CN113214408A

CN113214408A - 一种嵌合抗原受体巨噬细胞及其制备方法和用途

Info

Publication number: CN113214408A
Application number: CN202110485244.3A
Authority: CN
Inventors: 黄来强; 邓婷; 代小勇
Original assignee: Shenzhen International Graduate School of Tsinghua University
Current assignee: Shenzhen International Graduate School of Tsinghua University
Priority date: 2021-04-30
Filing date: 2021-04-30
Publication date: 2021-08-06
Anticipated expiration: 2041-04-30
Also published as: CN113214408B

Abstract

本发明涉及一种嵌合抗原受体巨噬细胞及其制备方法和用途，具体公开了一种靶向CD133且诱导巨噬细胞的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗CD133的轻链、抗CD133的重链、CD8铰链区、CD8跨膜区和胞内区、FCGR1A胞内区，其中，FCGR1A胞内区序列如SEQ ID NO.1所示。还公开了一种嵌合抗原受体巨噬细胞，所述嵌合抗原受体巨噬细胞表达如前所述的嵌合抗原受体。该嵌合抗原受体巨噬细胞对结直肠癌细胞具有显著的吞噬杀伤作用，可用于制备治疗结直肠癌药物。

Description

一种嵌合抗原受体巨噬细胞及其制备方法和用途

技术领域

本发明属于免疫学和分子生物学领域，具体而言，涉及一种嵌合抗原受体巨噬细胞及其制备方法和用途。

背景技术

结直肠癌作为最常见的恶行肿瘤之一，每年占据了癌症确诊率的10％。根据流行病学报告表明，结直肠癌的死亡率位列第四，位于肺癌、肝癌和胃癌之后。从1990年到2017年，全球结直肠癌的年龄标准化发病率增加了9.5％，而结直肠癌筛查措施的引入却使得死亡率下降了13.5％。但是中国的结直肠癌发病率和死亡率增幅都明显高于世界平均水平，中国结直肠癌发病数分别为10.7万和43.2万，发病率升高了84.1％。中国结直肠癌死亡数分别7.6万和18.7万，死亡率升高了8.2％，而结直肠癌已经增长为中国的第三大癌症。

目前结直肠癌的病因尚未完全明确，但是伴随着医学及分子生物学的不断发展及研究的日益深入，结直肠癌的病变过程可归纳为三种,其中染色体不稳定是主要的病变类型，基因APC的突变引起RAS激活和TP53丢失造成结直肠癌的形成。遗传和环境因素对结直肠癌的发生均具有重要的影响。日常生活中吸烟、饮酒过量，体重增加，以及红类和加工肉类的摄入会加速结直肠癌的发生。

结直肠癌的治疗方法主要以内镜治疗、外科手术、放射疗法、化学疗法等为主，其中外科手术为结直肠癌治疗的基础和主要手段。但是仅适用于早期阶段，对于中晚期患者，手术治疗效果不佳。所以其他新兴的治疗方式：靶向治疗、基因治疗、新辅助化疗、免疫治疗等治疗手段也越来越多的被应用。分子靶向药物治疗在特定患者中疗效显著，患者生存获益。但靶向药物的应用存在局限性，主要因为目前靶向药物的有效的靶点还较少，同时在选择适宜的靶向治疗药物前，需要对患者进行相应的分子靶点检测。目前针对CRC患者，主要的两种靶向药物是以血管内皮生长因子(VEGF)为靶点的贝伐珠单抗和以表皮生长因子受体(EGFR)为靶点的西妥昔单抗。国内学者研究提示，进展期及晚期结直肠癌患者使用西妥昔单抗和贝伐珠单抗生存获益。

