CN114617879B - Sjb2-043作为抑制胶质母细胞瘤的药物的用途 - Google Patents

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Abstract

本发明属于疾病治疗技术领域，具体涉及化合物SJB2‑043或其可药用衍生物在制备用于治疗胶质母细胞瘤的药物的用途。本发明为胶质母细胞瘤的治疗提供了良好的理论和实践基础。

Description

SJB2-043作为抑制胶质母细胞瘤的药物的用途
技术领域
本发明属于疾病治疗技术领域，具体涉及SJB2-043作为抑制胶质母细胞瘤的药物的用途。
背景技术
胶质瘤是中枢神经系统最常见的原发性肿瘤。根据世界卫生组织(WHO)对胶质瘤的分类标准，按照其恶性程度可分为Ⅱ-IV级，其中胶质母细胞瘤(WHO IV级)恶性程度极高，患者生存期短、复发率高、治疗困难。
目前，普遍采用手术加放疗和/或化疗的综合治疗方案来治疗恶性胶质瘤。然而，患者的中位生存期并未达到显著改善。现阶段，临床上将替莫唑胺(TMZ)用作治疗胶质母细胞瘤的一线化疗药物，但由于存在着诸如血脑屏障(BBB)，O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(MGMT)基因启动子甲基程度化低等问题，以替莫唑胺为基本药物的胶质母细胞瘤化疗效果并不理想。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供化合物SJB2-043或其可药用衍生物在制备用于治疗胶质母细胞瘤的药物的用途。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
第一个方面，本发明提供化合物SJB2-043、其药学上可接受的盐或水合物作为抑制胶质母细胞瘤的药物的用途。
可选地，化合物SJB2-043及其药学上可接受的盐、水合物是在细胞水平上抑制胶质母细胞瘤的侵袭、增殖、迁移。
可选地，化合物SJB2-043的IC50值为150-320nmol/L。
另一方面，本发明还提供抑制胶质母细胞瘤的药物，包括载体、赋形剂及权利要求1化合物SJB2-043、其药学上可接受的盐或水合物。
本发明的有益效果在于：
本发明为胶质母细胞瘤的治疗提供了良好的理论和实践基础。
附图说明
图1为将化合物SJB2-043在胶质母细胞瘤原位移植瘤模型上进行注射的实验模式图；
图2为化合物SJB2-043及DMSO对胶质母细胞瘤细胞系T98G、LN18、LN229、U87、U251、GBM1、GBM2、GBM3、GBM4、GBM5、GBM6、GBM7的细胞抑制活性检测结果图，其中，“Cellsurvival index”表示细胞存活指数；
图3为化合物SJB2-043对胶质母细胞瘤细胞系T98G、LN18、LN229、U87、U251、GBM1、GBM2、GBM3、GBM4、GBM5、GBM6、GBM7的IC50值检测结果图；
图4为SJB2-043处理组与DMSO对照组的胶质瘤细胞Transwell小室侵袭、迁移图，其中，“Migration”表示迁移，：“Invasuion”表示侵袭，“Migration cells per field”表示每个拍照视野下的迁移细胞数量，“Invasuion cells per field”表示每个拍照视野下的侵袭细胞数量；
图5为SJB2-043处理组与DMSO对照组的胶质瘤细胞的增殖曲线，其中，“RelativeOD value”表示相对光密度值；
图6为SJB2-043处理组与DMSO对照组小鼠颅内移植瘤的活体荧光成像图，其中，“Day”表示“天”，“Violuminescene”表示生物荧光,“Photo flux”表示荧光量,“Days aftertumor implantation”表示移植瘤建立后的天数；
图7为SJB2-043处理组与DMSO对照组小鼠的体重变化情况检测结果图，其中，“Days after treatment”表示处理后天数，“weight”表示体重；
图8为SJB2-043处理组与DMSO对照组小鼠的生存情况检测结果图，其中，“Survialrate”表示存活率，“Days after tumor inplantation”表示移植瘤建立后的天数；
图9为SJB2-043处理组与DMSO对照组荷瘤小鼠的全脑切片HE染色结果图，其中，“H&Estaining”表示HE染色。
具体实施方式
