CN116426527B - IBDV siRNA富集区基因片段、重组质粒及产生的siRNA、构建方法和应用 - Google Patents
IBDV siRNA富集区基因片段、重组质粒及产生的siRNA、构建方法和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了通过筛选得到鸡传染性法氏囊病毒的siRNA基因库，并将该数据库与鸡传染性法氏囊病毒基因组比对得到一段siRNA富集区的基因片段的方法。我们发现IBDV的基因组上siRNA富集区可以高效产生siRNA并能够作为鸡传染性法氏囊病预防与治疗的应用，所述应用包括：使用pcDNA3.1和PSilence4.1商品质粒构建包含IBDVsiRNA富集区片段的重组质粒。经实验证明，使用重组质粒处理DF1细胞后，细胞中IBDV复制量显著降低，IBDV病毒的增殖被抑制。在使用雏鸡进行的动物保护实验中也能得到了相同结论。因此，该重组质粒可作为预防/治疗鸡传染性法氏囊病的候选疫苗。
Description
技术领域
本发明属于生物技术基因工程领域，具体涉及IBDV siRNA富集区基因片段、重组质粒及产生的siRNA、构建方法和应用。
背景技术
1、IBDV流行现状及其防治难度
传染性法氏囊病毒(Infections bursal disease virus，IBDV)是一种能高度适应环境的非囊膜RNA病毒，能通过入侵鸟类特有的免疫器官法氏囊从而攻击免疫细胞、损伤免疫系统。其引起的这种高度接触性传染病称为传染性法氏囊病(Infections bursaldisease，IBD)国内外出现具有更高的发病率和致死率变异株IBDV(vvIBDV)，给世界各国养鸡业带来巨大打击，至今，IBDV仍在不断变异传播，威胁养鸡业的发展。针对具有高传染性特点的IBDV，我国目前采取的预防措施主要包括：对养殖环境进行消毒、优化饲养条件提高抗病能力、免疫疫苗接种等方式。这些措施也面临着许多困难，首先，IBDV传染性强，可以通过接触、水、饲料、灰尘、器具、人员活动等各种方式进行传播并且IBDV在环境具有高适应性，这对环境消毒的方式和效果带来巨大挑战。其次，优化饲养条件，包括：使用优质饲料、饮用水，使用更精确的温度、湿度控制器，采取更科学的饲养方式等等，确实能增强鸡群免疫能力，但同时也大大提高了养殖的成本。最后，接种疫苗是目前对抗传染性病毒的主要预防措施，但IBDV在出现至今已经通过不断变异产生不同亚型的毒株，其展现出的高突变性对研制疫苗提出更高的要求。而研制疫苗既要考虑提高免疫原性产生强的保护能力又要求保证疫苗的安全性，同时要降低疫苗的生产成本，这使疫苗的研制困难重重。
2、RNAi有望成为有效治疗IBD的新方法
RNA干扰(RNA interference，RNAi)是生物体进化过程中相对保守的一种基因调控方式，该系统可以通过将双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)切割成21-23nt的小片段，并利用小片段沉默特定的mRNA的表达。RNAi系统自被发现以来，提供了一种通过靶向特定基因来调节靶基因表达的新方法并表现出了高靶向性和高效性。目前，RNAi系统主要被应用于治疗领域，包括对遗传性疾病、病毒性疾病、肿瘤疾病等治疗难度高的疾病的治疗。自2018年以来多种RNAi的药物通过临床试验并获得FDA批准，包括：patisiran、Givosiran、Lumasiran、inclisiran等，除此之外还有很多RNAi疗法已经进入了临床试验阶段。最近，越来越多的研究关注RNAi在抗病毒中的应用，目前已经发现，RNAi是植物和无脊椎动物中主要的抗病毒机制并且在脊椎动物抗病毒中也发挥着重要作用，目前，RNAi系统应用于病毒治疗的策略是：向机体递送siRNA小片段或能产生siRNA小片段的基因片段作为疫苗，这种治疗方式相较于传统的弱毒疫苗、灭活疫苗、蛋白疫苗治疗方式有很多优势，首先，siRNA疫苗的安全性很高，siRNA特异性很高能精准靶向特定靶基因，而且，游离RNA分子相对不稳定，一旦发生脱靶也很容易被酶降解。其次，RNAi在病毒感染的早期就能通过siRNA靶向病毒mRNA，干扰病毒的转录过程，反应迅速。并且病毒mRNA降解产生的小片段能进一步增强RNAi作用，产生一个级联放大的效应，大大提高了siRNA疫苗的抗病毒能力。最后，RNAi疗法只需要提供siRNA，细胞中RNAi系统的其他组分结合siRNA就能调控靶基因，而随着生命科学的快速发展，降低了合成基因片段的难度和成本，使RNAi疗法面对不断的病毒变异，能快速生产针对新病毒的siRNA疫苗，减弱了病毒变异对疫苗研制造成的影响。