肿瘤干细胞(cancer stem cells，CSCs)是在肿瘤组织中存在一群具有自我更新且无限增殖，能够促进维持肿瘤生长的具有与正常组织干细胞相似功能的细胞，而且肿瘤干细胞具有多分化潜能，可以分化产生不同的组织细胞。其来源目前尚无定论，目前主要有两种观点；一种观点认为肿瘤干细胞来源于机体内原有的正常干细胞突变产生；另一种观点认为肿瘤干细胞是祖细胞基因突变突变而形成肿瘤干细胞。此外有部分学者提出肿瘤干细胞可能是骨髓来源的干细胞突变产生。目前研究已从结在卵巢癌、胰腺癌、脑肿瘤和直肠癌等肿瘤组织中分离出肿瘤干细胞。CD133又称Prominin-1，含5个跨膜区和2个胞外区的糖蛋白，是Prominin家族中的一员，最初作为造血干/祖细胞的标志物。2006年O，Brien等人首次从结直肠癌标本中分离出CD133+肿瘤细胞，并发现CD133+具有成瘤能力，而提出CD133可能为结直肠癌肿瘤干细胞。随后Cherciu等人研究提示CD44、CD133、0et4、ALDHl、CDl66、CD24等可能是结直肠癌肿瘤标干细胞标记物。伴随着对结直肠癌肿瘤干细胞标记物的研究报道增多，目前CD44/CD133是常用的结直肠癌肿瘤干细胞的标志物，并且CD44/CD133的高表达是影响患者预后的危险因素。

CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)是通过基因改造技术，让患者T细胞表达嵌合抗原受体，使效应T细胞的靶向性、杀伤性和持久性均较常规应用的免疫细胞高，并能克服肿瘤局部免疫抑制微环境和打破宿主免疫耐受状态。CAR-T的发展经历了四代改进，对目前来说，第三、四代CAR-T细胞发展仍未完善，仍有诸多问题有待解决，只有第二代CAR-T细胞对于血液恶性肿瘤具有很好的疗效。而即使是二代CAR-T，对于实体瘤的疗效远比不上血液瘤。

巨噬细胞是一种专职于检测、吞噬和破坏细菌和其他有害生物的细胞。此外，它们还可以将抗原呈现给T细胞，并通过释放激活其他细胞的分子(称为细胞因子)引发炎症。在肿瘤形成过程中，巨噬细胞能够有效浸润肿瘤微环境，促进肿瘤细胞侵袭和血管生成，促进转移以及增加免疫抑制。基于巨噬细胞的功能和特征，巨噬细胞是一种靶向抗体为基础的癌症治疗的潜在效应细胞，作为专业的抗原呈递细胞，活化的巨噬细胞可在促进抗肿瘤免疫应答中发挥作用。用嵌合受体CAR修饰巨噬细胞，重定向其吞噬功能，并导致靶向抗肿瘤治疗效果，具有激发适应性免疫反应的潜力。

发明内容

基于现有技术的缺陷，本发明提供了一种能靶向CD133靶点，并且活化巨噬细胞的嵌合抗原受体(CAR)质粒、嵌合抗原受体巨噬细胞(CAR-M)及其构建方法和应用。

本发明的上述技术目的是通过以下技术方案得以实现的：

本发明一个方面提供了一种靶向CD133且诱导巨噬细胞的嵌合抗原受体，所述嵌合抗原受体包括抗CD133的单链可变区、CD8信号肽、CD8铰链区、CD8跨膜区和FCGR1A胞内区，其中，FCGR1A胞内区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：RKELKRKKKWDLEISLDSGHEKKVISSLQEDRHLEEELKCQEQKEEQLQEGVHRKEPQGAT SEQ ID NO.1。

本发明再一个方面提供了编码基因，所述编码基因编码如前所述的嵌合抗原受体。

在一个具体的实施方案中，所述编码基因包括编码FCGR1A胞内区序列的片段，如SEQ ID NO.2所示:

CGTAAAGAACTGAAAAGAAAGAAAAAGTGGGATTTAGAAATCTCTTTGGATTCTGGTCATGAGAAGAAGGTAATTTCCAGCCTTCAAGAAGACAGACATTTAGAAGAAGAGCTGAAATGTCAGGAACAAAAAGAAGAACAGCTGCAGGAAGGGGTGCACCGGAAGGAGCCCCAGGGGGCCACGTAG SEQ ID NO.2。

