CN111926018A - 降低usp1表达的物质在制备治疗儿童t系急性淋巴细胞白血病的药物中的应用 - Google Patents

降低usp1表达的物质在制备治疗儿童t系急性淋巴细胞白血病的药物中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了降低USP1表达的物质在制备治疗儿童T系急性淋巴细胞白血病的药物中的应用。本发明公开形成茎环结构的短发夹RNA，其为shRNA‑1或shRNA‑2。去泛素化酶USP1在T系急性淋巴细胞白血病细胞中具有抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用，本发明证明抑制USP1的表达可促进肿瘤细胞白血病细胞发生凋亡，抑制白血病细胞的增殖。本发明为T系急性淋巴细胞白血病治疗提供了一条新的途径，去泛素化酶USP1有望成为抗白血病治疗的一个潜在靶点，在医学领域具有十分广阔的应用前景。

Description

降低USP1表达的物质在制备治疗儿童T系急性淋巴细胞白血 病的药物中的应用
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及降低去泛素化酶USP1表达的物质在制备治疗儿童T系急性淋巴细胞白血病的药物中的应用。
背景技术
急性淋巴细胞白血病(Acute lymphoblastic leukemia,ALL)是儿童最常见的恶性肿瘤，也是儿童期疾病相关死亡的主要原因。T系急性淋巴细胞白血病(T-ALL)是ALL中极具侵袭性的一个亚型，目前仍有高达30％的T-ALL患儿治疗无效或发生复发。发生发展的机制未明是T-ALL治愈率进一步提高的瓶颈。因此，深入研究儿童T-ALL，特别是难治复发T-ALL发生发展的分子机制，对于探索新的靶向治疗方案，以及提高生存率都至关重要。
USP1(Ubiquitin-specific peptidase 1)，即泛素特异性肽酶1，是一种半胱氨酸酶，属于去泛素化酶(Deubiquitinases,DUBs)的USPs家族，与其他的USPs成员一样，USP1包含高度保守的半胱氨酸结构域(Cys box)和组氨酸结构域(His box)。
研究发现USP1与靶蛋白相互作用，通过去泛素化调节靶蛋白的稳定性，从而影响DNA损伤修复、基因组稳定性、细胞凋亡、衰老、分化、生长、周期进展、自噬、干细胞特征维持等重要的生物学过程。USP1在多发骨髓瘤、胶质母细胞瘤、结直肠癌、前列腺癌、卵巢癌、乳腺癌等多种人类肿瘤中存在高表达，并且与肿瘤的发生发展密切相关，其作为肿瘤治疗的靶点已受到广泛关注。但是目前USP1在T-ALL，特别是儿童T-ALL发生发展中的作用机制还未见报道。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种可促进T系急性淋巴细胞白血病(T-ALL)细胞凋亡、抑制该细胞增殖的短发夹RNA(shRNA，short hairpin RNA)及其相关生物材料。
本发明提供形成茎环结构的短发夹RNA，其为以下shRNA-1或shRNA-2：
(1)shRNA-1，所述shRNA-1的茎环(Stem-loop)结构中茎(Stem)的一条链序列为SEQ ID NO:1，茎的另一条链序列为SEQ ID NO:2，其中SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2均由21个核糖核苷酸组成；
(2)shRNA-2，所述shRNA-2的茎环结构中茎的一条链序列为SEQ ID NO:3，茎的另一条链序列为SEQ ID NO:4，其中SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4均由21个核糖核苷酸组成。
所述短发夹RNA(shRNA-1和shRNA-2)中的环(loop)只要满足使所述短发夹RNA能产生由SEQ ID NO:1所示的单链RNA和SEQ ID NO:2所示的单链RNA组成的双链小干扰RNA(siRNA)或产生由SEQ ID NO:3所示的单链RNA和SEQ ID NO:4所示的单链RNA组成的双链小干扰RNA即可。在本发明的一个实施方案中，所述shRNA-1的核苷酸序列为SEQ ID NO:5，其中SEQ ID NO:5由48个核糖核苷酸组成，SEQ ID NO:5的第1-21位与SEQ ID NO:1相同，SEQID NO:5的第28-48位与SEQ ID NO:2相同。在本发明的一个实施方案中，所述shRNA-2的核苷酸序列是SEQ ID NO:6，其中，SEQ ID NO:6由48个核糖核苷酸组成，SEQ ID NO:6的第1-21位与SEQ ID NO:3相同，SEQ ID NO:6的第28-48位与SEQ ID NO:4相同。
本发明还提供编码上述短发夹RNA(shRNA-1和shRNA-2)的DNA分子。在本发明的一个实施方案中，编码shRNA-1的DNA分子为SEQ ID NO:8和SEQ ID NO:9形成的双链DNA分子。在本发明的一个实施方案中，编码shRNA-2的DNA分子为SEQ ID NO:10和SEQ ID NO:11形成的双链DNA分子。
本发明还提供与上述短发夹RNA(shRNA-1和shRNA-2)相关的生物材料，为如下1)-5)中的任一种：
1)含有上述任一所述的DNA分子的表达盒；
2)含有上述任一所述的DNA分子的重组载体、或含有1)所述的表达盒的重组载体；
3)含有上述任一所述的DNA分子的重组微生物、或含有1)所述的表达盒的重组微生物或含有2)所述的重组载体的重组微生物；
4)含有上述任一所述的DNA分子的转基因细胞系、或含有1)所述的表达盒的转基因细胞系或含有2)所述的重组载体的转基因细胞系；
5)小干扰RNA，siRNA-1和siRNA-2，其中所述siRNA-1由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2两条链组成，所述siRNA-2由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4两条链组成。
经过细胞内Dicer酶的酶切作用，shRNA-1可以产生siRNA-1，shRNA-2可以产生siRNA-2，siRNA-1的靶位点为sh-1，sh-1为SEQ ID NO:14的第2574-2594位，siRNA-2的靶位点为sh-2，sh-2为SEQ ID NO:14的第2030-2050位。
上述生物材料中，1)所述的表达盒是指能够在宿主细胞中表达上述任一所述的DNA分子的DNA，该DNA不但可以包括启动shRNA-1或shRNA-2基因转录的启动子，还可以包括终止shRNA-1或shRNA-2基因转录的终止子，进一步地，还可以包括增强子序列；2)所述重组载体具体为用编码shRNA-1或shRNA-2的DNA分子替换GV493的AgeⅠ和EcoRⅠ之间的片段得到的GV493-USP1-sh-1或GV493-USP1-sh-2；3)所述重组微生物具体可为细菌、酵母、藻和真菌；4)所述转基因细胞不包括动物和植物的繁殖材料。
本发明所要解决的又一个技术问题是提供治疗和/或预防T系急性淋巴细胞白血病的产品，所述产品的活性成分包括如下b1-b4中的至少一种：
b1、上述任一所述的短发夹RNA；
b2、上述任一所述的DNA分子；
b3、上述任一所述的生物材料；
b4、USP1抑制剂，优选ML323。
本发明所要解决的又一个技术问题是提供促进T系急性淋巴细胞白血病细胞凋亡的产品，所述产品的活性成分包括如下b1-b4中的至少一种：
b1、上述任一所述的短发夹RNA；
b2、上述任一所述的DNA分子；
b3、上述任一所述的生物材料；
b4、USP1抑制剂，优选ML323。
本发明所要解决的又一个技术问题是提供抑制T系急性淋巴细胞白血病细胞增殖的产品，所述产品的活性成分包括如下b1-b4中的至少一种：
b1、上述任一所述的短发夹RNA；
b2、上述任一所述的DNA分子；
b3、上述任一所述的生物材料；
b4、USP1抑制剂，优选ML323。
本发明所要解决的又一个技术问题是提供降低去泛素化酶USP1表达的物质的用途，所述用途为a1-a3中的任一种：
