CN105580774B - 一种兔舌癌动物模型的建立方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种兔舌癌动物模型的建立方法，包括以下步骤：建立兔舌鳞癌细胞系；将兔舌鳞癌细胞接种在裸鼠皮下并进行培养；取经过培养的裸鼠皮下肿瘤组织接种在兔舌上，建立兔舌癌模型；基于兔舌癌模型建立高淋巴结转移兔舌癌动物模型，建立具有高淋巴结转移潜能的舌癌动物模型，完整再现舌癌的临床特点及淋巴结转移生物学特性，为舌癌的预防及治疗提供更好的实验基础，可用于抗肿瘤化疗药物的敏感性评价，还可以进行放疗、内分泌治疗、免疫治疗、分子靶向治疗等新治疗手段的研究。
Description
技术领域
本发明涉及生物领域，尤其涉及一种兔舌癌动物模型的建立方法。
背景技术
近年来，随着基础和临床医学研究的不断发展，口腔颌面部鳞状细胞癌 (OSCC)的诊断、治疗水平得到了显著提高，经过以手术、放疗和化疗为主的综合序列治疗后，5年生存率已达到64％左右，但仍有超过1/3的病人5年内死于肿瘤的局部复发和(或)远处转移。早期(I、II期)的口腔癌患者，仍有约25％的病人不能得到治愈，而对于晚期(III、IV期)患者，这一数字则更高。因此，阐明口腔颌面部恶性肿瘤的发病机制，全面提高该病的治愈率和有效地预防其发生、发展，成为口腔颌面-头颈肿瘤科面临的迫切任务。
借助于肿瘤动物模型的间接研究，可有意识地施加或限制各种在自然条件下无法做到的干预因素，以便更准确地观察实验结果并与人类口腔颌面部鳞状细胞癌进行比较，有助于更简洁、更客观地认识该疾病的发生、发展规律，以提高该病的整体疗效和寻找有效的预防方法。因此，使用动物模型具有明显的优越性。对于研究颌面部恶性肿瘤的发生、发展规律及其转归等都具有重要的意义。
适于口腔颌面部恶性肿瘤研究的动物模型至少应具备以下几个特点：①建立在具有正常免疫功能的动物体内；②细胞株本身应是非致免疫性的，即最好是动物细胞自然发生恶性转化后形成的。③动物模型的病理类型、生物学行为应与人口腔颌面部恶性肿瘤基本相似，使用此模型进行的研究结果更具有参考价值。目前国内常用于鳞癌研究的主要是裸鼠移植瘤模型，裸鼠是免疫缺陷动物，不适合肿瘤免疫治疗和生物治疗研究。加之裸鼠平均寿命短等无法满足如抗癌药物的筛选及最佳化疗方案的选择、放化疗结合治疗颌面部转移癌的疗效机制、影像诊断和介入放射治疗学中有关药物的靶向性分布研究等。裸鼠个头太小，也不便于诸如热疗、放疗、介入治疗等局部治疗的实施。显然裸鼠口腔癌模型很难满足基础及临床研究的需要。
发明内容
本发明提供了一种兔舌癌动物模型的建立方法，建立具有高淋巴结转移潜能的舌癌动物模型，完整再现舌癌的临床特点及淋巴结转移生物学特性，为舌癌的预防及治疗提供更好的实验基础。本发明提供的技术方案如下：
一种兔舌癌动物模型的建立方法，包括以下步骤：
建立兔舌鳞癌细胞系；
将兔舌鳞癌细胞接种在裸鼠皮下并进行培养；
取经过培养的裸鼠皮下肿瘤组织接种在兔舌上，建立兔舌癌模型；
基于兔舌癌模型建立高淋巴结转移兔舌癌动物模型。
上述的建立方法，其中，所述建立兔舌鳞癌细胞系的步骤包括：
建立口腔鳞癌动物模型；
将口腔鳞癌动物模型分别以贴块法、消化法和癌腹水培养法进行原代培养；