在一个具体的实施方案中，所述编码基因还包括编码抗CD133的单链可变区、CD8信号肽、CD8铰链区、CD8跨膜区的的片段。

本发明再一个方面提供了一种表达载体，所述表达载体包括如前所述的编码基因的病毒载体；优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种。

在一个具体的实施方案中，慢病毒表达载体选自pGk。

本发明再一个方面提供了重组慢病毒，所述重组慢病毒由转染有如前所述的表达载体和哺乳细胞制备得到。

本发明再一个方面提供了一种嵌合抗原受体巨噬细胞，所述嵌合抗原受体巨噬细胞表达如前所述的嵌合抗原受体；

优选地，所述嵌合抗原受体巨噬细胞的基因组中整合有如前所述的编码基因；

优选地，所述嵌合抗原受体巨噬细胞包括如前所述的表达载体和/或如前所述的重组慢病毒。

在本发明的一些具体实施方案中，嵌合抗原受体巨噬细胞还进行了修饰，所述修饰为通过以下试剂进行的修改：核酸、抗生素、抗炎剂、抗体或其抗体片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子、碳水化合物或类似物、脂质、激素、微粒体、其衍生物或变体、以及其任何组合

本发明再一个方面提供了如前所述的嵌合抗原受体、如前所述的编码基因、如前所述的表达载体、如前所述的重组慢病毒或如前所述的嵌合抗原受体巨噬细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用；

优选地，所述肿瘤选自高表达CD133的肿瘤，更优选为高表达CD133结直肠癌。

本发明再一个方面提供了一种靶向CD133的表达载体的制备方法，包括以下步骤：

S11).依次连接抗CD133的单链可变区、CD8信号肽、CD8铰链区、CD8跨膜区和FCGR1A胞内区的基因片段；

S12).将步骤S1中得到的基因片段连接至在载体中，得到能抗CD133靶点的表达载体；其中，FCGR1A胞内区基因片段序列如SEQ ID NO.2所示：

在一个具体的实施方案中，载体选自慢病毒表达载体，优选为pGk慢病毒表达载体。

本发明再一个方面提供了一种嵌合抗原受体巨噬细胞的构建方法，所述方法包括将如前所述的嵌合抗原受体的编码基因导入巨噬细胞的步骤。

具体地，包括以下步骤：

A.构建能表达CD133的CAR的质粒；所述质粒以慢病毒为载体，其中包含抗CD133的轻链、抗CD133的重链、CD8铰链区、CD8跨膜区和胞内区、FCGR1A胞内区,并合成基因序列片段；其中，FCGR1A胞内区序列如SEQ ID NO.2所示；

B.慢病毒包装，于37℃含5％CO₂培养箱中用DMEM完全培养基培养293T细胞；将混合有步骤A中制备的质粒的三质粒包装系统的DMEM高糖培养基与聚乙烯亚胺混合并摇匀，于37℃孵育；将孵育后的混合液置于37℃含5％CO₂培养箱中培养；收集细胞培养上清液，并经滤膜过滤得到病毒初始液；

C.病毒液浓缩，将病毒初始液与5×PEG8000 NaCl混合，放置过夜；离心，去除上清，静置，去除残余液体；向离心管内加入PBS缓冲液，溶解慢病毒，得到病毒浓缩液；

D.慢病毒感染THP1细胞，向制备好的THP1细胞中加入病毒浓缩液，并置于含CO₂的培养箱中孵育，进行转导，得到CAR-M细胞。加入50ng/ml的PMA作用24h，再加入20ng/ml的IFN-γ和500pg的LPS作用24h,将CAR-THP1诱导成为CAR-M。

进一步地，步骤B中，三质粒包装系统中三种质粒及质量比为pGK-CAR-CD133:PsPax2:VSVG＝2:3:1。

本发明再一个方面提供了修饰的嵌合抗原受体巨噬细胞，包含选自下列的用剂：核酸、抗生素、抗炎剂、抗体或其抗体片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子、碳水化合物或类似物、脂质、激素、微粒体、其衍生物或变体、以及其任何组合对如前所述的嵌合抗原受体巨噬细胞进行修饰。。

