CN114149505A - 治疗b细胞相关疾病的免疫细胞、制备方法及其应用 - Google Patents

治疗b细胞相关疾病的免疫细胞、制备方法及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN114149505A
CN114149505A CN202111500114.9A CN202111500114A CN114149505A CN 114149505 A CN114149505 A CN 114149505A CN 202111500114 A CN202111500114 A CN 202111500114A CN 114149505 A CN114149505 A CN 114149505A
Authority
CN
China
Prior art keywords
sequence
cell
seq
antibody
gly
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Granted
Application number
CN202111500114.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN114149505B (zh
Inventor
王方圆
戴卫国
朱滨
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Beijing Menlo Biotech Co ltd
Original Assignee
Beijing Menlo Biotech Co ltd
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Beijing Menlo Biotech Co ltd filed Critical Beijing Menlo Biotech Co ltd
Publication of CN114149505A publication Critical patent/CN114149505A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN114149505B publication Critical patent/CN114149505B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • C07K16/18—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans
    • C07K16/28—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants
    • C07K16/2878—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies against material from animals or humans against receptors, cell surface antigens or cell surface determinants against the NGF-receptor/TNF-receptor superfamily, e.g. CD27, CD30, CD40, CD95
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/68—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an antibody, an immunoglobulin or a fragment thereof, e.g. an Fc-fragment
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P35/00—Antineoplastic agents
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
    • A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
    • A61P37/02—Immunomodulators
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C07K14/435—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof from animals; from humans
    • C07K14/705—Receptors; Cell surface antigens; Cell surface determinants
    • C07K14/70503—Immunoglobulin superfamily
    • C07K14/7051—T-cell receptor (TcR)-CD3 complex
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/56—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments variable (Fv) region, i.e. VH and/or VL
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/03—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a transmembrane segment

Abstract

本发明公开了治疗B细胞相关疾病的免疫细胞、制备方法及其应用。本发明还公开了在免疫细胞中表达的CAR分子及其编码核酸。本发明还公开了所述表达CAR的免疫细胞用于预防和/或治疗B细胞相关疾病(例如B细胞及浆细胞相关的恶性肿瘤、自身免疫疾病)的用途以及预防和/或治疗所述B细胞相关疾病的方法。

