CN107137425A - 一种循环肿瘤细胞小鼠模型、其构建方法及应用 - Google Patents

一种循环肿瘤细胞小鼠模型、其构建方法及应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种循环肿瘤细胞小鼠模型、其构建方法及应用，所述方法包括如下步骤：(1)皮下移植：将原代肿瘤组织样本移植到免疫缺陷小鼠的体内，构建原代癌症异种移植模型PDX；(2)采集循环肿瘤细胞：采集步骤(1)所述的原代癌症异种移植模型的外周血中的循环肿瘤细胞；(3)肾囊膜移植：将步骤(2)采集的循环肿瘤细胞移植到免疫缺陷小鼠的肾囊膜内，即构建成功所述循环肿瘤细胞小鼠模型。本发明方法采用二次以上的多次传代移植的方式，将原代肿瘤异种移植模型中的CTCs通过肾囊膜移植到免疫缺陷小鼠体内，得循环肿瘤细胞小鼠模型，可用于研究CTCs体内转移的机制及扩散情况。

Description

一种循环肿瘤细胞小鼠模型、其构建方法及应用
技术领域
本发明属于动物基因工程技术领域，具体涉及一种循环肿瘤细胞小鼠模型、其构建方法及应用。
背景技术
肺癌是中国死亡率最高的癌症，肺癌患者的5年生存率只有8％-10％。近年来在肺癌的诊断和治疗上具有许多新的发现，目前对早期肺癌采用外科治疗、化疗和放疗的手段能够得到良好的效果。但是这些方法对于已经广泛转移的IV期肺癌患者并不十分适用，肺癌的播散转移是导致肺癌死亡率居高不下的重要因素。因此，对肺癌转移机制和转移过程的研究是目前肺癌治疗研发平台的迫切需求。
肺癌的转移方式主要有以下三种：直接扩散、淋巴道转移和血行转移。其中血行转移是转移程度最大的一种，癌细胞可随肺静脉回流到左心后，可转移到体内任何部位，常见转移部位为肝、脑、肺、骨骼系统、肾上腺、胰等器官。循环肿瘤细胞(CTCs，CirculatingTumor Cells)是存在于外周血中的各类肿瘤细胞的统称，因自发或诊疗操作从实体肿瘤病灶(原发灶、转移灶)脱落，大部分CTC在进入外周血后发生凋亡或被吞噬，少数能够逃逸并锚着发展成为转移灶，增加恶性肿瘤患者死亡风险。目前，血液中的循环肿瘤细胞是研究癌症转移的主要方向。由于CTCs数目稀少，取材困难，目前对CTCs的应用主要在体外活检。
此外，现有技术中，CN 103320387 A公开了一种建立小鼠可移植乳腺癌实验性肺转移模型的方法，将小鼠自发乳腺癌瘤块在网筛中研磨，离心沉淀，用培养液调配细胞浓度(1-2)×107cell/mL的肿瘤细胞悬液，每只小鼠尾静脉注射肿瘤细胞悬液0.1-0.3mL，常规条件下饲养，正常繁殖25-35天，完成肺部转移模型。CN 105696087 A公开了PDX人源肿瘤异种移植模型，是将患者的新鲜肿瘤组织移植到免疫缺陷小鼠上，依靠小鼠提供的微环境进行生长，肿瘤的分化程度、形态特征、结构特点以及分子特性等与人本身的肿瘤特点更接近。现有技术中还有将CTCs移植到免疫缺陷小鼠体内建成异种移植模型，上述技术都是直接将相关的肿瘤细胞移植到免疫缺陷小鼠体内，其样本受限于每个病人的个体差异，导致样本的不同，具有不可重复的特性，不利于后续的研究，不能广泛的推广应用。
现有技术人体上皮细胞来源的肿瘤CTC细胞的定义并不明确，从人体中通过抗体标记、识别和分选人体肿瘤CTC细胞常规使用人表皮细胞表面标记物，hEpCAM(EpithelialCell Adhesion Molecule)/hCKs(Cytokeratins)+hCD45-即认定为CTC细胞。然而，通过该方法分析的CTC细胞并不准确，原因如下：1)因为部分的肿瘤CTC细胞在转移过程中，表皮的表面标记物会丢失，所以通过以上方法分析的肿瘤CTC细胞并不完全覆盖所有的肿瘤CTC细胞，如丢失表皮表面标记物的肿瘤CTC细胞；2)此外，通过以上方法标记的细胞也可能是脱落到血液中的正常细胞，所以该检测、分选方法是存在缺陷的。而现有技术中，从人肿瘤小鼠模型中标记、识别和分选人体肿瘤CTC细胞的方法也同样存在上述问题。