a1、治疗和/或预防T系急性淋巴细胞白血病；
a2、促进T系急性淋巴细胞白血病细胞凋亡；
a3、抑制T系急性淋巴细胞白血病细胞增殖。
在一个实施方案中，上述用途中，所述降低USP1表达的物质包括如下b1-b4中的至少一种：
b1、上述任一所述的短发夹RNA；
b2、上述任一所述的DNA分子；
b3、上述任一所述的生物材料；
b4、USP1抑制剂，优选ML323。
任选地，进一步包含药学上可接受的载体、赋形剂或稀释剂。
在一个实施方案中，上述用途中，所述去泛素化酶USP1的氨基酸序列为SEQ IDNO:15所示，所述去泛素化酶USP1的基因序列如SEQ ID NO:14的第422-2779位所示。
在一个实施方案中，上述用途中，T系急性淋巴细胞白血病为儿童T系急性淋巴细胞白血病。
本发明证明，以去泛素化酶USP1的mRNA为靶点，将RNA干扰重组表达载体——表达shRNA-1和shRNA-2的重组表达载体GV493-USP1-sh-1和GV493-USP1-sh-2转入T淋巴细胞白血病的细胞系Jurkat中获得的重组白血病细胞，其去泛素化酶USP1的表达水平明显低于对照组，细胞总体凋亡比率分别为24％和43％，是对照的10倍和17.9倍；白血病重组细胞的增殖速度显著低于对照组。本发明发现去泛素化酶USP1可以作为治疗T-ALL的新靶点，抑制USP1的表达可以促进T-ALL细胞凋亡、抑制T-ALL细胞增殖。本发明为T-ALL，尤其是儿童T-ALL的治疗提供了新的方向，去泛素化酶USP1有望成为抗T-ALL治疗的一个潜在靶点，在医学领域具有不可估量的应用价值。
附图说明
图1示出USP1在儿童T-ALL骨髓标本中的mRNA及蛋白表达。图1中，(A)T-ALL患儿骨髓标本(n＝169)中USP1的mRNA表达水平显著高于健康人骨髓标本(n＝73，p<0.0001)；(B)Western blot结果显示相对于对照ITP标本，T-ALL患儿骨髓标本中USP1存在高表达；(C)Western blot结果显示1例T-ALL患儿初诊(ND)-缓解(CR)-复发(RE)成对骨髓标本中，USP1在初诊和复发标本中表达上调，缓解期不表达。
图2示出敲降USP1对Jurkat细胞增殖和凋亡的影响。图2中，(A)Western blot结果显示Jurkat细胞中USP1的2个shRNA靶点显著下调USP1的蛋白表达水平；(B)CCK-8细胞增殖结果显示敲降USP1后Jurkat细胞的增殖能力显著降低；(C)流式细胞仪检测USP1的RNA干扰重组白血病细胞中的细胞凋亡比例；(D)重组白血病细胞细胞凋亡比例柱型统计图。
图3示出USP1抑制剂ML323对Jurkat细胞增殖和凋亡的影响。图3中，(A)USP1抑制剂ML323(1μM和10μM)可以有效抑制Jurkat细胞的增殖；(B)流式细胞仪检测USP1抑制剂ML323(50μM)处理细胞后的细胞凋亡比例；(C)USP1抑制剂ML323(50μM)处理细胞后的细胞凋亡比例柱型统计图。
图4示出Jurkat细胞中敲降USP1后的转录组测序结果。图4中，(A)USP1 sh-RNA敲降组和sh-Control对照组差异表达基因火山图；(B)GSEA分析显示敲降USP1后促进细胞凋亡；(C)GSEA分析显示敲降USP1后细胞增殖通路受抑制。
图1-4中，sh-Control、USP1 sh-1和USP1 sh-2分别代表重组白血病细胞Jurkat/GV493-sh-Control、Jurkat/GV493-USP1-sh-1和Jurkat/GV493-USP1-sh-2。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
以下结合具体实施例，对本发明作进一步说明。应理解，以下实施例仅用于说明本发明而非用于限定本发明的范围。
AnnexinV细胞凋亡检测试剂盒购自eBioscience，货号88-8007-72。
CCK-8细胞增殖检测试剂盒购自日本同仁化学，货号CK04。
实施例1：去泛素化酶USP1在儿童T-ALL中过表达
1、mRNA水平过表达
NCBI GEO数据库(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/geo)下载健康儿童及儿童T-ALL患儿骨髓标本的基因表达谱结果(GSE13159)，采用T-Test分析，我们发现在儿童T-ALL骨髓标本(n＝169)中USP1 mRNA表达水平显著高于健康儿童骨髓标本(n＝73,p<0.0001)，结果如图1中A所示。
2、蛋白水平过表达
采用肝素抗凝管抽取2ml T-ALL患儿的骨髓细胞，加入5ml的红细胞裂解液混匀，静置2分钟后100g离心5分钟，弃上清并重复上述步骤，然后用生理盐水将管底细胞洗两遍，去上清，收集细胞。
采用RIPA裂解液(购自北京普利莱基因技术有限公司，货号C1053)提取总蛋白，以GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)为内参，进行Western blot检测，其中使用USP1多克隆抗体(购自proteintech，货号14346-1-AP)或GAPDH单克隆抗体(购自上海康成生物工程有限公司，货号KC-5G5)进行一抗孵育，使用结合辣根过氧化物酶的羊抗兔二抗(Anti-rabbitIgG,HRP-linked Antibody，购自Cell Signaling Technology公司，货号7074)进行二抗孵育，最后使用Super ECL超敏发光液(购自北京普利莱基因技术有限公司，货号P1030)进行显色反应。USP1(分子量为110kDa，100kDa)，GAPDH(分子量34kDa)。结果如图1中B所示，结果表明，在4例T-ALL患儿骨髓标本(泳道1、2、3、5)中存在USP1的表达，而对照样品(特发性血小板减少性紫癜，ITP)中不表达USP1。
对T-ALL患儿初诊(ND)-缓解(CR)-复发(RE)成对骨髓标本进行Western blot检测，结果如图1中C所示，结果表明，初诊和复发样本中都有USP1的表达，而缓解期无表达，提示USP1蛋白表达上调有可能与T-ALL的复发相关。
实施例2：去泛素化酶USP1的RNA干扰重组表达载体的构建
1、RNA干扰靶序列的选择
针对去泛素化酶USP1编码基因USP1的全长cDNA序列(SEQ ID NO:14)，选择如下两段DNA序列为RNA干扰的靶序列：
sh-1:SEQ ID NO:14的第2574-2594位(即5’-CCAGTGACCAAACAGGCATTA-3’)
sh-2:SEQ ID NO:14的第2030-2050位(即5’-GCTAGTGGTTTGGAGTTTGAT-3’)
SEQ ID NO:14中第422-2779位为开放阅读框，编码SEQ ID NO:15所示的去泛素化酶USP1。
2、小干扰RNA(siRNA)
分别设计针对步骤1去泛素化酶USP1两种靶序列的两种siRNA，siRNA-1和siRNA-2，其中，siRNA-1的靶序列为sh-1，siRNA-2的靶序列为sh-2。
siRNA-1
siRNA-1-F:5’-ccagugaccaaacaggcauua-3’(SEQ ID NO:1)
siRNA-1-R:5’-uaaugccuguuuggucacugg-3’(SEQ ID NO:2)
siRNA-2
siRNA-2-F:5’-gcuagugguuuggaguuugau-3’(SEQ ID NO:3)
siRNA-2-R:5’-aucaaacuccaaaccacuagc-3’(SEQ ID NO:4)
3、短发夹RNA(shRNA)
根据步骤2的两种siRNA，设计产生siRNA-1的shRNA-1和产生siRNA-2的shRNA-2。
shRNA-1和shRNA-2的序列如下(大写字母为环序列，其余序列为茎序列，两段茎序列形成反向重复序列)：
shRNA-1：5’-ccagugaccaaacaggcauuaCUCGAGuaaugccuguuuggucacugg-3’(SEQ IDNO:5)
shRNA-2：5’-gcuagugguuuggaguuugauCUCGAGaucaaacuccaaaccacuagc-3’(SEQ IDNO:6)。