原代培养首次传代后用反复贴壁和胰酶消化法交替进行纯化。
上述的建立方法，其中，所述将兔舌鳞癌细胞接种在裸鼠皮下并进行培养的步骤包括：
选4周龄BALA/c-nu裸鼠，在SPF条件下饲养；
取兔舌鳞癌细胞培养的第60代细胞；
将上述第60代细胞接种在裸鼠后肢双侧臀部皮下，每只两个接种点。
上述的建立方法，其中，所述取经过培养的裸鼠皮下肿瘤组织接种在兔舌上，建立兔舌癌模型的步骤包括：
无菌切取经过培养的裸鼠皮下成瘤的肿瘤组织并剪成2mm3大小组织块；
将制成的组织块接种在兔舌前三分之二舌缘处，建立兔舌癌模型。
上述的建立方法，其中，所述基于兔舌癌模型建立高淋巴结转移兔舌癌动物模型的步骤包括：
基于兔舌癌模型筛选出发生颈淋巴结转移的兔鳞癌；
基于颈淋巴结转移的兔鳞癌建立高淋巴结转移兔舌癌动物模型。
上述的建立方法，其中，所述基于颈淋巴结转移的兔鳞癌建立高淋巴结转移兔舌癌动物模型的步骤包括：
将颈淋巴结转移的兔子进行培养；
在经过培养的兔子上取淋巴结转移组织并修剪成1mm3小块；
取2只新西兰兔并在臀部皮肤下分别植入所述小块后用1-0号线缝合继续饲养；
取经过饲养后的2只新西兰白兔臀部的肿瘤组织；
取10只新西兰白兔并将上述肿瘤组织植入新西兰白兔的舌体实质内经过培养后选出淋巴结转移的新西兰白兔；
将上述的步骤进行循环操作直到建立高淋巴结转移兔舌癌动物模型。
上述的建立方法，其中，所述建立兔舌鳞癌细胞系的步骤中，原代培养的条件为：在5％CO2、37℃培养箱内的20％RPMI1640兔血清培养基中培养。
上述的建立方法，其中，所述建立兔舌鳞癌细胞系的步骤中，原代培养首次传代后用反复贴壁和胰酶消化法交替进行纯化，在传代时用0.02％的EDTA和0.25％胰蛋白酶1∶4的混合液在37℃温箱内孵育15～20min。
上述的建立方法，其中，所述将兔舌鳞癌细胞接种在裸鼠皮下并进行培养的步骤中，取对数生长期的兔舌鳞癌细胞消化、离心、收集细胞，0.9％生理盐水洗涤1次，血球计数板上计数，用PBS制成细胞悬液，以1×106先后接种在裸鼠后肢双侧臀部皮下，每只两个接种点，共20个接种点。
上述的建立方法，其中，所述取10只新西兰白兔并将上述肿瘤组织植入新西兰白兔的舌体实质内经过培养后选出淋巴结转移的新西兰白兔的步骤中，其中植入的具体位置为舌前三分之二舌缘处的舌体实质内。
本发明提供了一种兔舌癌动物模型的建立方法及制备方法，包括以下步骤：建立兔舌鳞癌细胞系；将兔舌鳞癌细胞接种在裸鼠皮下并进行培养；取经过培养的裸鼠皮下肿瘤组织接种在兔舌上，建立兔舌癌模型；基于兔舌癌模型建立高淋巴结转移兔舌癌动物模型，由于舌癌是最常见的口腔癌，其生物学特征具有生长快、浸润性强、早期可发生淋巴结转移等特点。随着诊治技术，尤其是综合序列治疗在临床上的应用，舌癌患者的治愈率和生存率已有明显提高。但局部复发和淋巴结转移仍是舌癌患者主要致死因素，并以区域淋巴结转移为其主要表现形式，也是判断患者愈合的可靠指标。因此，建立具有高淋巴结转移潜能的舌癌动物模型，完整再现舌癌的临床特点及淋巴结转移生物学特性，为舌癌的预防及治疗提供更好的实验基础。
附图说明
通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明及其特征、外形和优点将会变得更明显。在全部附图中相同的标记指示相同的部分。并未刻意按照比例绘制附图，重点在于示出本发明的主旨。