本发明再一个方面提供了治疗对象中与肿瘤或癌症相关的疾病或状况的方法，包括向所述对象给予治疗有效量的包含所述嵌合抗原受体的药物组合物。

本发明再一个方面提供了一种对靶肿瘤细胞或肿瘤组织的免疫应答的方法，包括所述修饰细胞的药物组合物。

与现有技术相比，本发明的有益效果是：

该嵌合抗原受体巨噬细胞对结直肠癌细胞具有显著的吞噬杀伤作用，可用于制备治疗结直肠癌药物。能够在医学与生物学领域得到广泛的应用，并产生巨大的社会与经济效益。

附图说明

图1是构建的质粒图谱；

图2是本发明流程图；

图3是CAR-M细胞杀伤能力；

图4是流式检测CAR-M细胞的吞噬能力；

图5是共聚焦显微镜检测CAR-M细胞的吞噬能力。

具体实施方式

为了更清楚地理解本发明，现参照下列实施例及附图进一步描述本发明。实施例仅用于解释而不以任何方式限制本发明。实施例中，各原始试剂材料均可商购获得，未注明具体条件的实验方法为所属领域熟知的常规方法和常规条件，或按照仪器制造商所建议的条件。

实施例1能活化巨噬细胞吞噬能力，并且靶向CD133的CAR质粒的构建

构建流程如图2所示。

1.依次连接抗CD133的单链可变区(single chain fragment variable,scFv)、CD8信号肽、CD8铰链区、CD8跨膜区和FCGR1A胞内区的基因片段，所有序列都是人源化。

FCGR1A胞内区序列如SEQ ID NO.1所示

RKELKRKKKWDLEISLDSGHEKKVISSLQEDRHLEEELKCQEQKEEQLQEGVHRKEPQGAT SEQ IDNO.1；

FCGR1A胞内区序列的编码基因如SEQ ID NO.2所示

CGTAAAGAACTGAAAAGAAAGAAAAAGTGGGATTTAGAAATCTCTTTGGATTCTGGTCATGAGAAGAAGGTAATTTCCAGCCTTCAAGAAGACAGACATTTAGAAGAAGAGCTGAAATGTCAGGAACAAAAAGAAGAACAGCTGCAGGAAGGGGTGCACCGGAAGGAGCCCCAGGGGGCCACGTAG SEQ ID NO.2；

抗CD133的单链可变区scfv的编码基因如SEQ ID NO.3所示：

GGCCCAGGCGGCCGAGCTCGACATTGTTCTCTCCCAGTCTCCAGCAATCATGTCTGCATCTCCAGGGGAGAAGGTCACCATATCCTGCAGTGCCAGCTCAAGTGTAAGTTATATGTACTGGTACCAGCAGAACCAGGATCCTCCCCCAAACCCTGGATTTATCGCACATCCAACCTGGCTTCTGGAGTCCCTGCTCGCTTCAGTGGCAGTGGGTCTGGGACCTCTTACTCTCTCACAATCAGCAGCATGGAGGCTGAAGATGCTGCCACTTATTACTGCCAGCAGTATCATAGTTACCCACCCACGTTCGGTGCTGGGACCAAGCTGGAGCTGAAATCCTCTGGTGGCGGTGGCTCGGGCGGTGGTGGGGGTGGTTCCTCTAGATCTTCCCTCGAGGTGAAGCTGGTGGAGTCTGGACCTGAGCTGAAGAAGCCTGGAGAGACAGTCAAGATCTCCTGCAAGGCTTCTGGTTATACCTTCACAGACTATTCAATGCACTGGGTGAATCAGGCTCCAGGAAAGGGTTTAAAGTGGATGGGCTGGATAAACACTGAGACTGGTGAGCCATCATATGCAGATGACTTCAAGGGACGGTTTGCCTTCTCTTTGGAAACCTCTGCCAGCACTGCCTATTTGCAGATCAACAACCTCAAAAATGAGGACACGGCTACATATTTCTGTGCTACCGATTACGGGGACTACTTTGACTACTGGGGCCAAGGCACCACTCTCACAGTCTCCTCAGCCAAAACGACACCCCCATCTGTCACTAGTGGCCAGGCCGGCCAGCACCATCACCATCACCATGGCGCATACCCGTACGACGTTCCGGACTACGCTTCTTAG SEQ ID NO.3；

