CN111903606A - 一种经皮穿刺接种的肺癌原位pdx模型的构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种经皮穿刺接种的肺癌原位PDX模型的构建方法，包括下述步骤：(1)肿瘤样本采集；(2)肿瘤样本处理，(3)小鼠接种；(4)饲养与观察；(5)PET‑CT检查；(6)病理学检测。本发明采用经皮肺穿刺组织块肺原位接织样本的准备、免疫缺陷小鼠肺原位接种以及免疫缺陷小鼠常规饲养与观察种的方法，可以将人源性肺癌组织块接种到免疫缺陷小鼠肺组织内，构建人肺癌原位PDX模型，还优化了经皮穿刺点、穿刺针的角度和进针深度，使得小鼠接种成功率大大提高。本发明不仅充分保留了患者肿瘤组织的微环境，还高度模拟人体肿瘤的生物学模式，能更好的重现肺癌患者的病理生理特征，具有重要的科研、医疗价值和经济价值。

Description

一种经皮穿刺接种的肺癌原位PDX模型的构建方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种经皮穿刺接种的肺癌原位PDX模型的构建方法。

背景技术

人源肿瘤异种移植模型(Patient-derived xenografting，PDX)是指将肿瘤病人的新鲜肿瘤样本接种到免疫缺陷小鼠体内，肿瘤样本借助小鼠体内生理环境分裂增殖所构建的在体动物模型。PDX模型保留了肿瘤患者肿瘤的异质性、病理特征、基因表达与变异，与患者临床相关性高，因而有其他肿瘤模型所无法比拟的优势，对肿瘤个性化治疗、肿瘤科学研究和新药研发意义重大。但是，成功率低、周期长、成本高是阻碍PDX模型广泛使用的重要瓶颈。

肺癌的高发病率和死亡率使其成为世界上癌症死亡的最主要原因之一，这归因于大多数患者确诊时肿瘤分期太晚甚至发生远处转移而疗效不佳。然而关于肺癌发生发展、侵袭和转移的机制尚不完全清楚，目前急需对这一机制进行更深层次探索，找到新的治疗手段来改善患者的预后。由于直接在患者身上对肿瘤机制进行研究是困难、且不可取的，所以就需要建立一种经济、适用的模型，来模拟患者机体内肺癌发生、发展，侵袭、转移的生物学模式，借此探索肺癌机制和治疗策略。所以，建立一个合适的肺癌PDX模型在近些年来被公认为是研究肺癌机制和探索治疗模式的关键所在。PDX模型是目前肿瘤研究最有力的工具，有能力构建的地方不多。绝大多数研究者都是用细胞株移植瘤来做肺癌研究，且多为皮下移植瘤。

目前已被报道的肺癌模型有多种，皮下移植瘤模型凭借其操作简单、成瘤迅速、外形直观的优势一直被人所喜爱，但其接种的肿瘤生长局限很少发生转移，对于肿瘤转移机制的研究收益甚微。原位模型较皮下模型能更好的模拟人体内肿瘤环境，复制肺癌发生、发展、侵袭和转移的模式，研究的结果也更具代表性，但由于原位模型的构建相对困难、技术要求高而让人望而却步。肺癌原位模型的构建方法主要有3种：组织块外科缝合法、细胞悬液肺内注射法、支气管路径细胞悬液注射法，基本上都是用细胞株移植瘤来做的，外科法创伤较大、组织接种局限肺表面，细胞悬液缺少肿瘤间质容易扩散、肿瘤异质性难以保留等，使得原位建模效果不理想，而肺癌原位PDX模型尚未见报道。

采用组织块穿刺接种其保留了肿瘤组织原有的微环境，易成活，对接种对象的创伤小，模型性质稳定。但是由于胸腔负压等原因，肺癌原位模型的构建技术要求高、成功率低，肺癌肿瘤组织块经皮穿刺接种时，容易掉落在胸腔，很难顺利接种到肺脏里面，或者是损失大血管导致血气胸，小鼠死亡。为了提高成功率，目前组织块穿刺接种大多在超声引导或CT引导等环节进行操作，如超声波引导下经皮穿刺肿瘤组织条建设兔肝癌模型，CT引导下穿刺接种法建立兔椎体肿瘤模型等。这种方法通常需要昂贵的小动物专用影像设备(如CT、超声)，且需要具备小动物影像学专业知识、操作复杂。小动物超声探头较大，不适合做小鼠这样体型比较小，肺组织这种超声显像欠佳的脏器的超声引导穿刺。小动物CT检测通过需要将免疫缺陷动物动物带出SPF级动物房里面，且有放射性，通常没有合适的操作空间，因此实际操作可行性很小。