图1为本发明一种兔舌癌动物模型的建立方法示意图；
图2为本发明中兔舌种植瘤在光镜片下成像示意图；
图3为本发明中肿瘤细胞在透射电镜下的成像示意图；
图4为本发明中超微结构细胞间桥粒连接示意图；
图5为本发明中新西兰白兔舌鳞癌细胞接种裸鼠成瘤生长曲线。
具体实施方式
在下文的描述中，给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而，对于本领域技术人员而言显而易见的是，本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中，为了避免与本发明发生混淆，对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
为了彻底理解本发明，将在下列的描述中提出详细的步骤以及详细的结构，以便阐释本发明的技术方案。本发明的较佳实施例详细描述如下，然而除了这些详细描述外，本发明还可以具有其他实施方式。
如图1-图5所示，本发明提供的一种兔舌癌动物模型的建立方法，包括以下步骤：
步骤S1：建立兔舌鳞癌细胞系，具体步骤为，步骤S1a：建立口腔鳞癌动物模型，研究首先以通过致癌剂、病毒和机械刺激等诱发的口腔鳞癌动物模型为基础；步骤S1b：将口腔鳞癌动物模型分别以贴块法、消化法和癌腹水培养法进行原代培养，以上原代培养材料均加自制的20％RPMI1640兔血清培养基中，置5％CO2、37℃培养箱内培养；步骤S1c：原代培养首次传代后用反复贴壁和胰酶消化法交替进行纯化，首次传代后，用反复贴壁和胰酶消化法交替进行纯化以去除成纤维细胞，最后得到兔舌鳞状细胞癌细胞系。为了保证细胞能平稳传代，对于维系该细胞系的生长的条件进行了优化，发现该细胞更适合在我们自制的浓度为20％的RPMI1640兔血清培养基中生长；传代时用 0.02％的EDTA和0.25％胰蛋白酶1∶4的混合液在37℃温箱内孵育 15～20min，即可达到最佳的消化状态；接种密度为2×105时，细胞24h后大部分贴壁，且增殖速度最快；培养液最适宜的pH值应为 7.1～7.2，此时观察到细胞大部分均已贴壁，细胞界限最为清晰且立体感观最好，且生长迅速；换液时间最好选择在细胞培养后48h，这样可避免细胞随换液而丢弃，同时还可使贴壁的细胞数量明显增加，此外保留1/4-1/5旧培养液，其与补充入新的培养液可使细胞的增殖速度、细胞的功能状态方面优于全部更换新鲜的培养液后的生长状态。冷冻保存后，复苏细胞存活率65％～75％。经过上述优化措施，该舌鳞癌细胞系得以顺利传代。现已建立一株兔舌鳞癌无限细胞系，并命名为NZW-04831。现已稳定传至60余代。