CD8铰链区的编码基因如SEQ ID NO.4所示

ACCACTACCCCAGCACCGAGGCCACCCACCCCGGCTCCTACCATCGCCTCCCAGCCTCTGTCCCTGCGTCCGGAGGCATGTAGACCCGCAGCTGGTGGGGCCGTGCATACCCGGGGTCTTGACTTCGCCTGCGAT SEQ IDNO.4；

CD8跨膜区的编码基因如SEQ ID NO.5所示

ATCTACATTTGGGCCCCTCTGGCTGGTACTTGCGGGGTCCTGCTGCTTTCACTCGTGATCACTCTTTACTGT SEQ ID NO.5；

CD8信号肽的编码基因如SEQ ID NO.6所示

ATGGCCTTACCAGTGACCGCCTTGCTCCTGCCGCTGGCCTTGCTGCTCCACGCCGCCAGGCCG SEQID NO.6。

2.将步骤1中得到的基因序列片段连接至通用慢病毒表达载体pGk，得到能同时表达靶向CD133靶点CAR的质粒pGK-CAR-CD133。

质粒图谱如图1所示，该载体pGK-CAR-CD133(全称为Lenti-EF1a-CAR-CD133-EGFP-pGK-puro)是基于HIV1的慢病毒基因过表达载体，采用EF1a启动子启动CAR序列的表达；CAR序列为依次连接CD133scFv、CD8hinge、CD8transmembrane、FCGR1A序列片段所得；同时该载体还带有EGFP、嘌呤霉素双重筛选位点。

实施例2嵌合抗原受体巨噬细胞(CAR-M)细胞的构建

1.利用实施例1的构建方法构建能靶向CD133靶点的CAR质粒。

2.慢病毒包装:在直径10cm的培养皿中接入一定数目的293T细胞，用10mL DMEM完全培养基，在37℃含5％CO₂的培养箱中培养。当293T细胞长满培养皿大约90％左右的面积后，将混有16μg三质粒包装系统的100μL DMEM低糖培养基加入6μL脂质体Lipofectamine2000，漩涡震荡，充分混匀，得到体积为200μL的混合液，37℃孵育5min。将前述得到的200μL混合液滴入10cm的培养皿中，并置于37℃含5％CO₂培养箱培养，6-8小时后换液，去掉10cm培养皿中全部的培养基，加入新的10ml DMEM完全培养基。3天后，收集细胞培养上清液，通过0.45μm滤膜过滤，得到病毒初始液。

本实施例中三质粒包装系统为pGK-CAR-CD133:PsPax2:VSVG质粒与:PsPax2质粒和VSVG质粒的混合物，系统中三种质粒及质量比为pGK-CAR-CD133:PsPax2:VSVG＝2:3:1。

3.病毒液浓缩。具体步骤如下：1)配制5×PEG8000 NaCl：称取NaCl 8.766g；PEG8000 50g溶解在200mL Milli-Q纯水中；121℃，湿热灭菌30min；保存在4℃。2)每30mL过滤后的病毒初始液，加入5×PEG-母液7.5mL。3)每20～30min混合一次，共进行3-5次。4)4℃放置过夜。5)4℃，4000g，离心20min。6)吸弃上清，静置离心管1～2min，吸走残余液体。7)每30mL过滤后的病毒初始液，加入500μL PBS溶解慢病毒沉淀，得到病毒浓缩液。

在制备得到病毒浓缩液后，对病毒滴度进行测定，具体如下：

1)取生长状态良好的293T细胞，加入1ml胰酶消化细胞，直至细胞刚有脱落，消化后计数，按5×10⁵细胞/孔将细胞均匀铺至24孔细胞培养板，37℃含5％CO₂培养箱培养6～10h至细胞贴壁。