3.本发明在RNAi用于抗病毒领域解决的问题
RNAi系统随着不断深入研究，RNAi的具体机制也愈发清晰明了，其靶向mRNA沉默其表达的特点使其应用于各种领域，包括抗病毒领域。但在抵抗病毒的应用中也面临着一些问题，其中，最重要的一个问题就是如何大量获得siRNA，并且RNA在环境中并不稳定，在体外大量合成RNA直接免疫动物抵抗病毒的难度很高。目前的解决方式为通过大量合成能转录为一个RNA发卡结构(发卡结构中包含siRNA序列)的DNA质粒，质粒转入后会转录翻译为RNA发卡结构，这个结构被RNAi系统识别切割产生一条siRNA，从而进一步沉默病毒基因的表达。
发明内容
发明目的：本发明通过分析筛选得到一段富含IBDV siRNA序列的基因片段，使用该基因片段构建重组质粒相对使用发夹结构构建的质粒能更好的激活RNAi系统，产生更强的抗病毒效果，从而从一个更新的角度解决如何大量获得siRNA的技术问题，发现了siRNA应用于抗病毒的新方法。
本发明所要解决的技术问题是筛选分析得到了一段禽传染性法氏囊病毒(IBDV)的siRNA富集区片段。
本发明还构建了含有该富集区片段的重组质粒，该重组质粒具有抵抗禽传染性法氏囊病毒(IBDV)感染功能。
本发明还要解决的技术问题是提供了一种禽传染性法氏囊病毒(IBDV)的siRNA富集区基因片段及其重组质粒的构建方法。
本发明还要解决的技术问题是提供重组质粒或细胞系，所述重组质粒为真核载体，所述细胞系为表达细胞系，其能在细胞模型中抵抗禽传染性法氏囊病毒(IBDV)感染。
其中，该细胞系包括但不仅限于鸡成纤维细胞(DF-1)。
本发明还要解决的技术问题是提供重组质粒用于滴鼻的体外包裹方式和动物模型上的使用方法。
技术方案：为了解决上述技术问题，本发明提供了一种IBDV的siRNA富集区基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
本发明内容还包括一种IBDV的siRNA富集区基因片段的筛选方法，包括以下步骤：
(1)在NCBI的GEO数据库中收集整理IBDV感染后产生的21-23bp的siRNA序列；
(2)将(1)中收集得到的siRNA序列数据，通过snapgene软件与IBDV基因组序列进行分析比对；
(3)将(2)中分析比对数据使用基因组可视化软件IGV软件进行数据可视化，得到IBDV基因组序列上siRNA最多的区域，即为IBDV的siRNA富集区。
本发明内容还包括一种IBDV的siRNA富集区重组质粒，所述重组质粒包括所述的基因片段。
本发明的重组质粒，分别命名为pcDNA3.1-siRNA和psliencer 4.1-siRNA，其含有siRNA富集区片段，其图谱见说明书图3和图4。
本发明内容还包括一种使用IBDV的siRNA富集区构建重组质粒的方法，包括以下步骤：
(1)通过对IBDV分析筛选得到能有效抑制IBDV复制的siRNA富集区基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
(2)将步骤(1)所筛选出的基因片段连接在能表达产生siRNA的质粒上，构建能表达小siRNA的重组质粒。
其中，所述质粒包括但不仅限于pcDNA 3.1或psliencer 4.1，其图谱见说明书图1和图2；
本发明内容还包括一种IBDV的siRNA，所述siRNA的DNA序列如SEQ ID NO.2或SEQID NO.3或SEQ ID NO.4或SEQ ID NO.5或SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.7或SEQ ID NO.8或SEQID NO.9或SEQ ID NO.10或SEQ ID NO.11或SEQ ID NO.12或SEQ ID NO.13或SEQ ID NO.14或SEQ ID NO.15或SEQ ID NO.16所示。
