CN113368262A - 通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法，包括，将杀伤细胞输入实体肿瘤转移动物模型的外周血，然后从所述实体肿瘤转移动物模型中获取离体样品。本发明的所述通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法中，通过向所述外周血输入杀伤细胞以直接作用于所述实体肿瘤转移动物模型的循环肿瘤细胞，并检测离体样品中的循环肿瘤细胞数目或分布情况，有利于对后续临床应用中的转移灶控制起到参考作用。

Description

通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法

技术领域

本发明涉及过继免疫疗法技术领域，尤其涉及通过肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法。

背景技术

外周血中存在的肿瘤细胞称为循环肿瘤细胞(Circulating tumor cells，CTCs)。常规手术能够有效切除原发肿瘤，但早期阶段的原发肿瘤就会有肿瘤细胞脱落并进入血液或淋巴系统，其中具有高活力和高转移潜能的肿瘤细胞能够在循环系统中存活下来，进而循行并可能定植于远处器官组织以形成转移灶，极大提高了肿瘤的复发率。如能在进入外周血的肿瘤细胞形成转移灶之前使其被清除，不仅有望结合其他的临床方法控制转移灶的数目甚至杜绝转移灶的形成，更有利于减小肿瘤患者预后治疗的难度。

目前，现有技术对CTCs的研究大多集中在如何分离和准确鉴定外周血中的CTCs的表达特征等以提高预后方案的准确和有效性。例如公开号为CN112891659A的中国专利申请公开了使用磁珠过滤装置分离和劫获外周血中的CTCs，实现血液CTCs的清除。其中涉及的芯片过滤装置节流的CTCs有限，持续时间短，且存在磁珠残留等问题，显然不具有临床应用前景。如应用于临床，检测及清除CTCs必须要保证过程的安全、有效、可重复且对病人的创伤小等。

细胞疗法已经在血液瘤治疗中获得了显著的成效，目前已经有CAR-T细胞治疗产品用于血液瘤成人患者的治疗。然而实体瘤，尤其是复发型实体瘤的治疗仍然是细胞疗法难以攻克的顽石。考虑到实体瘤治疗过程中会释放CTCs进入外周血，并诱发转移灶的形成，使得CTCs成为了评估实体瘤的重要参考指标。

因此，有必要设计一种通过肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法以避免现有技术中存在的上述问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一种通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法，以有利于对后续临床应用中的转移灶控制起到参考作用。

为实现上述目的，本发明的所述通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法包括：

S0：提供实体肿瘤转移动物模型和杀伤细胞，所述实体肿瘤转移动物模型的循环系统含有循环肿瘤细胞；

S1：将所述杀伤细胞输入所述实体肿瘤转移动物模型的外周血，以作用于所述循环肿瘤细胞；

S2：从所述实体肿瘤转移动物模型中获取离体样品，检测所述离体样品以获取中间结果，所述中间结果为所述离体样品中的循环肿瘤细胞数目或分布情况。

本发明的所述通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法之有益效果在于：通过向所述外周血输入杀伤细胞以直接作用于所述实体肿瘤转移动物模型的循环肿瘤细胞，并检测离体样品中的循环肿瘤细胞数目或分布情况，有利于对后续临床应用中的转移灶控制起到参考作用。

具体的，本发明通过实体肿瘤转移动物模型获取的中间结果为所述离体样品中的循环肿瘤细胞数据和分布情况，所述中间结果并非诊断或治疗的结果，原因如下：

作为本领域公知常识的是，一方面，由原发肿瘤脱落而进入循环系统的肿瘤细胞在循环系统中循行和定植的机理是非常复杂的，循环系统中肿瘤细胞的存在与否与转移灶的形成没有必然的联系。

从实际的临床观察来看，有的患者的循环系统，例如血液循环系统的外周血中能够检测到循环肿瘤细胞，但可能由于该循环肿瘤细胞不具有定植的能力，该患者终生不会出现转移灶；有的患者尽管外周血中没有检测到循环肿瘤细胞，但仍能通过体腔转移、腹膜转移等非循环途径形成转移灶。因此，凭借循环肿瘤细胞的数目变化或分布情况变化无法判断转移灶的形成情况。

另一方面，杀伤细胞作为外源物质，作用于所述循环系统肿瘤细胞的同时极易引起患者自身免疫系统的排异反应或者引发其他非肿瘤部位的炎症风暴，严重时甚至是造成患者死亡的原因。例如，有报道显示靶向HER2的CAR-T细胞应用于临床治疗结肠癌的同时会高效识别并杀伤表达HER2的正常肺细胞，从而引起肺部毒性和水肿，并导致患者的死亡。可见，要想真正起到治疗的效果，绝不仅仅是向患者施用合适剂量的杀伤细胞就能够解决的问题，而是必须要结合其他临床方法，例如辅助使用抗炎药物或对患者的相关器官功能进行监测以及跟踪干预控制。

综上所述，本申请利用了实体肿瘤转移动物模型来研究杀伤细胞和循环肿瘤细胞的相互作用，并获取了离体样品中的循环肿瘤细胞数目或分布情况作为中间结果，从而为后续的临床应用提供有价值的参考意见。

优选的，所述杀伤细胞为基因修饰的免疫细胞。

进一步优选的，所述免疫细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞、树突状细胞、巨噬细胞和B细胞的至少一种。

