CN111139223B - 一种rvg-cd70 car-t细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

一种rvg-cd70 car-t细胞及其制备方法与应用 Download PDF

Info

Publication number
CN111139223B
CN111139223B CN202010054260.2A CN202010054260A CN111139223B CN 111139223 B CN111139223 B CN 111139223B CN 202010054260 A CN202010054260 A CN 202010054260A CN 111139223 B CN111139223 B CN 111139223B
Authority
CN
China
Prior art keywords
rvg
cell
car
gly
ser
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010054260.2A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111139223A (zh
Inventor
纪锋
郭志刚
孙裕铃
张凡
景丽
李恩洁
马颖
胡志刚
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Nanjing Kanghe Cell Genetic Engineering Research Institute Co ltd
Original Assignee
Nanjing Normal University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Nanjing Normal University filed Critical Nanjing Normal University
Priority to CN202010054260.2A priority Critical patent/CN111139223B/zh
Publication of CN111139223A publication Critical patent/CN111139223A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111139223B publication Critical patent/CN111139223B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0636—T lymphocytes
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/0005—Vertebrate antigens
    • A61K39/0011—Cancer antigens
    • A61K39/001102—Receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/70517—CD8
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70578—NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2875—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF/TNF superfamily, e.g. CD70, CD95L, CD153, CD154
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/51—Medicinal preparations containing antigens or antibodies comprising whole cells, viruses or DNA/RNA
    • A61K2039/515—Animal cells
    • A61K2039/5156—Animal cells expressing foreign proteins
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K2039/80—Vaccine for a specifically defined cancer
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/60—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments
    • C07K2317/62—Immunoglobulins specific features characterized by non-natural combinations of immunoglobulin fragments comprising only variable region components
    • C07K2317/622—Single chain antibody (scFv)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/33—Fusion polypeptide fusions for targeting to specific cell types, e.g. tissue specific targeting, targeting of a bacterial subspecies
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/70—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction
    • C07K2319/74—Fusion polypeptide containing domain for protein-protein interaction containing a fusion for binding to a cell surface receptor
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2510/00—Genetically modified cells
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2740/00—Reverse transcribing RNA viruses
    • C12N2740/00011—Details
    • C12N2740/10011—Retroviridae
    • C12N2740/15011—Lentivirus, not HIV, e.g. FIV, SIV
    • C12N2740/15041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2740/15043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2800/00—Nucleic acids vectors
    • C12N2800/10—Plasmid DNA
    • C12N2800/106—Plasmid DNA for vertebrates
    • C12N2800/107—Plasmid DNA for vertebrates for mammalian

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Toxicology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Oncology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • General Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明属于分子生物学和细胞生物学领域，具体涉及一种能够穿过血脑屏障特异性识别CD70的CAR‑T细胞及制备方法，将RVG‑SCFV(Anti CD70)‑CD8TM‑4‑1BB‑CD3ζ分子在T细胞内表达。本发明将CD70抗体用于CAR‑T细胞的构建，并提出以CD70分子为靶抗原，构建的CAR‑T细胞与表达CD70分子的肿瘤细胞接触时，距离会被拉的最近，增加T细胞杀伤特异性；制备所得RVG‑CD70 CAR‑T细胞具备辅助穿过血脑屏障的RVG蛋白，可更高效的定位于脑部并发挥肿瘤杀伤活性，可用于制备治疗CD70分子高表达的脑部肿瘤的CAR‑T细胞药物。