同时，设计shRNA-Control作为对照，NCBI数据库中检索，该序列和人类基因组中的任何序列没有连续16个碱基的同源性，因此用来作为阴性对照。
shRNA-Control：5’-uucuccgaacgugucacguUCUCUUGAAacgugacacguucggagaa-3’(SEQ ID NO:7)
4、编码siRNA及shRNA的DNA分子的设计与合成
(1)以sh-1为靶点的表达shRNA-1的双链DNA分子(名称为USP1 sh-1)的两条单链DNA序列如下：
USP1-1-F:5’-CCGGccagtgaccaaacaggcattaCTCGAGttgtcacttgtatttggctgcTTTTTG-3’(SEQ
ID NO:8)
USP1-1-R:5’-AATTCAAAAAccagtgaccaaacaggcattaCTCGAGttgtcacttgtatttggctgc-3’
(SEQ ID NO:9)。
(2)以sh-2为靶点的表达shRNA-2的双链DNA分子(名称为USP1 sh-2)的两条单链DNA序列如下：
USP1-2-F:5’-CCGGgcagcccttagagatttgtttCTCGAGaaacaaatctctaagggctgcTTTTTG-3’(SEQ
ID NO:10)
USP1-2-R:5’-AATTCAAAAAgcagcccttagagatttgtttCTCGAGaaacaaatctctaagggctgc-3’
(SEQ ID NO:11)。
(3)shRNA-Control的双链DNA分子(名称为sh-Control)的两条单链DNA序列如下：
shRNA-Control-F:5’-CCGGttctccgaacgtgtcacgtTTCAAGAGAacgtgacacgttcggagaaTTTTT G-3’(SEQ ID NO:12)
shRNA-Control-R:5’-AATTCAAAAAttctccgaacgtgtcacgtTCTCTTGAAacgtgacacgttcggag aa-3’(SEQ ID NO:13)。
上述6条单链DNA由上海吉凯基因医学科技股份有限公司合成，下划线部分分别为AgeⅠ和EcoRⅠ的粘性末端序列。
5、去泛素化酶USP1的RNA干扰重组表达载体的构建
(1)载体酶切
配制50μl酶切体系(AgeⅠ和EcoRⅠ均购自NEB公司，货号分别为R0552V和R0101V)，加入载体GV493纯化质粒(购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司)，置于37℃反应3h或过夜。对载体酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳，回收目的条带，得到双酶切线性化的载体。
(2)引物退火形成双链DNA
将上述步骤4互补的单链DNA干粉溶解于退火缓冲液中，90℃水浴15分钟，自然冷却至室温，单链引物退火形成双链DNA。
(3)退火产物与载体进行连接
通过T4 DNA连接酶(购自Thermo Scientific，货号EL0016)将步骤(1)得到的双酶切线性化的载体和步骤(2)得到的双链DNA连接，16℃连接1-3h或连接过夜。
(4)转化
将步骤(3)得到的10μL连接产物加入到100μL TOP10感受态细胞(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号CB104)中，轻弹管壁数下混匀，在冰上放置30min。42℃热激90s，冰水浴孵育2min。加入500μL LB培养基，置于37℃摇床振荡培养1h。取适量菌液均匀涂布在含有氨苄青霉素(购自天根生化科技(北京)有限公司，货号RT501，终浓度为50μg/ml)的平板上，在恒温培养箱中倒置培养12-16h。
(5)PCR鉴定
在超净工作台中，用无菌的枪头挑取单个菌落至20μL鉴定体系中(Taq Plus DNApolymerase，购自Vazyme，货号P201-D3)，吹打混匀，置于PCR仪中进行反应。通过琼脂糖凝胶电泳鉴定阳性克隆。
通过上述过程，分别获得RNA干扰重组表达载体GV493-USP1-sh-1、GV493-USP1-sh-2和GV493-sh-Control。
实施例3：去泛素化酶USP1 RNA干扰重组表达载体慢病毒感染白血病细胞及Western blot检测重组白血病细胞中去泛素化酶USP1的表达
1、去泛素化酶USP1 RNA干扰重组表达载体慢病毒感染白血病细胞
(1)RNA干扰重组表达载体慢病毒包装
采用目的基因GV493-USP1-sh-1、GV493-USP1-sh-2或对照序列GV493-sh-Control质粒、病毒包装辅助质粒pHelper 1.0和pHelper2.0(购自上海吉凯基因医学科技股份有限公司)共转染293T细胞，转染完成后的48-72h提取上清液进行病毒收获。于4℃、4000g离心10min，除去细胞碎片；以0.45μm滤器过滤上清液于40ml超速离心管中；分别配平样品，将带有病毒上清液的超速离心管逐一放入至Beckman超速离心机内，设置离心参数为25000rpm，离心时间为2h，离心温度控制在4℃；离心结束后，弃去上清，尽量去除残留在管壁上的液体，加入病毒保存液(可用PBS或细胞培养基替代)，轻轻反复吹打重悬；经充分溶解后，高速离心10000rpm、5min后，取上清按要求分装，得到目的基因GV493-USP1-sh-1、GV493-USP1-sh-2或对照序列GV493-sh-Control的病毒液。
(2)感染用细胞的培养
转染前24h，用含有10％胎牛血清(FBS，购自Thermo Fisher公司，货号10099141C)的RPMI-1640培养基(购自江苏凯基生物技术股份有限公司，货号KGM31800H-500)，在15ml培养皿、37℃和5％CO2条件下培养T-ALL细胞系Jurkat(购自国家实验细胞资源共享服务平台，货号3111C0001CCC000347)。
(3)慢病毒感染
用RPMI-1640完全培养基制备密度为5×104个/ml的Jurkat细胞悬液，取1ml加入6孔板中，MOI为20，加入相应慢病毒(目的基因GV493-USP1-sh-1、GV493-USP1-sh-2或对照序列GV493-sh-Control的病毒液)，37℃培养12小时后更换为新的RPMI-1640完全培养基，继续培养。感染96小时后，300g离心5分钟收集重组白血病细胞Jurkat/GV493-USP1-sh-1、Jurkat/GV493-USP1-sh-2和Jurkat/GV493-sh-Control进行细胞凋亡(采用AnnexinV细胞凋亡检测试剂盒，进行AnnexinV-APC单染，分别用流式细胞仪收集10000个细胞，对细胞的凋亡百分比进行T-Test统计分析，观察白血病细胞系在凋亡方面的变化特点)和增殖检测(用RPMI-1640完全培养基制备密度为5×104个/ml的细胞悬液，接种至96孔板，每孔5000个细胞，100μl，每种细胞三孔重复，检测5天，铺5张96孔板；每天取出一张96孔板，采用CCK-8细胞增殖检测试剂盒，加入10μl CCK-8试剂于每孔中，4小时后酶标仪450nm检测OD值，并进行T-Test分析)。结果如图2中B、C和D所示，结果表明，重组白血病细胞Jurkat/GV493-USP1-sh-1、Jurkat/GV493-USP1-sh-2和对照Jurkat/GV493-sh-Control的细胞凋亡比例分别为24％、43％和2.4％，说明RNA干扰重组表达载体GV493-USP1-sh-1、GV493-USP1-sh-2能够有效降低/抑制USP1在细胞中的表达，Jurkat/GV493-USP1-sh-1和Jurkat/GV493-USP1-sh-2细胞凋亡比例是对照重组白血病细胞Jurkat/GV493-sh-Control的10倍和17.9倍，并且重组白血病细胞Jurkat/GV493-USP1-sh-1、Jurkat/GV493-USP1-sh-2的增殖速度显著低于对照Jurkat/GV493-sh-Control细胞。
2、Western blot检测重组白血病细胞中去泛素化酶USP1的表达