本发明内容还包括所述的基因片段、所述的重组质粒或所述的siRNA在制备预防或治疗IBDV感染疾病的药物或疫苗中的应用。
本发明内容还包括所述的基因片段、所述的重组质粒或所述的siRNA在制备预防或治疗雏鸡感染IBDV病毒的药物或疫苗中的应用。
其中，所述药物或疫苗的剂型包括但不仅限于滴剂。
其中，所述应用包括将所述的重组质粒用于滴鼻的体外包裹方式和/或动物模型上。
本发明的重组质粒的构建方法具体包括以下步骤：
步骤1：在NCBI的GEO数据库上查找IBDV siRNA基因序列，通过分析筛选出有效的siRNA基因序列组成IBDV的siRNA库，将siRNA库中的片段对比在IBDV的基因组序列上，分析得到siRNA数量较多的区域即为siRNA富集区。使用primer 6设计出siRNA富集区的上下游扩增引物，该扩增引物应包含连接载体上下游的同源臂，通过PCR扩增siRNA富集片段。
步骤2：在37℃使用双酶切切开载体质粒，通过琼脂糖凝胶电泳分离切开的质粒片段，并使用DNA片段提纯试剂盒将片段回收。
步骤3：使用overlap法将siRNA富集片段与线性载体连接，即将infusion酶、siRNA富集片段与线性载体在37℃连接0.5h，将连接产物冰上转化DH5a感受态细胞，均匀涂布在含有氨苄抗生素的固体LB培养基上。37℃培养12h后，挑取固体LB培养基单个菌落，分别放入含氨苄抗生素的液体LB中摇菌12h。
步骤4：将菌液送到生工生物工程(上海)股份有限公司测序，测序正确的即为构建成功的重组质粒。
具体地，本发明内容还包括可抑制IBDV病毒复制的重组质粒的构建方法，包括以下步骤：
(1)根据pcDNA 3.1或psliencer 4.1、siRNA富集区的序列，选择合适的酶切位点，设计带同源臂的引物扩增IBDV的siRNA富集区序列。
(2)按步骤(1)所筛选出的酶切位点利用限制性内切酶切开pcDNA 3.1或psliencer 4.1。
(3)利用infusion酶将步骤(1)和步骤(2)得到的siRNA富集区片段连接在pcDNA3.1或psliencer 4.1片段上，得到重组质粒。
(4)对步骤(3)得到的重组质粒测序，选出正确连接的质粒，即为构建成功的重组质粒。
本发明内容还包括重组质粒的用于滴鼻的体外包裹方式，包括以下步骤：
(1)用0.5×HBS缓冲液(75mM NaCl，20mM HEPES，2.5％葡萄糖)在室温按N/P(氮磷比，用于计算支链聚醚酰亚胺与质粒间的电荷比)为6.5的比例分别稀释重组质粒溶液和支链聚醚酰亚胺(Polyetherimide，PEI)得到质粒缓冲液溶液与PEI缓冲液溶液。
(2)在室温环境下将步骤(1)得到的质粒缓冲液溶液与PEI缓冲液溶液混合，严格孵育20min。
本发明内容还包括将重组质粒体外保护IBDV感染实验的动物模型。
其中，所述模型动物为海兰褐蛋鸡。
其中，所述IBDV感染模型通过将IBDV滴鼻的方式构建得到。
有益效果：相对于现有技术，本发明具备以下优点：
1、本发明建立了一种筛选分析得到病毒siRNA富集区域的方法，通过该方法进行筛选找到病毒siRNA富集区域在病毒基因组中的位置。
2、本发明通过分析筛选首次得到了一段IBDV siRNA富集区域片段，该片段包含大量针对IBDV的siRNA，最终能够获得大量的siRNA片段，可以作为高效抑制IBDV复制的片段。
3、本发明制备得到了一种含siRNA富集片段的质粒，并证明其在细胞模型和动物模型中都能降低病毒载量，可以作为研究RNA干扰系统和IBDV入侵机制的良好工具，并可以作为一种预防治疗IBDV的DNA疫苗。
4、本发明提供了一种制备含siRNA富集区域片段的重组质粒的方法，该方法能快速设计、制备含siRNA富集区域的质粒且成本较低，该方法为研制疫苗提供了一种快速低成本的方案。
附图说明
图1为重组IBDV siRNA富集区质粒的pcDNA 3.1载体；
图2为重组IBDV siRNA富集区质粒的psliencer 4.1载体；
图3为重组IBDV siRNA富集区质粒的pcDNA 3.1-siRNA重组载体；