Description

一种RVG-CD70 CAR-T细胞及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于分子生物学和细胞生物学领域，具体涉及一种借助RVG蛋白靶向脑部并特异性识别CD70的CAR-T细胞及制备方法，以及其在治疗高表达CD70分子相关脑部肿瘤的药物中的应用。
背景技术
癌症病人因放、化疗导致的免疫系统功能低下，是导致病情复发的重要原因，也是困扰医学界的一大难题。嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric antigen receptor T-cell immuno-therapy，CAR-T)以其独特的抗肿瘤优势，已成为全球生物科技竞争的热点。CAR-T细胞是将能识别某种肿瘤抗原的抗体单链可变区(SCFV)与CD8TM，4-1BB，CD3-ζ链等的胞内区偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染体外培养的患者T细胞，使其表达嵌合抗体受体(CAR)。患者的T细胞被“重编程”后，生成大量具有杀伤性的CAR-T细胞，能够特异性的靶向肿瘤细胞。但又不会伤及正常细胞。由于是诱导、激活自体细胞，因此该疗法没有通常的免疫排斥反应，也没有传统治疗中出现的耐药性。
CAR-T细胞是由单克隆抗体的单链可变区和T细胞信号转导区连接而成，抗体与相应的肿瘤抗原结合后能以主要组织相容性复合体以非限制性方式使T细胞活化，进而发挥抗肿瘤效应。CAR的结构分为：胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。胞外抗原结合区：通常由针对肿瘤相关抗原的单克隆抗体的轻链及重链连接而成。铰链区：对于远离细胞膜的抗原表位，无铰链区的CAR-T细胞可以识别和结合抗原；而对于膜近端的抗原表位，一个灵活的铰链区对抗原的识别是必要的。因此针对不同肿瘤相关抗原需要调整铰链区长度，以更好发挥靶向结合能力。跨膜区：来自CD3、CD8、CD8的跨膜区常用来构建CAR，并在CAR的二聚化和T细胞活化中发挥重要作用。胞内信号区：由共刺激分子如CD8、CD134和CD137组成，其中CD8可募集PI3K、Grb2等分子来调节关键转录因子的活性。CD134能促进T细胞体外增殖且增加IL-2的分泌，CD137是肿瘤坏死因子家族受体，能激活下游的JNK，p38，MAPK和INF-κB信号途径。大多数研究者把CD8或CD137的协同共刺激信号分子融合到CD3结构域的上游。
根据胞内信号传导区域的组成不同可分为3代CAR-T细胞。第1代CAR-T细胞的胞内部分仅含CD3ζ结构域，虽然能诱导T细胞的激活和最初的细胞毒性反应，但是存活时间短且只有很低或者没有IL-2的产生；第2代CAR-T细胞将共刺激分子如CD8、CD137的胞内部分融合到CD3结构域的上游，效果比第1代明显增强因而应用最广泛；第3代CAR-T细胞则同时融合2种共刺激分子到CD3结构域的上游，其抗肿瘤活性与第2代CAR-T细胞相比尚无定论。CAR-T细胞在血液肿瘤的免疫治疗中起到了重要作用，以CD19-CAR-T细胞治疗淋巴细胞肿瘤最为突出，有些已经进入II期临床试验。CAR-T细胞在实体肿瘤中的研究大部分仍处于动物实验阶段，但有些小样本的临床试验和病例报道取得了不错的疗效。
脑肿瘤包括原发性脑肿瘤和脑转移瘤，其最佳治疗手段是手术彻底切除，然因正常脑组织的不可切除性及恶性肿瘤向颅内广泛浸润性生长的特点，手术大范围彻底切除极为困难。因此，如何减少脑组织的损伤、保护脑的中枢功能、最大限度地消除肿瘤仍是现如今肿瘤学者研究的方向和奋斗的目标。
脑肿瘤有原发与继发两大类，原发肿瘤又分髓内与髓外，髓内肿瘤主要有胶质细胞瘤、神经细胞瘤和类胚叶间质肿瘤，髓外肿瘤主要有间质类肿瘤、上皮类肿瘤、畸胎瘤和松果体瘤等。
脑胶质瘤是来源于神经上皮的肿瘤，在颅内各种类型肿瘤中占第一位，其发病率约占颅内肿瘤的40％～45％，常见有星形细胞瘤、星形母细胞瘤、多形性胶质母细胞瘤、髓母细胞瘤、少突胶质细胞瘤、少突胶质母细胞瘤、脉络丛乳头状瘤、松果体瘤等。
脑膜瘤为仅次于脑胶质瘤的第二种常见颅内肿瘤，约占颅内肿瘤总数的20％。脑膜瘤具有部位表浅、生长缓慢、与脑组织分界清楚等特点。大多数脑膜瘤属良性。瘤的组织形态可分为内皮细胞型与纤维型两大类。脑膜瘤来源于蛛网膜内皮细胞，以大脑凸面、矢状裂旁和大脑镰旁最多，其次为蝶骨嵴、鞍结节、嗅沟、小脑幕及颅后窝等几个部位，脑室内少见。可发生于任何年龄，但老人、儿童少见。
CD70是肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)超家族的成员之一，具有调控T细胞和B细胞活化、增殖及分化的能力，在维持机体免疫应答过程中起着重要的作用。同时，在生理条件下，CD70仅短暂性地表达于活化的淋巴细胞，有研究证实，约35％的新诊断的胶质母细胞瘤患者和更高百分比的复发性肿瘤患者携带CD70。
发明内容
发明目的：针对上述现有技术，本发明提供了一种RVG-CD70 CAR-T细胞及其制备方法和应用。
技术方案：本发明公开了一种RVG-CD70 CAR-T细胞，所述CAR-T细胞在T淋巴细胞内表达RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白。即本申请CAR-T细胞以CD70结构域为靶点，在T淋巴细胞内表达RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白。
其中，所述T淋巴细胞来源于人外周血分离的PBMC中。
所述RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示。