Description

治疗B细胞相关疾病的免疫细胞、制备方法及其应用
技术领域
本发明涉及医药生物领域，涉及治疗B细胞相关疾病的免疫细胞、制备方法及其应用。
背景技术
B-cell maturation antigen(BCMA)是B细胞成熟抗原(CD269)tumornecrosisfactor(TNF)受体超家族的成员，含有184个氨基酸，是I型跨膜蛋白。BCMA主要表达于晚期成熟B细胞亚群中，比如浆细胞中。在造血干细胞及早期B细胞中不表达，在非造血组织中也不表达。另外在非小细胞肺癌中异常表达。该靶点相关通路目前主要应用于治疗系统性红斑狼疮(Benlysta靶向BLyS，2011年获批)和多发性骨髓瘤(MM)。BCMA的配体为B细胞活化因子(BAFF)和增殖诱导配体(APRIL)。配体BlyS与BCMA结合后，激活BCMA的下游NF-kappaB和MAPK8/JNK通路，促进B细胞的增殖、分化和促进抗体的产生。配体APRIL与BCMA结合后，可促进MM细胞生长及产生骨髓中免疫抑制微环境。
在多发性骨髓瘤患者中，血清中游离性BCMA浓度升高，竞争性结合BAFF，导致浆细胞激活受到影响。因此BCMA在MM疾病进展中起到重要作用。BCMA RNA在MM细胞中普遍检测到，多发性骨髓瘤患者的浆细胞表面可检测到BCMA蛋白。BCMA缺乏的小鼠看上去一切正常，似乎很健康，而且B细胞数量正常，但浆细胞却不能长期存活。因此，BCMA将是用具有chimeric antigen receptor(CAR)表达细胞治疗MM的合适靶抗原。
发明内容
本发明提供了特异性结合BCMA的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下氨基酸序列的重链可变区：
1)SEQ ID NO.1所示的序列；
2)与SEQ ID NO.1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
3)与SEQ ID NO.1所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或
选自以下氨基酸序列的轻链可变区：
4)SEQ ID NO.2所示的序列；
5)与SEQ ID NO.2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
6)与SEQ ID NO.2所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
进一步，所述抗体或其抗原结合片段包括scFv、di-scFv、(scFv)2、Fab、Fab’、(Fab’)2、(Fab’)3、Fv片段、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白、单结构域抗体。
在本发明的一个具体实施方案中，所述抗体的抗原结合片段是scFv，所述scFv还包括连接重链可变区和轻链可变区的linker。
优选地，所述linker序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
本发明提供了特异性结合BCMA的嵌合抗原受体，其包含胞外抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域以及胞内信号传导结构域，所述胞外抗原结合结构域为特异性结合BCMA的scFv，所述scFv限定如前面所述。所述scFv的序列如SEQ ID NO.12所示。
进一步，所述跨膜结构域包含选自下列蛋白的跨膜区：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD137、CD152、CD154、PD1；优选地，所述跨膜结构域包含CD8α的跨膜区；更优选地，所述CD8α的跨膜区序列包括以下任一项所述的序列：
1)SEQ ID NO.4所示的序列；
2)与SEQ ID NO.4所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
3)与SEQ ID NO.4所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
进一步，所述间隔结构域位于胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间，所述间隔结构域包含选自铰链结构域和/或免疫球蛋白的CH2和CH3区；优选地，所述铰链结构域包含CD8α、PD1、CD152或CD154的铰链区；优选地，所述铰链结构域包含CD8α的铰链区；更优选地，所述CD8α的铰链区序列包括以下任一项所述的序列：
1)SEQ ID NO.5所示的序列；
2)与SEQ ID NO.5所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
3)与SEQ ID NO.5所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
进一步，所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域。
优选地，所述胞内信号传导结构域从N端到C端依次包含共刺激信号传导结构域和初级信号传导结构域。
优选地，所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域以及至少一个共刺激信号传导结构域。
优选地，所述初级信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸活化基序。
优选地，所述初级信号传导结构域包含选自以下蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b或CD66d；更优选地，所述初级信号传导结构域包含CD3ζ的胞内信号传导结构域；更优选地，所述CD3ζ的胞内信号传导结构域序列包括以下任一项所述的序列：
1)SEQ ID NO.6所示的序列；
2)与SEQ ID NO.6所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
3)与SEQ ID NO.6所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
优选地，所述共刺激信号传导结构域包含选自下列蛋白的胞内信号传导结构域：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD134、4-1BB、CD150、CD270、CD278或DAP10；更优选地，所述共刺激信号传导结构域包含4-1BB的胞内信号传导结构域；更优选地，所述4-1BB的胞内信号传导结构域序列包括以下任一项所述的序列：
2)SEQ ID NO.7所示的序列；
2)与SEQ ID NO.7所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
3)与SEQ ID NO.7所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
进一步，所述嵌合抗原受体进一步在其N端包含信号肽；优选地，所述信号肽包含重链信号肽、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体2信号肽，或CD8α信号肽；更优选地，所述信号肽是CD8α信号肽。CD8α信号肽包括以下任一项所述的序列：
1)SEQ ID NO.8所示的序列；
2)与SEQ ID NO.8所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
3)与SEQ ID NO.8所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
本发明的所述嵌合抗原受体包含以下任一项所述的氨基酸序列：
1)SEQ ID NO.9所示的序列；
2)与SEQ ID NO.9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
3)与SEQ ID NO.9所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