图4为重组IBDV siRNA富集区质粒的psliencer 4.1-siRNA重组载体；
图5为pcDNA 3.1-siRNA重组载体细胞接毒实验的定量结果。
图6为psliencer 4.1-siRNA重组载体在法氏囊中攻毒保护的定量结果；
图7为pcDNA 3.1-siRNA和psliencer 4.1-siRNA重组载体在法氏囊中攻毒保护的定量结果；
图8为pcDNA 3.1-siRNA和psliencer 4.1-siRNA重组载体在法氏囊中的病毒载量WB结果；
图9为pcDNA 3.1-siRNA和psliencer 4.1-siRNA重组载体在法氏囊中影响RNAi通路中Ago 2蛋白的WB结果；
图10为IBDV组病毒源A链siRNA富集区示意图。
具体实施方式
下面结合具体的实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于申请所附权利要求书所限定的范围。
除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
细胞、病毒和质粒：DF-1细胞由实验室液氮保存。IBDV病毒液通过将IBDV病毒原液(由江苏省农科院兽医所提供)，接种鸡胚后收取尿囊液的方式获得，称为IBDV胚毒，经实验测算病毒TCID50为104.5/0.1ml。pcDNA 3.1质粒和pSliencer 4.1质粒均为购买的商品化质粒。
仪器和耗材：荧光定量分析仪；转膜槽；蛋白电泳仪；蛋白显影仪；CO2恒温细胞培养箱；细胞培养瓶；12孔培养板。
试剂：1640培养基(Thermo Fisher Scientific公司)；DMEM培养基(ThermoFisher Scientific公司)；胎牛血清(gibco公司)；0.05％胰酶(碧云天生物技术有限公司)；2×Taq Plus Master Mix II(Vazyme公司)；ClonExpress II One Step Cloning Kit(vazyme)；QuickCutTM BamH I(Takara公司)；QuickCutTM Xho I(Takara公司)；QuickCutTMHind III(Takara公司)；DH5αCompetent cell(Vazyme公司)；Omega Endo-free PlasmidMega Kit(南京鼎思生物有限公司)；RIPA裂解液(Solarbio，China)；PSMF(Solarbio，China)；Scotch-Brite垫(麦高德公司)；雅酶滤纸(博奥赛公司)；Immobilon-P PVDF膜(南京费尔特生物技术有限公司)；
实施例1 IBDV的siRNA富集区片段的筛选以及重组质粒的获得
在NCBI的GEO数据库(www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/)上查询并下载IBDV感染后的小RNA信息(siRNA序列集的GEO数据库中保存号为GSE90095)。首先，使用snapgene软件将收集到的siRNA序列集与鸡的基因组对比，鸡的基因组为NCBI上的the reference genomeGalgal 4.73，将匹配上鸡的基因组对比上的siRNA排除，将剩下的siRNA使用snapgene与IBDV的基因组(IBDV A片段GenBank号为MZ740264.1，IBDV B片段GenBank号为MZ740265.1)进行比对将能对比上的siRNA组成IBDV的siRNA库。使用snapgene软件将siRNA库中的每一条片段(包括重复的片段)与IBDV的基因组对比确定其在IBDV的基因组上的位置，使用IGV软件统计落在IBDV基因组上siRNA数量，按数据可视化后病毒基因组上siRNA富集度，选择一段siRNA富集度最高的区域作为siRNA富集区。使用primer 6设计出siRNA富集区的上下游扩增引物，该扩增引物应包含连接两种载体上下游的同源臂，使用2×Taq Plus MasterMix II(Vazyme，China)按使用说明书通过PCR扩增siRNA富集片段。
引物序列如下：
pcDNA 3.1-siRNA：