进一步优选的，所述T细胞为γδT细胞。

进一步优选的，所述基因修饰的免疫细胞通过嵌合抗原受体和T细胞受体的任意一种对免疫细胞进行基因修饰得到。

其中，所述嵌合抗原受体通过识别和结合所述肿瘤细胞的抗原靶点并引发免疫应答反应，从而促使所述肿瘤细胞凋亡。

进一步优选的，所述嵌合抗原受体包括胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号区，所述胞外识别区特异性识别EpCAM、c-MET、CD47、Vimentin、E-cadherin、Cytokeratins、Zonula occludens、ESPR1、N-cadherin、Twist1、ZEB1、FGFR2IIIc、PLS3、ALDH1、CD44、GD2、GD3、Claudin18.2、Claudin6和GD1a的任意一种。

进一步优选的，所述基因修饰的免疫细胞通过嵌合抗原受体对T细胞进行基因修饰得到。

进一步优选的，所述嵌合抗原受体的序列如SEQ ID.3所示。

优选的，所述实体肿瘤转移动物模型为血行转移的实体肿瘤转移动物模型。

进一步优选的，所述步骤S0中，通过原位移植、静脉注射和皮下移植中的任意一种方式将外源循环肿瘤细胞引入实验动物体内，以建立所述实体肿瘤转移动物模型。

进一步优选的，将所述外源循环肿瘤细胞引入所述实验动物体内之后，获取并检测所述实验动物的外周血样品中含有所述循环肿瘤细胞后，执行所述步骤S1。

进一步优选的，将所述外源循环肿瘤细胞引入所述实验动物体内以形成实体肿瘤组织，切除所述实体肿瘤组织后执行所述步骤S1。

进一步优选的，所述步骤S1中，将包含所述杀伤细胞的细胞悬液通过静脉注射的方式输入所述实验动物体内，每次输入的细胞悬液中的杀伤细胞剂量为1×10⁴个/Kg-1×10⁸个/Kg。

优选的，所述步骤S2中，所述离体样品为离体外周血样品或离体实体肿瘤组织。

附图说明

图1为本发明实施例的通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的流程图；

图2为实施例1的利用微流控芯片验证CTC检测的方法学实验结果；

图3为实施例2的参比样品和EpCAM CAR-T阳性率检测的流式分析结果，左侧为unT细胞，右侧为CAR-T细胞；

图4为实施例3的体外模拟杀伤CTC实验终点各组肿瘤细胞存活率；

图5为实施例4的Day17时各组小鼠的血生化散点图对比，其中(a)谷丙转氨酶ALT(U/L)含量；(b)谷草转氨酶AST(U/L)含量；

图6为实施例4的各组小鼠外周血中human CD45+和human CD3+T细胞存续情况对比图；

图7为实施例4的给药后动物体重变化趋势图；

图8为实施例4的给药后各组小鼠肿瘤体积增长趋势图；

图9为实施例4的给药后各组小鼠活体荧光成像图统计得到的平均荧光值变化情况对比图；

图10为实施例4的给药后各组小鼠活体荧光成像对比图；

图11为实施例4的Day26时实验小鼠的(a)离体肺脏荧光值和(b)离体肝脏荧光值对比图；

图12为实施例4的Day26时实验小鼠的离体肺脏荧光和离体肝脏荧光成像对比图；

图13为实施例4的Day26各组实验小鼠的血液CTC含量；

图14为实施例5的Day17时各组小鼠的血生化散点图对比，其中(a)谷丙转氨酶ALT(U/L)含量；(b)谷草转氨酶AST(U/L)含量；

图15为实施例5的各组小鼠外周血中human CD45+和human CD3+T细胞存续情况对比图；

图16为实施例5的给药后动物体重变化趋势图；

图17为实施例5的给药后各组小鼠肿瘤荧光值增长趋势图；

图18为实施例5的给药后各组小鼠活体荧光成像对比图；

图19为实施例5的Day27时实验小鼠的(a)离体肺脏活体成像荧光值和(b)离体肝脏活体成像荧光值对比图；

图20为实施例5的Day27时实验小鼠的离体肺脏荧光和离体肝脏荧光成像对比图；

图21为实施例5的Day27时实验小鼠血样中的CTC含量。

具体实施方式

为使本发明实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。除非另外定义，此处使用的技术术语或者科学术语应当为本发明所属领域内具有一般技能的人士所理解的通常意义。本文中使用的“包括”等类似的词语意指出现该词前面的元件或者物件涵盖出现在该词后面列举的元件或者物件及其等同，而不排除其他元件或者物件。

本发明实施例提供了一种通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法，参照图1，包括：

S0：提供实体肿瘤转移动物模型和杀伤细胞，所述实体肿瘤转移动物模型的循环系统含有循环肿瘤细胞；

S1：将所述杀伤细胞输入所述实体肿瘤转移动物模型的外周血，以作用于所述循环肿瘤细胞；

S2：从所述实体肿瘤转移动物模型中获取离体样品，检测所述离体样品中的循环肿瘤细胞数目或分布情况作为中间结果。

本发明实施例中，通过向所述外周血输入杀伤细胞以直接作用于所述实体肿瘤转移动物模型的循环肿瘤细胞，从而考察所述杀伤细胞对所述实体肿瘤转移动物模型的影响，有利于对后续临床应用中的转移灶控制提供有价值的参考。

本发明一些实施例中，所述实体肿瘤细胞来源于实体肿瘤。

具体的，所述肿瘤细胞的抗原靶点为EpCAM、c-MET、CD47、Vimentin、E-cadherin、Cytokeratins、Zonula occludens、ESPR1、N-cadherin、Twist1、ZEB1、FGFR2IIIc、PLS3、ALDH1、CD44、GD2、GD3、Claudin18.2、Claudin6和GD1a的任意一种。