步骤S2：将兔舌鳞癌细胞接种在裸鼠皮下并进行培养，具体为步骤S2a：选4周龄BALA/c-nu裸鼠，在SPF条件下饲养；步骤S2b：取兔舌鳞癌细胞培养的第60代细胞；步骤S2c：将上述第60代细胞接种在裸鼠后肢双侧臀部皮下，每只两个接种点。在步骤S2中，实验材料和仪器包括以下部分：1、动物材料为纯种新西兰白兔82只，体重2.5～3kg，每笼一只，雌雄不限，在干燥通风的环境中，饲以兔用颗粒饲料，12h光暗循环。2、4周龄BALA/c-nu裸鼠10只，SPF条件下饲养。以上两种动物均由上海交通大学附属第九人民医院动物室提供。2、细胞为步骤S1中兔舌鳞癌培养细胞60代细胞；3、仪器：培养箱(调整至37℃)，培养瓶、六孔培养板、离心管、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37℃)。4、试剂：培养液为RPMI1640(内含20％兔血清、青霉素100IU/ml、链霉素50μg/ml、氢化考的松100IU/ml、胰岛素0.01IU/ml，pH7.1～7.2)；消化液为0.25％胰酶-0.02％EDTA，pH7.2；Hank’s液；碘酒。将新西兰白兔舌鳞癌无限细胞系NZW-04831的复苏：采用快速复温法，将 60代新西兰白兔舌鳞癌细胞低温保存管从液态氮中取出，迅速投入 37℃水浴箱，恒温震荡中复温，不停搅动至保存管中的液体完全溶解后，加完全培养基至10ml，1000r/min离心并弃上清。分离后所得肿瘤细胞用培养基同上清洗3次。20％兔血清RPMI1640培养基，在37℃，5％CO2培养条件下培养。
步骤S3：取经过培养的裸鼠皮下肿瘤组织接种在兔舌上，建立兔舌癌模型；具体步骤为，步骤S3a：无菌切取经过培养的裸鼠皮下成瘤的肿瘤组织并剪成2mm3大小组织块，取对数生长期的新西兰白兔舌鳞癌细胞消化、离心、收集细胞，0.9％生理盐水洗涤1次，血球计数板上计数，用PBS制成细胞悬液，以1×106先后接种在裸鼠后肢双侧臀部皮下，每只两个接种点，共20个接种点，每周观察1～2次。待裸鼠皮下成瘤后处死裸鼠，无菌切取肿瘤组织并剪成2mm3大小组织块。步骤S3b：将制成的组织块接种在兔舌前三分之二舌缘处，建立兔舌癌模型，将制成的组织块接种在兔舌前三分之二舌缘处，建立兔舌癌模型。并筛选发生颈淋巴结转移的兔鳞癌。
步骤S4：基于兔舌癌模型建立高淋巴结转移兔舌癌动物模型，具体步骤为，步骤S4a：基于兔舌癌模型筛选出发生颈淋巴结转移的兔鳞癌，步骤S4b：基于颈淋巴结转移的兔鳞癌建立高淋巴结转移兔舌癌动物模型，其中具体为，将颈淋巴结转移的兔子进行培养，也就是将步骤S3b中筛选发生颈淋巴结转移的兔鳞癌进行培养；在经过培养的兔子上取淋巴结转移组织并修剪成1mm3小块；然后取2只新西兰兔并在臀部皮肤下分别植入所述小块后用1-0号线缝合继续饲养；再取经过饲养后的2 只新西兰白兔臀部的肿瘤组织；取10只新西兰白兔并将上述肿瘤组织植入新西兰白兔的舌体实质内经过培养后选出淋巴结转移的新西兰白兔；将上述的步骤进行循环操作直到建立高淋巴结转移兔舌癌动物模型，进一步的具体步骤为：采用“淋巴结体内纯化技术”建立高淋巴结转移兔舌癌动物模型：由“兔舌癌转移的淋巴结-接种同种异体兔皮下扩散-接种到兔舌黏膜下-颈部淋巴结转移的顺序，实验步骤反复循环8次。第一次循环：将发生颈淋巴结转移的兔子接种后15d，固定在兔固定架上，新洁尔灭消毒颈部皮肤，麻醉下无菌切取转移的淋巴结，取无坏死鱼肉样淋巴结组织，修剪成1mm3小块，置入含有双抗(青霉素100ug/mL、链霉素100ug/mL)的生理盐水中，并放入4度冰箱0.5h备用。