F：5’-CTTGGTACCGAGCTCGGATCCTGGCCAACTTCGCACTCAG-3’
R：5’-TAAACGGGCCCTCTAGACTCGAGGGTCTCGGTGTTGGAGCAT-3’
pSliencer4.1-siRNA：
F：5’-GGTTTAGTGAACCGTGGATCCTGGCCAACTTCGCACTCAG-3’
R：5’-AAAAGATCCTTTATTAAGCTTGGTCTCGGTGTTGGAGCAT-3’
siRNA富集区序列如下：(SEQ ID NO.1)
实施例2抑制IBDV病毒复制的重组质粒的构建
(1)pcDNA3.1、pSliencer4.1质粒是实验室购买的商品化质粒。
(2)根据pcDNA3.1、psliencer4.1、siRNA富集区的序列(SEQ ID NO.1)，在pcDNA3.1中选择BamH I和Xho I作为酶切位点，在pSliencer4.1中选择BamH I和Hind III作为酶切位点，PCR扩增IBDV的siRNA富集区序列，引物、体系和程序参照实施例1中的引物序列、扩增体系和反应条件进行。
(3)按步骤(2)所选的酶切位点利用QuickCutTM BamH I、QuickCutTM Xho I、QuickCutTM Hind III限制性内切酶(Takara、Japan)切开pcDNA3.1质粒和pSliencer4.1质粒。
(4)根据使用说明书利用ClonExpress II One Step Cloning Kit(vazyme，China)酶将步骤(2)和步骤(3)得到的siRNA富集区片段分别连接在pcDNA 3.1、psliencer4.1片段上，得到两种重组质粒。
连接程序如下：
连接体系如下：
(5)从步骤(4)中取连接产物10μl，加入100μlDH5αCompetent cell(Vazyme，China)，冰上静置30min，42℃水浴热激45sec后，立即置于冰上冷却2-3min，加入900μlLB培养基(不添加抗生素)，37℃、220rpm摇菌1h，将菌液涂布在氨苄抗性的固体LB平板上，放入37℃培养箱中倒置过夜培养。
(6)对步骤(5)得到的菌板挑单菌落，加入1mL含氨苄抗性的液体LB 37℃220 rpm摇菌6h后，分装500μl菌液送生工测序，剩余菌液于4℃暂存。选出有正确连接的质粒的菌种，即构重组质粒建成功。为方便命名，将重组质粒pcDNA 3.1-siRNA简称为Pc-siRNA，将重组质粒psliencer 4.1-siRNA简称为Ps-siRNA。将含有正确的Pc-siRNA和Ps-siRNA质粒的菌种分别命名为Pc-siRNA菌种和Ps-siRNA菌种。
实施例3荧光相对定量检测重组质粒在细胞中抵抗IBDV感染能力
将冻存在液氮中的装有1.5ml DF-1细胞液的冻存管取出，在37℃中不断快速摇晃直至细胞液融化，用含10％胎牛血清(gibco公司)和2％双抗的DMEM培养液重悬细胞，将混匀的细胞悬液均分在新的无菌细胞培养瓶中，放入CO2培养箱中进行培养。待细胞铺满细胞瓶时，弃去培养液，使用0.05％的胰酶进行消化，加入新的含10％血清和2％双抗的DMEM培养液，将细胞悬液均分在新的无菌细胞培养瓶中，视为传代一次。正常传代三次后，将细胞铺在12孔板上。按试剂使用说明书使用转染试剂HieffLiposomal TransfectionReagent(yeasen，China)将构建好的Ps-siRNA质粒和Pc-siRNA质粒分别转染DF-1细胞作为Ps-siRNA组和Pc-siRNA组，将未插入siRNA片段的pcDNA 3.1质粒和pSliencer 4.1质粒分别转染细胞作为Empty vector组，不做处理操作的DF-1细胞组作为BK组。质粒转染浓度均为1μg/每孔，转染时间均为12h。使用DMEM培养基洗去培养液，向Empty vector组、Ps-siRNA组和Pc-siRNA组的每孔细胞滴加用DEME稀释的IBDV病毒液作为Empty vector+IBDV组、Ps-siRNA+IBDV组和Pc-siRNA+IBDV组，MOI为0.01。观察12h、24h、36h的细胞状态，并收集每个时间点的细胞样品，使用Trizol法提取细胞RNA，步骤如下：每孔加入1mL trizol，转移至1.5mL的离心管中，加入200μL的氯仿。