取慢病毒感染96小时后的三种重组白血病细胞Jurkat/GV493-USP1-sh-1、Jurkat/GV493-USP1-sh-2、Jurkat/GV493-sh-Control，按照实施例1中Western blot过程检测去泛素化酶USP1的表达。结果如图2中A所示，结果表明，含RNA干扰重组表达载体的重组白血病细胞Jurkat/GV493-USP1-sh-1和Jurkat/GV493-USP1-sh-2中，去泛素化酶USP1表达水平均显著低于含对照载体的重组白血病细胞Jurkat/GV493-sh-Control。
实施例4：USP1抑制剂ML323促进T-ALL细胞凋亡并抑制细胞增殖
1、去泛素化酶USP1抑制剂ML323处理白血病细胞
用RMPI-1640完全培养基制备密度为105个/ml的Jurkat细胞悬液，取1ml加入6孔板中。然后加入ML323(购自Selleck公司，货号S7529)，终浓度为1μM、10μM及50μM。对照组使用DMSO，购自Sigma公司，货号D2650。24h后收集细胞进行细胞凋亡和增殖检测。
2、白血病细胞的凋亡检测
300g离心5分钟收集DMSO和USP1抑制剂ML323处理24h的白血病细胞Jurkat，采用AnnexinV细胞凋亡检测试剂盒(购自eBioscience，货号88-8007-72)进行双染(AnnexinV-APC+7-AAD)，分别用流式细胞仪收集10000个细胞，对细胞的凋亡百分比进行T-Test统计分析，观察白血病细胞系在凋亡方面的变化特点。结果如图3中B和C所示，结果表明，USP1抑制剂ML323组和对照DMSO组的凋亡比例分别为31.7％和1.3％，抑制剂组的细胞凋亡比例是对照组的24倍，说明USP1抑制剂ML323能够促进白血病细胞发生凋亡。
3、白血病细胞的增殖检测
按照实施例3的方法进行细胞增殖检测，结果如图3中A所示，结果表明，相对于对照DMSO组，USP1抑制剂ML323可以有效抑制Jurkat细胞的生长。
实施例3和4证明，去泛素化酶USP1是一个抗凋亡、促增殖的分子，在T-ALL细胞中具有抑制细胞凋亡、促进细胞增殖的作用，抑制USP1的表达或加入其特异性抑制剂可促进肿瘤细胞——T-ALL白血病细胞发生凋亡，抑制细胞增殖。
实施例5：转录组测序
1、RNA提取与检测
采用标准提取方法从重组白血病细胞Jurkat/GV493-USP1-sh-1和对照Jurkat/GV493-sh-Control细胞中提取RNA，随后对RNA样品进行严格质控，质控标准主要包括以下3个方面：琼脂糖凝胶电泳：分析样品RNA完整性及是否存在DNA污染；NanoPhotometerspectrophotometer：检测RNA纯度(OD260/280及OD260/230比值)；Agilent2100bioanalyzer：精确检测RNA完整性。
2、文库构建与质检
mRNA的获取主要有两种方式：一是利用真核生物大部分mRNA都带有polyA尾的结构特征，通过Oligo(dT)磁珠富集带有polyA尾的mRNA；二是从总RNA中去除核糖体RNA，从而得到mRNA。随后在NEB Fragmentation Buffer中用二价阳离子将得到的mRNA随机打断，按照NEB普通建库方式或链特异性建库方式进行建库。
文库构建完成后，先使用Qubit2.0 Fluorometer进行初步定量，稀释文库至1.5ng/μl，随后使用Agilent 2100bioanalyzer对文库的insert size进行检测，insertsize符合预期后，qRT-PCR对文库有效浓度进行准确定量(文库有效浓度高于2nM)，以保证文库质量。
3、上机测序
库检合格后，把不同文库按照有效浓度及目标下机数据量的需求pooling后进行Illumina测序。测序的基本原理是边合成边测序(Sequencing by Synthesis)。在测序的flow cell中加入四种荧光标记的dNTP、DNA聚合酶以及接头引物进行扩增，在每一个测序簇延伸互补链时，每加入一个被荧光标记的dNTP就能释放出相对应的荧光，测序仪通过捕获荧光信号，并通过计算机软件将光信号转化为测序峰，从而获得待测片段的序列信息。
4、数据分析
对转录组测序结果进行基因集富集分析(GSEA)。
转录组测序结果如图4所示，结果表明：敲降USP1后可增强促凋亡基因的表达，抑制细胞增殖通路，这些与细胞表型实验结果(实施例3)是一致的。
序列表
<110> 首都医科大学附属北京儿童医院
<120> 降低USP1表达的物质在制备治疗儿童T系急性淋巴细胞白血病的药物中的应用
<130> DSP1F201584JW
<160> 15
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
ccagugacca aacaggcauu a 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
uaaugccugu uuggucacug g 21
<210> 3
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
gcuagugguu uggaguuuga u 21
<210> 4
<211> 21
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
aucaaacucc aaaccacuag c 21
<210> 5
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ccagugacca aacaggcauu acucgaguaa ugccuguuug gucacugg 48
<210> 6
<211> 48
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
gcuagugguu uggaguuuga ucucgagauc aaacuccaaa ccacuagc 48
<210> 7
<211> 47
<212> RNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
uucuccgaac gugucacguu cucuugaaac gugacacguu cggagaa 47
<210> 8
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
ccggccagtg accaaacagg cattactcga gttgtcactt gtatttggct gctttttg 58
<210> 9
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
aattcaaaaa ccagtgacca aacaggcatt actcgagttg tcacttgtat ttggctgc 58
<210> 10
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
ccgggcagcc cttagagatt tgtttctcga gaaacaaatc tctaagggct gctttttg 58
<210> 11
<211> 58
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
aattcaaaaa gcagccctta gagatttgtt tctcgagaaa caaatctcta agggctgc 58
<210> 12
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
ccggttctcc gaacgtgtca cgtttcaaga gaacgtgaca cgttcggaga atttttg 57
<210> 13
<211> 57
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 13
aattcaaaaa ttctccgaac gtgtcacgtt ctcttgaaac gtgacacgtt cggagaa 57
<210> 14