发明内容

针对现有技术中的不足与难题，本发明旨在提供一种经皮穿刺接种的肺癌原位PDX模型的构建方法。本发明采用组织块经皮肺穿刺的方法建立人肺癌原位PDX模型，能够将肺癌组织块接种至小鼠肺组织内，更微创、操作更简单又能保留肿瘤微环境，更贴近临床实际情况，应用价值巨大。

本发明通过以下技术方案予以实现：

一种经皮穿刺接种的肺癌原位PDX模型的构建方法，包括以下步骤：

(1)肿瘤样本采集：手术中切取肺癌肿瘤边缘生长比较旺盛、无溃疡坏死的肺癌肿瘤组织，迅速装入含有组织保存液的离心管中，离心管装入冰包低温运输至实验室；

(2)肿瘤样本处理：在实验室生物安全柜内用0.4％的台盼蓝染液检测肺癌肿瘤组织活性，剔除没有活性的组织；然后将组织放入0.2％的碘伏溶液中浸泡30秒钟消毒，再用含有3％双抗的PBS溶液冲洗组织2-3遍；将冲洗干净的肿瘤组织放入新的培养皿中，加入适量培养基，用眼科剪将组织块剪切为1*1*1mm大小的瘤块，剪好的瘤块用培养基冲洗2-3遍备用；

(3)小鼠接种：在SPF级动物房，选择成年裸鼠或其他高度免疫缺陷雌性小鼠，麻醉后将小鼠右侧卧位固定于手术板上，有毛小鼠需要将左侧胸部毛发剃除干净，选择左侧腋中线与第八肋间隙交点为进针穿刺处并做好标记；用碘伏消毒2-3遍，沿第八肋间隙将皮肤切开，接着用事先准备好的装有瘤块的穿刺针，垂直肋间隙并与水平面夹角30度进针，进针深度为0.8-1.0cm左右(进针深度与小鼠体重正相关)，进针后缓慢推出瘤块，推出后停留5s，缓慢旋转一周后依次拔出针芯和针鞘，用4-0普通丝线进行皮肤缝合，0.5％碘伏棉签消毒创口，注射抗生素，小鼠充分复温后放回饲养笼；

(4)小鼠饲养与观察：将小鼠饲养在SPF级动物房IVC笼具中，常规饲养；定期观察小鼠的精神、饮食、排便和活动等情况，当出现如下情况时伦理学处死：1.小鼠出现皮肤溃疡；2.肿瘤任意直径大于2cm；3.体重大于身体的10％，4.体重降低20％以下)；每周两次用电子天平称量小鼠的体重并详细记录；

(5)PET-CT检查：建模后第2w开始，按周次和组别将小鼠送PET-CT检查(连续送检4周，每周送检1组)，观察肿瘤的成瘤和转移情况，根据PET-CT结果将老鼠处死取瘤，将肿瘤组织送检；

(6)病理和基因检测：根据PET-CT结果，评估小鼠成瘤情况，肿瘤体积长到1500mm³左右将瘤体手术剥离下来，取一部分进行病理检测和基因测序，剩余组织一部分放入冻存液中冻存，一部分继续传代。

进一步地，步骤(2)中采用的穿刺针为抽吸式活检针，其包括针芯和鞘管针，鞘管针针鞘表面设有刻度，用于可以判断进针深度，抽吸式活检针针规格为18G*6cm～20G*6cm，根据接种的老鼠体型大小进行选择。

与现有技术相比，本发明有益效果包括：

(1)本发明经皮穿刺将患者的肿瘤组织接种到了免疫缺陷小鼠的肺脏组织内，而不是缝合在肺表面或者是用细胞悬液注射到肺脏内部，本发明的造模方法与肺癌临床变化更加相符，能更好的重现肺癌患者的病理生理特征，更具备临床价值，也节约了试剂耗材，降低了大量的医疗成本。

(2)本发明方法对经皮穿刺点、穿刺针的角度和进针深度进行了优化，找到了最佳穿刺点，穿刺角度和进针深度，使得实施过程中保证组织能顺利接种到肺脏里面，避免其掉落在胸腔，或者是损失大血管导致血气胸造成小鼠死亡。

(3)本发明所采用的穿刺针在穿刺成功率和保持组织块完整结构方面达到了一个较好的平衡，避免穿刺针太细装不了组织，太大不容易穿刺，并且因为气胸、肺损伤等原因引起的小鼠高死亡率。

附图说明

图1为本发明方法中小鼠的PET/CT图，其中图1(a)为融合图像冠状面不同切片展示肿瘤形态，图1(b)为小鼠矢状面、横截面、冠状面以及3D图像，图1(c)三维重建图。

图2为本发明进行原位接种后对小鼠肺组织进行病理切片的检查图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步地说明。

一种经皮穿刺接种的肺癌原位PDX模型的构建方法，包括以下步骤：

(1)肿瘤样本采集：手术中切取肿瘤边缘生长比较旺盛、无溃疡坏死的肿瘤组织，迅速装入含有组织保存液的离心管中，离心管装入冰包低温运输至实验室；

(2)肿瘤样本处理：在实验室生物安全柜内用0.4％的台盼蓝染液检测肿瘤组织活性，剔除没有活性的组织；然后将组织放入0.2％的碘伏溶液中浸泡30秒钟消毒，再用含有3％双抗的PBS溶液冲洗组织2-3遍；将冲洗干净的肿瘤组织放入新的培养皿中，加入适量培养基，用眼科剪将组织块剪切为1*1*1mm大小，剪好的组织用培养基冲洗2-3遍备用；

(3)小鼠接种：在SPF级动物房，选择成年裸鼠或其他高度免疫缺陷雌性小鼠，麻醉后将小鼠右侧卧位固定于手术板上，有毛小鼠需要将左侧胸部毛发剃除干净，选择左侧腋中线与第八肋间隙交点为进针穿刺处并做好标记；用碘伏消毒2-3遍，沿第八肋间隙将皮肤切开，接着用事先准备好的装有组织块的穿刺针，垂直肋间隙并与水平面夹角30度进针，进针深度为0.8-1.0cm左右(进针深度与小鼠体重正相关)，进针后缓慢推出组织块，推出后停留5s，缓慢旋转一周后依次拔出针芯和针鞘，用4-0普通丝线进行皮肤缝合。0.5％碘伏棉签消毒创口，注射抗生素，小鼠充分复温后放回饲养笼；

4)小鼠饲养与观察：将小鼠饲养在SPF级动物房IVC笼具中，常规饲养；定期观察小鼠的精神、饮食、排便和活动等情况，当出现如下情况时伦理学处死：1.小鼠出现皮肤溃疡；2.肿瘤任意直径大于2cm；3.体重大于身体的10％，4.体重降低20％以下)；每周两次用电子天平称量小鼠的体重并详细记录；

5)PET-CT检查：建模后第2w开始，按周次和组别将小鼠送PET-CT检查(连续送检4周，每周送检1组)，观察肿瘤的成瘤和转移情况，根据PET-CT结果将老鼠处死取瘤，将肿瘤组织送检，PET-CT检查情况如图1所示；

6)病理和基因检测：根据PET-CT结果，评估小鼠成瘤情况，肿瘤体积长到1500mm³左右将瘤体手术剥离下来，取一部分进行病理检测和基因测序，剩余组织一部分放入冻存液中冻存，一部分继续传代，病理图片如图2所示。

