NO：23)
第二次扩增：
mTR5b：(见上面)
嵌套B：5’-GGAGGCGGCCGCAGACGTTTGTTTTTTGAGGC-3’(SEQ ID NO：24)
                   实施例12
              小鼠抑制/延伸实验
用于这些实验的各寡核苷酸在10％丙烯酰胺尿素凝胶上进行凝胶纯化；切.下相应于单位长度大小的带并在水中从凝胶洗脱。洗脱后，使用NAP-5柱(Pharmacia，Inc.)进一步纯化寡核苷酸。经过在260nm下测O.D.测定各寡核苷酸的浓度。为了进行抑制和引物实验，在冰上用无DNase的RNase预处理或不处理的20μl含端粒酶活性的DEAE-琼脂糖级分预培养所示量的寡核苷酸30分钟。预培养后，加入20μl 2x端粒酶反应混合物(100mM Tris-乙酸盐，pH8.5；100mM乙酸钾，4mMdTTP，4mM dATP，2mM MgCl2，2mM亚精胺，2mM EGTA，10mM 2-巯基乙醇，20μCiα-32p dGTP(800Ci/mmol，New England Nuclear))并按所述进行端粒酶反应。为进行抑制研究，也将1.0μg端粒酶寡核苷酸(T2AG3)3加入2x反应混合物中进行抑制研究。使用的全部ddNTP终浓度为2mM。
用于抑制和延长实验的寡核苷酸顺序如下：
MI-2：ATGAAAATCAGGGTTAGG(SEQ ID NO：25)
MP-1：CCACAGCTAATGAAAATC(SEQ ID NO：26)
MP-4：CCACAGCTAATGAAAATCAGGGTTAGG(SEQ ID NO：27)
MI-3：TCACGTTCAAGGGTTAGG(SEQ ID NO：28)
MI-5：ATGAAAATCGCTACCTAA(SEQ ID NO：29)
MP-3：CCCACAGCTAATGAAAAT(SEQ ID NO：30)
MP-4：CCCCACAGCTAATGAAAA(SEQ ID NO：31)
                   实施例13
        细胞培养物和组织的Northern印迹
不同小鼠组织的总RNA购自Clontech，按(Sambrook，et al.，1989)所述从90mm组织培养板制备临界前和临界后Mus spretus成纤维细胞的总RNA。经过在分光光度计中在260nm下测吸光率测定RNA浓度。各RNA 20μg在6％丙烯酰胺-7M尿素凝胶上走电泳并转移到Hybond N+膜上。在Sambrook，et al.(1989)(出处同上)所述的高度严格的条件下与小鼠端粒酶RNA(mTR)探针进行杂交。
                   实施例14
              小鼠失效质粒的构建
图6显示了小鼠基因组中小鼠端粒酶RNA成分基因周围大约15kb的限制性图谱。为了实现标准小鼠失效，使用载体pPNT(质粒结构在图底部表示)。为构建特异性失效质粒，改变小鼠基因组DNA 5’区的3.3kb片段，经定点诱变加入SacI(Sc)位点。将3.3kb片段克隆进pPNTneo基因下游的XbaI位点。另外，改变小鼠端粒酶RNA基因3’侧翼区的4.0kb基因组片段以加入SacI限制性位点。然后将这些片段克隆进pPNT载体的上游XhoI位点。
                   实施例15
     从其它非人类哺乳动物鉴定和分离RNA成分的核酸
为了说明本发明的试剂如何用于从其它哺乳动物种类鉴定和分离基本上同源的核酸，将互补于人RNA成分序列的PCR引物用于在PCR中扩增同源序列。用于证实本发明该方面的一个举例性的引物对由引物+10(其序列为5’-CACCGGGTTGCGGAGGGAGG-3’(SEQ ID NO：32))和引物R7(其序列为5’-GGAGGGGCGAACGGGCCAGCA-3’(SEQ IDNO：33))组成。从黑猩猩，鼠猴，罗猴，和狒狒组织制备基因组DNA并以大约0.5-4mg/ml的浓度溶于TE缓冲液中。
对每种组织类型，制备PCR混合物，该混合物包括：1μl基因组DNA，48μl Master Mix(Master Mix由Stratagene的1x TaqExtenderTM缓冲液，200μM的各dNTP，和0.5μM的各引物组成)和0.5μl Taq聚合物(5单位/μl，Boehringe4-Mannheim)：Tth聚合酶(TaqExtenderTM聚合酶，来自Stratagene)的1∶1的混合物。反应管放到热循环仪上，它设制成首先在94℃加热反应混合物5分钟，然后进行27个保温循环：94℃30秒，63℃10秒和72℃45秒。完成扩增反应后，将各反应混合物大约10μl上样到2％琼脂糖凝胶上进行电泳。电泳后，染色凝胶并紫外照射，可观察到各反应混合物含预定大小(～200bp)的带。可克隆并测序这些带的核酸，各哺乳动物种类RNA成分基因的剩余部分可按上面所述克隆以得到人端粒酶或小鼠端粒酶RNA成分的基因。