优选的，所述RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中，CD8 Leader的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，CD70 SCFV(含(G4S)3)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
优选的，所述RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中，CD8_Hinge的分子序列如SEQ ID NO.3所示，CD8TM的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示。
优选的，所述RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中，4-1BB的氨基酸序列如SEQID NO.5所示，CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
优选的，所述RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白中，RVG的氨基酸序列如SEQ IDNO.7所示。
SEQ ID NO.1(CD8 Leader sequence)：
MALPVTALLLPLALLLHAARP
SEQ ID NO.2(CD70 Scfv)：
QVQLVQSGGGISWFPGGSIKISGSGFTFSWFYNVWKQGPGKGIQWVSDINNQGGTLFVADSWKGKFTISKENSRNSIFIVNRSIKGYDTGWFYCAKDAGYSNHWPIFDSWGQGTIWTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQGVWSNQPSITWSPGGTWTILHCGIKSGSSDNFPTWFNQTPGQGPKILIFNTNTKHSGWPDVKFSGSIIGNKGAITIVGAQGEDDQAQFTWGISVPSWQFGAGTQITVLG
SEQ ID NO.3(CD8_Hinge)：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY
SEQ ID NO.4(CD8_TM)：
IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
SEQ ID NO.5(4-1BB)：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO.6(CD3_zeta)：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
SEQ ID NO.7：
YTIWMPCDIKRAFTENPRPGTPNSRGSNG
SEQ ID NO.8：
MALPVTALLLPLALLLHAARPYTIWMPCDIKRAFTENPRPGTPNSRGSNGGGGGSGGGGSGGGGSQVQLVQSGGGISWFPGGSIKISGSGFTFSWFYNVWKQGPGKGIQWVSDINNQGGTLFVADSWKGKFTISKENSRNSIFIVNRSIKGYDTGWFYCAKDAGYSNHWPIFDSWGQGTIWTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQGVWSNQPSITWSPGGTWTILHCGIKSGSSDNFPTWFNQTPGQGPKILIFNTNTKHSGWPDVKFSGSIIGNKGAITIVGAQGEDDQAQFTWGISVPSWQFGAGTQITVLGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPLAGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYDALHMQALPPR
本申请所述的RVG-CD70 CAR-T细胞，所述T细胞的胞外表达所述RVG-CD70 SCFV序列的分子和RVG蛋白，所述T细胞的胞内由所述4-1BB-CD3ζ分子传递T细胞活化信号。
本发明还公开了上述RVG-CD70 CAR-T细胞制备方法，包括以下步骤：
(1)合成和扩增RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因，将所述RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因克隆到慢病毒表达载体上；
(2)利用慢病毒包装质粒和步骤(1)得到的慢病毒表达载体质粒感染293T细胞，包装和制备慢病毒；
(3)分离T淋巴细胞，培养扩增，利用步骤(2)得到的慢病毒感染T淋巴细胞，使所述T淋巴细胞表达RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白，得到RVG-CD70 CAR-T细胞。
本发明还公开了RVG-CD70 CAR-T细胞在制备治疗高表达CD70分子的脑部肿瘤的药物中的应用，所述RVG蛋白亦可辅助其他靶点CAR-T细胞入脑，用于治疗相应脑部疾病。
进一步的，所述肿瘤为脑瘤中的脑胶质母细胞瘤或CD70高表达的其他肿瘤的脑部转移。
有益效果：本发明将CD70抗体用于CAR-T细胞的构建，并提出以CD70分子为靶抗原，构建的CAR-T细胞以RVG蛋白辅助其穿过血脑屏障，与表达CD70分子的肿瘤细胞接触时，距离会被拉的最近，增加T细胞杀伤特异性。制备所得RVG-CD70 CAR-T细胞具备更高效的肿瘤杀伤活性，可用于制备CD70分子高表达脑部肿瘤的药物。