再选取2只新西兰兔，新吉尔灭消毒兔臀部皮肤，横切大小约2mm切口，用显微镊子将2-3粒1mm3舌癌淋巴转移瘤组织块植人皮下扩散，1-0号线缝合，送回洁净动物房继续饲养观察。接种后 15d后2只兔臀部均长出肿瘤肿块。接种后第15d将2只兔固定兔固定架上，新洁尔灭消毒臀部皮肤，麻醉下无菌切取肿瘤组织，其余同发生颈淋巴结转移的兔子。然后选取10只纯种新西兰白兔，麻醉并常规备皮、固定在动物手术台上；消毒后把兔舌牵出口外，于左侧前三分之二舌缘粘膜上横切大小约2mm粘膜切口，深达肌下，距离表面粘膜大约0.5cm，压迫止血；用显微镊子将2-3粒1mm3舌癌块植人舌体实质内，1-0线缝合；待兔完全清醒后送回清洁动物房观察，继续观察。术后15d后10只兔均发生舌癌，其中 3只发生颈淋巴结转移。第二次循环：按照第一次循环操作步骤，将从发生淋巴结转移的2只兔上切取鱼肉样淋巴结组织块分别接种到另外2只兔臀部皮下扩散，接种5d后2只兔臀部均长出肿块。接种后7d切取组织备用。再选取10只新西兰白兔，按照第一次循环操作步骤将肿瘤组织块接种到10只兔左侧前三分之二舌缘粘膜下，继续观察其成瘤情况。接种15d后10只兔均长出舌癌，有5只发生颈淋巴结转移。第三次循环：将第二次循环所得淋巴结转移块接种另外10只兔左侧前三分之二舌缘粘膜下，继续观察其成瘤情况。接种15d后10只兔均长出舌癌，有4只发生颈淋巴结转移。第四次循环：取 10只新西兰兔，在兔舌侧缘种植第三次循环所得淋巴结转移块，观察，结果 10只新西兰兔5只出现淋巴结转移。麻醉、无菌取下转移的淋巴结，备用。第五次循环：步骤同第四次循环，结果10只新西兰兔7只出现淋巴结转移。第六次循环：步骤同第五次循环，结果10只新西兰兔6只出现淋巴结转移。第七次循环：步骤同第六次循环，结果10只新西兰兔7只出现淋巴结转移。第八次循环：步骤同第七次循环，结果10只新西兰兔8只出现淋巴结转移。本发明中的高淋巴结转移兔舌癌动物模型中，高淋巴结转移指的是经过上述的多次循环后得到的比较高的淋巴结转移兔舌癌的情况。
在本发明中，肿瘤细胞接种实验鼠皮下后，肉眼可见局部液体隆起，3～5h后消失，1周后，实验鼠皮下有肿块(直径约1～2mm)并逐渐长大。荷瘤鼠接种后4～5周，恶病质体征明显，死后尸检。肿瘤为1.3cm×1.5cm～2.5cm×4.8cm。鼠致瘤率为100％，新西兰白兔舌鳞癌细胞兔原位接种后，潜伏期约一周，一周后就在接种部位可触及一圆形实体瘤，表面呈结节状，与舌粘膜有明显粘连，成瘤率为 100％。而臀部皮下的无粘连。两部位均无自然消退。肿瘤细胞按5 ×106/ml浓度接种皮下后最早5天即可成瘤，成瘤率为100％。10只原位接种后有5只发生颈淋巴结转移.由兔舌癌转移的淋巴结-接种同种异体兔皮下扩散-接种到兔舌黏膜下-颈部淋巴结转移”的顺序，反复8次，使第八次兔舌癌的颈部淋巴结转移率达到80％，总淋巴结转移率达到56.7％，从而建立了高淋巴结转移潜能的兔舌癌动物模型。
如图2-图4所示，成瘤且颈部淋巴结转移后后取颈淋巴结制作光镜和电镜标本同原代培养时保留的光镜及电镜标本，在组织来源、部位、包括供体兔的情况进行对照，属同一上皮源性恶性肿瘤。