本发明提供了分离的核酸分子，其包含编码前面所述的抗体或其抗原结合片段的核苷酸序列，或者编码前面所述的嵌合抗原受体的核苷酸序列。
进一步，所述核酸分子进一步包含编码自杀开关多肽和/或自裂解肽的核苷酸序列。
进一步，所述自裂解肽包括P2A，E2A，F2A或T2A；优选地，所述自裂解肽是T2A，优选地，T2A的氨基酸序列包括SEQ ID NO.10所示的序列。
进一步，所述自杀开关多肽包括Caspase-9、EGFR中的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段或RQR8，优选地，EGFR中的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的氨基酸序列包括SEQ ID NO.11所示的序列。
本发明提供了载体，其包含前面所述的核酸分子。
进一步，所述载体包括DNA载体，RNA载体，质粒，转座子载体，CRISPR/Cas9载体，或病毒载体；优选地，所述病毒载体包含慢病毒载体，腺病毒载体或逆转录病毒载体。
本发明提供了宿主细胞，其包含前面所述的核酸分子，或前面所述的载体。
进一步，所述宿主细胞包括大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，或哺乳动物细胞。
进一步，所述宿主细胞包括包含免疫细胞；优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、NK细胞，单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合。
本发明提供了制备前面所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养前面所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段。
本发明提供了制备表达前面所述的嵌合抗原受体的细胞的方法，其包括：(1)提供宿主细胞；(2)获得能够表达所述嵌合抗原受体的宿主细胞；其中步骤(2)包括将前面所述的核酸分子或前面所述的载体引入步骤(1)所述的宿主细胞；优选地，所述宿主细胞包括免疫细胞；优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合。
本发明提供了宿主细胞群体，其包含前面所述的宿主细胞；优选地，所述宿主细胞群体进一步包含不包含前面所述的核酸分子，或前面所述的载体的宿主细胞；优选地，所述宿主细胞包括包含免疫细胞；优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、NK细胞，单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合。
本发明提供了试剂盒，其包含前面所述的抗体或其抗原结合片段、前面所述的核酸分子，前面所述的载体，前面所述的宿主细胞，或前面所述的宿主细胞群体。
本发明提供了缀合物，其包含前面所述的抗体或其抗原结合片段，以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的修饰部分；优选地，所述修饰部分包括可检测的标记或治疗剂；优选地，可检测的标记包括酶、放射性核素、荧光染料、发光物质或生物素；优选地，所述治疗剂包括具有抗肿瘤活性的药物或细胞毒剂。
本发明提供了药物组合物，其包含前面所述的抗体或其抗原结合片段、前面所述的核酸分子，前面所述的载体，前面所述的宿主细胞，前面所述的宿主细胞群体，或前面所述的缀合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂。
进一步，本发明的药物组合物还包括另外的药学活性剂；优选地，所述另外的药学活性剂包括另外的抗体、融合蛋白或药物(如抗肿瘤药物，如用于放疗的药物或化疗药物)。
本发明提供了用于在受试者中预防和/或治疗B细胞相关病况的方法，所述方法包括向有此需要的受试者施用有效量的前面所述的宿主细胞、前面所述的宿主细胞群体，或前面所述的药物组合物。
本发明提供了用于诊断受试者是否患有表达BCMA的肿瘤的方法，其包括使用前面所述的抗体或其抗原结合片段检测BCMA在来自所述受试者的样品中的量；
优选地，所述方法还包括：将所述BCMA在来自所述受试者的样品中的量与其在已知标准品或参照样品中的量进行比较，并确定来自所述受试者的样品的BCMA水平是否落入与肿瘤相关的BCMA水平内；
优选地，所述样品可以选自尿液、血液、血清、血浆、唾液、腹水、循环细胞、循环肿瘤细胞、非组织缔合的细胞、组织、组织学制备物；
优选地，所述表达BCMA的肿瘤包括B细胞恶性肿瘤，优选地，所述B细胞恶性肿瘤包括多发性骨髓瘤或非霍奇金氏淋巴瘤。
本发明提供了应用，其包含以下任一项所述的应用：
1)前面所述的抗体或其抗原结合片段在制备特异性结合BCMA的嵌合抗原受体中的应用；优选地，所述嵌合抗原受体包括前面所述的嵌合抗原受体。
2)前面所述的抗体或其抗原结合片段在制备预防和/或治疗B细胞相关病况的药物中的应用；优选地，所述药物是前面所述的药物组合物；
3)前面所述的抗体或其抗原结合片段，或所述的缀合物在制备诊断受试者是否患有表达BCMA的肿瘤的试剂盒中的应用；
4)前面所述的抗体或其抗原结合片段在制备前面所述的缀合物中的应用；
5)前面所述的抗体或其抗原结合片段、前面所述的核酸分子，前面所述的载体在制备表达嵌合抗原受体的宿主细胞中的应用；优选地，所述宿主细胞是前面所述的宿主细胞；
6)前面所述的核酸分子，前面所述的载体在制备前面所述的试剂盒中的应用；
7)前面所述的核酸分子，前面所述的载体在制备预防和/或治疗B细胞相关病况的药物中的应用；优选地，所述药物是前面所述的药物组合物；
8)前面所述的宿主细胞在制备预防和/或治疗B细胞相关病况的药物中的应用；优选地，所述药物是前面所述的药物组合物；
9)前面述的宿主细胞群体在制备预防和/或治疗B细胞相关病况的药物中的应用；优选地，所述药物是前面所述的药物组合物。
本发明的所述B细胞相关病况包括B细胞恶性肿瘤或与B细胞相关的自身免疫疾病。
本发明的所述B细胞相关病况包括多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤、具有不确定的恶性潜能的B细胞增殖、淋巴瘤样肉芽肿病、移植后淋巴增生性病症、免疫调节病症、风湿性关节炎、重症肌无力、特发性血小板减少性紫癜、抗磷脂综合症、恰加斯氏病、格雷夫斯氏病、韦格纳肉芽肿、结节性多动脉炎、斯耶格伦氏综合症、寻常天胞疮、硬皮病、多发性硬化、抗磷脂综合症、ANCA相关性小血管炎、古德帕斯彻病、川崎病、自身免疫性溶血性贫血以及急进性肾小球肾炎、重链疾病、原发性或免疫细胞相关淀粉样变性或者意义未明的单克隆丙种球蛋白血症、系统性红斑狼疮。
如本文中所使用的，术语“抗体”指能够通过位于免疫球蛋白分子可变区的至少一个抗原识别位点特异性结合靶(如碳水化合物、多核苷酸、脂质、多肽等)的免疫球蛋白分子。如本文所用，该术语不仅包括完整的多克隆或单克隆抗体，而且包括其片段(例如Fab、Fab'、F(ab')2、Fv)、单链(例如scFv，di-scFv，(scFv)2)和结构域抗体(包括例如鲨鱼和骆驼抗体)、以及包括抗体的融合蛋白、以及包括抗原识别位点的任何其它修饰构型的免疫球蛋白分子。本发明的抗体不受任何特定的产生抗体的方法限制。抗体包括任何类型的抗体，例如IgG、IgA或IgM(或其亚类)，并且抗体不需要属于任何特定的类型。取决于抗体重链恒定区的氨基酸序列，免疫球蛋白可以分配到不同的类型。有五种主要类型的免疫球蛋白：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，其中几种可进一步分为亚类(同种型)，例如IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA1和IgA2。对应于不同类型的免疫球蛋白的重链恒定区分别被称为α、δ、ε、γ和μ。抗体轻链可分类为κ(kappa)和λ(lambda)轻链。不同类型的免疫球蛋白的亚基结构和三维构型是众所周知的。重链恒定区由4个结构域(CH1、hinge region、CH2和CH3)组成。各轻链由轻链可变区(VL)和轻链恒定区(CL)组成。轻链恒定区由一个结构域CL组成。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但展现出多种效应子功能，如可介导免疫球蛋白与宿主组织或因子，包括免疫系统的各种细胞(例如，效应细胞)和经典补体系统的第一组分(C1q)的结合。