附图说明
图l是本发明的慢病毒质粒载体RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ结构图；
图2是本发明的高表达CD70抗原的脑胶质瘤细胞(M059K)流式检测结果以及不表达CD70抗原的HEB细胞流式检测结果；
图3是本发明的构建的RVG-CD70 CAR-T细胞的流式检测结果图；
图4是本发明的CAR-T体外杀伤实验效果图(M059K、HEB(HEBCD70+))；
图5是本发明的不同效靶比条件下CAR-T细胞体外杀伤效果图(RTCA测得)；
图6是本发明的动物水平实验获得的小鼠存活率变化结果图；
图7是本发明的动物水平实验获得的小鼠皮下移植瘤体积变化结果图；
图8是本发明的动物水平实验获得的实验周期内小鼠体重变化结果图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例一：慢病毒表达载体制备
基因合成RVG-SCFV(anti CD70)-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合基因序列，基因序列如SEQID NO.8所示，通过酶切转化连接到PLV载体中，基因上游为EF-1α启动子。载体转化DH5α大肠杆菌菌株，氨苄青霉素筛选，获得阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定克隆，获得PLV-RVG-SCFV(anti CD70)-CD8TM-4-1BB-CD3ζ慢病毒包装载体，见图1。
实施例二：慢病毒制备
转染前24小时，以每瓶约8×106将293T细胞接种至T75培养瓶中。确保细胞在80％左右的融合度且均匀分布于培养瓶中时进行慢病毒包装。
准备制备质粒和转染试剂稀释液
1、漩涡震荡混匀PEI转染试剂。
2、准备2个离心管，按以下顺序分别制备质粒和转染试剂稀释液。
Figure BDA0002372274470000051
Figure BDA0002372274470000061
3、充分混匀。
4、将转染试剂稀释液(离心管2)加入质粒DNA溶液(离心管1)中，立刻充分混匀。注意加入顺序非常重要。
5、室温孵育转染混合液15～20分钟。
6、将每1ml转染混合液加入铺好293T细胞培养瓶，轻轻吹吸培养基混匀。
7、放入37℃培养6小时。
8、去除含有转染试剂的培养基，用20ml病毒培养基换液。
9、转染后48小时收集细胞培养上清。500g离心10min去除细胞碎片。该上清可以直接用于慢病毒感染，也可以进行病毒滴度测定或病毒浓缩。如需长时间保存，可-80℃冻存。
实施例三：RVG-CD70 CAR-T细胞制备
取0.5ml血进行快速的病原微生物检测，排除HBV、HCV、HDV和HEV、HIV-1/2、梅毒螺旋体及寄生虫等微生物感染。通过单采机采集得到病人外周血单核细胞(PBMC)。配置完全生长培养基，PBS添加5％自体AB或FBS，IL-2浓度为20ng/ml，将分离得到的PBMC用培养基稀释成2×106/ml，取50u1流式检测PBMC中T细胞的纯度。0天，配置buffer1，PBS添加1％的FBS，将beads振荡30s或手动上下摇匀5min，根据beads与T细胞比例3比1的比例取出CD3/CD8 beads置于1.5ml EP管中，添加1ml Buffer1清洗beads，之后使用磁铁从EP管外吸beads 1min，弃洗液，重复两次，再使用培养基将beads重悬到原体积，将细胞和beads混合后按2×105PBMC/ml加到合适的培养瓶中。第二天将细胞密度调整至2×105/ml，按virusvector：cel1＝1：5比例添加virus vector，同时添加polybrene 4ug/ml和20ng/ml IL-15。4h之后，补加新鲜的完全培养基将细胞密度调整至5×104/ml继续培养。将所有的细胞离心，加入新鲜的培养基，继续培养。每隔2-3天进行半量换液，维持细胞密度在0.5-1×10％/ml。10-12天，细胞数量达到106级别，400g，5min离心得免疫细胞，再用预冷的PBS洗涤两遍(400g，5min)。用血球计数板计数，流式细胞仪检测细胞类群，CAR-T细胞比例，见图3，根据图示可见通过本实例方法制得的CAR-T细胞阳性率达到97％以上。每天观察培养基的颜色变化、细胞密度、细胞形态并作相应记录。逐步扩大培养过程中，加入总体积所需的IL-15。
实施例四：工程细胞株的筛选检测
(1)筛选可能存在CD70高表达的癌细胞系进行培养；
(2)取不同细胞各2万个，400g，5min，再用预冷的PBS洗涤两遍，分别加入2μ1的CD70的抗体(BD)避光孵育20min，离心，再用预冷的PBS洗涤1遍，200μ1PBS重悬细胞，流式细胞术检测CD70的表达(见图2)，实验结果验证脑胶质瘤细胞M059K高表达CD70，可作为靶细胞用于后续杀伤实验，人的正常脑胶质细胞系HEB几乎不表达CD70，可作为阴性对照。
实施例五
RTCA实时监测RVG-CD70 CAR-T细胞介导的M059K杀伤作用
1.接种靶细胞之前，每个孔加100μ1 1640培养基放入RTCA中，此时值记为“0”；
2.每孔加入1×105个靶细胞，37℃5％CO2培养24h，至细胞融合度达到90％以上；
3.取出96孔板，每孔按E/T比1:1、2:1、4:1、8:1加入200μ1CD70 CAR-T细胞；
4.将电极板放回RTCA中扣紧，继续培养；