用力震荡离心，4℃放置5min。12000rpm 4℃离心15min，取上层液相移入新的1.5ml离心管。加入等体积异丙醇，轻轻颠倒离心管充分混匀液体，-20℃放置10min以上。4℃，12000rpm离心10min，用枪小心吸去所有上清；加入1mL 75％乙醇(DEPC水配制)，弃上清，重复使用75％乙醇(DEPC水配制)清洗一次。4℃，12000rpm离心10min，用枪小心吸去所有上清，在超净台中干燥5min，加入10μL DEPC水。测浓度后按生产厂商使用说明书使用反转录试剂盒/>AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit(yeasen，China)将RNA反转成cDNA。按照使用说明书使用ChamQ Universal SYBR qPCRMaster Mix(vyzam，China)进行荧光定量PCR，按荧光定量PCR体系表进行加样，随后按反应程序表使用荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR实验。
荧光定量PCR的引物序列如下：
IBDV-B链：
F：5’-CGAGAATGAGGAGTATGAGA-3’
R：5’-TGAGTAGTGCGATGTCTG-3’
荧光定量PCR如下：
荧光定量PCR反应：
评价Ps-siRNA质粒和Pc-siRNA质粒在细胞中抑制IBDV复制的能力，图5结果表明在DF-1细胞中相对空白对照组，pc-siRNA组在12h、24h、36h的IBDV载量均降低。图6结果表明在DF-1细胞中相对空白对照组，ps-siRNA组在12h、24h、36h的IBDV载量均降低。结果表明，在体外细胞抗病毒实验中，pc-siRNA重组质粒和ps-siRNA重组质粒均能起到抗病毒的作用。
实施例4雏鸡攻IBDV保护实验
将实施例2中构建的Ps-siRNA和Pc-siRNA菌液各500μl分别放入5mL具有氨苄青霉素抗性的液体LB培养基中，置于摇床中(220rpm，37℃)培养12h，然后再置于50mL的氨苄青霉素液体LB培养基中继续置于摇床中(220rpm，37℃)培养4h，按制造商说明书使用Endo-free Plasmid Mega Kit(omega，南京鼎思生物有限公司)提取无内毒素质粒。使用聚醚酰亚胺(Polyetherimide，PEI)包裹质粒，具体方式如下：分别使用250μl的0.5×HBS缓冲液(75mM NaCl，20mM HEPES，2.5％葡萄糖)在室温按N/P为6.5的比例分别稀释重组质粒溶液和支链聚醚酰亚胺(Polyetherimide，PEI)得到质粒缓冲液溶液与PEI缓冲液溶液。并在室温环境下将250μl质粒缓冲液溶液与250μl PEI缓冲液溶液混合，严格孵育20min作为质粒PEI混合物。购买一周龄海兰褐蛋鸡，待雏鸡在新环境中适应一周后，通过滴鼻给药的方式将500μl的Ps-siRNA质粒PEI混合物接入Ps-siRNA组雏鸡，将500μl的Pc-siRNA的质粒PEI的混合物接入Pc-siRNA组，以将未插入siRNA片段的500μl的pcDNA 3.1质粒PEI混合物和500μl的pSliencer 4.1质粒PEI混合物滴鼻雏鸡作为Empty vector组，不做处理正常饲养的雏鸡作为BK组。正常饲养12h后，通过滴鼻的方式将Ps-siRNA组、Pc-siRNA组和Empty vector组的每只雏鸡接入200μl IBDV胚毒，正常饲养雏鸡并每天观察雏鸡病理情况。正常饲养三天后，处死雏鸡，取法氏囊。将法氏囊加入含500μl Trizol的磨样管中，使用磨样仪破碎组织，Trizol法提取法氏囊RNA，浓度后按生产厂商使用说明书使用反转录试剂盒AdvanceFast 1st Strand cDNA Synthesis Kit(yeasen，China)将RNA反转成cDNA，按实施例2中荧光定量PCR体系表进行加样，引物使用实施例3中IBDV-B链，随后按实施例2中的反应程序表使用荧光定量PCR仪进行荧光定量PCR实验。
实验结果见图7，结果表明，在雏鸡攻毒保护实验中，pc-siRNA重组质粒和ps-siRNA重组质粒均能降低雏鸡的法氏囊中的病毒载量，在雏鸡法氏囊中抵抗IBDV入侵。
实施例3免疫印迹法检测重组质粒在雏鸡组织中抵抗IBDV感染能力
将-80℃保存的雏鸡法氏囊组织出，在4℃融化，剪取黄豆大小的组织块放入装有磨样珠的磨样管中。加入普通RIPA裂解液(Solarbio，China)和PSMF(Solarbio，China)混合液，使用匀浆仪破碎组织2min，室温放置5min。将样品振荡1 min，4℃，12000rpm离心15min，用移液枪转移上清至新的离心管中，加入SDS上样缓冲液，99℃变性15min，得到细胞的蛋白样品。按制造商的使用说明书，配制聚丙烯酰胺凝胶并放入电泳槽中，在电泳槽中加入1×SDS电泳缓冲液，将蛋白样品加入胶孔中，并在对照孔加入蛋白质分子量标准样品。接通电源，以85V的电压跑浓缩胶，跑出浓缩胶后用110V电压电泳分离蛋白质。将PVDF膜裁至比凝胶略大，用甲醇浸泡5min，按照从阴极到阳极：Scotch-Brite垫、雅酶滤纸、聚丙烯酰胺凝胶、Immobilon-PPVDF膜、雅酶滤纸、Scothe-Brite垫的顺序制作转印三明治，其中，Scotch-Brite垫(麦高德公司)，雅酶滤纸(博奥赛公司)、Immobilon-PPVDF膜(南京费尔特生物技术有限公司)。并确保PVDF膜与凝胶之间无气泡。将转印夹层放入加入预冷的转膜液的转印槽中，连接电源，在冰浴条件下110V电转85min，关闭电源。将PVDF膜放入封闭液中(含5％脱脂牛奶的1xTBST)，室温封闭2h。将PVDF膜用TBST清洗一次后对照maker蛋白大小切下对应大小的条带，分别放入用TBST稀释的对应一抗中，4℃孵育过夜。将PVDF膜从一抗中取出，用TBST清洗5次，每次8min。将条带放入种属匹配的HRP标记的二抗中，室温孵育2h。用TBST清洗条带5次，每次8min，使用ECL发光液，借助LAS-4000mini型发光成像分析仪检测结果。
实验结果见图8、图9，根据图8的实验结果说明，在雏鸡法氏囊中pc-siRNA重组质粒相对与pcDNA3.1空质粒VP2蛋白量降低，ps-siRNA重组质粒相对与pSliencer4.1空质粒VP2蛋白量降低。进一步表明pc-siRNA重组质粒和ps-siRNA重组质粒均能降低雏鸡的法氏囊中的病毒载量。图9实验结果表明，ps-siRNA重组质粒组相对与pSliencer4.1空质粒组RNAi通路中的重要蛋白Ago2蛋白含量增多，说明ps-siRNA重组质粒在雏鸡法氏囊中抵抗病毒入侵的效果与RNAi通路存在联系。
Claims (8)
1.一种IBDV的siRNA富集区基因片段，其特征在于，所述基因片段的核苷酸序列如SEQID NO：1所示。
2.一种IBDV的siRNA富集区重组质粒或细胞系，其特征在于，所述重组质粒或细胞系包括权利要求1所述的基因片段。
3.一种使用IBDV的siRNA富集区构建重组质粒的方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）通过对IBDV分析筛选得到能有效抑制IBDV复制的siRNA富集区基因片段，所述基因片段的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；
（2）将步骤（1）所筛选出的基因片段连接在能表达产生siRNA的质粒上，构建能表达小siRNA的重组质粒。
4.根据权利要求3所述的构建重组质粒的方法，其特征在于，所述质粒包括pcDNA 3.1或psliencer 4.1。
5.权利要求1所述的基因片段、权利要求2所述的重组质粒或细胞系在制备预防或治疗IBDV感染疾病的药物或疫苗中的应用。
6.权利要求1所述的基因片段、权利要求2所述的重组质粒或细胞系在制备预防或治疗雏鸡感染IBDV病毒的药物或疫苗中的应用。
7.根据权利要求5或6所述的应用，其特征于，所述药物或疫苗的剂型为滴剂。
8.根据权利要求5或6所述的应用，其特征于，所述应用包括将所述的重组质粒用于滴鼻的体外包裹方式和/或动物模型上。
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