如本文中所使用的，术语抗体的“抗原结合片段”是指抗体的片段的多肽，例如全长抗体的片段的多肽，其保持特异性结合全长抗体所结合的相同抗原的能力，和/或与全长抗体竞争对抗原的特异性结合，其也被称为“抗原结合部分”。通常参见，FundamentalImmunology,Ch.7(Paul,W.,ed.,第2版，Raven Press,N.Y.(1989)，其以其全文通过引用合并入本文，用于所有目的。可通过重组DNA技术或通过完整抗体的酶促或化学断裂产生抗体的抗原结合片段。抗原结合片段的非限制性实例包括骆驼Ig、Ig NAR、Fab片段、Fab'片段、F(ab)'2片段、F(ab)'3片段、Fd、Fv、scFv、di-scFv、(scFv)2、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白(“dsFv”)和单结构域抗体(sdAb，纳米抗体)和这样的多肽，其包含足以赋予多肽特异性抗原结合能力的抗体的至少一部分。工程改造的抗体变体综述于Holliger等,2005；Nat Biotechnol,23:1126-1136中。
如本文中所使用的，术语“骆驼Ig”或“骆驼VHH”是指重链抗体的最小已知抗原结合单位(Koch-Nolte等人,FASEB J.,21:3490-3498(2007))。“重链抗体”或“骆驼抗体”是指含有两个VH结构域并且不含轻链的抗体(Riechmann L.等人,免疫学方法杂志(J.Immunol.Methods)231:25-38(1999)；WO94/04678；WO94/25591；美国专利第6,005,079号)。
如本文中所使用的，术语“IgNAR”或“免疫球蛋白新抗原受体”是指来自鲨鱼免疫组库的由一个可变新抗原受体(VNAR)结构域和五个恒定新抗原受体(CNAR)结构域的同源二聚体组成的一类抗体。
附图说明
图1显示利用流式细胞仪检测T细胞表面CAR的表达情况的结果图；
图2显示利用流式细胞仪检测CAR-T细胞杀伤效果第一次结果图；
图3显示利用流式细胞仪检测CAR-T细胞杀伤效果的第二次结果图。
具体实施方式
下面将结合附图和实施例对本发明的实施方案进行详细描述，但是本领域技术人员将理解，下列附图和实施例仅用于说明本发明，而不是对本发明的范围的限定。根据附图和优选实施方案的下列详细描述，本发明的各种目的和有利方面对于本领域技术人员来说将变得可实施。
实施例
1、T细胞纯化
人外周血经密度梯度离心后，分离外周血单个核细胞。利用德国美天旎公司的T细胞分离试剂盒获得纯化的CD3+T细胞，再按照2个细胞加入1个磁珠的比例，加入适量的CD3/CD28磁珠活化2天。2天后，敲除TCR。2天后，进行TCR阴性分选，之后加入病毒上清与polybrene(6μg/mL)孵育。6小时后，离心清洗T细胞1次后，加入含250U IL-2的
Figure BDA0003402370760000101
CTSTMAIM VTM T细胞扩增无血清培养基扩增T细胞。
2、CAR表达载体构建
构建的嵌合抗原受体慢病毒表达载体中嵌合抗原受体各个元件的组合顺序(从N端到C端)如下：
CD8α信号肽-scFv-人CD8a分子柔性片段-人CD8分子跨膜区-4-1BB胞内段-CD3ζ(氨基酸序列如SEQ ID NO.9所示)。
另外，载体中还插入编码T2A的核苷酸序列和编码EGFR中的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的核苷酸序列。各个元件的组合顺序(从N端到C端)如下：
CD8α信号肽-scFv-人CD8a分子柔性片段-人CD8分子跨膜区-4-1BB胞内段-CD3ζ-T2A-EGFR中的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段(T2A的氨基酸序列如SEQ ID NO.10所示，EGFR中的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的氨基酸序列如SEQ ID NO.11所示)。
3、慢病毒包装
4、慢病毒转导
5、CAR-T细胞扩增
6、T细胞CAR表达效率检测
T细胞感染3天后，利用流式细胞术对T细胞表面CAR的表达情况进行检测。结果显示CAR表达阳性率达到～65％(如图1所示)。
7、CAR-T细胞杀伤效果评价
T细胞感染3天后，计数T细胞与靶细胞，然后按照效靶比(效应细胞：靶细胞，E:T)2：1，1：1，1：2的比例，将T细胞(效应细胞)与CD269高表达靶细胞(H929)分别共孵育20小时、36小时、48小时。共孵育结束后，离心收集细胞，利用细胞燃料(APC)对靶细胞进行标记，然后流式细胞术分析靶细胞占比(如图2，表1所示)。结果显示，CAR-T细胞对表达CD269的肿瘤细胞具有很强的杀伤能力，说明该CAR-T细胞具有很强的特异性杀伤能力。48小时CAR-T细胞将靶细胞杀光后(2：1，1：1)，继续按照效靶比(效应细胞：靶细胞，E:T)2：1，1：1的比例，将T细胞(效应细胞)再次与CD269高表达靶细胞(H929)分别共孵育24小时、36小时。共孵育结束后，离心收集细胞，利用细胞燃料(APC)对靶细胞进行标记，然后流式细胞术分析靶细胞占比(如图3，表2所示)。结果显示，CAR-T细胞对表达CD269的肿瘤细胞仍然具有很强的杀伤能力，说明该CAR-T细胞具有非常强的特异性杀伤能力。
表1第一次杀伤
第一次杀伤 0h 20h 36h 48h
2：1 15.2％ 0.5％ 0.1％ 0％
1：1 27％ 4.1％ 0.2％ 0.4％
1：2 44.5％ 28.3％ 1.8％ 4.4％
表2第二次杀伤
第二次杀伤 0h 24h 36h
2：1 12.1％ 0.3％ 0％
1：1 20.8％ 0.6％ 0％
尽管本发明的具体实施方式已经得到详细的描述，但本领域技术人员将理解：根据已经公布的所有教导，可以对细节进行各种修改和变动，并且这些改变均在本发明的保护范围之内。本发明的全部分为由所附权利要求及其任何等同物给出。
序列表
<110> 北京门罗生物科技有限公司
<120> 治疗B细胞相关疾病的免疫细胞、制备方法及其应用
<141> 2021-12-09
<160> 12
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 118
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Ala Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asn Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser
115
<210> 2
<211> 107
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly
1 5 10 15
Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr
20 25 30
Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile
35 40 45
Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly
50 55 60
Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro
65 70 75 80
Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Pro
85 90 95
Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
100 105
<210> 3
<211> 15
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