通过影像学检测方法PET-CT进行检查，如图1所示的不同角度、不同状态下的PET/C图像，图1(a)为为融合图像冠状面不同切片展示肿瘤形态(，橙色箭头为肺肿瘤绿色箭头为胃转移蓝色箭头为皮下种植肿瘤，肺部和肩胛皮下种植小鼠肺癌细胞(LLC)，尾静脉注射136.3μCi18F-FDG，代谢40分钟后采集30min；图1(b)为小鼠矢状面、横截面、冠状面以及3D图像，箭头所指为肿瘤；图1(c)为三维重建图，将肺脏肿瘤单独分割，其红色区域即为肿瘤块。

图2所示的原位接种组对小鼠肺组织进行病理切片检查图像，可见肺组织间聚集有大量核大深染的肿瘤细胞，肿瘤细胞异型性明显，高倍镜下可见核分裂(10*40)。

以上所述仅表达了本发明的优选实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形、改进及替代，这些都属于本发明的保护范围。因此，本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。

Claims (4)

1.一种经皮穿刺接种的肺癌原位PDX模型的构建方法，包括下述步骤：

(1)肿瘤样本采集，取得生长旺盛、无溃疡坏死的肺癌肿瘤组织；

(2)肿瘤样本处理，检测肺癌肿瘤组织活性并剔除没有活性的组织，再进行分块处理制作成多组1*1*1mm的瘤块备用；

(3)模型建立；

(4)饲养与观察，将接种后的小鼠饲养在SPF级动物房IVC笼具中，常规饲养；定期观察小鼠情况，并每周两次称量、记录小鼠的体重；对异常情况的小鼠进行伦理学处死；

(5)PET-CT检查；

(6)病理学检测；

其特征在于，所述步骤(3)中模型建立方法为：选择多组成年裸鼠或其他高度免疫缺陷小鼠作为接种动物，在SPF级动物房内，小鼠麻醉后将其右侧卧位固定于手术板上，有毛小鼠需要将左侧胸部毛发剃除干净；将步骤(2)制作的瘤块装入穿刺针；选择左侧腋中线与第八肋间隙交点为进针穿刺处并做好标记；将进针穿刺处消毒2-3遍，沿第八肋间隙将皮肤切开，接着将穿刺针垂直肋间隙并与水平面夹角30度进针，进针深度为0.8～1.0cm，进针后缓慢推出瘤块，推出后停留5s，缓慢旋转一周后依次拔出针芯和针鞘；将皮肤缝合后消毒穿刺处；术后注射抗生素，直至小鼠充分复温后放回饲养笼；

所述步骤(5)从建模后第2周开始，按周次和组别将小鼠送PET-CT检查，连续送检4周，每周送检1组，观察肺癌肿瘤的成瘤和转移情况，根据PET-CT结果将老鼠处死取瘤，将肺癌肿瘤组织送检；

所述步骤(6)的病理学检测为根据PET-CT结果评估小鼠成瘤情况，将肺癌肿瘤体积长到1500mm³的瘤体手术剥离下来，取一部分进行病理检测和基因测序，剩余瘤体组织一部分放入冻存液中冻存，一部分继续传代。

2.根据权利要求1所述的一种经皮穿刺接种的肺癌原位PDX模型的构建方法，其特征在于：所述步骤(1)的操作方法为：手术中切取肿瘤边缘生长旺盛、无溃疡坏死的肿瘤组织，迅速装入含有组织保存液的离心管中，所述离心管装入冰包低温运输。

3.根据权利要求1所述的一种经皮穿刺接种的肺癌原位PDX模型的构建方法，其特征在于：所述步骤(2)的操作方法为：在实验室生物安全柜内用0.4％的台盼蓝染液检测肿瘤组织活性，剔除没有活性的组织；然后将肺癌肿瘤组织放入0.2％的碘伏溶液中浸泡30秒钟消毒，再用含有3％双抗的PBS溶液冲洗组织2-3遍；将冲洗干净的肿瘤组织放入新的培养皿中，加入适量培养基，将肿瘤组织块剪切为1*1*1mm大小的瘤块，瘤块用培养基冲洗2-3遍备用。

4.根据权利要求1所述的一种经皮穿刺接种的肺癌原位PDX模型的构建方法，其特征在于：所述步骤(3)中采用的穿刺针为抽吸式活检针，其包括针芯和鞘管针，鞘管针的针鞘表面设有刻度，规格为18G*6cm-20G*6cm。

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