5.48h后结束实验，显微镜下观察细胞杀伤结果，如图4，根据图示可见CD70 CAR-T对脑胶质瘤(M059K)的杀伤效果随着效靶比的升高而增强，对过表达CD70的HEB细胞表现出和M059K同样的杀伤效果，而对不表达CD70的细胞(HEB)在不同效靶比的试验中均未见任何杀伤效果；
6.分析数据，结果如图5，根据图示可见CD70 CAR-T对脑胶质瘤细胞(M059K)达到相同杀伤效果所需时间随着效靶比的升高而缩短，且不同效靶比最终均能几乎清除癌细胞，对过表达CD70抗原的HEB细胞几乎能达到同样的杀伤效果，而对不表达CD70的人的正常脑胶质细胞(HEB)在不同效靶比的试验中均未见任何杀伤效果。
实施例六
NCG小鼠背部右侧皮下接种CD70高表达的人脑胶质瘤细胞(M059K)，构建皮下移植瘤模型。肿瘤注射后第20、25天后分组(每组5只)进行RVG-CD70 CAR-T细胞、Mock T细胞和PBS尾静脉输注治疗，每三天观察并记录小鼠存活情况，结果如图6，根据图示可见注射RVG-CD70 CAR-T组小鼠缓解率达到100％，注射Mock T组小鼠缓解率为33％，而注射PBS和MockT细胞组小鼠在22天内全部死亡。每三天测量肿瘤的大小，结果如图7，根据图示可见注射三个不同剂量RVG-CD70 CAR-T组小鼠皮下移植瘤均在注射RVG-CD70 CAR-T细胞一周后消失，注射Mock T和PBS组小鼠皮下移植瘤50天后平均接近2000mm3。记录小鼠体重变化情况，结果如图8，根据图示可见注射三个不同剂量RVG-CD70 CAR-T组小鼠体重均增长到接近27g，而注射PBS和Mock T组小鼠体重由原来平均21g下降到接近15g。以上实验结果均显示了RVG-CD70 CAR-T具有较好的抑制肿瘤的效果，移植瘤小鼠的死亡率和生存状态都得到了很好的改善。
序列表
<110> 南京师范大学
<120> 一种RVG-CD70 CAR-T细胞及其制备方法与应用
<160> 8
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 2
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Ile Ser Trp Phe Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Ile Lys Ile Ser Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Phe Tyr
20 25 30
Asn Val Trp Lys Gln Gly Pro Gly Lys Gly Ile Gln Trp Val Ser Asp
35 40 45
Ile Asn Asn Gln Gly Gly Thr Leu Phe Val Ala Asp Ser Trp Lys Gly
50 55 60
Lys Phe Thr Ile Ser Lys Glu Asn Ser Arg Asn Ser Ile Phe Ile Val
65 70 75 80
Asn Arg Ser Ile Lys Gly Tyr Asp Thr Gly Trp Phe Tyr Cys Ala Lys
85 90 95
Asp Ala Gly Tyr Ser Asn His Trp Pro Ile Phe Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ile Trp Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Gly Val Trp Ser Asn Gln Pro Ser
130 135 140
Ile Thr Trp Ser Pro Gly Gly Thr Trp Thr Ile Leu His Cys Gly Ile
145 150 155 160
Lys Ser Gly Ser Ser Asp Asn Phe Pro Thr Trp Phe Asn Gln Thr Pro
165 170 175
Gly Gln Gly Pro Lys Ile Leu Ile Phe Asn Thr Asn Thr Lys His Ser
180 185 190
Gly Trp Pro Asp Val Lys Phe Ser Gly Ser Ile Ile Gly Asn Lys Gly
195 200 205
Ala Ile Thr Ile Val Gly Ala Gln Gly Glu Asp Asp Gln Ala Gln Phe
210 215 220
Thr Trp Gly Ile Ser Val Pro Ser Trp Gln Phe Gly Ala Gly Thr Gln
225 230 235 240
Ile Thr Val Leu Gly
245
<210> 3
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
35 40 45
<210> 4
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 5
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 7
<211> 29
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Tyr Thr Ile Trp Met Pro Cys Asp Ile Lys Arg Ala Phe Thr Glu Asn
1 5 10 15
Pro Arg Pro Gly Thr Pro Asn Ser Arg Gly Ser Asn Gly
20 25
<210> 8
<211> 533
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Tyr Thr Ile Trp Met Pro Cys Asp Ile Lys Arg
20 25 30
Ala Phe Thr Glu Asn Pro Arg Pro Gly Thr Pro Asn Ser Arg Gly Ser
35 40 45
Asn Gly Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly
50 55 60
Ser Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Ile Ser Trp Phe Pro
65 70 75 80
Gly Gly Ser Ile Lys Ile Ser Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Phe
85 90 95
Tyr Asn Val Trp Lys Gln Gly Pro Gly Lys Gly Ile Gln Trp Val Ser
100 105 110
Asp Ile Asn Asn Gln Gly Gly Thr Leu Phe Val Ala Asp Ser Trp Lys
115 120 125
Gly Lys Phe Thr Ile Ser Lys Glu Asn Ser Arg Asn Ser Ile Phe Ile
130 135 140
Val Asn Arg Ser Ile Lys Gly Tyr Asp Thr Gly Trp Phe Tyr Cys Ala
145 150 155 160
Lys Asp Ala Gly Tyr Ser Asn His Trp Pro Ile Phe Asp Ser Trp Gly
165 170 175
Gln Gly Thr Ile Trp Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly
180 185 190
Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Gly Val Trp Ser Asn Gln Pro
195 200 205
Ser Ile Thr Trp Ser Pro Gly Gly Thr Trp Thr Ile Leu His Cys Gly
210 215 220
Ile Lys Ser Gly Ser Ser Asp Asn Phe Pro Thr Trp Phe Asn Gln Thr
225 230 235 240
Pro Gly Gln Gly Pro Lys Ile Leu Ile Phe Asn Thr Asn Thr Lys His
245 250 255
Ser Gly Trp Pro Asp Val Lys Phe Ser Gly Ser Ile Ile Gly Asn Lys
260 265 270
Gly Ala Ile Thr Ile Val Gly Ala Gln Gly Glu Asp Asp Gln Ala Gln
275 280 285
Phe Thr Trp Gly Ile Ser Val Pro Ser Trp Gln Phe Gly Ala Gly Thr
290 295 300
Gln Ile Thr Val Leu Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr
305 310 315 320
Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala
325 330 335
Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe
340 345 350
Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val
355 360 365
Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys
370 375 380
Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr
385 390 395 400
Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu
405 410 415
Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro
420 425 430
Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly
435 440 445
Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro
450 455 460
Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr
465 470 475 480
Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly
485 490 495
Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln
500 505 510
Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln
515 520 525
Ala Leu Pro Pro Arg
530

Claims (5)

1.一种RVG-CD70 CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞以CD70结构域为靶点，在T淋巴细胞内表达RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白；所述RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.8所示，其中RVG的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
2.根据权利要求1所述的RVG-CD70 CAR-T细胞，其特征在于，所述T淋巴细胞来源于人外周血分离的PBMC中。
3.根据权利要求1所述的RVG-CD70 CAR-T细胞，其特征在于，所述T细胞的表面表达所述RVG-CD70 SCFV序列的分子，所述T细胞的胞内由所述4-1BB-CD3ζ分子传递T细胞活化信号。
4.权利要求1-3中任一所述RVG-CD70 CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）合成和扩增RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因，将所述RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因克隆到慢病毒表达载体上；
（2）利用慢病毒包装质粒和步骤（1）得到的慢病毒表达载体质粒感染293T细胞，包装和制备慢病毒；
（3）分离T淋巴细胞，培养扩增，利用步骤（2）得到的慢病毒感染T淋巴细胞，使所述T淋巴细胞表达RVG-SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白，得到RVG-CD70 CAR-T细胞。
5.权利要求1-3中任一所述RVG-CD70 CAR-T细胞在制备治疗高表达CD70分子的脑部肿瘤的药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为脑胶质瘤。
CN202010054260.2A 2020-01-17 2020-01-17 一种rvg-cd70 car-t细胞及其制备方法与应用 Active CN111139223B (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010054260.2A CN111139223B (zh) 2020-01-17 2020-01-17 一种rvg-cd70 car-t细胞及其制备方法与应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN202010054260.2A CN111139223B (zh) 2020-01-17 2020-01-17 一种rvg-cd70 car-t细胞及其制备方法与应用

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111139223A CN111139223A (zh) 2020-05-12
CN111139223B true CN111139223B (zh) 2021-04-27

Family

ID=70525883

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010054260.2A Active CN111139223B (zh) 2020-01-17 2020-01-17 一种rvg-cd70 car-t细胞及其制备方法与应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111139223B (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
EP4226972A1 (en) * 2020-10-12 2023-08-16 Nanjing Iaso Biotechnology Co., Ltd. Antibody and chimeric antigen receptor (car) binding to cd70, and application thereof

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102174110A (zh) * 2011-01-24 2011-09-07 西南大学 狂犬病毒糖蛋白衍生肽及其应用
CN107227299A (zh) * 2017-06-01 2017-10-03 刘未斌 Anti MUC1 CAR‑T细胞及其制备方法和应用
CN108743964A (zh) * 2017-04-25 2018-11-06 中国医学科学院药物研究所 一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽修饰的脑靶向核酸递送载体及其应用
CN110592023A (zh) * 2019-09-11 2019-12-20 浙江蓝盾药业有限公司 一种Anti CD70 CAR-T细胞及其制备方法与应用

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102174110A (zh) * 2011-01-24 2011-09-07 西南大学 狂犬病毒糖蛋白衍生肽及其应用
CN108743964A (zh) * 2017-04-25 2018-11-06 中国医学科学院药物研究所 一种狂犬病毒糖蛋白衍生肽修饰的脑靶向核酸递送载体及其应用
CN107227299A (zh) * 2017-06-01 2017-10-03 刘未斌 Anti MUC1 CAR‑T细胞及其制备方法和应用
CN110592023A (zh) * 2019-09-11 2019-12-20 浙江蓝盾药业有限公司 一种Anti CD70 CAR-T细胞及其制备方法与应用

Non-Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
The potential use of rabies virus glycoprotein-derived peptides to facilitate drug delivery into the central nervous system: a mini review;Rachel Huey等;《Journal of Drug Targeting》;20160831;第25卷(第5期);第379-385页 *
狂犬病毒糖蛋白中多肽片段作为脑靶向药物载体的研究进展;陈利刚等;《中国药理学通报》;20170424;第33卷(第5期);第607-611页 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111139223A (zh) 2020-05-12

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN110592023B (zh) 一种Anti CD70 CAR-T细胞及其制备方法与应用
CN110041433B (zh) 一种靶向bcma的嵌合抗原受体及其应用
US11932872B2 (en) Dual chimeric antigen receptor-t cell which can be regulated, construction method therefor and use thereof
CN109748973A (zh) 表达于t淋巴细胞表面的嵌合抗原受体组合及其应用
WO2019024933A1 (zh) 靶向gpc3的car nk细胞
CN109320615A (zh) 靶向新型bcma的嵌合抗原受体及其用途
CN113416260B (zh) 靶向Claudin18.2的特异性嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
CN110055269B (zh) 人间皮素嵌合抗原受体、其t细胞及其制备方法和用途
CN113214408B (zh) 一种嵌合抗原受体巨噬细胞及其制备方法和用途
CN110317822B (zh) Trop2嵌合抗原受体、其t细胞及其制备方法和用途
CN113234151B (zh) 一种基于靶向SARS-CoV2病毒S蛋白的三聚体纳米抗体的CAR-NK的研制
WO2018103734A1 (zh) 嵌合抗原受体及其用途和制备方法
CN113896801A (zh) 靶向人Claudin18.2和NKG2DL的嵌合抗原受体细胞及其制备方法和应用
CN107254447B (zh) Anti AFP CAR-T细胞及其制备方法和应用
WO2022222846A1 (zh) 靶向cd19的嵌合抗原受体、制备方法及其应用
CN109517798B (zh) 一种嵌合cea抗原受体的nk细胞及其制备方法与应用
CN109265563B (zh) 一种用于治疗血液肿瘤的人源嵌合抗原受体及其应用
CN109824783B (zh) 表达于t淋巴细胞表面的嵌合抗原受体及其应用
CN111139223B (zh) 一种rvg-cd70 car-t细胞及其制备方法与应用
CN111378624A (zh) 一种靶向性抗肿瘤t细胞及其制备方法和应用
CN116478931A (zh) 一种高亲和型抗肿瘤nk细胞及其制备方法和应用
CN110699371A (zh) 一种基于FcγRⅢa的嵌合基因及其用途
CN110669138A (zh) 一种双嵌合抗原受体、t细胞及其构建方法与应用
WO2022171195A1 (zh) 抗cd87抗体与抗pd1抗体联合治疗胃癌
CN109824782B (zh) 抗cd19抗体和muc1抗原肽的偶联物及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant
TR01 Transfer of patent right
TR01 Transfer of patent right

Effective date of registration: 20240315

Address after: Room 620, 6th Floor, Building F7, Jiangsu Life Science and Technology Park, No. 9 Weidi Road, Xianlin Street, Qixia District, Nanjing City, Jiangsu Province, 210046

Patentee after: Nanjing Kanghe cell Genetic Engineering Research Institute Co.,Ltd.

Country or region after: China

Address before: No. 1 Wenyuan Road, Qixia District, Nanjing City, Jiangsu Province

Patentee before: NANJING NORMAL University

Country or region before: China