1 5 10 15
<210> 4
<211> 24
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu Leu Leu
1 5 10 15
Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys
20
<210> 5
<211> 45
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro Ala Pro Thr Ile Ala
1 5 10 15
Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys Arg Pro Ala Ala Gly
20 25 30
Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala Cys Asp
35 40 45
<210> 6
<211> 112
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala Tyr Gln Gln Gly
1 5 10 15
Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg Arg Glu Glu Tyr
20 25 30
Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu Met Gly Gly Lys
35 40 45
Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn Glu Leu Gln Lys
50 55 60
Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met Lys Gly Glu Arg
65 70 75 80
Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly Leu Ser Thr Ala
85 90 95
Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala Leu Pro Pro Arg
100 105 110
<210> 7
<211> 42
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 7
Lys Arg Gly Arg Lys Lys Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met
1 5 10 15
Arg Pro Val Gln Thr Thr Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe
20 25 30
Pro Glu Glu Glu Glu Gly Gly Cys Glu Leu
35 40
<210> 8
<211> 21
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 8
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro
20
<210> 9
<211> 484
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 9
Met Ala Leu Pro Val Thr Ala Leu Leu Leu Pro Leu Ala Leu Leu Leu
1 5 10 15
His Ala Ala Arg Pro Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val
20 25 30
Lys Lys Pro Gly Ala Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr
35 40 45
Thr Phe Thr Ser Tyr Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln
50 55 60
Gly Leu Glu Trp Met Gly Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Ala Thr Lys
65 70 75 80
Tyr Asn Glu Lys Phe Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser
85 90 95
Ile Ser Thr Ala Tyr Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr
100 105 110
Ala Val Tyr Tyr Cys Ala Arg Tyr Asn Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Val
115 120 125
Trp Gly Gln Gly Thr Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser
130 135 140
Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln
145 150 155 160
Ser Pro Ser Ser Leu Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr
165 170 175
Cys Arg Ala Ser Gln Ser Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln
180 185 190
Lys Pro Gly Lys Ala Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser
195 200 205
Ile Ser Gly Val Pro Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp
210 215 220
Phe Thr Leu Thr Ile Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr
225 230 235 240
Tyr Cys Gln Asn Gly His Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr
245 250 255
Lys Leu Glu Ile Lys Thr Thr Thr Pro Ala Pro Arg Pro Pro Thr Pro
260 265 270
Ala Pro Thr Ile Ala Ser Gln Pro Leu Ser Leu Arg Pro Glu Ala Cys
275 280 285
Arg Pro Ala Ala Gly Gly Ala Val His Thr Arg Gly Leu Asp Phe Ala
290 295 300
Cys Asp Ile Tyr Ile Trp Ala Pro Leu Ala Gly Thr Cys Gly Val Leu
305 310 315 320
Leu Leu Ser Leu Val Ile Thr Leu Tyr Cys Lys Arg Gly Arg Lys Lys
325 330 335
Leu Leu Tyr Ile Phe Lys Gln Pro Phe Met Arg Pro Val Gln Thr Thr
340 345 350
Gln Glu Glu Asp Gly Cys Ser Cys Arg Phe Pro Glu Glu Glu Glu Gly
355 360 365
Gly Cys Glu Leu Arg Val Lys Phe Ser Arg Ser Ala Asp Ala Pro Ala
370 375 380
Tyr Gln Gln Gly Gln Asn Gln Leu Tyr Asn Glu Leu Asn Leu Gly Arg