<211> 3602
<212> DNA
<213> 智人(Homo sapiens)
<220>
<221> CDS
<222> (422)..(2779)
<400> 14
gaaaacgcgc caagttcccc tcggtggcgg agtgctaaag accctagcgg ttcaggcgtt 60
cggcgagcgg ggccgctgct tgttgcgctc ctggctctcc cggggcgggc gcagatgggc 120
gccgctcccg ggatgtagtt ggtgttggtg caagacggga gcgagcggcg gtcggggttc 180
ccgctcttgg gagcggatgg tcactccccc gcggggaggg cgagccgacc agattttcct 240
ggggccgggg acccggcggg ctcggggcag ggactcacct gtcgcaccca cactcattcg 300
ggttggactt gccggcgtca ccgccgcgga cttcgctttg ggccatgacc agatataatt 360
ggtgattaca actttcctct ataaattaac tcttgacact ccttgggatt tgaagaaaaa a 421
atg cct ggt gtc ata cct agt gaa agt aat gga ctt tca aga ggt agc 469
Met Pro Gly Val Ile Pro Ser Glu Ser Asn Gly Leu Ser Arg Gly Ser
5 10 15
cct tca aag aaa aac aga ctt tcc tta aag ttt ttt cag aaa aag gaa 517
Pro Ser Lys Lys Asn Arg Leu Ser Leu Lys Phe Phe Gln Lys Lys Glu
20 25 30
act aag aga gct ttg gat ttc aca gat tct caa gaa aat gaa gaa aaa 565
Thr Lys Arg Ala Leu Asp Phe Thr Asp Ser Gln Glu Asn Glu Glu Lys
35 40 45
gct tct gaa tat aga gca tct gaa att gat caa gtt gtt cct gca gca 613
Ala Ser Glu Tyr Arg Ala Ser Glu Ile Asp Gln Val Val Pro Ala Ala
50 55 60
cag tct tca cct ata aac tgt gag aag aga gaa aac ttg tta cca ttt 661
Gln Ser Ser Pro Ile Asn Cys Glu Lys Arg Glu Asn Leu Leu Pro Phe
65 70 75 80
gtg gga ctg aat aat ctc ggc aat act tgc tat ctt aat agt ata ctt 709
Val Gly Leu Asn Asn Leu Gly Asn Thr Cys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu
85 90 95
cag gta tta tat ttt tgt ccc ggt ttt aaa tct gga gta aag cac tta 757
Gln Val Leu Tyr Phe Cys Pro Gly Phe Lys Ser Gly Val Lys His Leu
100 105 110
ttt aat att att tca agg aag aaa gaa gct cta aag gat gaa gcc aat 805
Phe Asn Ile Ile Ser Arg Lys Lys Glu Ala Leu Lys Asp Glu Ala Asn
115 120 125
caa aaa gac aag gga aat tgc aaa gaa gat tct ttg gca agt tat gaa 853
Gln Lys Asp Lys Gly Asn Cys Lys Glu Asp Ser Leu Ala Ser Tyr Glu
130 135 140
ttg ata tgc agt tta cag tcc tta atc att tcg gtt gaa cag ctc cag 901
Leu Ile Cys Ser Leu Gln Ser Leu Ile Ile Ser Val Glu Gln Leu Gln
145 150 155 160
gct agt ttt ctc tta aat cca gag aaa tat act gat gaa ctt gcc act 949
Ala Ser Phe Leu Leu Asn Pro Glu Lys Tyr Thr Asp Glu Leu Ala Thr
165 170 175
cag cca agg cga ctg ctt aac aca ctg agg gaa ctc aac cct atg tat 997
Gln Pro Arg Arg Leu Leu Asn Thr Leu Arg Glu Leu Asn Pro Met Tyr
180 185 190
gaa gga tat cta cag cat gat gca cag gaa gta tta caa tgt att ttg 1045
Glu Gly Tyr Leu Gln His Asp Ala Gln Glu Val Leu Gln Cys Ile Leu
195 200 205
gga aac att caa gaa aca tgc caa ctc cta aaa aaa gaa gaa gta aaa 1093
Gly Asn Ile Gln Glu Thr Cys Gln Leu Leu Lys Lys Glu Glu Val Lys
210 215 220
aat gtg gca gaa tta cct act aag gta gaa gaa ata cct cat ccg aaa 1141
Asn Val Ala Glu Leu Pro Thr Lys Val Glu Glu Ile Pro His Pro Lys
225 230 235 240
gag gaa atg aat ggt att aac agc ata gag atg gac agt atg agg cat 1189
Glu Glu Met Asn Gly Ile Asn Ser Ile Glu Met Asp Ser Met Arg His
245 250 255
tct gaa gac ttt aaa gag aaa ctc cca aaa gga aat ggg aaa aga aaa 1237
Ser Glu Asp Phe Lys Glu Lys Leu Pro Lys Gly Asn Gly Lys Arg Lys
260 265 270
agt gac act gaa ttt ggt aac atg aag aaa aaa gtt aaa tta tcc aag 1285
Ser Asp Thr Glu Phe Gly Asn Met Lys Lys Lys Val Lys Leu Ser Lys
275 280 285
gaa cac cag tca ttg gaa gag aac cag aga caa act aga tca aaa aga 1333
Glu His Gln Ser Leu Glu Glu Asn Gln Arg Gln Thr Arg Ser Lys Arg
290 295 300
aaa gct aca agt gat aca tta gag agt cct cct aaa ata att ccc aag 1381
Lys Ala Thr Ser Asp Thr Leu Glu Ser Pro Pro Lys Ile Ile Pro Lys
305 310 315 320