2)向24孔板中细胞培养上清中分别加入0.1μL、0.5μL、1μL浓度的病毒浓缩液，并设置1个阴性对照，轻轻拍打24孔板边缘，使病毒液与培养液混合均匀，于培养箱中37℃含5％CO₂培养箱感染48h。

3)感染48h后，加入1ml胰酶消化细胞消化，直至细胞刚有脱落，收集细胞，标准流式细胞术检测阳性细胞百分比，并根据以下公式计算病毒滴度，单位为TM/mL：T＝(铺板时细胞数×阳性细胞百分比×1000)/加入的病毒液体积(μL)

4.慢病毒感染THP1细胞，向THP1细胞中按照感染时病毒总pfu和细胞总数的比值MOI为2的比例加入病毒浓缩液，混匀后置于含5％的CO₂的培养箱中孵育，4小时后补加T细胞完全培养基，调整细胞密度至1.0×10⁶/mL进行培养转导，得到CAR-THP1细胞。48小时后选用含有1μg/mL嘌呤霉素(puromycin)的培养基进行筛选；待细胞不再出现死亡后即得到稳定表达CAR-THP1细胞。加入50ng/ml的PMA作用24h，再加入20ng/ml的IFN-γ和500pg的LPS作用24h,将CAR-THP1诱导成为CAR-M.。

图2为CAR-M细胞构建的主要流程。构建成功的THP1带EGFP，并且对嘌呤霉素有一定抗性；诱导成功的CAR-M具有M1型标志物上升和M2型标志物下降的特征，能够准确表达CAR，并具有目标效应活性，靶向吞噬高表达CD133的肿瘤细胞。

采用相同的方法制备CAR-M细胞，区别仅在于采用CD3ζ序列片段替代实施例1和2中的FCGR1A序列片段，得到胞内段包含CD3ζ的CAR-M细胞。

实施例3CAR-M对高表达CD133的结直肠癌细胞系具有显著杀伤作用

①将结直肠癌细胞HCT-116、LoVo、CaCo₂以1×10⁴个/孔接种于96孔细胞培养板中，每孔培养基体积为200μL；

②同时将诱导成功的CAR-M以1×10⁴个/孔接种于①中的96孔细胞培养板中，和三种结直肠癌细胞系共同培养，于培养箱中37℃含5％CO₂培养箱过夜；

③未被杀伤的结直肠癌细胞贴壁生长，去除上清液，再用PBS润洗三次，加入200μL完全培养基，每孔加入20μL的MTT工作溶液，继续放入二氧化碳培养箱中培养4小时；

④弃培养板中的上清，加入150μL DMSO(二甲基亚砜)，震荡10分钟，在酶标仪上选择490nm波长进行检测，绘制细胞的生长曲线。

图3中control为不表达CAR-CD133且诱导成功的M1型巨噬细胞。较于control，CAR-M对高表达CD133的三种结直肠癌细胞：HCT116、LoVo、Caco₂具有显著的增殖抑制作用。

实施例4CAR-M吞噬高表达CD133的结直肠癌细胞的能力验证(流式检测)

①将结直肠癌细胞HCT-116、LoVo、CaCo₂用1μmol/mL浓度的DiI染液孵育30min，再以5×10⁴个/孔接种于6孔细胞培养板中，每孔培养基体积为2mL；

②将诱导成功的CAR-M用钙黄绿素染液孵育30min，以5×10⁴个/孔接种于①中6孔细胞培养板中，和结直肠癌细胞系共同培养，于培养箱中37℃含5％CO₂培养箱4-6小时；

③将六孔板中的两种细胞收集到离心管中，500g左右离心5分钟，沉淀细胞；用预冷的PBS洗涤细胞两次，500g左右离心5分钟收集细胞；加入400μL预冷的PBS，轻轻混匀，将样品至于冰上避光放置，1h内用流式细胞仪检测。分析检测结果。