385 390 395 400
Arg Glu Glu Tyr Asp Val Leu Asp Lys Arg Arg Gly Arg Asp Pro Glu
405 410 415
Met Gly Gly Lys Pro Arg Arg Lys Asn Pro Gln Glu Gly Leu Tyr Asn
420 425 430
Glu Leu Gln Lys Asp Lys Met Ala Glu Ala Tyr Ser Glu Ile Gly Met
435 440 445
Lys Gly Glu Arg Arg Arg Gly Lys Gly His Asp Gly Leu Tyr Gln Gly
450 455 460
Leu Ser Thr Ala Thr Lys Asp Thr Tyr Asp Ala Leu His Met Gln Ala
465 470 475 480
Leu Pro Pro Arg
<210> 10
<211> 18
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 10
Glu Gly Arg Gly Ser Leu Leu Thr Cys Gly Asp Val Glu Glu Asn Pro
1 5 10 15
Gly Pro
<210> 11
<211> 352
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 11
Met Trp Leu Gln Ser Leu Leu Leu Leu Gly Thr Val Ala Cys Ser Ile
1 5 10 15
Ser Arg Lys Val Cys Asn Gly Ile Gly Ile Gly Glu Phe Lys Asp Ser
20 25 30
Leu Ser Ile Asn Ala Thr Asn Ile Lys His Phe Lys Asn Cys Thr Ser
35 40 45
Ile Ser Gly Asp Leu His Ile Leu Pro Val Ala Phe Arg Gly Asp Ser
50 55 60
Phe Thr His Thr Pro Pro Leu Asp Pro Gln Glu Leu Asp Ile Leu Lys
65 70 75 80
Thr Val Lys Glu Ile Thr Gly Phe Leu Leu Ile Gln Ala Trp Pro Glu
85 90 95
Asn Arg Thr Asp Leu His Ala Phe Glu Asn Leu Glu Ile Ile Arg Gly
100 105 110
Arg Thr Lys Gln His Gly Gln Phe Ser Leu Ala Val Val Ser Leu Asn
115 120 125
Ile Thr Ser Leu Gly Leu Arg Ser Leu Lys Glu Ile Ser Asp Gly Asp
130 135 140
Val Ile Ile Ser Gly Asn Lys Asn Leu Cys Tyr Ala Asn Thr Ile Asn
145 150 155 160
Trp Lys Lys Leu Phe Gly Thr Ser Gly Gln Lys Thr Lys Ile Ile Ser
165 170 175
Asn Arg Gly Glu Asn Ser Cys Lys Ala Thr Gly Gln Val Cys His Ala
180 185 190
Leu Cys Ser Pro Glu Gly Cys Trp Gly Pro Glu Pro Arg Asp Cys Val
195 200 205
Ser Cys Arg Asn Val Ser Arg Gly Arg Glu Cys Val Asp Lys Cys Asn
210 215 220
Leu Leu Glu Gly Glu Pro Arg Glu Phe Val Glu Asn Ser Glu Cys Ile
225 230 235 240
Gln Cys His Pro Glu Cys Leu Pro Gln Ala Met Asn Ile Thr Cys Thr
245 250 255
Gly Arg Gly Pro Asp Asn Cys Ile Gln Cys Ala His Tyr Ile Asp Gly
260 265 270
Pro His Cys Val Lys Thr Cys Pro Ala Gly Val Met Gly Glu Asn Asn
275 280 285
Thr Leu Val Trp Lys Tyr Ala Asp Ala Gly His Val Cys His Leu Cys
290 295 300
His Pro Asn Cys Thr Tyr Gly Cys Thr Gly Pro Gly Leu Glu Gly Cys
305 310 315 320
Pro Thr Asn Gly Pro Lys Ile Pro Ser Ile Ala Thr Gly Met Val Gly
325 330 335
Ala Leu Leu Leu Leu Leu Val Val Ala Leu Gly Ile Gly Leu Phe Met
340 345 350
<210> 12
<211> 240
<212> PRT
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 12
Gln Val Gln Leu Val Gln Ser Gly Ala Glu Val Lys Lys Pro Gly Ala
1 5 10 15
Ser Val Lys Val Ser Cys Lys Ala Ser Gly Tyr Thr Phe Thr Ser Tyr
20 25 30
Val Met His Trp Val Arg Gln Ala Pro Gly Gln Gly Leu Glu Trp Met
35 40 45
Gly Tyr Ile Ile Pro Tyr Asn Asp Ala Thr Lys Tyr Asn Glu Lys Phe
50 55 60
Lys Gly Arg Val Thr Met Thr Arg Asp Thr Ser Ile Ser Thr Ala Tyr
65 70 75 80
Met Glu Leu Ser Arg Leu Arg Ser Asp Asp Thr Ala Val Tyr Tyr Cys
85 90 95
Ala Arg Tyr Asn Tyr Asp Gly Tyr Phe Asp Val Trp Gly Gln Gly Thr
100 105 110
Leu Val Thr Val Ser Ser Gly Gly Gly Gly Ser Gly Gly Gly Gly Ser
115 120 125
Gly Gly Gly Gly Ser Asp Ile Gln Met Thr Gln Ser Pro Ser Ser Leu
130 135 140
Ser Ala Ser Val Gly Asp Arg Val Thr Ile Thr Cys Arg Ala Ser Gln
145 150 155 160
Ser Ile Ser Asp Tyr Leu His Trp Tyr Gln Gln Lys Pro Gly Lys Ala
165 170 175
Pro Lys Leu Leu Ile Lys Tyr Ala Ser Gln Ser Ile Ser Gly Val Pro
180 185 190
Ser Arg Phe Ser Gly Ser Gly Ser Gly Ser Asp Phe Thr Leu Thr Ile
195 200 205
Ser Ser Leu Gln Pro Glu Asp Phe Ala Thr Tyr Tyr Cys Gln Asn Gly
210 215 220
His Ser Phe Pro Pro Thr Phe Gly Gln Gly Thr Lys Leu Glu Ile Lys
225 230 235 240