tat att tct gaa aat gag agt cca aga ccc tca caa aag aaa tca aga 1429
Tyr Ile Ser Glu Asn Glu Ser Pro Arg Pro Ser Gln Lys Lys Ser Arg
325 330 335
gtt aaa ata aat tgg tta aag tct gca act aag caa ccc agc att ctt 1477
Val Lys Ile Asn Trp Leu Lys Ser Ala Thr Lys Gln Pro Ser Ile Leu
340 345 350
tct aaa ttt tgt agt ctg gga aaa ata aca aca aac caa gga gtc aaa 1525
Ser Lys Phe Cys Ser Leu Gly Lys Ile Thr Thr Asn Gln Gly Val Lys
355 360 365
gga caa tct aaa gaa aat gaa tgt gat cct gaa gag gac ttg ggg aag 1573
Gly Gln Ser Lys Glu Asn Glu Cys Asp Pro Glu Glu Asp Leu Gly Lys
370 375 380
tgt gaa agt gat aac aca act aat ggt tgt gga ctt gaa tct cca gga 1621
Cys Glu Ser Asp Asn Thr Thr Asn Gly Cys Gly Leu Glu Ser Pro Gly
385 390 395 400
aat act gtt aca cct gta aat gtt aat gaa gtt aaa ccc ata aac aaa 1669
Asn Thr Val Thr Pro Val Asn Val Asn Glu Val Lys Pro Ile Asn Lys
405 410 415
ggt gaa gaa caa att ggt ttt gag cta gtg gag aaa tta ttt caa ggt 1717
Gly Glu Glu Gln Ile Gly Phe Glu Leu Val Glu Lys Leu Phe Gln Gly
420 425 430
cag ctg gta tta agg acg cgt tgc ttg gaa tgt gaa agt tta aca gaa 1765
Gln Leu Val Leu Arg Thr Arg Cys Leu Glu Cys Glu Ser Leu Thr Glu
435 440 445
aga aga gaa gat ttt caa gac atc agt gtg cca gta caa gaa gat gag 1813
Arg Arg Glu Asp Phe Gln Asp Ile Ser Val Pro Val Gln Glu Asp Glu
450 455 460
ctt tcc aaa gta gag gag agt tct gaa att tct cca gag cca aaa aca 1861
Leu Ser Lys Val Glu Glu Ser Ser Glu Ile Ser Pro Glu Pro Lys Thr
465 470 475 480
gaa atg aag acc ctg aga tgg gca att tca caa ttt gct tca gta gaa 1909
Glu Met Lys Thr Leu Arg Trp Ala Ile Ser Gln Phe Ala Ser Val Glu
485 490 495
agg att gta gga gaa gat aaa tat ttc tgt gaa aac tgc cat cat tat 1957
Arg Ile Val Gly Glu Asp Lys Tyr Phe Cys Glu Asn Cys His His Tyr
500 505 510
act gaa gct gaa cga agt ctt ttg ttt gac aaa atg cct gaa gtt ata 2005
Thr Glu Ala Glu Arg Ser Leu Leu Phe Asp Lys Met Pro Glu Val Ile
515 520 525
act att cat ttg aag tgc ttt gct gct agt ggt ttg gag ttt gat tgt 2053
Thr Ile His Leu Lys Cys Phe Ala Ala Ser Gly Leu Glu Phe Asp Cys
530 535 540
tat ggt ggt gga ctt tcc aag atc aac act cct tta ttg aca cct ctt 2101
Tyr Gly Gly Gly Leu Ser Lys Ile Asn Thr Pro Leu Leu Thr Pro Leu
545 550 555 560
aaa ttg tca cta gaa gaa tgg agc aca aag cca act aac gac agc tat 2149
Lys Leu Ser Leu Glu Glu Trp Ser Thr Lys Pro Thr Asn Asp Ser Tyr
565 570 575
gga tta ttt gcg gtt gtg atg cat agt ggc att aca att agt agt ggg 2197
Gly Leu Phe Ala Val Val Met His Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ser Gly
580 585 590
cat tac act gct tct gtt aaa gtc act gac ctt aac agt tta gaa cta 2245
His Tyr Thr Ala Ser Val Lys Val Thr Asp Leu Asn Ser Leu Glu Leu
595 600 605
gat aaa gga aat ttt gtg gtt gac caa atg tgt gaa ata ggt aag cca 2293
Asp Lys Gly Asn Phe Val Val Asp Gln Met Cys Glu Ile Gly Lys Pro
610 615 620
gaa cca ttg aat gag gag gaa gca agg ggt gtg gtt gag aat tat aat 2341
Glu Pro Leu Asn Glu Glu Glu Ala Arg Gly Val Val Glu Asn Tyr Asn
625 630 635 640
gat gaa gaa gtg tca att aga gtt ggt gga aat aca cag cca agt aaa 2389
Asp Glu Glu Val Ser Ile Arg Val Gly Gly Asn Thr Gln Pro Ser Lys
645 650 655
gtt ttg aac aaa aaa aat gta gaa gct att gga ctt ctt gga gga caa 2437
Val Leu Asn Lys Lys Asn Val Glu Ala Ile Gly Leu Leu Gly Gly Gln
660 665 670
aag agc aaa gca gat tat gag cta tac aac aaa gcc tct aat cct gat 2485
Lys Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Leu Tyr Asn Lys Ala Ser Asn Pro Asp
675 680 685
aag gtt gct agt aca gcg ttt gct gaa aat aga aat tct gag act agt 2533
Lys Val Ala Ser Thr Ala Phe Ala Glu Asn Arg Asn Ser Glu Thr Ser