图4的control为不表达CAR-CD133且诱导成功的M1型巨噬细胞，CarM(FcR)为胞内段包含FCGR1A序列的CarM，CarM(CD3ζ)为胞内段包含CD3ζ序列的CarM。流式结果显示control对高表达CD133的结直肠癌细胞基本不具有吞噬能力，实验组中的CarM(FcR)和CarM(CD3ζ)则对高表达CD133的结直肠癌细胞具有吞噬能力，且CarM(FcR)的吞噬效率百分比远高于CarM(CD3ζ)，实验结果证实，对于CarM细胞而言，除了胞外嵌合抗原受体段会影响杀伤效率外，胞内的片段也会影响效果，本发明选用的FCGR1A序列为本发明的CarM细胞带来了预料不到的技术效果。

实施例5CAR-M吞噬高表达CD133的结直肠癌细胞的能力验证(共聚焦荧光检测)

①将结直肠癌细胞HCT-116、LoVo、CaCo₂用1μmol/mL浓度的DiI染液孵育30min，再以2×10⁴个/孔接种于confocal培养皿中，每孔培养基体积为2mL；

②将诱导成功的CAR-M用钙黄绿素染液孵育3 0min，以2×10⁴个/孔接种于①confocal培养皿中，和结直肠癌细胞系共同培养，于培养箱中37℃含5％CO2培养箱过夜；

③培养皿放置冰上，终止培养。用共聚焦显微镜拍照。

图5中红色标记为结直肠癌细胞(DiI,，激发光为561nm)，绿色标记为CAR-M(钙黄绿素，激发光为488nm)，箭头所指为吞噬完成的细胞，荧光结果显示CAR-M细胞内出现的大量红色荧光，为结直肠癌细胞碎片。结果显示CAR-M具有啃噬靶细胞、吞噬细胞碎片、进而杀伤靶细胞的能力，且具有较强的吞噬活性。

SEQUENCE LISTING

<110> 清华大学深圳国际研究生院

<120> 一种嵌合抗原受体巨噬细胞及其制备方法和用途

<130> CP121010289C

<160> 6

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 61

<212> PRT

<213> 人工序列

<400> 1

Arg Lys Glu Leu Lys Arg Lys Lys Lys Trp Asp Leu Glu Ile Ser Leu

1 5 10 15

Asp Ser Gly His Glu Lys Lys Val Ile Ser Ser Leu Gln Glu Asp Arg

20 25 30

His Leu Glu Glu Glu Leu Lys Cys Gln Glu Gln Lys Glu Glu Gln Leu

35 40 45

Gln Glu Gly Val His Arg Lys Glu Pro Gln Gly Ala Thr

50 55 60

<210> 2

<211> 186

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 2

cgtaaagaac tgaaaagaaa gaaaaagtgg gatttagaaa tctctttgga ttctggtcat 60

gagaagaagg taatttccag ccttcaagaa gacagacatt tagaagaaga gctgaaatgt 120

caggaacaaa aagaagaaca gctgcaggaa ggggtgcacc ggaaggagcc ccagggggcc 180

acgtag 186

<210> 3

<211> 846

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 3

ggcccaggcg gccgagctcg acattgttct ctcccagtct ccagcaatca tgtctgcatc 60

tccaggggag aaggtcacca tatcctgcag tgccagctca agtgtaagtt atatgtactg 120

gtaccagcag aaccaggatc ctcccccaaa ccctggattt atcgcacatc caacctggct 180

tctggagtcc ctgctcgctt cagtggcagt gggtctggga cctcttactc tctcacaatc 240

agcagcatgg aggctgaaga tgctgccact tattactgcc agcagtatca tagttaccca 300

cccacgttcg gtgctgggac caagctggag ctgaaatcct ctggtggcgg tggctcgggc 360

ggtggtgggg gtggttcctc tagatcttcc ctcgaggtga agctggtgga gtctggacct 420

gagctgaaga agcctggaga gacagtcaag atctcctgca aggcttctgg ttataccttc 480

acagactatt caatgcactg ggtgaatcag gctccaggaa agggtttaaa gtggatgggc 540

tggataaaca ctgagactgg tgagccatca tatgcagatg acttcaaggg acggtttgcc 600

ttctctttgg aaacctctgc cagcactgcc tatttgcaga tcaacaacct caaaaatgag 660

gacacggcta catatttctg tgctaccgat tacggggact actttgacta ctggggccaa 720

ggcaccactc tcacagtctc ctcagccaaa acgacacccc catctgtcac tagtggccag 780

gccggccagc accatcacca tcaccatggc gcatacccgt acgacgttcc ggactacgct 840

tcttag 846

<210> 4

<211> 135

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 4

accactaccc cagcaccgag gccacccacc ccggctccta ccatcgcctc ccagcctctg 60

tccctgcgtc cggaggcatg tagacccgca gctggtgggg ccgtgcatac ccggggtctt 120

gacttcgcct gcgat 135

<210> 5

<211> 72

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

atctacattt gggcccctct ggctggtact tgcggggtcc tgctgctttc actcgtgatc 60

actctttact gt 72

<210> 6

<211> 63

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

atggccttac cagtgaccgc cttgctcctg ccgctggcct tgctgctcca cgccgccagg 60

ccg 63

Claims

1.一种靶向CD133且诱导巨噬细胞的嵌合抗原受体，其特征在于，所述嵌合抗原受体包括抗CD133的单链可变区、CD8信号肽、CD8铰链区、CD8跨膜区和FCGR1A胞内区，其中，FCGR1A胞内区氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示：RKELKRKKKWDLEISLDSGHEKKVISSLQEDRHLEEELKCQEQKEEQLQEGVHRKEPQGAT SEQ ID NO.1。

2.一种编码基因，其特征在于，所述编码基因编码如权利要求1所述的嵌合抗原受体；

优选地，所述编码基因包括编码FCGR1A胞内区序列的片段，如SEQ ID NO.2所示:

3.一种表达载体，其特征在于，所述表达载体包括如权利要求2所述的编码基因的病毒载体；

优选地，所述病毒载体包括慢病毒载体、逆转录病毒载体或腺相关病毒载体中的任意一种。

4.一种重组慢病毒，其特征在于，所述重组慢病毒由权利要求3所述的表达载体和哺乳细胞制备得到。

5.一种嵌合抗原受体巨噬细胞，其特征在于，所述嵌合抗原受体巨噬细胞表达如权利要求1所述的嵌合抗原受体；

6.根据权利要求5所述的嵌合抗原受体巨噬细胞，其特征在于，嵌合抗原受体巨噬细胞还进行了修饰，所述修饰为通过以下试剂进行的修改：核酸、抗生素、抗炎剂、抗体或其抗体片段、生长因子、细胞因子、酶、蛋白质、肽、融合蛋白、合成分子、有机分子、碳水化合物或类似物、脂质、激素、微粒体、其衍生物或变体、以及其任何组合。

7.如权利要求1所述的嵌合抗原受体、如权利要求2所述的编码基因、如权利要求3所述的表达载体、如权利要求4所述的重组慢病毒或如权利要求5所述的嵌合抗原受体巨噬细胞在制备治疗肿瘤药物中的应用；

8.权利要求3所述表达载体的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：

S12).将步骤S1中得到的基因片段连接至在载体中，得到能抗CD133靶点的表达载体；

其中，FCGR1A胞内区基因片段序列如SEQ ID NO.2所示：

9.权利要求5所述嵌合抗原受体巨噬细胞的构建方法，其特征在于，所述方法包括将权利要求2所述的嵌合抗原受体的编码基因，或权利要求3所述的表达载体，或权利要求4所述的重组慢病毒导入巨噬细胞的步骤。

10.治疗对象中与肿瘤或癌症相关的疾病或状况，或者对靶肿瘤细胞或肿瘤组织的免疫应答的方法，包括给予治疗有效量的包含权利要求1所述的嵌合抗原受体、如权利要求2所述的编码基因、如权利要求3所述的表达载体、如权利要求4所述的重组慢病毒或如权利要求5所述的嵌合抗原受体巨噬细胞的药物组合物。