本发明的具体有益效果为：自1969年Bygaard和Poulsen开始在免疫缺陷小鼠异种移植人类恶性肿瘤成功以来，异体裸鼠肿瘤模型已成检测体外培养肿瘤细胞成瘤试验的重要载体。但是由于脱离了起源组织器官的微环境，移植瘤在实验中的某些行为常不同于原动物体内的肿瘤行为，比如局限性生长，很少发生转移或远处器官转移等。裸鼠体内人类移植瘤的转移须经历局部生长、游走、远处器官内再生长等程序，包括浸入淋巴管、血管附着增殖等一系列步骤，目前仅有少数移植肿瘤可越过上述一系列屏障而发生转移。目前找到裸鼠体内人类肿瘤高转移率的移植瘤比较困难，人类肿瘤的侵袭性和转移性并非经常在动物模型中得到重现。而体外培养的肿瘤细胞接种在有免疫力的动物后成瘤，并发生区域性淋巴结及远隔器官转移，就更为罕见，文件查新未见有这类报道。本发明兔舌癌动物模型的建立，具有极其重要的意义，为口腔颌面部肿瘤的基础和临床研究搭建了一重要的技术平台：①有利于抗癌药物的筛选及最佳化疗方案的选择；②有利于研究放化疗结合治疗颌面部转移癌的疗效机制；③有利于影象诊断和介入放射治疗学中关于药物的靶向性分布研究。同时，使用这些动物模型，较过去以人为研究对象有明显的优越性：①避免了在人身上进行实验所带来的风险；②重复性好，易建立。颌面部恶性肿瘤可以用动物通过细胞接种随时的复制出来；③可以克服人类颌面部恶性肿瘤潜伏期及病程长等缺点；④可以严格控制实验条件，增加可比性；⑤可以简化实验操作和样品收集；⑥有利于短期内，成批研究颌面部恶性肿瘤的发生、发展规律及其转归等；⑧成癌率高。鉴于此，不少学者如Beckhove等曾尝试在建立恶性肿瘤原代培养基础上，较早探讨了人类乳癌组织在NOD/SCID鼠体内成瘤的可行性。在早期由于动物模型无法建立，Gazdar、Wilbur等许多学者也曾采用非动物模型进行细胞化疗药物的筛选，结果显示该技术评价成功率为33～78％，但疗效结果的差异较大。舌癌是最常见的口腔癌，其生物学特征具有生长快、浸润性强、早期可发生淋巴结转移等特点。随着诊治技术，尤其是综合序列治疗在临床上的应用，舌癌患者的治愈率和生存率已有明显提高。但局部复发和淋巴结转移仍是舌癌患者主要致死因素，并以区域淋巴结转移为其主要表现形式，也是判断患者愈合的可靠指标。因此，建立具有高淋巴结转移潜能的舌癌动物模型，完整再现舌癌的临床特点及淋巴结转移生物学特性，为舌癌的预防及治疗提供更好的实验基础。因此，这一研究平台的建立，不但可用于抗肿瘤化疗药物的敏感性评价，还可以进行放疗、内分泌治疗、免疫治疗、分子靶向治疗等新治疗手段的研究，必将受到越来越多的科技工作者的重视，并具有广阔的研究前景。
以上对本发明的较佳实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述特定实施方式其中未尽详细描述的设备和结构应该理解为用本领域中的普通方式予以实施；任何熟悉本领域的技术人员，在不脱离本发明技术方案范围情况下，都可利用上述揭示的方法和技术内容对本发明技术方案做出许多可能的变动和修饰，或修改为等同变化的等效实施例，这并不影响本发明的实质内容。因此，凡是未脱离本发明技术方案的内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所做的任何简单修改、等同变化及修饰，均仍属于本发明技术方案保护的范围内。
Claims (9)