Claims (10)

1.特异性结合BCMA的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或其抗原结合片段包含选自以下氨基酸序列的重链可变区：
1)SEQ ID NO.1所示的序列；
2)与SEQ ID NO.1所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
3)与SEQ ID NO.1所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
和/或选自以下氨基酸序列的轻链可变区：
4)SEQ ID NO.2所示的序列；
5)与SEQ ID NO.2所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
6)与SEQ ID NO.2所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列；
优选地，所述抗体或其抗原结合片段包括scFv、di-scFv、(scFv)2、Fab、Fab’、(Fab’)2、(Fab’)3、Fv片段、微型抗体、双功能抗体、三功能抗体、四功能抗体、二硫键稳定的Fv蛋白、单结构域抗体；
优选地，所述抗体的抗原结合片段是scFv，所述scFv还包括连接重链可变区和轻链可变区的linker；
优选地，所述linker序列包括SEQ ID NO.3所示的序列。
2.特异性结合BCMA的嵌合抗原受体，其包含胞外抗原结合结构域、间隔结构域、跨膜结构域以及胞内信号传导结构域，所述胞外抗原结合结构域为特异性结合BCMA的scFv，所述scFv如权利要求1中所述；优选地，所述scFv序列包括SEQ ID NO.12所示的序列；
优选地，所述跨膜结构域包含选自下列蛋白的跨膜区：T细胞受体的α、β或ζ链、CD3ε、CD3ζ、CD4、CD5、CD8α、CD137、CD152、CD154、PD1；优选地，所述跨膜结构域包含CD8α的跨膜区；更优选地，所述CD8α的跨膜区序列包括SEQ ID NO.4所示的序列；
优选地，所述间隔结构域位于胞外抗原结合结构域与跨膜结构域之间，所述间隔结构域包含选自铰链结构域和/或免疫球蛋白的CH2和CH3区；优选地，所述铰链结构域包含CD8α、PD1、CD152或CD154的铰链区；优选地，所述铰链结构域包含CD8α的铰链区；更优选地，所述CD8α的铰链区序列包括SEQ ID NO.5所示的序列；
优选地，所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域和/或共刺激信号传导结构域；
优选地，所述胞内信号传导结构域从N端到C端依次包含共刺激信号传导结构域和初级信号传导结构域；
优选地，所述胞内信号传导结构域包含初级信号传导结构域以及至少一个共刺激信号传导结构域；
优选地，所述初级信号传导结构域包含免疫受体酪氨酸活化基序；
优选地，所述初级信号传导结构域包含选自以下蛋白的胞内信号传导结构域：CD3ζ、FcRγ、FcRβ、CD3γ、CD3δ、CD3ε、CDS、CD22、CD79a、CD79b或CD66d；更优选地，所述初级信号传导结构域包含CD3ζ的胞内信号传导结构域；更优选地，所述CD3ζ的胞内信号传导结构域序列包括SEQ ID NO.6所示的序列；
优选地，所述共刺激信号传导结构域包含选自下列蛋白的胞内信号传导结构域：CARD11、CD2、CD7、CD27、CD28、CD30、CD134、4-1BB、CD150、CD270、CD278或DAP10；更优选地，所述共刺激信号传导结构域包含4-1BB的胞内信号传导结构域；更优选地，所述4-1BB的胞内信号传导结构域序列包括SEQ ID NO.7所示的序列；
优选地，所述嵌合抗原受体进一步在其N端包含信号肽；优选地，所述信号肽包含重链信号肽、粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子受体2信号肽，或CD8α信号肽；更优选地，所述信号肽是CD8α信号肽，更优选地，所述CD8α信号肽包括SEQ ID NO.8所示的序列；
优选地，所述嵌合抗原受体包含以下任一项所述的氨基酸序列：
1)SEQ ID NO.9所示的序列；
2)与SEQ ID NO.9所示的序列相比具有一个或几个氨基酸的置换、缺失或添加的序列；
3)与SEQ ID NO.9所示的序列具有至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％的序列同一性的序列。
3.分离的核酸分子，其包含编码权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段的核酸序列，或者编码权利要求2所述的嵌合抗原受体的核酸序列；
优选地，所述核酸分子进一步包含编码自杀开关多肽和/或自裂解肽的核苷酸序列；
优选地，所述自裂解肽包括P2A，E2A，F2A或T2A，优选地，所述自裂解肽是T2A，优选地，T2A的氨基酸序列包括SEQ ID NO.10所示的序列；
优选地，所述自杀开关多肽包括Caspase-9、EGFR中的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段或RQR8；优选地，所述自杀开关多肽是EGFR中的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段，优选地，EGFR中的含胞外结构域III和胞外结构域IV的片段的氨基酸序列包括SEQID NO.11所示的序列。
4.载体，其包含权利要求3所述的核酸分子；
优选地，所述载体选自DNA载体，RNA载体，质粒，转座子载体，CRISPR/Cas9载体，或病毒载体；优选地，所述病毒载体包含慢病毒载体，腺病毒载体或逆转录病毒载体。
5.宿主细胞，其包含权利要求3所述的核酸分子，或权利要求4所述的载体。
优选地，所述宿主细胞包括大肠杆菌，酵母，昆虫细胞，或哺乳动物细胞；
优选地，所述宿主细胞包括包含免疫细胞；优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、NK细胞，单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合。
6.一种方法，所述方法包括以下任一项所述的方法：
1)制备权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段的方法，其包括，在允许所述抗体或其抗原结合片段表达的条件下，培养权利要求5所述的宿主细胞，和从培养的宿主细胞培养物中回收所述抗体或其抗原结合片段；
2)制备表达权利要求2所述的嵌合抗原受体的细胞的方法，其包括：(a)提供宿主细胞；(b)获得能够表达所述嵌合抗原受体的宿主细胞；其中步骤(b)包括将权利要求3所述的核酸分子或权利要求4所述的载体引入步骤(a)所述的宿主细胞；优选地，所述宿主细胞包括免疫细胞；优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、NK细胞、单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合。
7.宿主细胞群体，其包含权利要求5所述的宿主细胞；优选地，所述宿主细胞群体进一步包含不包含权利要求3所述的核酸分子，或权利要求4所述的载体的宿主细胞；优选地，所述宿主细胞包括包含免疫细胞；优选地，所述免疫细胞包括T淋巴细胞、NK细胞，单核细胞、巨噬细胞或树突状细胞及其任意组合。
8.一种产品，所述产品包括以下任一项：
1)缀合物，其包含权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，以及连接于所述抗体或其抗原结合片段的修饰部分；优选地，所述修饰部分包括可检测的标记或治疗剂；优选地，可检测的标记包括酶、放射性核素、荧光染料、发光物质或生物素；优选地，所述治疗剂包括具有抗肿瘤活性的药物或细胞毒剂；
2)药物组合物，其包含权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3所述的核酸分子，权利要求4所述的载体，权利要求5所述的宿主细胞，权利要求7所述的宿主细胞群体，或所述缀合物，以及药学上可接受的载体和/或赋形剂；优选地，所述药物组合物还包括另外的药学活性剂；优选地，所述另外的药学活性剂包括另外的抗体、融合蛋白或药物。
9.一种试剂盒，其包含权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3所述的核酸分子，权利要求4所述的载体，权利要求5所述的宿主细胞，或权利要求7所述的宿主细胞群体、权利要求8所述的产品。
10.应用，其包含以下任一项所述的应用：
1)权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段在制备特异性结合BCMA的嵌合抗原受体中的应用；优选地，所述嵌合抗原受体包括权利要求2所述的嵌合抗原受体；
2)权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段在制备预防和/或治疗B细胞相关病况的药物中的应用；优选地，所述药物是权利要求8中所述的药物组合物；
3)权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段，或权利要求8中所述的缀合物在制备诊断受试者是否患有表达BCMA的肿瘤的试剂盒中的应用；
4)权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段在制备权利要求8中所述的缀合物中的应用；
5)权利要求1所述的抗体或其抗原结合片段、权利要求3所述的核酸分子，权利要求4所述的载体在制备表达嵌合抗原受体的宿主细胞中的应用；优选地，所述宿主细胞是权利要求5所述的宿主细胞；
6)权利要求3所述的核酸分子，权利要求4所述的载体在制备权利要求9所述的试剂盒中的应用；
7)权利要求3所述的核酸分子，权利要求4所述的载体在制备预防和/或治疗B细胞相关病况的药物中的应用；优选地，所述药物是权利要求8中所述的药物组合物；
8)权利要求5所述的宿主细胞在制备预防和/或治疗B细胞相关病况的药物中的应用；优选地，所述药物是权利要求8中所述的药物组合物；
9)权利要求7所述的宿主细胞群体在制备预防和/或治疗B细胞相关病况的药物中的应用；优选地，所述药物是权利要求8中所述的药物组合物；
优选地，所述B细胞相关病况包括B细胞恶性肿瘤、具有不确定的恶性潜能的B细胞增殖、淋巴瘤样肉芽肿病、移植后淋巴增生性病症、免疫调节病症、风湿性关节炎、重症肌无力、特发性血小板减少性紫癜、抗磷脂综合症、恰加斯氏病、格雷夫斯氏病、韦格纳肉芽肿、结节性多动脉炎、斯耶格伦氏综合症、寻常天胞疮、硬皮病、多发性硬化、抗磷脂综合症、ANCA相关性小血管炎、古德帕斯彻病、川崎病、自身免疫性溶血性贫血以及急进性肾小球肾炎、重链疾病、原发性或免疫细胞相关淀粉样变性或者意义未明的单克隆丙种球蛋白血症、系统性红斑狼疮；优选地，所述B细胞恶性肿瘤包括多发性骨髓瘤、非霍奇金淋巴瘤；
优选地，所述表达BCMA的肿瘤包括B细胞恶性肿瘤，优选地，所述B细胞恶性肿瘤包括多发性骨髓瘤或非霍奇金氏淋巴瘤。
CN202111500114.9A 2021-01-12 2021-12-09 治疗b细胞相关疾病的免疫细胞、制备方法及其应用 Active CN114149505B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNPCT/CN2021/071250 2021-01-12
CN2021071250 2021-01-12