本发明一些实施例中，所述杀伤细胞包含特异性多肽，以通过识别和结合所述肿瘤细胞的抗原靶点并引发免疫应答反应，从而使所述肿瘤细胞凋亡。

其中，抗原靶点的含义为：所述肿瘤细胞中能够与所述特异性多肽相作用的结合位点，具体包括基因位点、受体、酶、离子通道、核酸等生物大分子。

本发明一些实施例中，所述特异性多肽为嵌合抗原受体，所述杀伤细胞为基因修饰的免疫细胞。具体的，所述免疫细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞、树突状细胞、巨噬细胞和B细胞的至少一种。

本发明一些实施例中，T细胞为γδT细胞。

本发明一些实施例中，所述基因修饰的免疫细胞通过嵌合抗原受体和T细胞受体的任意一种对免疫细胞进行基因修饰得到。嵌合抗原受体(Chimeric Antigen Receptor，CAR)能够靶向所述循环肿瘤细胞的抗原靶点。

本发明一些实施例中，所述基因修饰的免疫细胞为CAR-T细胞、CAR-NK细胞和CAR-M细胞中的任意一种。

本发明一些实施例中，所述嵌合抗原受体包括重链可变区和轻链可变区，所述重链可变区的序列为SEQ ID.1所示序列经替换得到的突变序列，所述轻链可变区的序列为SEQ ID.2所示序列经替换或缺失得到的突变序列。

本发明一些实施例中，所述嵌合抗原受体包含胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号区。

本发明一些实施例中，所述胞外识别区特异性识别EpCAM、c-MET、CD47、Vimentin、E-cadherin、Cytokeratins、Zonula occludens、ESPR1、N-cadherin、Twist1、ZEB1、FGFR2IIIc、PLS3、ALDH1、CD44、GD2、GD3、Claudin18.2、Claudin6和GD1a的任意一种。

本发明一些实施例中，所述铰链区的序列来源于CD8α、CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD40、CD80和IgG的至少一种。

本发明一些实施例中，所述跨膜区的序列来源于CD8α、CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD40和CD80的至少一种。

本发明一些实施例中，所述胞内信号区的序列来源于CD8α、CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD40、CD80、DAP10、DAP12、CD3ζ和CD3e的至少一种。

本发明一些实施例中，所述实体肿瘤转移动物模型为血行转移的实体肿瘤转移动物模型。

本发明一些实施例中的所述步骤S0还包括，通过原位移植、静脉注射和皮下移植中的任意一种方式将外源循环肿瘤细胞引入实验动物体内，以建立所述实体肿瘤转移动物模型。

具体的，所述外源循环肿瘤细胞来源于人实体肿瘤细胞株或人实体肿瘤组织。

进一步的，所述外源循环肿瘤细胞引入所述实验动物体内之后，获取并检测所述实验动物的外周血样品，确认所述外周血样品中含有循环肿瘤细胞的数目后，执行所述步骤S1。

进一步的，所述步骤S1中，将包含所述杀伤细胞的细胞悬液通过静脉注射的方式引入所述实验动物体内，每次输入的细胞悬液中的杀伤细胞剂量为1×10⁴个/Kg-1×10⁸个/Kg。

所述步骤S2中，所述离体样品为离体外周血样品或离体实体肿瘤组织。

以下通过具体的实施例对实体肿瘤转移动物模型的应用以及有益效果进行详细阐述。

实施例1

本实施例提供了利用微流控芯片检测CTC的相关方法学的验证，包括实验建模步骤和芯片检测步骤，以证明本发明采用的微流控芯片可以灵敏且准确检出血样中的肿瘤细胞。

实施例1中，抗EpCAM的捕获抗体来源于R&D System，货号为BAF960；血清蛋白来源于生工生物，货号为A600332-0025；TritonX-100来源于Sigma，货号为X100-500ML；DAPI溶液来源于Invitrogen，货号为D1306。

实验建模步骤具体操作如下：

将实验血样分为对照组和实验组，其中实验组血样中肿瘤细胞含量分为5、25、50和100个/毫升，每组2个血样，取1毫升健康全血中加入10微升磷酸盐缓冲液作为空白对照组。

实验组各血样的配置方法如下：

人结直肠癌细胞悬液1、人结直肠癌细胞悬液2、人结直肠癌细胞悬液3和人结直肠癌细胞悬液4均由HCT116细胞和磷酸盐缓冲液组成，HCT116细胞的含量分别为1×10⁴个/毫升、5×10³个/毫升、2.5×10³个/毫升以及5×10²个/毫升。取上述悬液各10微升在镜下分别进行细胞计数，确认每种悬液的细胞含量后，将悬液中的细胞分别离心至离心管内，并向每个离心管各加入1毫升健康全血，得到含有肿瘤细胞的血样作为实验组，完成利用微流控芯片检测CTC的相关方法学的模型建立。

芯片检测步骤的具体操作如下：

将微流控芯片与抗EpCAM的捕获抗体孵育过夜后，用磷酸盐缓冲液清洗芯片，然后用血清蛋白封闭芯片1小时后再次用磷酸盐缓冲液清洗芯片并低温保存备用；

将实验血样缓慢注入微流控芯片内，注射完毕后用磷酸盐缓冲液缓慢冲洗微流控芯片，并在微流控芯片内加入4％多聚甲醛溶液固定细胞，用含Tween20的磷酸盐缓冲液清洗微流控芯片；

在微流控芯片内加入TritonX-100，孵育5分钟后，用含Tween20的磷酸盐缓冲液清洗微流控芯片，然后再次用血清蛋白封闭微流控芯片1小时后用含Tween20的磷酸盐缓冲液清洗微流控芯片；