为了解决现有技术中人体肿瘤CTC细胞分析不准确和分选不纯的问题，建立一种具有稳定的重复性的小鼠模型用于对癌症转移机制和转移过程，获得高纯度的人体肿瘤CTC细胞的研究是一个亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足及实际的需求，本发明提高一种循环肿瘤细胞小鼠模型、其构建方法及应用，所述模型可用于癌症CTCs体内转移机制和转移过程的研究，通过流式细胞等技术分析、分离获得高纯度的人体肿瘤CTC细胞。
为达此目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种循环肿瘤细胞小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：
(1)皮下移植：将原代肿瘤组织样本移植到免疫缺陷小鼠体内，构建原代癌症异种移植模型PDX(Patient Derived Xenografts)；
(2)采集循环肿瘤细胞：采集步骤(1)所述的原代癌症异种移植模型的外周血中的循环肿瘤细胞；
(3)肾囊膜移植：将步骤(2)采集的循环肿瘤细胞移植到免疫缺陷小鼠的肾囊膜内，即构建成功所述循环肿瘤细胞小鼠模型。
本发明，发现在所述模型小鼠外周血HLA阳性细胞中存在hHLA+mCD45+双阳性细胞群，该细胞群可能并非人体肿瘤CTC细胞，该双阳性细胞群的存在，将导致通过hEpCAM/hCKs+hCD45-标记分选的肿瘤CTC细胞不纯，含有非人肿瘤CTC细胞的hHLA+mCD45+杂质细胞，而通过本发明所述方法构建的循环肿瘤细胞小鼠模型，其通过二次移植CTCs细胞，建立CTCs来源的肺癌小鼠模型，采用本方法可有效地得到大量CTCs来源的肺癌小鼠模型，且模型来源于同一病人样本，生物学背景一致，能筛选到纯度很高的肿瘤CTC细胞。
本发明中，所述原代肿瘤组织样本来源于三甲医院的肿瘤组织样本库，所述肿瘤组织样本需浸泡于RMPI-1640培养基中并保存于冰上运输，所述原代肿瘤组织样本优先选择肉色部分肿瘤组织样本，其次选择白色部分肿瘤组织样本。
本发明中，所述方法还包括对肿瘤组织样本的前处理，采用浓度为0.5-3％，优选为1％的PBS进行清洗1-5次，优选为2-3次，并将样本分成三个部分；
所述第一部分用于冻存保种；
所述第二部分用于肿瘤组织切片和免疫组化分析；
所述第三部分用于肿瘤移植备用。
根据本发明，步骤(1)所述的肿瘤为实体瘤，优选为上皮细胞来源的实体瘤，进一步优选为为肺癌、肝癌、胃癌、直肠癌或乳腺癌中的任意一种或至少两种的组合，最优选为肺癌。
根据本发明，步骤(1)所述的肿瘤组织样本移植到免疫缺陷小鼠体内需要进行修剪，所述修剪的形状和大小只要能够将肿瘤组织样本成功移植入免疫缺陷小鼠体内都是可行的，本领域技术人员可以根据需要自行选择，本发明将所述的肿瘤组织样本剪成体积为10-30mm3，例如可以是10mm3、12mm3、15mm3、18mm3、20mm3、22mm3、25mm3、28mm3或30mm3，优选为15mm3的肿瘤组织小块，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
根据本发明，步骤(1)所述的肿瘤组织样本修剪后采用Matrix gel(基质胶)包裹备用。
根据本发明，步骤(1)所述免疫缺陷小鼠为C57BL/6-nu、NOD、CB17-scid、NOD-scid、C57BL/6-Rag1–/–、BALB/c-Rag2–/–、C57BL/6-IL2rg–/–、NSG、NOG或NSI中的任意一种或至少两种的组合，优选为NSI。
根据本发明，步骤(2)所述采集步骤(1)所述的原代癌症异种移植模型的外周血中的CTCs具体包括：处死步骤(1)所述PDX小鼠模型，采集全部外周血，离心收集全部血细胞，加入红细胞裂解液，离心收集白细胞即得所述循环肿瘤细胞。
根据本发明，步骤(2)所述处死的PDX小鼠模型为步骤(1)将肿瘤组织样本移植到免疫缺陷小鼠体内后20-80天，例如可以是20天、21天、23天、25天、26天、28天、30天、31天、32天、33天、35天、36天、38天、40天、42天、45天、46天、48天、50天、52天、53天、55天、56天、58天、60天、62天、63天、65天、66天、68天、70天、72天、73天、75天、76天、78天或80天，优选为30-60天，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
根据本发明，所述处死步骤(1)所述PDX小鼠模型只要能够处死PDX小鼠模型的方式都可行，本领域技术人员可以根据条件自行选择，本申请采用CO2处死小鼠模型。
本发明中，将PDX小鼠模型处死后，取PDX小鼠模型的肿瘤组织，对肿瘤组织样本的前处理，剪取肿瘤脂质外层肉色部分，采用浓度为0.5-3％，优选为1％的PBS进行清洗1-5次，优选为2-3次，并将样本分成三个部分；
所述第一部分用于冻存保种；
所述第二部分用于肿瘤组织切片和免疫组化分析；
所述第三部分用于肿瘤移植备用。
根据本发明，所述离心的离心力为100-400g，例如可以是100g、120g、130g、150g、160g、180g、200g、220g、230g、250g、260g、280g、300g、310g、320g、330g、350g、360g、380g或400g，优选为200-350g，进一步优选为300g，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
根据本发明，步骤(3)所述CTCs可以采用PBS进行调节浓度，本申请中的采用的循环肿瘤细胞的浓度为40-300CTCs/μL，例如可以是40CTCs/μL、42CTCs/μL、45CTCs/μL、48CTCs/μL、50CTCs/μL、55CTCs/μL、60CTCs/μL、65CTCs/μL、70CTCs/μL、75CTCs/μL、80CTCs/μL、85CTCs/μL、90CTCs/μL、95CTCs/μL、100CTCs/μL、105CTCs/μL、110CTCs/μL、115CTCs/μL、120CTCs/μL、125CTCs/μL、130CTCs/μL、135CTCs/μL、140CTCs/μL、145CTCs/μL、150CTCs/μL、160CTCs/μL、170CTCs/μL、180CTCs/μL、190CTCs/μL、200CTCs/μL、210CTCs/μL、220CTCs/μL、230CTCs/μL、240CTCs/μL、250CTCs/μL、260CTCs/μL、270CTCs/μL、280CTCs/μL、290CTCs/μL或300CTCs/μL，优选为40CTCs/μL，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
根据本发明，步骤(3)所述循环肿瘤细胞的移植体积为5-20μL，例如可以是5μL、6μL、7μL、8μL、9μL、10μL、11μL、12μL、13μL、14μL、15μL、16μL、17μL、18μL、19μL或20μL，优选为10μL，以及上述数值之间的具体点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
根据本发明，步骤(3)所述的免疫缺陷小鼠为C57BL/6-nu、NOD、CB17-scid、NOD-scid、C57BL/6-Rag1–/–、BALB/c-Rag2–/–、C57BL/6-IL2rg–/–、NSG、NOG或NSI中的任意一种或至少两种的组合，优选为NSI。
根据本发明，步骤(3)所述移植到肾囊膜内为本领域的常规技术，在此不做特殊限定，本申请采用如下具体方式移植：将免疫缺陷小鼠麻醉，选取小鼠一侧肾脏，用青霉素-生理盐水湿润肾包囊，用胰岛素针吸取细胞重悬液，移植入受体小鼠肾囊膜下，将肾脏放回体腔中，并向体腔中注入适量青霉素-生理盐水，依次缝合腹膜和皮肤，于伤口涂抹碘酒消毒。
作为优选技术方案，所述循环肿瘤细胞小鼠模型的构建方法，包括如下步骤：
(1)前处理：将肺癌组织样本采用浓度为0.5-3％的PBS进行清洗1-5次；
(2)皮下移植：将前处理后的肺癌组织样本剪成体积为10-30mm3的小块，采用Matrix gel包裹，移植到免疫缺陷小鼠体内，构建原代癌症异种移植模型PDX小鼠模型；
(3)采集循环肿瘤细胞：当步骤(2)所述PDX小鼠模型培养20-80天后，用CO2处死，采集全部外周血，100-400g离心收集全部血细胞，加入红细胞裂解液，100-400g离心收集白细胞即得所述循环肿瘤细胞；
(4)肾囊膜移植：将步骤(3)采集的循环肿瘤细胞采用PBS进行调节浓度，调节到浓度为30-50CTCs/μL，将免疫缺陷小鼠麻醉，选取免疫缺陷小鼠一侧肾脏，用青霉素-生理盐水湿润肾包囊，用胰岛素针吸取5-20μL细胞重悬液，移植入受体小鼠肾囊膜下，将肾脏放回体腔中，并向体腔中注入适量青霉素-生理盐水，依次缝合腹膜和皮肤，于伤口涂抹碘酒消毒，即构建成功所述循环肿瘤细胞小鼠模型。
第二方面，本发明提供一种如第一方面所述的构建方法制备得到的循环肿瘤细胞小鼠模型。
第三方面，本发明提供一种如第二方面所述的循环肿瘤细胞小鼠模型用于制备人体的病理和生理的研究的模型鼠，优选作为肿瘤疾病研究的模型鼠。
本发明中，通过将构建小鼠模型培养60-90天后，采用CO2处死小鼠，取小鼠外周血、肺脏、肝脏、脾脏和肿瘤组织，通过流式细胞技术检测其中的肿瘤细胞的比例和迁移，用于研究CTCs的扩散情况。
第四方面，本发明提供一种如第二方面所述的循环肿瘤细胞小鼠模型的人循环肿瘤细胞的检测方法，包括如下步骤：将人实体瘤细胞特异表面标记物和所述小鼠模型外周血细胞特异表面标记物进行标记，通过分析技术分析小鼠模型外周血白细胞中人循环肿瘤细胞；
所述人循环肿瘤细胞为人实体瘤细胞特异表面标记物阳性，且所述小鼠模型外周血细胞特异表面标记物阴性的细胞群。
本发明中，所述人实体瘤细胞特异表面标记物阳性为所述人实体瘤细胞特异表面标记物进行了相关的表达，所述小鼠模型外周血细胞特异表面标记物阴性为所述小鼠模型外周血细胞特异表面标记物没有进行相关表达，同时满足这两个条件的细胞群才能确定为所述人循环肿瘤细胞。
根据本发明，所述人实体瘤细胞特异表面标记物为HLA(Human LeukocyteAntigen，人类白细胞抗原)、EPCAM(Epithelial Cell Adhesion Molecule，上皮细胞粘附分子)、CKs(cytokeratins，细胞角蛋白家族)或CD44(Cluster of Differentiation，分化抗原44)中的任意一种或至少两种的组合，优选为HLA。
根据本发明，所述小鼠模型外周血细胞特异表面标记物为CD45(LeukocyteCommon Antigen，白细胞共同抗原)和/或MHCI(Major Histocompatibility Complexclass I molecule，主要组织相容性复合体I类分子)，优选为CD45。
根据本发明，所述分析技术选自但不限于流式细胞技术和/或免疫组化技术。
第五方面，本发明提供一种制备人循环肿瘤细胞的方法，包括如下步骤：采用分选技术分离如第二方面所述的循环肿瘤细胞小鼠模型中的人循环肿瘤细胞；
所述人循环肿瘤细胞为所述小鼠模型中外周血白细胞中人实体瘤细胞特异表面标记物阳性，且所述小鼠模型外周血细胞特异表面标记物阴性的细胞群；
根据本发明，所述人实体瘤细胞特异表面标记物为HLA、EPCAM、CKs或CD44中的任意一种或至少两种的组合，优选为HLA。
根据本发明，所述小鼠模型外周血细胞特异表面标记物为CD45和/或MHCI，优选为CD45。
优选地，所述分选技术选自但不限于流式细胞和/或磁珠分选技术。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
(1)本发明方法采用二次移植的方式，将原代肿瘤异种移植模型中的CTCs通过肾囊膜移植到免疫缺陷小鼠体内，可用于研究CTCs体内转移的机制及扩散情况以及针对CTCs的药效实验；
(2)采用本发明所诉的方式，能够有效地得到大量CTCs来源的肺癌肿瘤模型，且模型来源于同一病人样本，生物学背景一致，有利于后续实验的开展。
附图说明
图1是本发明通过免疫组化对比肺癌病人原代肿瘤组织和PDX模型肿瘤组织，其中，图1(A)为通过免疫组化对比肺癌病人原代肿瘤组织和PDX模型肿瘤组织的结果图，图1(B)为通过免疫组化分析原代肺癌在PDX小鼠中的转移情况的结果图；
图2是本发明通过流式细胞术分析原代肺癌在PDX小鼠中的转移情况的结果图；
图3是本发明通过流式细胞术分析CTC模型小鼠中肿瘤的生长和转移情况的结果图。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合附图并通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
本发明所有动物饲养、繁殖于SPF(Specific Pathogen Free)级别实验动物中心。
本发明所有原代肿瘤组织样本来源于三甲医院的肿瘤组织样本库。
实施例1：肺癌PDX模型的构建
1)原代肺癌样本处理：原代肺癌肿瘤组织样本来源于三甲医院的肿瘤组织样本库，肺癌样本需浸泡于RMPI-1640培养基并保存于冰上运输。获取肿瘤样本后，使用PBS(1％P/S)清洗2-3次将样本分成三份，一份冻存保种；一份进行肿瘤组织切片和免疫组化分析；一份用于肿瘤移植备用。
2)肺癌组织移植与检测：可通过肝癌样本大小选择合适的肿瘤组织移植方式。移植方式如下：
(1)皮下移植：用剪刀将原代肿瘤组织样本剪成15mm3的肿瘤组织小块，将肺癌肿瘤组织小块用Matrix Gel包裹备用，用剪刀在小鼠下腹部一侧剪开小口，用镊子将MatrixGel包裹的肿瘤组织块夹入小口中，用伤口夹将小口缝合；
(2)肾囊膜移植：用剪刀将原代肿瘤组织样本剪成体积为2mm3的肿瘤组织小块备用；将小鼠麻醉，选取小鼠一侧肾脏，在肾包囊上开小口(开口大小与移植管口相当)，用青霉素-生理盐水湿润肾包囊，以移植管吸取带一只的聚合卵巢并移植入受体小鼠肾囊膜下(远离手术开口)，将肾脏放回体腔中，并向体腔中注入适量青霉素-生理盐水，依次缝合腹膜和皮肤，于伤口涂抹碘酒消毒。
实施例2：肺癌PDX模型的多次传代
肺癌PDX小鼠模型传代：将实施例1的肺癌PDX小鼠通过CO2处死后，取小鼠肿瘤组织，剪取肿瘤组织外层肉色部分，使用PBS(1％P/S)清洗2-3次，将样本分成三份，一份冻存保种；一份进行肿瘤组织切片和免疫组化分析；一份用于肿瘤移植；
(1)皮下移植：用剪刀将原代肿瘤组织样本剪成15mm3的肿瘤组织小块，将肺癌肿瘤组织小块用Matrix Gel包裹备用，用剪刀在小鼠下腹部一侧剪开小口，用镊子将MatrixGel包裹的肿瘤组织块夹入小口中，用伤口夹将小口缝合；
(2)肾囊膜移植：用剪刀将原代肿瘤组织样本剪成体积为2mm3的肿瘤组织小块备用；将小鼠麻醉，选取小鼠一侧肾脏，在肾包囊上开小口(开口大小与移植管口相当)，用青霉素-生理盐水湿润肾包囊，以移植管吸取带一只的聚合卵巢并移植入受体小鼠肾囊膜下(远离手术开口)，将肾脏放回体腔中，并向体腔中注入适量青霉素-生理盐水，依次缝合腹膜和皮肤，于伤口涂抹碘酒消毒。
所述传代可以传代3-5次。
实施例3：肺癌PDX模型的检测
肿瘤移植30-60天内，CO2处死实施例1和实施例2的PDX模型，取小鼠外周血、肺脏、肝脏、脾脏和肿瘤组织，通过流式细胞技术检测其中的肿瘤细胞的比例(hHLA+)和迁移(除肿瘤组织外的器官hHLA+细胞比例)，结果如图1-2所示。
结果分析：从图1(A)免疫组化的结果显示PDX小鼠体内的肿瘤和病人肿瘤表达一致的肿瘤标记物(甲状腺转录因子1(TTF1)、细胞角蛋白7(CK7)、天冬氨酸蛋白酶A(NapsinA)，表明在免疫缺陷小鼠体内传代后，肿瘤保留原有组织结构特征。图1(B)免疫组化结果显示肺癌可以在免疫缺陷小鼠体内转移到肺部、脾脏和肝脏等主要器官，可见采用构建PDX模型后再采集CTCs进行移植是可行的。从图2流式数据图可知病人原代肺癌可以在免疫缺陷小鼠体内转移到骨、脾脏、肝脏和肺部。人白细胞抗原(hHLA)标记人肿瘤细胞，鼠白细胞共同抗原(mCD45)标记鼠细胞。
实施例4：构建循环肿瘤细胞小鼠模型
(1)前处理：将肺癌组织样本采用浓度为1％的PBS进行清洗2-3次；
(2)皮下移植：将前处理后的肺癌组织样本剪成体积为15mm3的小块，采用Matrixgel包裹，移植到免疫缺陷小鼠体内，构建原代癌症异种移植模型PDX小鼠模型；
(3)采集循环肿瘤细胞：当步骤(2)所述PDX小鼠模型培养30-60天后，用CO2处死，采集全部外周血，300g离心收集全部血细胞，加入红细胞裂解液，300g离心收集白细胞即得所述循环肿瘤细胞；
(4)肾囊膜移植：将步骤(3)采集的循环肿瘤细胞采用PBS进行调节浓度，调节到浓度为40CTCs/μL，将免疫缺陷小鼠麻醉，选取免疫缺陷小鼠一侧肾脏，用青霉素-生理盐水湿润肾包囊，用胰岛素针吸取10μL细胞重悬液，移植入受体小鼠肾囊膜下，将肾脏放回体腔中，并向体腔中注入适量青霉素-生理盐水，依次缝合腹膜和皮肤，于伤口涂抹碘酒消毒，即构建成功所述循环肿瘤细胞小鼠模型。
实施例5：构建循环肿瘤细胞小鼠模型
(1)前处理：将肺癌组织样本采用浓度为3％的PBS进行清洗2-3次；
(2)皮下移植：将前处理后的肺癌组织样本剪成体积为10mm3的小块，采用Matrixgel包裹，移植到免疫缺陷小鼠体内，构建原代癌症异种移植模型PDX小鼠模型；
(3)采集循环肿瘤细胞：当步骤(2)所述PDX小鼠模型培养30-60天后，用CO2处死，采集全部外周血，400g离心收集全部血细胞，加入红细胞裂解液，400g离心收集白细胞即得所述循环肿瘤细胞；
(4)肾囊膜移植：将步骤(3)采集的循环肿瘤细胞采用PBS进行调节浓度，调节到浓度为50CTCs/μL，将免疫缺陷小鼠麻醉，选取免疫缺陷小鼠一侧肾脏，用青霉素-生理盐水湿润肾包囊，用胰岛素针吸取5μL细胞重悬液，移植入受体小鼠肾囊膜下，将肾脏放回体腔中，并向体腔中注入适量青霉素-生理盐水，依次缝合腹膜和皮肤，于伤口涂抹碘酒消毒，即构建成功所述循环肿瘤细胞小鼠模型。
实施例6：构建循环肿瘤细胞小鼠模型
(1)前处理：将肺癌组织样本采用浓度为0.5％的PBS进行清洗5次；
(2)皮下移植：将前处理后的肺癌组织样本剪成体积为30mm3的小块，采用Matrixgel包裹，移植到免疫缺陷小鼠体内，构建原代癌症异种移植模型PDX小鼠模型；
(3)采集循环肿瘤细胞：当步骤(2)所述PDX小鼠模型培养30-60天后，用CO2处死，采集全部外周血，100g离心收集全部血细胞，加入红细胞裂解液，100g离心收集白细胞即得所述循环肿瘤细胞；