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN114149505A true CN114149505A (zh) 2022-03-08
CN114149505B CN114149505B (zh) 2022-11-04

Family

ID=80454171

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202111500114.9A Active CN114149505B (zh) 2021-01-12 2021-12-09 治疗b细胞相关疾病的免疫细胞、制备方法及其应用

Country Status (2)

Country Link
CN (1) CN114149505B (zh)
WO (1) WO2022152151A1 (zh)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN117069847A (zh) * 2023-10-08 2023-11-17 北京奇迈永华生物科技有限公司 靶向bcma抗体及其相关产品和医药用途

Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2019209631A1 (en) * 2018-04-23 2019-10-31 Baylor College Of Medicine Chimeric hla accessory receptor
CN110494451A (zh) * 2017-01-13 2019-11-22 塞尔达拉医疗有限责任公司 靶向tim-1的嵌合抗原受体
CN110592023A (zh) * 2019-09-11 2019-12-20 浙江蓝盾药业有限公司 一种Anti CD70 CAR-T细胞及其制备方法与应用
CN111040036A (zh) * 2018-10-12 2020-04-21 上海卡智生物技术有限公司 抗gpc3单克隆抗体、由其修饰的免疫效应细胞及其应用
CN111454358A (zh) * 2019-01-18 2020-07-28 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
CN111849910A (zh) * 2020-05-27 2020-10-30 南京北恒生物科技有限公司 工程化免疫细胞及其用途
CN112074279A (zh) * 2019-01-16 2020-12-11 卡里布生物科学公司 人源化bcma抗体和bcma-car-t细胞

Family Cites Families (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN105384825B (zh) * 2015-08-11 2018-06-01 南京传奇生物科技有限公司 一种基于单域抗体的双特异性嵌合抗原受体及其应用
CN110616187B (zh) * 2018-06-20 2021-12-03 西安桑尼赛尔生物医药有限公司 CRISPR-Cas9高效敲入嵌合抗原受体基因到T细胞特定基因组位点的方法及应用
CN109134665B (zh) * 2018-08-24 2021-06-11 上海先博生物科技有限公司 一种基于单域抗体的bcma嵌合抗原受体及应用
CN109320615B (zh) * 2018-09-25 2023-09-22 上海恒润达生生物科技股份有限公司 靶向新型bcma的嵌合抗原受体及其用途
CN111944054B (zh) * 2019-05-15 2022-04-05 重庆精准生物技术有限公司 抗bcma的car及其表达载体和应用
CN114364801B (zh) * 2019-05-30 2024-04-19 莱蒂恩技术公司 用于用抗bcma免疫治疗来治疗癌症的组合物和方法
CN112062864A (zh) * 2020-09-18 2020-12-11 樊克兴 靶向bcma肿瘤抗原受体修饰t细胞的制备方法和应用
CN111925451B (zh) * 2020-10-12 2021-01-29 佑仁细胞工程(浙江)有限公司 一种靶向bcma的嵌合抗原受体(car)及其应用

Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN110494451A (zh) * 2017-01-13 2019-11-22 塞尔达拉医疗有限责任公司 靶向tim-1的嵌合抗原受体
WO2019209631A1 (en) * 2018-04-23 2019-10-31 Baylor College Of Medicine Chimeric hla accessory receptor
CN111040036A (zh) * 2018-10-12 2020-04-21 上海卡智生物技术有限公司 抗gpc3单克隆抗体、由其修饰的免疫效应细胞及其应用
CN112074279A (zh) * 2019-01-16 2020-12-11 卡里布生物科学公司 人源化bcma抗体和bcma-car-t细胞
CN111454358A (zh) * 2019-01-18 2020-07-28 四川科伦博泰生物医药股份有限公司 一种嵌合抗原受体及其应用
CN110592023A (zh) * 2019-09-11 2019-12-20 浙江蓝盾药业有限公司 一种Anti CD70 CAR-T细胞及其制备方法与应用
CN111849910A (zh) * 2020-05-27 2020-10-30 南京北恒生物科技有限公司 工程化免疫细胞及其用途

Also Published As

Publication number Publication date
WO2022152151A1 (zh) 2022-07-21
CN114149505B (zh) 2022-11-04

Similar Documents

Publication Publication Date Title
JP6959970B2 (ja) 抗ヒトパピローマウイルス１６ ｅ６ ｔ細胞受容体
EP3149031B1 (en) Anti-human papillomavirus 16 e7 t cell receptors
CN110950953B (zh) 抗b7-h3的单克隆抗体及其在细胞治疗中的应用
CN103124740B (zh) 抗-ssx-2t细胞受体和相关材料及使用方法
CN112469829B (zh) 包含抗gpc3单链抗体的car
CA3059444A1 (en) Chimeric antigen receptor t cells targeting the tumor microenvironment
CN112979820B (zh) 靶向cd123的嵌合抗原受体及含有靶向cd123嵌合抗原受体的双靶点嵌合抗原受体
CN115057930B (zh) 靶向人Claudin18.2蛋白的单克隆抗体及其应用
CN113354739B (zh) 一种靶向表达Claudin18.2细胞的嵌合抗原受体及其应用
CN115443140A (zh) 人ror-1抗体和抗ror-1-car-t细胞
WO2023020537A1 (zh) 一种双特异性抗体及其用途
CN115715298A (zh) 靶向bcma和cd19的嵌合抗原受体car或car构建体及其应用
KR20220012856A (ko) 항 ｐｄ―ｌ１ 항체 및 그의 용도
CN114149505B (zh) 治疗b细胞相关疾病的免疫细胞、制备方法及其应用
CN114437218B (zh) 靶向cd276的嵌合抗原受体以及包含其的免疫细胞
WO2023202280A1 (zh) 抗B7H6的scFv抗体、其编码基因及其应用
KR101783907B1 (ko) ＣＤ66ｃ에 대한 항체와 화학치료제를 포함하는 폐암 예방 또는 치료용 약학조성물
WO2023160260A1 (zh) Cd7-car-t细胞及其制备方法和应用
CN110577603B (zh) 一种抗cd3和抗cd19双特异性抗体
CN114616247A (zh) Ox40/pd-l1双特异性抗体
JP2022514815A (ja) ＣＤＲ１領域に突然変異したヒト化ＣＤ１９ ｓｃＦｖを有するＣＡＲ－Ｔ細胞
EP4141028A1 (en) Personalized vnar-based chimeric antigen receptors (vnar-car) for the treatment of clonal b-and t cell malignancies, and methods for producing vnar-cars
RU2783685C2 (ru) Анти-pd-l1 антитело и его применение
WO2022142272A1 (zh) Cldn18.2抗体及其应用
CN114685659A (zh) Cd22特异性人源化抗体及利用其的嵌合抗原受体

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant