CN110592023A - 一种Anti CD70 CAR-T细胞及其制备方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于分子生物学和细胞生物学领域，具体涉及一种特异性识别CD70的CAR‑T细胞及制备方法，将SCFV(Anti CD70)‑CD8TM‑4‑1BB‑CD3ζ分子在T细胞内表达。本发明将CD70抗体用于CAR‑T细胞的构建，并提出以CD70分子为靶抗原，构建的CAR‑T细胞与表达CD70分子的肿瘤细胞接触时，距离会被拉的最近，增加T细胞杀伤特异性；制备所得Anti CD70 CAR‑T细胞具备更高效的肿瘤杀伤活性，可用于制备CD70分子高表达肿瘤的药物。

Description

一种Anti CD70 CAR-T细胞及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于分子生物学和细胞生物学领域，具体涉及一种特异性识别CD70 的CAR-T细胞及制备方法，以及其在治疗高表达CD70分子相关疾病的药物中的应用。
背景技术
癌症病人因放、化疗导致的免疫系统功能低下，是导致病情复发的重要原因，也是困扰医学界的一大难题。嵌合抗原受体T细胞免疫疗法(Chimeric antigen receptor T-cell immuno-therapy，CAR-T)以其独特的抗肿瘤优势，已成为全球生物科技竞争的热点。CAR-T细胞是将能识别某种肿瘤抗原的抗体单链可变区 (SCFV)与CD8TM，4-1BB，CD3-ζ链等的胞内区偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染体外培养的患者T细胞，使其表达嵌合抗体受体(CAR)。患者的T细胞被“重编程”后，生成大量具有杀伤性的CAR-T细胞，能够特异性的靶向肿瘤细胞。但又不会伤及正常细胞。由于是诱导、激活自体细胞，因此该疗法没有通常的免疫排斥反应，也没有传统治疗中出现的耐药性。
CAR-T细胞是由单克隆抗体的单链可变区和T细胞信号传导区连接而成，抗体与相应的肿瘤抗原结合后能以主要组织相容性复合体以非限制性方式使T细胞活化，进而发挥抗肿瘤效应。CAR的结构分为：胞外抗原结合区、铰链区、跨膜区和胞内信号区。目标抗原的选择对于CAR的特异性、有效性以及基因改造T细胞自身的安全性来讲都是关键的决定因素。胞外抗原结合区：通常由针对肿瘤相关抗原的单克隆抗体的轻链及重链连接而成。铰链区：对于远离细胞膜的抗原表位，无铰链区的CAR-T细胞可以识别和结合抗原；而对于膜近端的抗原表位，一个灵活的铰链区对抗原的识别是必要的。因此针对不同肿瘤相关抗原需要调整铰链区长度，以更好发挥靶向结合能力。跨膜区：来自CD3、CD8、 CD8的跨膜区常用来构建CAR，并在CAR的二聚化和T细胞活化中发挥重要作用。胞内信号区：由共刺激分子如CD8、CD134和CD137组成，其中CD8 可募集PI3K、Grb2等分子来调节关键转录因子的活性。
CD134能促进T细胞体外增殖且增加IL-2的分泌，CD137是肿瘤坏死因子家族受体，能激活下游的JNK，p38，MAPK和INF-κB信号途径。大多数研究者把CD8或CD137的协同共刺激信号分子融合到CD3结构域的上游。根据胞内信号传导区域的组成不同可分为3代CAR-T细胞。第1代CAR-T细胞的胞内部分仅含CD3ζ结构域，虽然能诱导T细胞的激活和最初的细胞毒性反应，但是存活时间短且只有很低或者没有IL-2的产生；第2代CAR-T细胞将共刺激分子如CD8、CD137的胞内部分融合到CD3结构域的上游，效果比第1代明显增强因而应用最广泛；第3代CAR-T细胞则同时融合2种共刺激分子到CD3结构域的上游，其抗肿瘤活性与第2代CAR-T细胞相比尚无定论。CAR-T细胞在血液肿瘤的免疫治疗中起到了重要作用，以CD19-CAR-T细胞治疗淋巴细胞肿瘤最为突出，有些已经进入II期临床试验。CAR-T细胞在实体肿瘤中的研究大部分仍处于动物实验阶段，但有些小样本的临床试验和病例报道取得了不错的疗效。
肾细胞癌(简称肾癌)是泌尿系统中恶性度较高的肿瘤，也是最常见的肿瘤之一，是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，又称肾腺癌，占肾恶性肿瘤的80％～90％。据调查，肾癌在我国泌尿生殖系统肿瘤中占第二位，仅次于膀胱肿瘤，占成人恶性肿瘤的2％～3％、小儿恶性肿瘤的20％左右。男女发病率有明显差异，据统计，男女之比为2：1。肾癌的发病率随年龄增大而升高，有资料显示，肾癌的高发年龄在40～55岁。我国肾癌发病率呈逐年上升趋势，居男性恶性肿瘤发病率第10位。
CD70是肿瘤坏死因子受体(tumor necrosis factor receptor，TNFR)超家族的成员之一，具有调控T细胞和B细胞活化、增殖及分化的能力，在维持机体免疫应答过程中起着重要的作用。同时，在生理条件下，CD70仅短暂性地表达于活化的淋巴细胞，但在肾透明细胞癌病例中有38％～68％的高表达，肾乳头状细胞癌有30％～60％高表达，而且原发性肿瘤内有CD70表达的病例，在转移灶内也发现了C70的高表达。使其可能成为肿瘤免疫治疗的一个有效的靶点分子。