(4)肾囊膜移植：将步骤(3)采集的循环肿瘤细胞采用PBS进行调节浓度，调节到浓度为30CTCs/μL，将免疫缺陷小鼠麻醉，选取免疫缺陷小鼠一侧肾脏，用青霉素-生理盐水湿润肾包囊，用胰岛素针吸取20μL细胞重悬液，移植入受体小鼠肾囊膜下，将肾脏放回体腔中，并向体腔中注入适量青霉素-生理盐水，依次缝合腹膜和皮肤，于伤口涂抹碘酒消毒，即构建成功所述循环肿瘤细胞小鼠模型。
由于实施例5-6制备的小鼠模型的结果与实施例4类似，后续的实验都采用实施例4制备的小鼠模型。
实施例7：循环肿瘤细胞小鼠模型的检测
将实施例1构建的循环肿瘤小鼠模型，肿瘤移植60-90天内，CO2处死小鼠，取小鼠外周血、肺脏、肝脏、脾脏和肿瘤组织，通过流式细胞技术检测其中的肿瘤细胞的比例(hHLA+)和迁移(除肿瘤组织外的器官hHLA+细胞比例)，结果如图3所示。
结果分析：从图3流式数据图可知CTCs可以在免疫缺陷小鼠体内长成肿瘤，并且转移到骨、脾脏、肝脏和肺部。人白细胞抗原(hHLA)标记人肿瘤细胞，鼠白细胞共同抗原(mCD45)标记鼠细胞。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的详细方法，但本发明并不局限于上述详细方法，即不意味着本发明必须依赖上述详细方法才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。

Claims (10)

1.一种循环肿瘤细胞小鼠模型的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)皮下移植：将原代肿瘤组织样本移植到免疫缺陷小鼠的体内，构建原代癌症异种移植模型PDX；
(2)采集循环肿瘤细胞：采集步骤(1)所述的原代癌症异种移植模型的外周血中的循环肿瘤细胞；
(3)肾囊膜移植：将步骤(2)采集的循环肿瘤细胞移植到免疫缺陷小鼠的肾囊膜内，即构建成功所述循环肿瘤细胞小鼠模型。
2.根据权利要求1所述的构建方法，其特征在于，所述方法还包括对所述肿瘤组织样本的前处理；
优选地，所述前处理具体包括：将所述肿瘤组织样本采用浓度为0.5-3％，优选为1％的PBS进行清洗1-5次，优选为2-3次；
优选地，步骤(1)所述的肿瘤为实体瘤，优选为上皮细胞来源的实体瘤，进一步优选为肺癌、肝癌、胃癌、直肠癌或乳腺癌中的任意一种或至少两种的组合，最优选为肺癌；
优选地，步骤(1)所述肿瘤组织样本剪成体积为10-30mm3，优选为15mm3；
优选地，步骤(1)所述的肿瘤组织样本修剪后采用基质胶包裹备用；
优选地，步骤(1)所述免疫缺陷小鼠为C57BL/6-nu、NOD、CB17-scid、NOD-scid、C57BL/6-Rag1–/–、BALB/c-Rag2–/–、C57BL/6-IL2rg–/–、NSG、NOG或NSI中的任意一种或至少两种的组合，优选为NSI。
3.根据权利要求1或2所述的构建方法，其特征在于，步骤(2)所述采集步骤(1)所述的原代癌症异种移植模型的外周血中的循环肿瘤细胞具体包括：处死步骤(1)所述PDX小鼠模型，采集全部外周血，离心收集全部血细胞，加入红细胞裂解液，离心收集白细胞即得所述循环肿瘤细胞；
优选地，步骤(2)所述处死的PDX小鼠模型为步骤(1)将肿瘤组织样本移植到免疫缺陷小鼠体内后20-80天，优选为30-60天；
优选地，所述离心的离心力为100-400g，优选为200-350g，进一步优选为300g。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的构建方法，其特征在于，步骤(3)所述循环肿瘤细胞的浓度为30-50CTCs/μL，优选为40CTCs/μL；
优选地，步骤(3)所述循环肿瘤细胞的移植体积为5-20μL，优选为10μL；
优选地，步骤(3)所述的免疫缺陷小鼠为C57BL/6-nu、NOD、CB17-scid、NOD-scid、C57BL/6-Rag1–/–、BALB/c-Rag2–/–、C57BL/6-IL2rg–/–、NSG、NOG或NSI中的任意一种或至少两种的组合，优选为NSI；
优选地，步骤(3)所述移植到肾囊膜内具体包括：将免疫缺陷小鼠麻醉，选取小鼠一侧肾脏，用青霉素-生理盐水湿润肾包囊，用胰岛素针吸取细胞重悬液，移植入受体小鼠肾囊膜下，将肾脏放回体腔中，并向体腔中注入适量青霉素-生理盐水，依次缝合腹膜和皮肤，于伤口涂抹碘酒消毒。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的构建方法，其特征在于，包括如下步骤：
(1)前处理：将肺癌组织样本采用浓度为0.5-3％的PBS进行清洗1-5次；
(2)皮下移植：将前处理后的肺癌组织样本剪成体积为10-30mm3的小块，采用Matrixgel包裹，移植到免疫缺陷小鼠体内，构建原代癌症异种移植模型PDX小鼠模型；
(3)采集循环肿瘤细胞：当步骤(2)所述PDX小鼠模型培养20-80天后，用CO2处死，采集全部外周血，100-400g离心收集全部血细胞，加入红细胞裂解液，100-400g离心收集白细胞即得所述循环肿瘤细胞；
(4)肾囊膜移植：将步骤(3)采集的循环肿瘤细胞采用PBS进行调节浓度，调节到浓度为30-50CTCs/μL，将免疫缺陷小鼠麻醉，选取小鼠一侧肾脏，用青霉素-生理盐水湿润肾包囊，用胰岛素针吸取5-20μL细胞重悬液，移植入受体小鼠肾囊膜下，将肾脏放回体腔中，并向体腔中注入适量青霉素-生理盐水，依次缝合腹膜和皮肤，于伤口涂抹碘酒消毒，即构建成功所述循环肿瘤细胞小鼠模型。
6.一种如权利要求1-5中任一项所述的构建方法制备得到的循环肿瘤细胞小鼠模型。
7.一种如权利要求6所述的循环肿瘤细胞小鼠模型用于制备人体的病理和生理的研究的模型鼠，优选作为肿瘤疾病研究的模型鼠，进一步优选为作为肿瘤转移研究的模型鼠。
8.一种如权利要求6所述的循环肿瘤细胞小鼠模型的人循环肿瘤细胞的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：将人实体瘤细胞特异表面标记物和小鼠外周血细胞特异表面标记物进行标记，通过分析技术分析小鼠模型外周血白细胞中人循环肿瘤细胞；
所述人实体瘤细胞特异表面标记物阳性，且所述小鼠模型外周血细胞特异表面标记物阴性的细胞群为所述小鼠模型中的人循环肿瘤细胞。
9.一种如权利要求8所述的检测方法，其特征在于，所述人实体瘤细胞特异表面标记物优选为人类白细胞抗原、上皮细胞粘附分子或细胞角蛋白家族分化抗原44中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为人类白细胞抗原；
优选地，所述小鼠外周血细胞特异表面标记物优选为白细胞共同抗原和/或主要组织相容性复合体I类分子，进一步优选为白细胞共同抗原；
优选地，所述分析技术为流式细胞技术和/或免疫组化技术。
10.一种制备人循环肿瘤细胞的方法，其特征在于，包括如下步骤：采用分选技术分离如权利要求6所述的循环肿瘤细胞小鼠模型中的人循环肿瘤细胞；
所述分离的人循环肿瘤细胞为所述小鼠模型中外周血白细胞中人实体瘤细胞特异表面标记物阳性，且小鼠外周血细胞特异表面标记物阴性的细胞群；
优选地，所述人实体瘤细胞特异表面标记物优选为人类白细胞抗原、上皮细胞粘附分子、细胞角蛋白家族或分化抗原4中的任意一种或至少两种的组合，进一步优选为人类白细胞抗原；
优选地，所述小鼠外周血细胞特异表面标记物优选为白细胞共同抗原和/或主要组织相容性复合体I类分子，进一步优选为白细胞共同抗原；
优选地，所述分选技术为流式细胞和/或磁珠分选技术。
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