在微流控芯片内加入含抗CK抗体和抗CD45抗体的一抗混合液并孵育1小时后，用含Tween20的磷酸盐缓冲液清洗微流控芯片；然后在芯片内加入二抗溶液，孵育30分钟后，用含Tween20的磷酸盐缓冲液清洗微流控芯片；再向微流控芯片加入DAPI溶液，孵育5分钟后，用含Tween20的磷酸盐缓冲液清洗芯片；最后使用倒置荧光显微镜对微流控芯片进行荧光成像，并对其中所含肿瘤细胞数目进行统计，统计结果见图2。

从图2中可以看到，健康血样中肿瘤细胞含量为0个/毫升，实验组微流控芯片检出的肿瘤细胞含量与实际的细胞含量具有良好的线性关系，微流控芯片对肿瘤细胞的平均回收率为93.4％，能够灵敏且准确检出血样中的肿瘤细胞。

实施例2

本发明实施例提供了靶向EpCAM的嵌合抗原受体(简记为EpCAM-CAR)并构建为CAR-T细胞(简记为CAR-T)。

EpCAM-CAR的分子结构由信号肽、抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内共刺激信号结构域组成。EpCAM-CAR和第三代慢病毒载体骨架部分所组成的CAR质粒由和元生物科技有限公司使用全基因合成技术构建得到。EpCAM-CAR序列请参见SEQ ID NO.3。

具体包装方法如下：

在T75培养瓶中接种293T细胞并培养至汇合度在70％-80％左右，然后进行等体积换液，得到待转染样品，其中，培养瓶中控制细胞数量为5x10⁶，培养体积为20毫升，使用的培养基为含10％胎牛血清的DMEM培养基；

使用2毫升Opti-MEM和55微升Lipo3000配置Tube A液；使用2毫升Opti-MEM、46微升P3000、18微克辅助质粒以及6微克EpCAM-CAR主质粒配置Tube B液；

将Tube A液和Tube B液混匀后室温孵育15分钟，然后加入所述待转染样品培养48小时；

48小时转染完毕后，收集上清并在500g离心10min，过滤上清至离心管中密封，在10000g，4℃下离心过夜，得到白色病毒沉淀；提取白色病毒沉淀并用200μl AIM-V培养基溶解后，取2ul按照后续步骤测定滴度，其余置于-80℃保存。

将2ul重悬病毒上清加至198ul 1640培养基中稀释病毒，后在24孔板中按照每孔2x105数量分别加入稀释后的病毒2ul、10ul和50ul一共3个孔，并加入终浓度为5ul/ml的Polybrene辅助病毒感染48小时，得到慢病毒。病毒感染结束后，使用EpCAM-FITC标记抗原检测病毒滴度，滴度在2.5E+07-1.2E+08之间。

本发明实施例将上述慢病毒感染人外周血单个核细胞(PBMC)以构建CAR-T细胞(简记为CAR-T)。具体构建过程如下：

人外周血单个核细胞(PBMC)采用由AIM-V培养基、5％胎牛血清、青霉素100U/mL、链霉素0.1mg/mL以及300IU/mL IL-2组成的培养基进行培养；采用来源于美天旎公司的CD2/CD3/CD28 T细胞激活扩增试剂盒激活T细胞，即包被磁珠与细胞以1:2比例混合，细胞最终密度为5×10⁶个/mL/cm²，混合后置于37℃、5％CO2培养箱培养刺激48h；将来源于Takara公司的RetroNectin稀释至20μg/ml后包被培养板(non-tissue culture treated)，包被液4μg/cm2，置于4℃冰箱过夜。T细胞激活的48h后，在300g下离心5min去上清，用新鲜培养基重悬T细胞，转移至使用来源于Takara公司的RetroNectin包被好的板中，加入上述慢病毒并控制MOI＝5，置于37℃、5％CO2培养箱培养；同时制备未加入慢病毒的T细胞作为参比样品简记为unT)；加入慢病毒的24h后，300g离心5min，去上清，培养基重悬T细胞，即得CAR-T。

进一步的，加入慢病毒的48h后，取样使用流式细胞术检测转导率，其中使用EpCAM蛋白作为一抗，来源于Biolegend公司的anti-EpCAM-FITC作为二抗，得到图3所示的参比样品和CAR-T的流式分析结果对比图，可知CAR在CAR-T上得到了成功的表达。

实施例3

本实施例证明了杀伤细胞能够在体外模拟体系中清除CTC。

24孔板分为健康血样组、空白对照组(Blank组)、UnT组和CAR-T组。其中CAR-T组分为低剂量CAR-T组1和高剂量CAR-T组2。

在24孔板第2列的三个孔2-A、2-B、2-C、第三列的四个孔3-A、3-B、3-C和3-D孔以及第四列的四个孔4-A、4-B、4-C和4-D中分别加入0.5毫升全血后，再分别加入10微升人结直肠癌细胞悬液并混合均匀以模拟含CTC的血样。其中的人结直肠癌细胞悬液由HCT116细胞和磷酸盐缓冲液组成，HCT116细胞的含量为1×10⁴个/毫升。取磷酸盐缓冲液10微升分别加入24孔板的第2列的2-D孔作为空白组，至此完成体外药物杀伤CTC实验的血样建模。

然后，将效应细胞与2-A、2-B、2-C、3-A、3-B、3-C和3-D，以及4-A、4-B、4-C和4-D的血样共孵育，具体操作步骤如下：

未转导T细胞(UnT)悬液由UnT细胞和AIMV培养基组成，UnT细胞的含量为1×10⁷个/毫升。未转导T细胞来源于人外周血单个核细胞(PBMC)。

CAR-T细胞悬液1和CAR-T细胞悬液2由CAR-T细胞和AIMV培养基组成，其中CAR-T细胞悬液1的CAR-T细胞的含量为2×10⁵个/毫升，CAR-T细胞悬液2的CAR-T细胞的含量为1×10⁷个/毫升。CAR-T细胞悬液1和CAR-T细胞悬液2中的CAR-T细胞由实施例2得到。

将0.1mL AIMV培养基分别加入3-D和4-D孔形成AIMV培养基组，0.1mL UnT细胞悬液分别加入2-C、3-C和4-C组形成UnT组，其中UnT的浓度为1M。0.1mL CAR-T细胞悬液1分别加入2-B、3-B和4-B孔形成低剂量的CAR-T组1，其中CAR-T的浓度为0.02M。0.1mL CarT细胞悬液2分别加入2-A、3-A和4-A孔形成高剂量的CAR-T组2，其中CAR-T的浓度为1M。

将24孔板置于37℃含5％的CO2细胞培养箱中培养24h。

培养结束后，使用实施例1提供的芯片检测步骤对各组所含肿瘤细胞数目进行统计，实验组数据统计结果见图4。健康血样中肿瘤细胞含量为0个/毫升，Blank组、UnT组、CAR-T组1和CAR-T组2的血样中的平均肿瘤细胞存活率分别为95.4％、63.2％、18.7％和4.0％。比较实验结果可以看出CAR-T组血样中的肿瘤细胞存活率较AIMV组和UnT组显著降低，而高剂量CAR-T组2的血样中肿瘤细胞存活率比低剂量CAR-T组1有进一步降低。实验结果表明在该体外杀伤循环肿瘤细胞模型中CAR-T细胞可以明显降低血样中的肿瘤细胞存活率，具有较强的肿瘤杀伤能力，且随着CAR-T细胞浓度的增高，其表现的血样中肿瘤杀伤能力增强。

实施例4

本实施例提供了肿瘤转移动物模型的第一种应用，证明CAR-T可以通过杀伤血样中CTC的方式，抑制肿瘤的转移。

所述第一种应用的步骤S0包括：通过皮下荷瘤和尾静脉注射法建立人结直肠癌血行转移小鼠模型作为肿瘤转移动物模型。具体操作步骤如下：

提供低温保存的人结直肠癌细胞悬液和若干体重为18-22克，6周龄的雌性M-NSG实验小鼠；其中，人结直肠癌细胞悬液1由HCT116细胞和磷酸盐缓冲液组成，HCT116细胞的含量为5×10⁷个/毫升。人结直肠癌细胞悬液2由HCT116-Luc细胞和磷酸盐缓冲液组成，HCT116-Luc细胞的含量为1×10⁷个/毫升。

将所述人结直肠癌细胞悬液1通过右侧皮下注射的方式注入每只实验小鼠，所述人结直肠癌细胞悬液1的注射剂量为0.1毫升，并在3秒内完成推注以确保HCT116细胞的注入剂量以及活性。

尾静脉注射完毕后在SPF级条件下继续饲养，定期观察小鼠及肿瘤生长情况。待平均肿瘤体积约为110mm³时，淘汰体积过大、过小或者肿瘤形状不规则的动物。

第一次给药当天记为Day 0，在Day 3将人结直肠癌细胞悬液2分为两次通过尾静脉注射的方式注入每只实验小鼠，作为人结直肠癌血行转移小鼠模型。所述人结直肠癌细胞悬液2的注射剂量每次为0.1毫升，每次注射间隔15min。注意需要确定针尖确实在尾静脉血管内，且在10秒内完成人结直肠癌细胞悬液2的推注以确保HCT116-Luc细胞的注入剂量以及活性。

在Day 5拍摄1次小鼠活体荧光成像，小鼠肿瘤平均荧光值达到5E5-5E6，完成人结直肠癌血行转移小鼠模型的建模。

所述第一种应用的步骤S1包括：

将经本实施例的步骤S0皮下荷瘤后得到的若干人结直肠癌血行转移小鼠模型随机分为对照组和给药组；给药组分为UnT组和Car-T组。每组8只，共24只小鼠。

在Day 0按照分组方案开始给药，通过尾静脉注射的方式向对照组的每只实验小鼠注射0.2毫升的生理盐水。通过尾静脉注射的方式向UnT组的每只实验小鼠注射0.2毫升的UnT细胞悬液，UnT细胞的剂量为每只实验小鼠注射3.57×10⁶个UnT细胞。通过尾静脉注射的方式向Car-T组的每只实验小鼠注射0.2毫升的靶向EpCAM的CAR-T细胞悬液，靶向EpCAM的CAR-T细胞悬液中，CAR-T细胞的剂量为每只实验小鼠注射3.57×10⁶个CAR-T细胞；靶向EpCAM的CAR-T细胞悬液中的CAR-T细胞由实施例2得到。

在Day 17时，经眼内眦采血检测各组小鼠的谷丙转氨酶ALT(U/L)和谷草转氨酶AST(U/L)的含量。结果如图5所示，PBS组、UnT组和CAR-T组的平均谷丙转氨酶ALT(U/L)的含量依次为53.6±1.6、62.8±4.9和56.8±1.5；谷草转氨酶AST(U/L)含量依次为117.6±19.9、129±10.4和104±24.1。ALT和AST在各组之间均未有显著性差异，表明Car-T在该剂量下均未表现出对肝脏的毒性反应。

在Day 21时，经眼内眦采血，通过流式细胞术(FACS)检测各组小鼠外周血中humanCD45+和human CD3+T细胞占比。如图6所示，FACS检测结果为：PBS组和UnT组小鼠外周血中human CD45+和human CD3+存续平均占比分别为0.06％和0.16％，而CAR-T组的小鼠外周血中human CD45+和human CD3+存续平均占比则明显增高，达到了18.56％。PBS组、UnT组和CAR-T组淋巴细胞中的CAR+平均占比分别为0.01％、0.00％和0.79％。实验结果表明和未转导T细胞相比，CAR-T在外周血中具有较长的存续时间。