发明内容
发明目的：针对上述现有技术，本发明提供了一种Anti CD70 CAR-T细胞及其制备方法和应用。
技术方案：本发明公开了一种Anti CD70 CAR-T细胞，所述CAR-T细胞在T 淋巴细胞内表达SCFV(Anti CD70)-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白。即本申请 CAR-T细胞以CD70结构域为靶点，在T淋巴细胞内表达 SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白。
其中，所述T淋巴细胞来源于人外周血分离的PBMC中。
所述SCFV-CD8TM4-1BB-CD3ζ融合蛋白氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
优选的，所述SCFV-CD8TM4-1BB-CD3ζ融合蛋白中，CD8Leader的氨基酸序列如SEQID NO.1所示，CD70SCFV(含(G4S)3)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2 所示。
优选的，所述SCFV-CD8TM4-1BB-CD3ζ融合蛋白中，CD8_Hinge的分子序列如SEQ IDNO.3所示，CD8TM的氨基酸序列如SEQ ID NO.4所示，
优选的，所述SCFV-CD8TM4-1BB-CD3ζ融合蛋白中，4-1BB的氨基酸序列如SEQ IDNO.5所示，CD3ζ的氨基酸序列如SEQ ID NO.6所示。
SEQ ID NO.1(CD8Leader sequence)：
MALPVTALLLPLALLLHAARP
SEQ ID NO.2(CD70Scfv)：
QVQLVQSGGGISWFPGGSIKISGSGFTFSWFYNVWKQGPGKGIQWVSDINNQ GGTLFVADSWKGKFTISKENSRNSIFIVNRSIKGYDTGWFYCAKDAGYSNHW PIFDSWGQGTIWTVSSGGGGSGGGGSGGGGSQGVWSNQPSITWSPGGTWTIL HCGIKSGSSDNFPTWFNQTPGQGPKILIFNTNTKHSGWPDVKFSGSIIGNKGAI TIVGAQGEDDQAQFTWGISVPSWQFGAGTQITVLG
SEQ ID NO.3(CD8_Hinge)：
TTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIY
SEQ ID NO.4(CD8_TM)：
IWAPLAGTCGVLLLSLVITLYC
SEQ ID NO.5(4-1BB)：
KRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEEGGCEL
SEQ ID NO.6(CD3_zeta)：
RVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMGGKPRR KNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTATKDTYD ALHMQALPPR
SEQ ID NO.7：
MALPVTALLLPLALLLHAARPQVQLVQSGGGISWFPGGSIKISGSGFTFSWFY NVWKQGPGKGIQWVSDINNQGGTLFVADSWKGKFTISKENSRNSIFIVNRSIK GYDTGWFYCAKDAGYSNHWPIFDSWGQGTIWTVSSGGGGSGGGGSGGGGS QGVWSNQPSITWSPGGTWTILHCGIKSGSSDNFPTWFNQTPGQGPKILIFNTNT KHSGWPDVKFSGSIIGNKGAITIVGAQGEDDQAQFTWGISVPSWQFGAGTQIT VLGTTTPAPRPPTPAPTIASQPLSLRPEACRPAAGGAVHTRGLDFACDIYIWAPL AGTCGVLLLSLVITLYCKRGRKKLLYIFKQPFMRPVQTTQEEDGCSCRFPEEEE GGCELRVKFSRSADAPAYQQGQNQLYNELNLGRREEYDVLDKRRGRDPEMG GKPRRKNPQEGLYNELQKDKMAEAYSEIGMKGERRRGKGHDGLYQGLSTAT KDTYDALHMQALPPR
本申请所述的Anti CD70 CAR-T细胞，所述T细胞的表面表达所述Anti CD70SCFV序列的分子，所述T细胞的胞内由所述4-1BB-CD3ζ分子传递T细胞活化信号。
本发明还公开了上述Anti CD70 CAR-T细胞的制备方法，包括以下步骤：
(1)合成和扩增SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因，将所述 SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因克隆到慢病毒表达载体上；