690 695 700
gat act act ggg acc cat gaa tct gat aga aac aag gaa tcc agt gac 2581
Asp Thr Thr Gly Thr His Glu Ser Asp Arg Asn Lys Glu Ser Ser Asp
705 710 715 720
caa aca ggc att aat att agt gga ttt gag aac aaa att tca tac gta 2629
Gln Thr Gly Ile Asn Ile Ser Gly Phe Glu Asn Lys Ile Ser Tyr Val
725 730 735
gtg caa agc tta aag gag tat gag ggg aag tgg ttg ctt ttt gat gat 2677
Val Gln Ser Leu Lys Glu Tyr Glu Gly Lys Trp Leu Leu Phe Asp Asp
740 745 750
tct gaa gtc aaa gtt act gaa gag aag gac ttt ctg aat tct ctt tcc 2725
Ser Glu Val Lys Val Thr Glu Glu Lys Asp Phe Leu Asn Ser Leu Ser
755 760 765
cct tct aca tct cct act tct act cct tac ttg cta ttt tat aag aaa 2773
Pro Ser Thr Ser Pro Thr Ser Thr Pro Tyr Leu Leu Phe Tyr Lys Lys
770 775 780
tta tag agtgagtgta ttttccttgt gtatatatta aacacaccca tacaaacatt 2829
Leu
785
ggtaaagttg attacatcaa agaatcttta gcttatcttt tgaagctact ggatattatt 2889
ggtctctcta ggtttttata taaatagtga aatttgaatt actgaaaacc atgttaattt 2949
ttagaactca ttttcctcag tagagactag tgatgcatta gcttctggga acaaacttgt 3009
atcggttctt aattaaatta tccaaaacgg aggcatttaa acacttggat ttacaccagt 3069
cttttgtgtt tgctttttaa aataaagtgc tcgtatttgt attctccata ttttggagta 3129
attatctaca tgatgtttat agttcctgtg gtttttcacc caagaagcag aatctcattc 3189
agtacattta gttttataag agtcatgaag ctaaatcctt gggctatgtc agaggcacaa 3249
agtctagaat gtgtgtattc acaatggtgt atgtacattt tgtgccttga ttcacttaga 3309
agtgtctcag aaaacctgga cagttcgctt ctacacaaga attttatatg tatttatgaa 3369
gatgattctg taccctagta tatctttttg ggcatggact aatttgtatc tgtttaactc 3429
atattctgca cgatctgtat atagtacatc aaacttagag gtgtgacctt aaatttaact 3489
ttttttaaaa actgggaggt caataaaatt taaactgctt aactatgtat atgaatattt 3549
gaatttttta cttgtatatt tttataaata cagctgagtt ttcttaaagc gaa 3602
<210> 15
<211> 785
<212> PRT
<213> 智人(Homo sapiens)
<400> 15
Met Pro Gly Val Ile Pro Ser Glu Ser Asn Gly Leu Ser Arg Gly Ser
1 5 10 15
Pro Ser Lys Lys Asn Arg Leu Ser Leu Lys Phe Phe Gln Lys Lys Glu
20 25 30
Thr Lys Arg Ala Leu Asp Phe Thr Asp Ser Gln Glu Asn Glu Glu Lys
35 40 45
Ala Ser Glu Tyr Arg Ala Ser Glu Ile Asp Gln Val Val Pro Ala Ala
50 55 60
Gln Ser Ser Pro Ile Asn Cys Glu Lys Arg Glu Asn Leu Leu Pro Phe
65 70 75 80
Val Gly Leu Asn Asn Leu Gly Asn Thr Cys Tyr Leu Asn Ser Ile Leu
85 90 95
Gln Val Leu Tyr Phe Cys Pro Gly Phe Lys Ser Gly Val Lys His Leu
100 105 110
Phe Asn Ile Ile Ser Arg Lys Lys Glu Ala Leu Lys Asp Glu Ala Asn
115 120 125
Gln Lys Asp Lys Gly Asn Cys Lys Glu Asp Ser Leu Ala Ser Tyr Glu
130 135 140
Leu Ile Cys Ser Leu Gln Ser Leu Ile Ile Ser Val Glu Gln Leu Gln
145 150 155 160
Ala Ser Phe Leu Leu Asn Pro Glu Lys Tyr Thr Asp Glu Leu Ala Thr
165 170 175
Gln Pro Arg Arg Leu Leu Asn Thr Leu Arg Glu Leu Asn Pro Met Tyr
180 185 190
Glu Gly Tyr Leu Gln His Asp Ala Gln Glu Val Leu Gln Cys Ile Leu
195 200 205
Gly Asn Ile Gln Glu Thr Cys Gln Leu Leu Lys Lys Glu Glu Val Lys
210 215 220
Asn Val Ala Glu Leu Pro Thr Lys Val Glu Glu Ile Pro His Pro Lys
225 230 235 240
Glu Glu Met Asn Gly Ile Asn Ser Ile Glu Met Asp Ser Met Arg His
245 250 255
Ser Glu Asp Phe Lys Glu Lys Leu Pro Lys Gly Asn Gly Lys Arg Lys
260 265 270
Ser Asp Thr Glu Phe Gly Asn Met Lys Lys Lys Val Lys Leu Ser Lys
275 280 285
Glu His Gln Ser Leu Glu Glu Asn Gln Arg Gln Thr Arg Ser Lys Arg
290 295 300
Lys Ala Thr Ser Asp Thr Leu Glu Ser Pro Pro Lys Ile Ile Pro Lys
305 310 315 320
Tyr Ile Ser Glu Asn Glu Ser Pro Arg Pro Ser Gln Lys Lys Ser Arg
325 330 335
Val Lys Ile Asn Trp Leu Lys Ser Ala Thr Lys Gln Pro Ser Ile Leu
340 345 350
Ser Lys Phe Cys Ser Leu Gly Lys Ile Thr Thr Asn Gln Gly Val Lys
355 360 365
Gly Gln Ser Lys Glu Asn Glu Cys Asp Pro Glu Glu Asp Leu Gly Lys
370 375 380
Cys Glu Ser Asp Asn Thr Thr Asn Gly Cys Gly Leu Glu Ser Pro Gly
385 390 395 400
Asn Thr Val Thr Pro Val Asn Val Asn Glu Val Lys Pro Ile Asn Lys
405 410 415
Gly Glu Glu Gln Ile Gly Phe Glu Leu Val Glu Lys Leu Phe Gln Gly
420 425 430
Gln Leu Val Leu Arg Thr Arg Cys Leu Glu Cys Glu Ser Leu Thr Glu
435 440 445
Arg Arg Glu Asp Phe Gln Asp Ile Ser Val Pro Val Gln Glu Asp Glu
450 455 460
Leu Ser Lys Val Glu Glu Ser Ser Glu Ile Ser Pro Glu Pro Lys Thr
465 470 475 480
Glu Met Lys Thr Leu Arg Trp Ala Ile Ser Gln Phe Ala Ser Val Glu
485 490 495
Arg Ile Val Gly Glu Asp Lys Tyr Phe Cys Glu Asn Cys His His Tyr
500 505 510
Thr Glu Ala Glu Arg Ser Leu Leu Phe Asp Lys Met Pro Glu Val Ile
515 520 525
Thr Ile His Leu Lys Cys Phe Ala Ala Ser Gly Leu Glu Phe Asp Cys
530 535 540
Tyr Gly Gly Gly Leu Ser Lys Ile Asn Thr Pro Leu Leu Thr Pro Leu
545 550 555 560
Lys Leu Ser Leu Glu Glu Trp Ser Thr Lys Pro Thr Asn Asp Ser Tyr
565 570 575
Gly Leu Phe Ala Val Val Met His Ser Gly Ile Thr Ile Ser Ser Gly
580 585 590
His Tyr Thr Ala Ser Val Lys Val Thr Asp Leu Asn Ser Leu Glu Leu
595 600 605
Asp Lys Gly Asn Phe Val Val Asp Gln Met Cys Glu Ile Gly Lys Pro
610 615 620
Glu Pro Leu Asn Glu Glu Glu Ala Arg Gly Val Val Glu Asn Tyr Asn
625 630 635 640
Asp Glu Glu Val Ser Ile Arg Val Gly Gly Asn Thr Gln Pro Ser Lys
645 650 655
Val Leu Asn Lys Lys Asn Val Glu Ala Ile Gly Leu Leu Gly Gly Gln
660 665 670
Lys Ser Lys Ala Asp Tyr Glu Leu Tyr Asn Lys Ala Ser Asn Pro Asp
675 680 685
Lys Val Ala Ser Thr Ala Phe Ala Glu Asn Arg Asn Ser Glu Thr Ser
690 695 700
Asp Thr Thr Gly Thr His Glu Ser Asp Arg Asn Lys Glu Ser Ser Asp
705 710 715 720
Gln Thr Gly Ile Asn Ile Ser Gly Phe Glu Asn Lys Ile Ser Tyr Val
725 730 735
Val Gln Ser Leu Lys Glu Tyr Glu Gly Lys Trp Leu Leu Phe Asp Asp
740 745 750
Ser Glu Val Lys Val Thr Glu Glu Lys Asp Phe Leu Asn Ser Leu Ser
755 760 765
Pro Ser Thr Ser Pro Thr Ser Thr Pro Tyr Leu Leu Phe Tyr Lys Lys
770 775 780
Leu
785

Claims (10)

1.形成茎环结构的短发夹RNA，其为以下shRNA-1或shRNA-2：
(1)shRNA-1，所述shRNA-1的茎环结构中茎的一条链序列为SEQ ID NO:1，茎的另一条链序列为SEQ ID NO:2；
(2)shRNA-2，所述shRNA-2的茎环结构中茎的一条链序列为SEQ ID NO:3，茎的另一条链序列为SEQ ID NO:4。
2.根据权利要求1所述的短发夹RNA，其特征在于：所述shRNA-1的核苷酸序列为SEQ IDNO:5，所述shRNA-2的核苷酸序列为SEQ ID NO:6。
3.编码权利要求1或2所述的短发夹RNA的DNA分子。
4.与权利要求1或2所述的短发夹RNA相关的生物材料，为如下1)-5)中的任一种：
1)含有权利要求3所述的DNA分子的表达盒；
2)含有权利要求3所述的DNA分子的重组载体、或含有1)所述的表达盒的重组载体；
3)含有权利要求3所述的DNA分子的重组微生物、或含有1)所述的表达盒的重组微生物或含有2)所述的重组载体的重组微生物；
4)含有权利要求3所述的DNA分子的转基因细胞系、或含有1)所述的表达盒的转基因细胞系或含有2)所述的重组载体的转基因细胞系；
5)小干扰RNA，siRNA-1和siRNA-2，其中所述siRNA-1由SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2两条链组成，所述siRNA-2由SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:4两条链组成。
5.治疗和/或预防T系急性淋巴细胞白血病的产品，所述产品的活性成分包括如下b1-b4中的至少一种：
b1、权利要求1或2所述的短发夹RNA；
b2、权利要求3所述的DNA分子；
b3、权利要求4所述的生物材料；
b4、USP1抑制剂。
6.促进T系急性淋巴细胞白血病细胞凋亡的产品，所述产品的活性成分包括如下b1-b4中的至少一种：
b1、权利要求1或2所述的短发夹RNA；
b2、权利要求3所述的DNA分子；
b3、权利要求4所述的生物材料；
b4、USP1抑制剂。
7.抑制T系急性淋巴细胞白血病细胞增殖的产品，所述产品的活性成分包括如下b1-b4中的至少一种：
b1、权利要求1或2所述的短发夹RNA；
b2、权利要求3所述的DNA分子；
b3、权利要求4所述的生物材料；
b4、USP1抑制剂。
8.降低去泛素化酶USP1表达的物质的用途，所述用途为a1-a3中的任一种：
a1、治疗和/或预防T系急性淋巴细胞白血病；
a2、促进T系急性淋巴细胞白血病细胞凋亡；
a3、抑制T系急性淋巴细胞白血病细胞增殖。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述降低USP1表达的物质包括如下b1-b4中的至少一种：
b1、权利要求1或2所述的短发夹RNA；
b2、权利要求3所述的DNA分子；
b3、权利要求4所述的生物材料；
b4、USP1抑制剂。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于：所述去泛素化酶USP1的氨基酸序列为SEQID NO:15所示，所述去泛素化酶USP1的基因序列如SEQ ID NO:14的第422-2779位所示。
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