每周称量2次小鼠体重，结果如图7所示。在Day 25时，对照组、UnT组和Car-T组小鼠的体重增长率依次为-1.62％、-4.75％和-1.15％。其中Car-T组的小鼠在实验期间能较好地保持体重，表明Car-T在该剂量下未显示明显毒性。

每周测量2次小鼠瘤径，结果如图8所示。在Day 25时，对照组小鼠平均肿瘤体积为2260.46±441.97mm³，UnT组小鼠平均肿瘤体积为2347.27±737.55mm³，肿瘤抑制率为-4.05％。Car-T组小鼠平均肿瘤体积为373.12±360.01mm³，肿瘤抑制率为87.77％。其中Car-T组平均肿瘤体积明显低于对照组，表明Car-T在该剂量下具有明显肿瘤抑制效应。

每周拍摄1次活体荧光成像，结果如图9、图10所示。随着饲养时间的延长，PBS组和UnT组小鼠体内荧光信号明显增强。CAR-T组小鼠荧光信号未出现明显变化。在Day 26时，对照组小鼠肿瘤平均荧光值为6.70×10⁹±1.79×10⁹p/s，UnT组和Car-T组的小鼠肿瘤平均荧光值依次为3.10×10⁹±1.07×10⁹p/s和6.80×10⁶±5.47×10⁶p/s。其中Car-T组小鼠肿瘤的平均荧光值明显低于对照组和UnT组。在实验计划终点，按照实验要求对小鼠取抗凝血并实施安乐死，解剖小鼠并取肺脏和肝脏拍摄离体成像，结果如图11、图12所示。对照组小鼠离体肝脏平均荧光值为2.41×10⁷±1.37×10⁷p/s，而UnT组和Car-T组小鼠的离体肝脏平均荧光值分别为5.28×10⁷±4.79×10⁷p/s和6.22×10⁴±3.21×10³p/s。其中Car-T组小鼠离体肝脏平均荧光值明显低于对照组和UnT组。对照组小鼠离体肺脏脏平均荧光值为1.45×10⁸±3.46×10⁷p/s，而UnT组和Car-T组小鼠的离体肺脏平均荧光值依次为2.09×10⁷±7.72×10⁶p/s和7.59×10⁴±5.62×10³p/s。其中Car-T组小鼠离体肺脏平均荧光值明显低于对照组和UnT组。以上实验表明CAR-T在该剂量下具有明显抑制肿瘤转移的效应。

所述第一种应用的步骤S2包括：

在Day 26时经眼内眦采血，通过微流控芯片技术检测并统计对照组和实验组的每只存活实验小鼠外周血样品中的肿瘤细胞数目。

实验统计结果如图13所示。在实验终点，对照组小鼠血样中的平均CTC含量为7.74个/mL，而UnT组小鼠血样中的平均CTC含量为5.55个/mL，CAR-T组血样中的平均CTC含量为2.84个/mL。CAR-T组小鼠外周血样品中的平均肿瘤细胞数目明显低于对照组和UnT组。表明CAR-T在该剂量下具有明显的杀伤血液中CTC效应。

实施例5

本实施例提供了肿瘤转移动物模型的第二种应用，证明CAR-T可以通过杀伤血样中CTC的方式，抑制肿瘤的转移。

所述第二种应用的步骤S0包括：通过尾静脉注射法建立人结直肠癌血行转移小鼠模型作为肿瘤转移动物模型。具体操作步骤如下：

提供低温保存的人结直肠癌细胞悬液和若干体重为18-22克，6周龄的雌性M-NSG实验小鼠；其中，人结直肠癌细胞悬液由HCT116-Luc细胞和磷酸盐缓冲液组成，HCT116-Luc细胞的含量为1×10⁷个/毫升。

将所述人结直肠癌细胞悬液通过尾静脉注射的方式分两次注入每只实验小鼠，所述人结直肠癌细胞悬液的每次注射剂量为0.1毫升，每次注射间隔15min。注意需要确定针尖确实在尾静脉血管内，且在10秒内完成人结直肠癌细胞悬液的推注以确保HCT116-Luc细胞的注入剂量以及活性。

尾静脉注射完毕后在SPF级条件下继续饲养，定期观察小鼠活体成像并监测肿瘤转移荧光值。待肿瘤转移平均荧光值达到为5E6-5E7p/s时，淘汰荧光值过大、过小的动物，完成人结直肠癌血行转移小鼠模型的建模。

所述第二种应用的步骤S1包括：

将经所述第二种应用的步骤S0得到的若干人结直肠癌血行转移小鼠模型随机分为对照组和给药组；给药组分为UnT组和Car-T组。每组6只，共18只实验小鼠。

第一次给药当天记为Day 0，在Day 0按照分组方案开始给药，通过尾静脉注射的方式向对照组的每只实验小鼠注射0.2毫升的生理盐水。通过尾静脉注射的方式向UnT组的每只实验小鼠注射0.2毫升的未转导T细胞悬液，UnT细胞的剂量为每公斤实验小鼠注射8.93×10⁶个UnT细胞。通过尾静脉注射的方式向Car-T组的每只实验小鼠注射0.2毫升的靶向EpCAM的CAR-T细胞悬液，靶向EpCAM的CAR-T细胞悬液中，CAR-T细胞的剂量为每只实验小鼠注射8.93×10⁶个CAR-T细胞。靶向EpCAM的CAR-T细胞悬液中的CAR-T细胞由实施例2得到。