相似方法可用于克隆并测序大鼠，中国仓鼠和牛端粒酶RNA成分。PCR引物设计成人和小鼠RNA成分间的保守区域。除了小鼠基因组序列，将Sal1限制性位点加到5’引物，Not1限制性位点加到3’引物使有效克隆。引物序列是：
mTR 5’：5’-CGTCGACTAGCGCTGTTTTTCTCGCTGACT-3’(SEQ ID NO：34)
mTR 3’：5’-GGAGGCGGCCGCAGGTGCACTTCCCACAGCTCAG(SEQ ID NO：35)
这些引物用于PCR大鼠端粒酶RNA成分的特异性序列。使用标准方法(Sambrook，et al.，出处同上)分离基因组DNA，使用Sambrook，etal.(出处同上)所述的程序用这两个引物扩增大鼠端粒酶RNA基因的区域。克隆并测序PCR片段。
PCR引物间获得的序列(269个核苷酸)显示出与小鼠端粒酶RNA基因74％同源。由于在引物间扩增的序列未用于选择该克隆，74％的同源性表明已克隆了正确的基因。为了克隆全长基因，用克隆的大鼠片段探测基因组文库。当筛选出5个基因组等价物时鉴定出5个阳性克隆。这表明该大鼠基因在大鼠基因组中以单拷贝存在，与小鼠和人基因组的基因一样，大鼠基因的完整序列在图7A-7B(SEQ ID NO：5)中表示。
使用上面所述的相同引物，使用从母牛、水貂、中国仓鼠、非洲绿猴和非洲角蛙Xenopus获得的基因组DNA，得到了适当大小的PCR片段。因此人和小鼠端粒酶RNA基因中保守序列的引物一般在从许多不同哺乳动物种类和甚至从其它脊椎动物克隆端粒酶RNA基因时有用。使用与用于克隆大鼠序列(图7A-7B)所用相同的方法也克隆了中国仓鼠(SEQ ID NO：43)和母牛(SEQ ID NO：44)的全部序列。
                   实施例16
               RNA成分的二级结构
人、小鼠、大鼠、中国仓鼠、和牛端粒酶RNA成分的克隆序列已用于测定这些RNA序列推断的二级结构的折叠(图8A-8E)。这种二级结构是重要的，因为它实现了该RNA的功能。
上面实施例描述了本发明的各个方面以及怎样制备本发明的一些核酸。这些实施例并不试图穷举由下面权利要求书包含的本发明的许多不同实施方案。

Claims (54)

1.基本上纯化形式的小鼠端粒酶RNA成分。
2.具有与SEQ ID NO：4相同序列的权利要求1所述的RNA成分。
3.一种基本上纯化形式的寡核苷酸，有一个与权利要求2的RNA成分中长度为10到500核苷酸邻接序列相同或完全互补的序列。
4.根据权利要求3所述的寡核苷酸是一种寡脱氧核糖核苷酸。
5.根据权利要求3所述的寡核苷酸是一种寡核糖核苷酸。
6.根据权利要求3所述的寡核苷酸，当与小鼠端粒酶RNA成分结合时，具有抑制或阻碍端粒酶活性的作用。
7.一种重组表达质粒，含有权利要求3中的寡核苷酸，并含有一个启动子，其被定位驱使与所述寡核苷酸序列互补或相同的RNA转录。
8.根据权利要求7所述的重组表达质粒，其中所述质粒的功能是在真核宿主细胞中产生寡核苷酸。
9.根据权利要求7所述的重组表达质粒，其中所述质粒的功能是在原核宿主细胞中产生寡核苷酸。
10.根据权利要求8所述的重组表达质粒，其中所述质粒含有一种编码小鼠端粒酶RNA成分的小鼠基因。
11.根据权利要求10所述的重组表达质粒，其中所述的基因含有SEQID NO：3核苷酸序列。
12.一种用权利要求7中重组表达质粒转化的真核宿主细胞，质粒编码一种与小鼠端粒酶蛋白质成分结合的RNA分子，以产生端粒酶活性，能在端粒上添加核苷酸重复单元序列。
13.根据权利要求11所述的宿主细胞，其中所述的复制单元为5’-TTAGGG-3’。
14.根据权利要求11所述的宿主细胞，其中所述复制单元不是5’-TTAGGG-3’。
15.根据权利要求12所述的宿主细胞，其中所述RNA分子包含SEQID NO：4。
16.根据权利要求12所述的宿主细胞，其中所述的重组表达载体含有SEQ ID NO：3限定的核苷酸序列。
17.哺乳动物端粒酶的RNA成分编码区，含有的序列基本上与权利要求2的RNA成分中的序列同源。
18.一种制备重组端粒酶的方法，所述方法包括采用编码权利要17的RNA成分的重组表达载体来转化表达端粒酶蛋白质成分的真核宿主细胞，在一定条件下培养用所述载体转化的所述宿主细胞，使得蛋白质成分和RNA成分被表达和装配，形成能在染色体DNA端粒上添加序列的活性端粒酶分子。
19.基本上纯化形式的哺乳动物端粒酶RNA成分。
20.一种编码权利要求19的RNA成分的DNA序列。