(2)利用慢病毒包装质粒和步骤(1)得到的慢病毒表达载体质粒感染293T 细胞，包装和制备慢病毒；
(3)分离T淋巴细胞，培养扩增，利用步骤(2)得到的慢病毒感染T淋巴细胞，使所述T淋巴细胞表达SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白，得到Anti CD70 CAR-T细胞。
本发明还公开了上述Anti CD70 CAR-T细胞在制备治疗高表达CD70分子的肿瘤的药物中的应用。进一步的，所述肿瘤为肾癌。
有益效果：本发明将CD70抗体用于CAR-T细胞的构建，并提出以CD70 分子为靶抗原，构建的CAR-T细胞与表达CD70分子的肿瘤细胞接触时，距离会被拉的最近，增加T细胞杀伤特异性；制备所得Anti CD70 CAR-T细胞具备更高效的肿瘤杀伤活性，可用于制备CD70分子高表达肿瘤的药物。
附图说明
图l是本发明的慢病毒质粒载体PLV-SCFV(anti CD70)-CD8TM-4-1BB-CD3ζ结构图；
图2是本发明的高表达CD70抗原的肾细胞(786-0)流式检测结果图；
图3是本发明的构建的Anti CD70 CAR-T细胞的流式检测结果图；
图4是本发明的CAR-T体外杀伤实验效果图(786-0为实验组，MCF-7为阴性对照组)；
图5是本发明的不同效靶比条件下CAR-T细胞体外杀伤效果图(RTCA测得)；
图6是本发明的动物水平实验获得的小鼠存活率变化结果图；
图7是本发明的动物水平实验获得的小鼠皮下移植瘤体积变化结果图；
图8是本发明的动物水平实验获得的实验周期内小鼠体重变化结果图。
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明中的技术方案进行清楚、完整地描述。
实施例一：慢病毒表达载体制备
基因合成SCFV(anti CD70)-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合基因序列，基因序列如 SEQ IDNO.7所示，通过酶切转化连接到PLV载体中，基因上游为EP-1a启动子。载体转化DH5α大肠杆菌菌株，氨苄青霉素筛选，获得阳性克隆，提取质粒，酶切鉴定克隆，获得PLV-SCFV(antiCD70)-CD8TM-4-1BB-CD3ζ慢病毒包装载体，见图1。
实施例二：慢病毒制备
转染前24小时，以每瓶约8×106将293T细胞接种至T75培养瓶中。确保细胞在80％左右的融合度且均匀分布于培养瓶中时进行慢病毒包装。
准备制备质粒和转染试剂稀释液
1、漩涡震荡混匀PEI 40K转染试剂。
2、准备2个离心管，按以下顺序分别制备质粒和转染试剂稀释液。
3、充分混匀。
4、将转染试剂稀释液(离心管2)加入质粒DNA溶液(离心管1)中，立刻充分混匀。注意加入顺序非常重要。
5、室温孵育转染混合液15～20分钟。
6、将每1ml转染混合液加入铺好293T细胞培养瓶，轻轻吹吸培养基混匀。
7、放入37℃培养6小时。
8、去除含有转染试剂的培养基，用20ml病毒培养基换液。
9、转染后48小时收集细胞培养上清。500g离心10min去除细胞碎片。该上清可以直接用于慢病毒感染，也可以进行病毒滴度测定或病毒浓缩。如需长时间保存，可-80℃冻存。
实施例三：Anti CD70 CAR-T细胞制备
取0.5ml血进行快速的病原微生物检测，排除HBV、HCV、HDV和HEV、 HIV-1/2、梅毒螺旋体及寄生虫等微生物感染。通过单采机采集得到病人外周血单核细胞(PBMC)。配置完全生长培养基，PBSPBS添加5％自体AB或FBS，IL-2 浓度为20ng/ml，将分离得到的PBMC用培养基稀释成2×10/ml，取50u1流式检测PBMC中T细胞的纯度。0天，配置buffer1，PBS添加1％的FBS，将beads 振荡30s或手动上下摇匀5min，根据beads与T细胞比例3比1的比例取出CD3/CD8beads置于1.5ml EP管中，添加1ml Buffer1清洗beads，之后使用磁铁从EP管外吸beadslmin，弃洗液，重复两次，再使用培养基将beads重悬到原体积，将细胞和beads混合后按2×105PBMC/ml加到合适的培养瓶中。第二天将细胞密度调整至2×105/ml，按virusvector：cel1＝1：5比例添加virus vector，同时添加polybrene 4ug/ml和20ng/ml IL-2。4h之后，补加新鲜的完全培养基将细胞密度调整至5×104/ml继续培养。将所有的细胞离心，加入新鲜的培养基，继续培养。每隔2-3天进行半量换液，维持细胞密度在0.5-1×10％/ml。10-12天，细胞数量达到106级别，400g，5min离心得免疫细胞，再用预冷的PBS洗涤两遍(400g，5min)。用血球计数板计数，流式细胞仪检测细胞类群，CAR-T细胞比例，见图3，根据图示可见通过本实例方法制得的CAR-T细胞阳性率达到97％以上。每天观察培养基的颜色变化、细胞密度、细胞形态并作相应记录。逐步扩大培养过程中，加入总体积所需的IL-2。