在Day17时，经眼内眦采血检测各组小鼠的谷丙转氨酶ALT(U/L)和谷草转氨酶AST(U/L)的含量。结果如图14所示，PBS组、UnT组和CAR-T组的平均ALT(U/L)的含量依次为52.3±1.7、53.5±2.6和52.7±2.8；平均AST(U/L)含量依次为95.8±7.0、88.7±5.1和86.7±3.4。ALT和AST在各组之间均未有显著性差异，表明Car-T在该剂量下均未表现出对肝脏的毒性反应。

在Day21时，经眼内眦采血，通过流式细胞术(FACS)检测各组小鼠外周血中humanCD45+和human CD3+T细胞存续以及淋巴细胞中的CAR+占比。FACS检测结果如图15所示：PBS组、UnT组和CAR-T组小鼠外周血中human CD45+和human CD3+存续平均占比分别为0.00％、1.52％和24.63％。Day21时各组小鼠体内淋巴细胞中的CAR+的平均占比如下：PBS组为0.00％、UnT组为0.00％、CAR-T组为2.79％。以上实验结果说明了相较于UnT，CAR-T在小鼠体内的存续时间更长。

每周称量2次小鼠体重，结果如图16所示。在Day25时，PBS组、UnT组和CAR-T组各组小鼠的体重增长率依次为-22.03％、-21.90％和0.56％，其中CAR-T组的小鼠在实验期间能较好地保持体重，表明CAR-T在该剂量下未显示明显毒性。

每周拍摄1次活体荧光成像，结果如图17、图18所示。随着饲养时间的延长，PBS组和UnT组小鼠体内荧光信号明显增强，CAR-T组小鼠荧光信号未出现明显变化。在Day25时，PBS组小鼠的肿瘤平均荧光值为1.28E11±1.63E10p/s，UnT组和CAR-T组小鼠的肿瘤平均荧光值依次为9.73E10±2.66E10p/s和1.14E6±5.30E4p/s，其中CAR-T组小鼠的肿瘤平均荧光值明显低于PBS组，表明CAR-T在该剂量具有明显抑制肿瘤转移效应。

在实验计划终点Day27时，按照实验要求对小鼠实施安乐死，解剖小鼠并取肺脏和肝脏拍摄离体成像，结果如图19、图20所示。PBS组、UnT组和CAR-T组各组小鼠离体肺脏的肿瘤平均荧光值分别为4.66E10±1.34E10、2.32E9±2.18E9和8.41E4±3.76E3；离体肝脏的肿瘤平均荧光值分别为2.65E10±7.71E9，2.84E9±1.73E9和1.74E5±2.92E4，其中CAR-T组小鼠的离体肺脏和肝脏的肿瘤平均荧光值明显低于PBS组，表明CAR-T在该剂量具有明显抑制肿瘤转移效应。

所述第二种应用的步骤S2包括：

在Day 27时经眼内眦采血，通过微流控芯片技术检测并统计对照组和实验组的每只存活实验小鼠外周血样品中的肿瘤细胞数目。

实验统计结果如图21所示。在实验终点，对照组小鼠血样中的平均CTC含量为26.87个/mL，而UnT组小鼠血样中的平均CTC含量为18.00个/mL，CAR-T组血样中的平均CTC含量为4.98个/mL。CAR-T组小鼠外周血样品中的平均肿瘤细胞数目明显低于对照组和UnT组。表明CAR-T在该剂量下具有明显的杀伤血液中CTC效应。

虽然在上文中详细说明了本发明的实施方式，但是对于本领域的技术人员来说显而易见的是，能够对这些实施方式进行各种修改和变化。但是，应理解，这种修改和变化都属于权利要求书中所述的本发明的范围和精神之内。而且，在此说明的本发明可有其它的实施方式，并且可通过多种方式实施或实现。

序列表

<110> 上海易慕峰生物科技有限公司

<120> 通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法

<130> 20210706

<160> 3

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 121

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 1

Gln Val Lys Leu Gln Gln Ser Gly Ala Glu Leu Val Arg Pro Gly Ala

1 5 10 15

Ser Val Lys Leu Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr

20 25 30

Trp Ile Asn Trp Val Lys Gln Arg Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Ile

35 40 45

Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Tyr Ile Tyr Thr Asn Tyr Asn Gln Glu Phe

50 55 60

Lys Asp Lys Val Thr Leu Thr Val Asp Glu Ser Ser Ser Thr Ala Tyr

65 70 75 80

Met Gln Leu Ser Ser Pro Thr Ser Glu Asp Ser Ala Val Tyr Tyr Cys

85 90 95

Thr Arg Ser Pro Tyr Gly Tyr Asp Glu Tyr Gly Leu Asp Tyr Trp Gly

100 105 110

Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser

115 120

<210> 2

<211> 113

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 2

Asp Ile Glu Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Thr Val Thr Ala Gly

1 5 10 15

Glu Lys Val Thr Met Asn Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Ser

20 25 30

Arg Asn Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Gln

35 40 45

Pro Pro Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val

50 55 60

Pro Asp Arg Phe Thr Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr

65 70 75 80

Ile Ser Ser Val Gln Ala Glu Asp Leu Ala Val Tyr Tyr Cys Gln Asn

85 90 95

Asp Tyr Val Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Ala Gly Thr Lys Leu Glu Ile

100 105 110

Lys

<210> 3

<211> 490

<212> PRT

<213> Artificial

<400> 3

Met Leu Leu Leu Val Thr Ser Leu Leu Leu Cys Glu Leu Pro His Pro

1 5 10 15

Ala Phe Leu Leu Ile Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu

20 25 30

Val Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly

35 40 45

Tyr Thr Phe Thr Asn Tyr Trp Ile Asn Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly

50 55 60

Gln Gly Leu Glu Trp Ile Gly Asn Ile Tyr Pro Ser Tyr Ile Tyr Thr

65 70 75 80

Asn Tyr Asn Gln Glu Phe Lys Asp Lys Val Thr Leu Thr Val Asp Glu

85 90 95

Ser Thr Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Ser Leu Arg Ser Glu Asp

100 105 110

Thr Ala Val Tyr Tyr Cys Thr Arg Ser Pro Tyr Gly Tyr Asp Glu Tyr

115 120 125

Gly Leu Asp Tyr Trp Gly Gln Gly Thr Thr Val Thr Val Ser Ser Gly

130 135 140

Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile

145 150 155 160

Gln Leu Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg

165 170 175

Val Thr Met Thr Cys Lys Ser Ser Gln Ser Leu Leu Asn Thr Arg Asn

180 185 190

Gln Lys Asn Tyr Leu Thr Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro

195 200 205

Lys Leu Leu Ile Tyr Trp Ala Ser Thr Arg Glu Ser Gly Val Pro Ser

210 215 220

Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Thr Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser

225 230 235 240

Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Asp Tyr

245 250 255

Val Tyr Pro Leu Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys Ile

260 265 270

Glu Val Met Tyr Pro Pro Pro Tyr Leu Asp Asn Glu Lys Ser Asn Gly

275 280 285

Thr Ile Ile His Val Lys Gly Lys His Leu Cys Pro Ser Pro Leu Phe

290 295 300

Pro Gly Pro Ser Lys Pro Phe Trp Val Leu Val Val Val Gly Gly Val

305 310 315 320

Leu Ala Cys Tyr Ser Leu Leu Val Thr Val Ala Phe Ile Ile Phe Trp

325 330 335

Val Arg Ser Lys Arg Ser Arg Leu Leu His Ser Asp Tyr Met Asn Met

340 345 350

Thr Pro Arg Arg Pro Gly Pro Thr Arg Lys His Tyr Gln Pro Tyr Ala

355 360 365

Pro Pro Arg Asp Phe Ala Ala Tyr Arg Ser Arg Val Lys Phe Ser Arg

370 375 380

Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn

385 390 395 400

Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg

405 410 415

Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro

420 425 430

Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala

435 440 445

Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His

450 455 460

Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp

465 470 475 480

Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg

485 490

Claims (13)

1.一种通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法，其特征在于，包括：

S0：提供实体肿瘤转移动物模型和杀伤细胞，所述实体肿瘤转移动物模型的外周血含有循环肿瘤细胞；

S1：将所述杀伤细胞输入所述实体肿瘤转移动物模型的外周血，以作用于所述循环肿瘤细胞；

S2：从所述实体肿瘤转移动物模型中获取离体样品，检测所述离体样品以获取中间结果，所述中间结果为所述离体样品中的循环肿瘤细胞数目或分布情况。

2.根据权利要求1所述的通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法，其特征在于，所述杀伤细胞为基因修饰的免疫细胞。

3.根据权利要求2所述的通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法，其特征在于，所述免疫细胞为T细胞、NK细胞、NKT细胞、树突状细胞、巨噬细胞和B细胞的至少一种。

4.根据权利要求2所述的通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法，其特征在于，所述基因修饰的免疫细胞通过嵌合抗原受体和T细胞受体的任意一种对免疫细胞进行基因修饰得到。

5.根据权利要求4所述的通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括胞外识别区、铰链区、跨膜区和胞内信号区，所述胞外识别区特异性识别EpCAM、c-MET、CD47、Vimentin、E-cadherin、Cytokeratins、Zonula occludens、ESPR1、N-cadherin、Twist1、ZEB1、FGFR2IIIc、PLS3、ALDH1、CD44、GD2、GD3、Claudin18.2、Claudin6和GD1a的任意一种。

6.根据权利要求5所述的通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法，其特征在于，所述铰链区的序列来源于CD8α、CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD40、CD80和IgG的至少一种，所述跨膜区的序列来源于CD8α、CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD40和CD80的至少一种，所述胞内信号区的序列来源于CD8α、CD28、4-1BB、ICOS、OX40、CD40、CD80、DAP10、DAP12、CD3ζ和CD3e的至少一种。

7.根据权利要求4所述的通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法，其特征在于，所述嵌合抗原受体的序列如SEQ ID.3所示。

8.根据权利要求1所述的通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法，其特征在于，所述实体肿瘤转移动物模型为血行转移的实体肿瘤转移动物模型。

9.根据权利要求8所述的通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法，其特征在于，所述步骤S0中，通过原位移植、静脉注射和皮下移植中的任意一种方式将外源肿瘤细胞引入实验动物体内，以建立所述实体肿瘤转移动物模型。

10.根据权利要求9所述的通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法，其特征在于，将所述外源肿瘤细胞引入所述实验动物体内之后，获取并检测所述实验动物的外周血样品中含有所述循环肿瘤细胞后，执行所述步骤S1。

11.根据权利要求9所述的通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法，其特征在于，将所述外源循环肿瘤细胞引入所述实验动物体内以形成实体肿瘤组织，切除所述实体肿瘤组织后执行所述步骤S1。

12.根据权利要求9所述的通过实体肿瘤转移动物模型获取中间结果的方法，其特征在于，所述步骤S1中，将包含所述杀伤细胞的细胞悬液通过静脉注射的方式输入所述实验动物体内，每次输入的细胞悬液中的杀伤细胞剂量为1×10⁴个/Kg-1×10⁸个/Kg。

13.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤S2中，所述离体样品为离体外周血样品或离体实体肿瘤组织。

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