1.一种高淋巴结转移兔舌癌动物模型的建立方法，其特征在于，包括以下步骤：
建立兔舌鳞癌细胞系；
将兔舌鳞癌细胞接种在裸鼠皮下并进行培养；
取经过培养的裸鼠皮下肿瘤组织接种在兔舌上，建立兔舌癌模型；基于兔舌癌模型筛选出发生颈淋巴结转移的兔鳞癌；
基于颈淋巴结转移的兔鳞癌建立高淋巴结转移兔舌癌动物模型。
2.如权利要求1所述的一种高淋巴结转移兔舌癌动物模型的建立方法，其特征在于，所述建立兔舌鳞癌细胞系的步骤包括：
建立口腔鳞癌动物模型；
将口腔鳞癌动物模型分别以贴块法、消化法和癌腹水培养法进行原代培养；
原代培养首次传代后用反复贴壁和胰酶消化法交替进行纯化。
3.如权利要求1所述的一种高淋巴结转移兔舌癌动物模型的建立方法，其特征在于，所述将兔舌鳞癌细胞接种在裸鼠皮下并进行培养的步骤包括：
选4周龄BALA/c-nu裸鼠，在SPF条件下饲养；
取兔舌鳞癌细胞培养的第60代细胞；
将上述第60代细胞接种在裸鼠后肢双侧臀部皮下，每只两个接种点。
4.如权利要求1所述的一种高淋巴结转移兔舌癌动物模型的建立方法，其特征在于，所述取经过培养的裸鼠皮下肿瘤组织接种在兔舌上，建立兔舌癌模型的步骤包括：
无菌切取经过培养的裸鼠皮下成瘤的肿瘤组织并剪成2mm3大小组织块；
将制成的组织块接种在兔舌前三分之二舌缘处，建立兔舌癌模型。
5.如权利要求1所述的一种高淋巴结转移兔舌癌动物模型的建立方法，其特征在于，所述基于颈淋巴结转移的兔鳞癌建立高淋巴结转移兔舌癌动物模型的步骤包括：
将颈淋巴结转移的兔子进行培养；
在经过培养的兔子上取淋巴结转移组织并修剪成1mm3小块；
取2只新西兰兔并在臀部皮肤下分别植入所述小块后用1-0号线缝合继续饲养；
取经过饲养后的2只新西兰白兔臀部的肿瘤组织；
取10只新西兰白兔并将上述肿瘤组织植入新西兰白兔的舌体实质内经过培养后选出淋巴结转移的新西兰白兔；
将上述的步骤进行循环操作直到建立高淋巴结转移兔舌癌动物模型。
6.如权利要求1所述的一种高淋巴结转移兔舌癌动物模型的建立方法，其特征在于，所述建立兔舌鳞癌细胞系的步骤中，原代培养的条件为：在5％CO2、37℃培养箱内的20％RPMI1640兔血清培养基中培养。
7.如权利要求1所述的一种高淋巴结转移兔舌癌动物模型的建立方法，其特征在于，所述建立兔舌鳞癌细胞系的步骤中，原代培养首次传代后用反复贴壁和胰酶消化法交替进行纯化，在传代时用0.02％的EDTA和0.25％胰蛋白酶1∶4的混合液在37℃温箱内孵育15～20min。
8.如权利要求1所述的一种高淋巴结转移兔舌癌动物模型的建立方法，其特征在于，所述将兔舌鳞癌细胞接种在裸鼠皮下并进行培养的步骤中，取对数生长期的兔舌鳞癌细胞消化、离心、收集细胞，0.9％生理盐水洗涤1次，血球计数板上计数，用PBS制成细胞悬液，以1×106先后接种在裸鼠后肢双侧臀部皮下，每只两个接种点，共20个接种点。
9.如权利要求5所述的一种高淋巴结转移兔舌癌动物模型的建立方法，其特征在于，所述取10只新西兰白兔并将上述肿瘤组织植入新西兰白兔的舌体实质内经过培养后选出淋巴结转移的新西兰白兔的步骤中，其中植入的具体位置为舌前三分之二舌缘处的舌体实质内。
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