21.一种重组表达质粒，含有权利要求19的寡核苷酸，并含有一个启动子，其被定位驱使与所述寡核苷酸序列互补或相同的RNA转录。
22.一种重组表达质粒，含有如权利要求20所述的寡核苷酸，并含有一个启动子，其被定位驱使与所述寡核苷酸序列互补或相同的RNA转录。
23.根据权利要求21所述的重组表达质粒，其中所述的质粒功能是在宿主细胞中产生寡核苷酸。
24.根据权利要求22所述的重组表达质粒，其中所述的质粒功能是在宿主细胞中产生寡核苷酸。
25.被权利要求21所述的重组表达质粒转化的真核宿主细胞，质粒编码一种与小鼠端粒酶蛋白质成分结合的RNA分子，以产生端粒酶活性，能在端粒上添加核苷酸重复单元序列。
26.被权利要求22所述的重组表达质粒转化的真核宿主细胞，质粒编码一种与小鼠端粒酶蛋白质成分结合的RNA分子，以产生端粒酶活性，能在端粒上添加核苷酸重复单元序列。
27.基本上纯化形式的非人类哺乳动物端粒酶RNA成分。
28.一种编码权利要求27中RNA成分的DNA序列。
29.一种重组表达质粒，含有权利要求27的寡核苷酸，并含有一个启动子，其被定位驱使与所述寡核苷酸序列互补或相同的RNA转录。
30.一种重组表达质粒，含有权利要求28的寡核苷酸，并含有一个启动子，其被定位驱使与所述寡核苷酸序列互补或相同的RNA转录。
31.根据权利要求29所述的重组表达质粒，其中所述的质粒功能是在宿主细胞中产生寡核苷酸。
32.根据权利要求30所述的重组表达质粒，其中所述的质粒功能是在宿主细胞中产生寡核苷酸。
33.由权利要求29的重组表达质粒转化的真核宿主细胞，质粒编码一种与小鼠端粒酶蛋白质成分结合的RNA分子，以产生端粒酶活性，能在端粒上添加核苷酸重复单元序列。
34.被权利要求30的重组表达质粒转化的真核宿主细胞，质粒编码一种与小鼠端粒酶蛋白质成分结合的RNA分子，以产生端粒酶活性，能在端粒上添加核苷酸重复单元序列。
35.基本上纯化形式的大鼠端粒酶RNA成分。
36.具有由SEQ ID NO：5编码的序列的权利要求35的RNA成分。
37.含有大约20至200或更多个核苷酸的DNA探针或引物，包括SEQID NO：1和SEQ ID NO：3之间的保守序列。
38.含有大约20至200或更多个核糖核苷酸的RNA探针或引物，由包括SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3间保守序列的DNA编码。
39.在中等严格条件下与权利要求37的保守序列杂交的DNA序列。
40.含有SEQ ID NO：34或SEQ ID NO：35的探针或引物。
41.在中等严格条件下与SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：3之间的保守序列杂交的RNA序列。
42.一种编码部分小鼠基因组的质粒，其中端粒酶RNA基因被不同的DNA序列取代。
43.一种编码部分小鼠基因组的质粒，通常编码端粒酶RNA的基因，但其中以细菌新霉素基因代替了端粒酶RNA基因。
44.一种缺乏端粒酶的小鼠。
45.其本上纯化形式的中国仓鼠端粒酶RNA成分。
46.具有SEQ ID NO：43编码序列的权利要求45的RNA成分。
47.其本上纯化形式的牛端粒酶RNA成分。
48.具有SEQ ID NO：44编码序列的权利要求47的RNA成分。
49.含有大约20至200或更多核苷酸的DNA探针或引物，包括SEQID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：43和SEQID NO：44间的保守序列。
50.含有大约20至200或更多核糖核苷酸的RNA探针或引物，由包括SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44间的保守序列的DNA编码。
51.一种基本上为纯化形式的DNA，含有5个或多个SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44之间的保守序列。
52.由权利要求51中的DNA编码或与其基本同源的RNA。
53.一种DNA序列，在中等严格条件下与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44之间的保守序列杂交。
54.一种RNA序列，在中等严格条件下与SEQ ID NO：1、SEQ IDNO：3、SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：43和SEQ ID NO：44之间的保守序列杂交。
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