所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。
本实施例中，细胞T98G、LN18、LN229、U87、U251购自美国标准菌库(American TypeCulture Collection,ATCC)、GBM1、GBM2、GBM3、GBM4、GBM5、GBM6、GBM7均来自陆军军医大学附属西南医院神经外科提供的胶质母细胞瘤病人肿瘤组织经分离鉴定均为胶质母细胞瘤(WHOⅣ级)。
检测化合物SJB2-043及DMSO对胶质母细胞瘤细胞系T98G、LN18、LN229、U87、U251、GBM1、GBM2、GBM3、GBM4、GBM5、GBM6、GBM7的抑制活性，具体方法为：
(1)将不同胶质母细胞瘤细胞系细胞用PBS缓冲液清洗3次后，用胰酶消化下来，800rmp离心5min；
(2)用含有10％FBS的DMED培养基将胶质母细胞瘤细胞重悬后，细胞计数，调至30个/uL；
(3)将调整好数目的胶质母细胞瘤细胞均匀铺入96孔板，每孔200uL；
(4)将SJB2-043以及与SJB2-043同体积的DMSO分别加入到96孔板中，配制成10uM浓度处理48h；
(5)将CCK-8试剂与完全培养基按照1：9的比例配制成工作液，吸出96孔板中原有培养基后加入100uL CCK-8工作液；
(6)37℃孵育2h后，用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计测定细胞在450nm处的吸光度OD值；结果如图2所示。
检测化合物SJB2-043对胶质母细胞瘤细胞系LN18、LN229、GBM2、GBM3、GSC2、GSC5的半数抑制浓度(IC50)值，具体方法为：
(1)将不同胶质母细胞瘤细胞系细胞用PBS缓冲液清洗3次后，用胰酶消化下来，800rmp离心5min；
(2)用含有10％FBS的DMED培养基将胶质母细胞瘤细胞重悬后，细胞计数，调至40个/uL；
(3)将调整好数目的胶质母细胞瘤细胞均匀铺入96孔板，每孔200uL；
(4)将SJB2-043加入到96孔板中，按每一纵列为一组，分别配制成30nM、60nM、120nM、240nM、480nM、960nM、1920nM、3840nM、7680nM浓度处理48h；
(5)将CCK-8试剂与完全培养基按照1：9的比例配制成工作液，吸出96孔板中原有培养基后加入100uL CCK-8工作液；
(6)37℃孵育2h后，用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计测定细胞在450nm处的吸光度OD值后用GraphPad Prism 8.0软件绘制IC50曲线以及计算IC50值，结果如图3所示。
检测SJB2-043处理组与DMSO对照组的胶质瘤细胞Transwell小室侵袭、迁移指标，具体试验过程为：
(1)Transwell侵袭实验：将Transwell小室放置于24孔板中；
(2)将7.5ulMatrigel胶与7.5ulDMED于冰上混合均匀；
(3)每个小室共计用15ul混合液将其底部铺满、铺匀后吸去多于的混合液；
(4)将铺好胶的小室置于37℃孵箱，20min；
(5)GBM细胞PBS清洗3次后，用Accutase酶消化下来，800rmp离心5min；
(6)将500uL含有10％FBS的DMED加入24孔板中，实验组加入SJB2-043配制成220nM,对照组加入与实验组同体积的DMSO；
(7)计数细胞后用无血清DMEM重悬GBM细胞，取200ul加入Transwell小室上层，确保LN229细胞共计30000个、GBM2细胞40000个，放入37℃培养箱培养24小时；
(8)随后取出小室用PBS清洗3次后浸没于4％多聚甲醛溶液，室温15min；
(9)PBS清洗小室3次后浸没于结晶紫溶液，室温15min；
(10)染色完毕后，将小室放入50mL离心管中加入PBS溶液，轻轻旋转震荡将晶紫溶液洗净，随后用棉棒轻轻旋转擦干净小室上层细胞，在显微镜下观察、拍照。
(11)Transwell迁移实验：除Transwell小室不用预先铺胶，细胞培养时间缩短为12h外，其余操作与Transwell侵袭实验同，结果如图4所示；
检测SJB2-043处理组与DMSO对照组的胶质瘤细胞的增殖情况，具体试验过程为：
(1)胶质母细胞瘤细胞系细胞PBS清洗3次后，用胰酶消化下来，800rmp离心5min；
(2)用含有10％FBS的DMED培养基将胶质母细胞瘤细胞重悬后，细胞计数，调至15个/uL；
(3)将调整好数目的胶质母细胞瘤细胞均匀铺入96孔板，每孔200uL；
(4)将SJB2-043加入到96孔板中，配制成200nM浓度,对照组加入与实验组同体积的DMSO；
(5)将CCK-8试剂与完全培养基按照1：9的比例配制成工作液，吸出96孔板中原有培养基后加入100uL CCK-8工作液；
(6)37℃孵育2h后，用Nanodrop 2000微量紫外分光光度计测定细胞在450nm处的吸光度OD值。待细胞完全贴壁后进行第一次测量，其余每隔24小时进行一次测量，持续9天，结果如图5所示。
检测SJB2-043处理组与DMSO对照组的胶质瘤细胞的颅内移植瘤的荧光成像情况，具体试验过程为：先构建胶质母细胞瘤原位移植瘤模型，具体方法为：1.收集对数生长期的LN229细胞，调整细胞密度为2×105/ul；2.取4-6周龄雌性NOD/SCID小鼠(购自陆军军医大学附属西南医院实验动物中心)，将小鼠用戊巴比妥钠麻醉剂麻醉后展平放置于木板，用已消毒微量进样针将5uL细胞悬液注射入小鼠颅内，进针位点选择在鼠脑前正中线相交与外眦连线后右侧5mm处，进针5mm。在移植瘤接种第10天进行化合物注射，首先将荷瘤小鼠分为SJB2-043注射组和DMSO对照组，其中SJB2-043注射组将SJB2-043以3mg/kg/每天进行腹腔注射，DMSO对照组以与实验组等量的DMSO进行腹腔注射，检测DMSO对照组及实验组的抑制活性，具体为：向每只小鼠腹腔注射200uL Luciferin工作液，随后用IVIS活体动物成像仪观察实验组与对照组小鼠的各自的成瘤情况，结果如图6所示；
检测SJB2-043处理组与DMSO对照组的小鼠的体重变化情况，具体试验过程为：在移植瘤接种第10天，每天固定在下午2点将SJB2-043处理组与DMSO对照组的小鼠放在电子秤上进行称量，记录其体重并绘制体重变化曲线，直至小鼠出现死亡时终止称重和记录，结果如图7所示；
检测SJB2-043处理组与DMSO对照组的荷瘤小鼠的生存情况，具体试验过程为：在移植瘤构建的第一天起，每日观察并记录各组小鼠的生存情况，记录每只小鼠的死亡时间，待小鼠全部死亡后，对各实验组小鼠生存率进行统计学比较，结果如图8所示；
对SJB2-043处理组与DMSO对照组荷瘤小鼠全脑切片HE染色，具体试验过程为：
(1)脱蜡：在烤灯下将样本烘烤30min，按照二甲苯I(15min)→二甲苯II(15min)进行脱蜡处理；
(2)水化：无水酒精I(10min)→无水酒精II(10min)→95％酒精(5min)→85％酒精(5min)→75％酒精(5min)的顺序过缸，在自来水下冲洗玻片3min后用超纯水洗涤切片3次，每次5min；
(3)核染色：将玻片置于苏木素溶液中20sec后自来水洗净，放入盐酸酒精中分化2sec后自来水冲洗10min进行反蓝；
(4)0.5％伊红染液染色20sec；
(5)脱水封片：将玻片依次通过75％酒精(3min)→85％酒精(3min)→95％酒精(3min)→100％酒精(5min)→100％酒精(5min)→二甲苯Ⅰ(20min)→二甲苯Ⅱ(20min)的顺序脱水、透明，放置于通风处过夜后用中性树脂封片并采图，结果如图9显示。
由图2可知，化合物SJB2-043对胶质母细胞具有普遍抑制作用。
由图3可知，低浓度的SJB2-043(IC50在200nM附近)能够显著抑制胶质母细胞瘤生长。
由图4可知，SJB2-043能够显著抑制胶质母细胞瘤的侵袭、迁移。
由图5可知，SJB2-043能够显著抑制胶质母细胞瘤的增殖能力。
由图6可知，SJB2-043能够显著抑制胶质母细胞瘤原位移植瘤生长。
由图7可知，SJB2-043组的荷瘤小鼠的体重下降幅度显著小于DMSO对照组小鼠。
由图8可知，SJB2-043能够显著延长荷瘤小鼠的生存期。
由图9可知，SJB2-043能够显著抑制胶质母细胞瘤原位移植瘤生长。
此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

Claims (3)

1.化合物SJB2-043在制备用于治疗胶质母细胞瘤的药物的用途。
2.如权利要求1所述的用途，其特征在于，化合物SJB2-043是在细胞水平上抑制胶质母细胞瘤的侵袭、增殖、迁移。
3.如权利要求1或2所述的用途，其特征在于，化合物SJB2-043的IC50值为150-320nmol/L。
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