实施例四：工程细胞株的筛选检测
(1)筛选可能存在CD70高表达的癌细胞系进行培养；
(2)取不同细胞各2万个，400g，5min，再用预冷的PBS洗涤两遍，分别加入2μ1的CD70的抗体(BD)避光孵育20min，离心，再用预冷的PBS洗涤1遍， 200μ1PBS重悬细胞，流式细胞术检测CD70的表达(见图2)，实验结果验证肾癌细胞系786-0高表达CD70(接近100％)，脑胶质瘤细胞MO59K也有较高的表达率，可作为靶细胞用于后续杀伤实验，乳腺癌细胞系MCF-7几乎不表达 CD70，可作为阴性对照。
实施例五
RTCA实时监测CD70 CAR-T细胞介导的786-0、M059K杀伤作用(MCF-7 作为阴性对照)
1.接种靶细胞之前，每个孔加100μ1 1640培养基放入RTCA中，此时值记为“0”；
2.每孔加入1×105个靶细胞，37℃5％CO2培养24h，至细胞融合度达到 90％以上；
3.取出96孔板，每孔按E/T比1:1、2:1、4:1、8:1加入200μ1CD70 CAR-T 细胞；
4.将电极板放回RTCA中扣紧，继续培养；
5.48h后结束实验，显微镜下观察细胞杀伤结果，如图4，根据图示可见 CD70 CAR-T对肾癌细胞(786-0)和脑胶质瘤(M059K)的杀伤效果随着效靶比的升高而增强，而对不表达CD70的细胞(MCF-7)在不同效靶比的试验中均未见任何杀伤效果；
6.分析数据，结果如图5，根据图示可见CD70 CAR-T对肾癌细胞(786-0) 和脑胶质瘤细胞(M059K)达到相同杀伤效果所需时间随着效靶比的升高而缩短，且不同效靶比最终均能几乎清除癌细胞，而对不表达CD70的乳腺癌细胞 (MCF-7)在不同效靶比的试验中均未见任何杀伤效果。
实施例六
NCG小鼠(购自百奥赛图基因生物技术有限公司)背部左右两侧分别皮下接种CD70高表达的人肾癌细胞786-0，构建皮下移植瘤模型。肿瘤注射后第20、 25天后分组(每组5只)进行Anti CD70 CAR-T细胞、mock T细胞和PBSPBSPBS 尾静脉输注治疗，每三天观察并记录小鼠存活情况，结果如图6，根据图示可见注射CD70 CAR-T组小鼠缓解率达到94％，注射mock T组小鼠缓解率为25％，而注射PBS组小鼠在第22天全部死亡。每五天测量肿瘤的大小，结果如图7，根据图示可见注射三个不同剂量CD70 CAR-T组小鼠皮下移植瘤均在注射CD70 CAR-T细胞20天后消失，注射mock T组小鼠皮下移植瘤平均达到510mm2，而注射PBS组小鼠皮下移植瘤平均达到700mm2。记录小鼠体重变化情况，结果如图8，根据图示可见注射CD70 CAR-T和mock T组小鼠体重均出现增长，而注射PBS组小鼠体重由原来平均21g下降到19g。以上实验结果均显示了CD70 CAR-T具有较好的抑制肿瘤的效果，移植瘤小鼠的死亡率和生存状态都得到了很好的改善。
序列表
<110> 浙江蓝盾药业有限公司
<120> 一种Anti CD70 CAR-T细胞及其制备方法与应用
<160> 7
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 2
<211> 245
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Ile Ser Trp Phe Pro Gly
1 5 10 15
Gly Ser Ile Lys Ile Ser Gly Ser Gly Phe Thr Phe Ser Trp Phe Tyr
20 25 30
Asn Val Trp Lys Gln Gly Pro Gly Lys Gly Ile Gln Trp Val Ser Asp
35 40 45
Ile Asn Asn Gln Gly Gly Thr Leu Phe Val Ala Asp Ser Trp Lys Gly
50 55 60
Lys Phe Thr Ile Ser Lys Glu Asn Ser Arg Asn Ser Ile Phe Ile Val
65 70 75 80
Asn Arg Ser Ile Lys Gly Tyr Asp Thr Gly Trp Phe Tyr Cys Ala Lys
85 90 95
Asp Ala Gly Tyr Ser Asn His Trp Pro Ile Phe Asp Ser Trp Gly Gln
100 105 110
Gly Thr Ile Trp Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly
115 120 125
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Gly Val Trp Ser Asn Gln Pro Ser
130 135 140
Ile Thr Trp Ser Pro Gly Gly Thr Trp Thr Ile Leu His Cys Gly Ile
145 150 155 160
Lys Ser Gly Ser Ser Asp Asn Phe Pro Thr Trp Phe Asn Gln Thr Pro
165 170 175
Gly Gln Gly Pro Lys Ile Leu Ile Phe Asn Thr Asn Thr Lys His Ser
180 185 190
Gly Trp Pro Asp Val Lys Phe Ser Gly Ser Ile Ile Gly Asn Lys Gly
195 200 205
Ala Ile Thr Ile Val Gly Ala Gln Gly Glu Asp Asp Gln Ala Gln Phe
210 215 220
Thr Trp Gly Ile Ser Val Pro Ser Trp Gln Phe Gly Ala Gly Thr Gln
225 230 235 240
Ile Thr Val Leu Gly
245
<210> 3
<211> 47
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr
35 40 45
<210> 4
<211> 22
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu
1 5 10 15
Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 5
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 7
<211> 489
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Gly Gly Ile
20 25 30
Ser Trp Phe Pro Gly Gly Ser Ile Lys Ile Ser Gly Ser Gly Phe Thr
35 40 45
Phe Ser Trp Phe Tyr Asn Val Trp Lys Gln Gly Pro Gly Lys Gly Ile
50 55 60
Gln Trp Val Ser Asp Ile Asn Asn Gln Gly Gly Thr Leu Phe Val Ala
65 70 75 80
Asp Ser Trp Lys Gly Lys Phe Thr Ile Ser Lys Glu Asn Ser Arg Asn
85 90 95
Ser Ile Phe Ile Val Asn Arg Ser Ile Lys Gly Tyr Asp Thr Gly Trp
100 105 110
Phe Tyr Cys Ala Lys Asp Ala Gly Tyr Ser Asn His Trp Pro Ile Phe
115 120 125
Asp Ser Trp Gly Gln Gly Thr Ile Trp Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly
130 135 140
Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gln Gly Val Trp
145 150 155 160
Ser Asn Gln Pro Ser Ile Thr Trp Ser Pro Gly Gly Thr Trp Thr Ile
165 170 175
Leu His Cys Gly Ile Lys Ser Gly Ser Ser Asp Asn Phe Pro Thr Trp
180 185 190
Phe Asn Gln Thr Pro Gly Gln Gly Pro Lys Ile Leu Ile Phe Asn Thr
195 200 205
Asn Thr Lys His Ser Gly Trp Pro Asp Val Lys Phe Ser Gly Ser Ile
210 215 220
Ile Gly Asn Lys Gly Ala Ile Thr Ile Val Gly Ala Gln Gly Glu Asp
225 230 235 240
Asp Gln Ala Gln Phe Thr Trp Gly Ile Ser Val Pro Ser Trp Gln Phe
245 250 255
Gly Ala Gly Thr Gln Ile Thr Val Leu Gly Thr Thr Thr Pro Ala Pro
260 265 270
Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu
275 280 285
Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg
290 295 300
Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly
305 310 315 320
Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys
325 330 335
Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg
340 345 350
Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro
355 360 365
Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser
370 375 380
Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu
385 390 395 400
Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg
405 410 415
Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln
420 425 430
Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr
435 440 445
Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp
450 455 460
Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala
465 470 475 480
Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
485

Claims (10)

1.一种Anti CD70 CAR-T细胞，其特征在于，所述CAR-T细胞以CD70结构域为靶点，在T淋巴细胞内表达SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白。
2.根据权利要求1所述的Anti CD70 CAR-T细胞，其特征在于，所述T淋巴细胞来源于人外周血分离的PBMC中。
3.根据权利要求1所述的Anti CD70 CAR-T细胞，其特征在于，所述SCFV-CD8TM4-1BB-CD3ζ融合蛋白的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示。
4.根据权利要求1所述的Anti CD70 CAR-T细胞，其特征在于，所述SCFV-CD8TM4-1BB-CD3ζ融合蛋白中，CD8 Leader的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示，CD70 SCFV(含(G4S)3)的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
5.根据权利要求1所述的Anti CD70 CAR-T细胞，其特征在于，所述SCFV-CD8TM4-1BB-CD3ζ融合蛋白中，CD8_Hinge的分子序列如SEQ ID NO.3所示，CD8TM的氨基酸序列如SEQ IDNO.4所示。
6.根据权利要求1所述的Anti CD70 CAR-T细胞，其特征在于，所述SCFV-CD8TM4-1BB-CD3ζ融合蛋白中，4-1BB的氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示，CD3ζ的氨基酸序列如SEQ IDNO.6所示。
7.根据权利要求1所述的Anti CD70 CAR-T细胞，其特征在于，所述T细胞的表面表达所述Anti CD70 SCFV序列的分子，所述T细胞的胞内由所述4-1BB-CD3ζ分子传递T细胞活化信号。
8.权利要求1-7中任一所述Anti CD70 CAR-T细胞的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)合成和扩增SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因，将所述SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白基因克隆到慢病毒表达载体上；
(2)利用慢病毒包装质粒和步骤(1)得到的慢病毒表达载体质粒感染293T细胞，包装和制备慢病毒；
(3)分离T淋巴细胞，培养扩增，利用步骤(2)得到的慢病毒感染T淋巴细胞，使所述T淋巴细胞表达SCFV-CD8TM-4-1BB-CD3ζ融合蛋白，得到Anti CD70 CAR-T细胞。
9.权利要求1-7中任一所述Anti CD70 CAR-T细胞在制备治疗高表达CD70分子的肿瘤的药物中的应用。
10.根据权利要求9所述的应用，其特征在于，所述肿瘤为肾癌、脑胶质瘤。
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